FI79557B - Foerfarande foer isomerisering av glukos till fruktos. - Google Patents

Description

1 79557

Menetelmä glukoosin isomeroimiseksi fruktoosiksi Tämä keksintö koskee entsymaattista menetelmää glukoosin (dekstroosin) isomeroimiseksi fruktoosiksi (le-5 vuloosiksi).

Suurin osa elintarvikelaatuisesta glukoosista on tarjolla maissitärkkelyksestä entsymaattista tietä saatuna hydrolysaattina eli kaupallisena maissisiirappi-na. Glukoosin makeudeksi arvioidaan yleisesti 60 - 80 % 10 sakkaroosin makeudesta ja siten sitä myydään vastaavasti halvemmalla. Glukoosi on jo kauan pystytty isomeroimaan fruktoosiksi (joka on sakkaroosiakin makeampi) glukoosi-isomeraasiaktiivisuuden omaavan entsyymin avulla, joka mieluiten on immobilisoitu inertille kantajalle kuten 15 dietyyliaminoetyyliselluloosalle, huokoiselle lasille tai kitiinille. Glukoosin entsymaattista konversiota fruktoosiksi glukoosi-isomeraasin avulla on yksityiskohtaisesti kuvattu lähteissä Hamilton et ai., "Glucose Isomerase: a Case Study of Enzyme-Catalyzed Process 20 Technology", Immobilized Enzymes in Food and Microbial

Processes, Olson et al., Plenum Press, New York, (1974), s. 94 - 106, 112, 115 - 137:, Antrim et al., "Glucose Isomerase Production of High-Fructose Syrups", Applied Biochemistry and Bioengineering, Vol. 2, Academic Press 25 (1979); Chen et al., "Glucose Isomerase (a Review)",

Process Biochem., (1980), s. 30 - 35:, Chen et al., "Glucose Isomerase (a Review)", Process Biochem., (1980), s. 36 - 41, ja Takasaki, "Fructose Production by Glucose Isomerase", Chem. Abstracts, Vol. 81, (1974), Abs. No.

30 76 474a. Lisäksi lukuisat patentit käsittelevät glukoo sin isomerointia ja edustavia ovat US-patentit nro 3 616 221:, Re 28 885 (alkuaan 3 623 953); 3 694 314; 3 708 397; 3 715 276; 3 788 945; 3 826 714; 3 843 442; 3 909 354; 3 960 663; 4 144 127 ja 4 308 349.

35 Isomerointireaktion tasapaino rajoittaa fruktoosin 2 79557 määrää, joka on saatavissa isomeroitaessa glukoosia glu-koosi-isomeraasin avulla. Lämpötilassa 65°C reaktion tasapaino asettuu kohtaan, jossa on muodostunut n. 51 pai-no-% fruktoosia lähtöaineena käytetystä puhtaasta dekst-5 roosista. Käytettäessä substraattina puhdistettua dekst-roosiliuosta (joka sisältää n. 6 paino-%:iin saakka ei-monosakkarideja) ja sallittaessa kohtuullinen viipymis-aika entsyymireaktorissa, mainittujen tekniikan tason menetelmillä voidaan saada fruktoosisiirappi, jonka suu-10 rin fruktoosipitoisuus on n. 48 - 52%. Enemmän fruktoosia sisältävien siirappien saamiseksi on käytettävä frak-tiointisysteemejä, jotka lisäävät tuntuvasti lopputuotteen kustannuksia. Korkeampi lämpötila siirtää kuitenkin tasapainon edullisemmaksi. Voitaisiin esim. käyttää läm-15 pötilassa n. 90 - 140°C toimivaa glukoosin isomerointi- prosessia, jossa suoraan voitaisiin saada paljon fruktoosia sisältäviä maissisiirappeja (high fructose corn syrups, HFCS), jotka sisältävät 53 - 60 paino-% fruktoosia ja tämä eliminoisi fraktioinnin ja uudelleenkierrätyksen 20 tarpeen. Tähän saakka ovat tunnettuihin glukoosi-isome- raasisysteemeihin liittyvä lämpödenaturoituminen ja tästä johtuva aktiivisuuden jyrkkä lasku olleet esteenä pyrkimyksille käyttää korkeampia lämpötiloja isomerointitasa-painon siirtämiseksi fruktoosin suuntaan.

25 Lisäksi glukoosi on äärimmäisen labiili sokeri, joka helposti hajoaa lukuisiksi ei-toivotuiksi sivutuotteiksi kuumennettaessa sen liuoksia korkeissa lämpötiloissa, jotka ovat tarpeen glukoosin muuttamiseksi 53 - 60 % risesti fruktoosiksi. Kuumennettaessa fruktoosiliuoksia 30 voimakkaasti tavallisimmin muodostuvat sivutuotteet ovat psikoosi, mannoosi, tagatoosi, fruktoosidianhydridit, orgaaniset hapot, värilliset tuotteet ja värien prekur-sorit.

Nyt on yllättäen havaittu, että suorittamalla glu-35 koosin isomerointiprosessi ottaen huomioon alla kuvatulla 3 79557 tavalla pH:n ja entsyymireaktorissa viipymisajan määrätyt kriittiseet rajoitukset voidaan tehokkaasti käyttää iso-merointilämpötilaa n. 93 - n. 102°C ja suoraan saada korkealaatuisia HFCS-sllrappeja sivutuotemuodostuksen pysyes-5 sä hyväksyttävänä, jotka sisältävät n. 53 - n. 60 paino-% fruktoosia. Tällä tavoin voidaan eliminoida kalliiden ja käytöltään monimutkaisten fraktiointl- ja uudelleenkier-rätysoperaatioiden tarve, jotka operaatiot ovat tarpeen tunnetuissa glukoosin isomerointiprosesseissa yllä maini-10 tun fruktoosipitoisuuden omaavien HFCS-siirappien saamiseksi .

Keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista, että glukoosipitoinen syöteliuos, joka sisältää n. 20 -n. 65 paino-% glukoosia, saatetaan kosketukseen glukoosi-15 isomeraasin kanssa, joka on eristetty mikro-organismeista Streptomyces rubigenosus tai Arthrobacter citreus, tai Maxazyma G1 lämpötilassa n. 93 - n. 102°C ja pH:ssa n. 6,5 -n. 7,On. lOs-n. 5h kosketusajaksi, jotta fruktoosin lopulliseksi pitoisuudeksi liuoksessa saadaan vähintään 20 n. 53 - n. 60 paino-% hiilihydraattien kokonaismäärästä laskettuna ilman olennaista psikoosin ja/tai muiden ei-fruktoosi-, ei-glukoosisokerien muodostusta.

Glukoosi-isomeraasin on oltava riittävän stabiili vastustamaan deaktivoitumista 90eC:ssa ja korkeammassa 25 lämpötilassa aikana, joka riittää isomerolnnin suorittamiseksi riittävän pitkälle.

Käsiteltävänä olevan keksinnön mukaisesti fruktoosiksi isomeroitava glukoosi voidaan saada mistä tahansa tämän sokerin tunnetuista lähteistä. Taloudellisista syis-30 tä glukoosi saadaan tavallisesti hydrolysoimalla selluloosaa tai tärkkelystä hapolla ja/tai entsyymillä, mieluiten jälkimmäisellä tavalla, tunnettujen menetelmien mukaan. Tällä tavoin saadut glukoosipitoiset liuokset sisältävät tyypillisesti pieniä määriä polysakkarideja, sokerioligo-35 meerejä jne. käytetystä hiilihydraattilähteestä ja hydro- 4 79557 lyysimenetelmästä riippuen. Viljat, kuten maissi, durra, vehnä, ruis ja vastaavat sekä tärkkelyspitoiset juurikasvit ja mukulakasvit kuten peruna, jamssi, porkkana, kas-sava (maniokki) ja vastaavat ovat erinomaisia tärkkelys-5 lähteitä muutettaviksi tämän keksinnön glukoosilähtö- aineiksi. Yhdysvalloissa maissitärkkelys on erityisen suositeltava verrattain halvan hintansa ja helposti saatavuutensa vuoksi. Koska elintarvikelaatuisen glukoosin tuotanto suosii tärkkelyksen entsymaattisia hydrolyysimenetel-10 miä, tällaiset menetelmät ovat tässä suositeltavia. Entsymaattisia hydrolyysimenetelmiä on kuvattu US-patenteissa 4 017 363, 3 912 590, 3 922 196, 3 922 197 - 201 ja 4 284 722, jotka julkistukset on liitetty tähän viitteinä.

Koska tämän keksinnön mukaan muodostunut fruktoosi 15 saadaan glukoosista, on eduksi maksimoida jokaisen isome-roinnissa käytetyn maissihydrolysaatin glukoosipitoisuus. Glukoosin tuottamiseksi ovat entsymaattiset menetelmät suositeltavia. Suositeltavimmat ovat menetelmät, joissa käytetään entsyymien kuten glukoamylaasin ja haaroitus-20 ta poistavan entsyymin yhdistelmää kuten on kuvattu GB-hakemusjulkaisussa 2 097 405A. Erityisen suositeltavia ovat entsyymiyhdistelmät, jotka pystyvät muuttamaan liuotetun tärkkelyksen samanaikaisesti glukoosiksi ja fruktoosiksi, esim. glukoamylaasin, pullulanaasin ja glukoosi-25 isomeraasin yhdistelmä kuten on kuvattu US-patentissa nro 4 111 750. Jälkimmäisellä menetelemällä saadaan isomeroi-tuja hydrolysaatteja, jotka sisältävät kuivapainosta laskettuna 48 % fruktoosia ja 50 % glukoosia ja jotka sopivat ihantellisesti tämän keksinnön mukaiseen jatkokonversioon 30 fruktoosipitoisuuden kohottamiseksi 53-60 %:iin. On myös mahdollista käyttää kalvomenetelmiä polysakkaridien poistamiseksi tärkkelyshydrolysaateista. Tällöin saadaan yli 99 % glukoosia sisältäviä fraktioita, jotka ovat tämän 5 79557 keksinnön ihanteellisia lähtöaineksia. Tämän keksinnön toteuttamisessa sopiviin raaka-aineisiin kuuluvat tietenkin myös glukoosiliuokset, jotka on saatu tärkkelyshydroly-saatteja kiteyttämällä.

5 Lähtöaineksina käytetyt glukoosi- ja/tai glukoosi- fruktoosiliuokset mieluiten puhdistetaan valmistuksensa jossakin vaiheessa ei-hiilihydraattiepäpuhtauksien glukoo-si-isomeraasille aiheuttamien haittavaikutuksien estämiseksi ja värinmuodostuksen minimoimiseksi tämän keksinnön 10 mukaisen korkealämpötilaisomeroinnin aikana. Puhdistamat-tomat tärkkelyshydrolysaatit voivat kuitenkin olla sopivia sillä edellytyksellä, että niiden valmistuksessa noudatetaan US-patentissa 4 376 824 esitettyjä periaatteita.

Käytettäessä liuosta, joka käsiteltävänä olevan me-15 netelmän substraattina sisältää pelkästään glukoosia, on haluttaessa myös mahdollista käyttää glukoosiliuosta, jossa osa glukoosista on jo isomeroitu fruktoosiksi. Esim. isomeroidun glukoosin liuosta, joka sisältää 52 %:iin saakka fruktoosia, voidaan käsitellä käsiteltävänä olevan 20 menetelmän mukaisesti fruktoosikonsentraation lisäämiseksi halutumpaan pitoisuuteen yli 52 % ja suositeltavaan pitoisuuteen 55-56 % ja ylikin tämän ajan.

Glukoosiliuokset, jotka sisältävät fruktoosia määränä alle 50 paino-% hiilihydraattia, voidaan valmistaa 25 tekniikan tason tuntemin menetelmin.

Apuna liiallisen värinmuodostuksen estämiseksi korkealämpötilaisomeroinnin aikana glukoosi-fruktoosisyöte-liuokseen voidaan lisätä bisulfiittia muodostavia aineita kuten on esitetty US-patentissa 3 623 953 (Re 28 885). On 30 suositeltavaa sulkea happi pois kaikista liuoksista, jotka saattavat joutua kosketukseen glukoosi-isomeraasin kanssa korkealämpötilaisomerointireaktion aikana entsyymin hapettumisen estämiseksi, joka voi johtaa deaktivoitumiseen.

Tämän keksinnön menetelmässä Streptomyces sp. ATCC

6 79557 21 175 on erinomainen glukoosi-isomeraasilähde.

Koska mlkro-organlsmlt muodostavat glukoosi-isome-raasla solunsisäisesti, glukoosl-lsomeraasllähde saadaan yksinkertaisesti ottamalla solut talteen ja erottamalla 5 entsyymi soluista tekniikan tason tuntemin menetelmin esim. hajottamalla solut sonikaatiolla. Entsyymejä voidaan käyttää tunnetussa, tavanomaista rakennetta olevassa ent-syymireaktorissa. Saantolähteistään riippumatta tässä käytetty glukoosi-isomeraasi mieluiten immobilisoidaan iner-10 tille substraatille tunnettujen ja tavanomaisten menetelmien avulla. Entsyymien immobilisoinnissa käytetyt ainekset ja menettelyt ovat tunnettuja ja niitä on kuvattu useissa julkaisuissa, mm. Wang et ai., Fermentation & Enzyme Technology, John Wiley & Sons, Inc., New York 15 (1979), s. 318-388 ja Kirk-Othmer, Encyklopedia of

Chemical Technology, 3rd Ed., John Wiley & Sons, Inc., New York (1980), Voi. 9. 148-172, jotka julkaisut on liitetty tähän viitteinä. Pidetään myös suotavana, että mukana on pieniä määriä kobolttikationeja ja/tai rikkihapokkeen ve-20 siliukoista suolaa kuten natriumsulfiittia, natriumbisul-fiittia, magnesiumsulfiittla ja/tai magnesiumbisulfiittia kuten on esitetty US-patentissa Re 28 885 vähentämään tai estämään glukoosi-isomeraasin denaturoituminen prosessin käytön aikana.

25 Haluttujen tulosten saavuttamiseksi on toivottavaa, että glukoosipitoisen syöteliuoksen hiilihydraattipitoi-suus on alueella n. 20 - n. 65, mieluiten n. 40 - n. 65 paino-%.

Isomerointi suoritetaan pH-alueella n. 6,5 - n. 7. 30 Jos isomerointi suoritetaan huomattavasti yllä mainitun pH-alueen ala- tai yläpuolella, syntyy suuria määriä ei-toivottuja sivutuotteita kuten psikoosia, orgaanisia happoja, värillisiä tuotteita, värien prekursoreita, fruktoo-sidianhydridejä ja vastaavia.

7 79557

On havaittu, että glukoosi-isomeraasin optimiaktii-visuuden edellyttämä pH on selvästi pienempi korkeissa lämpötiloissa. Niinpä esim. Streptomyces rubigenosuksesta saadun glukoosi-isomeraasin aktiivisuus saavuttaa optimi-5 arvon pH:ssa 8,6-9,2 25°C:ssa, pH:ssa 6,8-7,5 75eC:ssa ja pH:ssa 5,6-6,2 125°C:ssa. Niinpä kun isomerointilämpötilaa kohotetaan, on isomeroinnin pH-arvoa piennettävä maksimaalisen entsyymiaktiivisuuden ylläpitämiseksi ja lisäksi ei-toivottujen sivutuotteiden muodostumisen estämiseksi.

10 Käsiteltävänä olevassa menetelmässä kontaktiaika rajoitetaan mieluiten aikaan, joka tarvitaan lopullisen konsentraation saavuttamiseksi, joka on vähintään n. 53 n. 60 paino-% fruktoosia laskettuna reaktioseoksessa olevien hiilihydraattien kokonaismäärästä. Koska glukoosipi-15 toinen syöteliuos voi olennaisesti muodostua pelkästään glukoosista ts. siinä on hyvin vähän tai ei lainkaan fruktoosia tai glukoosista ja fruktoosista määrään n. 52 % saakka, reaktioajat vaihtelevat syöteliuoksen luonteesta riippuen. Niinpä kontaktiaika niinkin lyhyestä kuin kym-20 menestä sekunnista viiteen tuntiin saattaa osoittautua tehokkaaksi. Tavallisesti suositeltava aika on n. kahdesta minuutista n. 30 minuuttiin.

Glukoosi-isomeraasin ja glukoosipitoisen liuoksen välinen suositeltava kontaktiaika riippuu suureksi osaksi 25 lsomerointireaktion pH-arvosta. pH-alueen alapäässä voidaan sallia pidempiä aikoja ilman glukoosin ja fruktoosin haitallista hajoamista psikoosiksi ja muiksi ei-toivotuik-si hajoamistuotteiksi. Alueen yläpäässä lyhyempi kontaktiaika on välttämätön psikoosin ja värin muodostumisen 30 estämiseksi. Käytännössä kokonaisaika, jona glukoosipitoi-nen siirappi on lopullisessa reaktiolämpötilassa tai lähellä sitä, voidaan pitää tehokkaana kontaktiaikana, koska tapahtuvat sokerin hajoamisreaktiot ovat ei-entsymaattisia ja reaktiot tapahtuvat riippumatta siitä, onko liuos kos-35 ketuksessa glukoosi-isomeraasin kanssa vaiko ei. Suoritet- 8 79557 taessa isomerointeja lämpötilassa yli 90°C on siis tärkeää minimoida aika, joka tarvitaan glukoosiliuoksen saattamiseksi haluttuun isomerointilämpötilaan (esim. sekoittamalla liuokseen höyryä juuri ennen kontaktia isomeraasin 5 kanssa tai kontaktin aikana) ja, kun haluttu fruktoosipi-toisuus on saavutettu, nopeasti tämän jälkeen erottaa liuos mahdollisesti jäljellä olevasta isomeraasista ja sitten mahdollisimman nopeasti jäähdyttää liuos alle 90eC ja mieluiten alle 70°C. Käytettäessä glukoosi-isomeraasin 10 liukoista muotoa on välttämätöntä deaktivoida tämä (esim. alentamalla pH alueelle, jossa isomeraasi deaktivoituu) ennen jäähdytysvaihetta estämään korkealämpötilaisomeroin-tivaiheessa muodostuneen fruktoosin muuttuminen takaisin glukoosiksi, koska isomerointireaktio on tietenkin rever-15 siibeli.

Glukoosin ja fruktoosin termodynaaminen tasapaino määrää glukoosin saavutettavissa olevan maksimikonversio-asteen fruktoosiksi ja tämä tasapaino puolestaan riippuu isomerointilämpötilasta. Glukoosin ja fruktoosin tasapai-20 noseosten erittäin huolellinen analyysi on osoittanut seu-raavan riippuvuussuhteen: F - 100 K/(K+1) (1) 25

In K = + 2,3005 (2) 30 jolloin F on fruktoosin prosentuaalinen osuus tasapainotilassa glukoosin ja fruktoosin kokonaispainosta, T on iso-merointilämpötila (°C) ja K on glukoosin ja fruktoosin välinen tasapainovakio.

9 79557

Glukoosipitoisen siirapin ja isomeraasin todellinen kontaktiaika reaktorissa voidaan yleisesti määrittää seu-raavan kaavan avulla, kun käytetään immobilisoitua isome-raasimuotoa sisältävää reaktoria.

5 CV In Fe ~ Fo

F - F

e 10 t = _ (3)

kA

jossa t » todellinen kontaktiaika 15 C - glukoosin ja fruktoosin konsentraatio V - liuoksen vapaa tilavuus pakatussa kerroksessa (kerroksen tilavuus miinus immobilisoitujen entsyymi hiukkasten tilavuus)

Fe - fruktoosin osuus glukoosi-fruktoosiseoksesta 20 tasapainotilassa isomerointilämpötilassa

Fo - fruktoosin osuus (G+F:stä laskettuna) pakattuun kerrokseen tulokohdassa F - fruktoosin osuus (G+F:stä laskettuna) pakatusta kerroksesta poistuvassa liuoksessa 25 k * isomerointiin rekationopesuvakio isomerointiolosuh-telssa A - isomeraasin aktiivisuus pakatussa kerroksessa 30

Alla esitettyjen esimerkkien mukaan valmistetun im-mobilisoidun isomeraasin k-arvot ovat n. 0,07 - n. 5 g h'1 IGIU'1 lämpötilojen ollessa vastaavasti 90eC ja 140eC. Tämä riippuvuussuhde osoittaa, että käytettäessä 10 79557 pakattuja, suuren aktiivisuuden tilavuusyksikköä kohti omaavia kerroksia on kontaktiaika minimoitava korkeassa lämpötilassa. Seuraavien esimerkkien menetelmien mukaan valmistetut pakatut kerrokset voivat sisältää jopa 2000 5 IGIU/ml, jolloin voidaan saavuttaa tasapainotilassa 99,5 %:n fruktoosipitoisuus vähemmässä kuin yhdessä minuutissa korkealämpötilareaktorissa, kun käytetään vaiheistettuja, eri lämpötiloissa toimivia reaktoreita ja syöte ensimmäiseen reaktoriin isomeroidaan matalassa lämpötilas-10 sa ennen isomerointia korkeassa lämpötilassa toisessa reaktorissa. Käytettäessä vaiheistettua reaktorisysteemiä on suositeltavaa käyttää menetelmää glukoosin muuttamiseksi entsymaattisesti fruktoosiksi, jolloin saatetaan glu-koosipitoinen syöteliuos, joka sisältää n. 20 - n. 65 pai-15 no-% glukoosia, kosketukseen glukoosi-isomeraasin kanssa lämpötilassa n. 20 - n. 80eC, pHrssa n. 6,0 - n. 9,0 ja kontaktiaikana n. 0,5 - n. 2 tuntia fruktoosipitoisuuden saavuttamiseksi, joka on n. 52 paino-%:iin saakka laskettuna mainitussa liuoksessa olevien hiilihydraattien koko-20 naispainosta, kohotetaan isomerointiväliaineen lämpötila n. 93°C - n. 102°C:seen, säädetään isomerointiväliaineen pH tarpeen mukaan alueelle n. 6,5 - n. 7,0, saatetaan fruktoosipitoinen liuos kosketukseen glukoosi-isomeraasin kanssa vielä ajaksi, n. kymmenestä sekunnista n. viiteen 25 tuntiin konversioasteen nostamiseksi n. 53 - n. 60 pai-no-%:iin laskettuna glukoosipitoisessa syöteliuoksessa alkuaan olevasta glukoosista ilman psikoosin tai muiden ei-fruktoosi-, ei-glukoosisokereiden olennaista muodostumista. Näin ollen erittäin tehokkaiden pakattujen kerros-30 ten käyttö voi johtaa hyvin lyhyihin tehollisiin kontak-tiaikoihin, mikä puolestaan vähentää fruktoosin hajoamista, mitä tapahtuu tämän keksinnön vaatimissa korkeissa lämpötiloissa.

11 79557

Glukoosi-isomeraasin immobilisointitekniikoista suositeltavia ovat sellaiset, joissa muodostuu pieniä, olennaisesti kokoonpuristumattomia, huokoisia katalyyt-tihiukkasia, mikä minimoi diffuusiovaikutukset, jotka 5 hidastavat isomerointinopeutta. Vaihtoehtoisesti isome- raasi voidaan immobilisoida kalvossa oleviin huokosiin ja pakottaa glukoosiliuos virtaamaan kalvon läpi korkea-lämpötilaisomeroinnin aikana. Tämä aikaansaa hyvän kosketuksen entsyymin ja substraatin välillä ja minimoi 10 diffuusion aiheuttamia rajoituksia. Immobilisoinnissa käytetty kantaja on mieluiten täysin liukenematon ja inertti substraattiliuosten glukoosi-fruktoosikomponent-tien haitallisen kontaminoitumisen tai hajoamisen estämiseksi .

15 Mutta kaupallisessa käytössä fruktoosipitoisia siirappeja ei valmisteta puhtaasta glukoosista. Sen sijaan käytetään glukoosilähteenä tärkkelyshydrolysaatt.eja (jotka valmistetaan yllä mainittujen viitteiden mukaan), jotka poikkeuksetta sisältävät ei-glukoosi- ja ei-fruk-20 toosisakkarideja (joita jatkossa kutsutaan polysakkari deiksi) , jotka johtuvat tärkkelyksen epätäydellisestä hydrolyysistä ja glukoosin reversiosta. Näiden osuus on tyypillisesti 3 - 8 % kokonaiskuivapainosta, kun sakka-ridit saadaan tärkkelystä hydrolysoimalla. Niinpä on 25 välttämätöntä isomerointilämpötilaa määritettäessä ottaa huomioon glukoosiliuoksessa mahdollisesti olevat polysakkaridit ja muutkin tekijät kuten saavutettava fruktoosipi toisuus kokonaiskuivapainosta laskettuna ja glu-koosiliuoksen ja isomeraasin tehollisena kontaktialka-30 na muodostuva psikoosi ja muut ei-glukoosi- ja ei-fruk-toosituotteet. Seuraavassa on esitetty riippuvuussuhteet isomerointilämpötilan laskemiseksi.

T = —--273 (4)

35 2,3005-lnK

12 79557 _ f K “ 100-F (5) „ _ 10 000 (M+C) (6) 5 Q(100-P) T = isomerointilämpötila (°C) F = fruktoosipitoisuus tasapainotilassa (prosentteina glukoosin ja fruktoosin kokonaismäärästä) lämpötilassa T 10 M = isomeroidussa tuotteessa haluttu fruktoosin prosent- tipitoisuus kuivapainosta laskettuna C = tehollisena isomerointikontaktiaikana muodostuneen psikoosin ja muiden hajoamistuotteiden prosenttiosuus Q = isomerointireaktiossa saavutettu tasapaino prosent-15 teinä P = glukoosiliuoksen prosentuaalinen polysakkaridipatoi-suus

Tyypillisesti muodostuu vähemmän kuin 1 % ja mieluiten vähemmän kuin 0,5 % psikoosia ja muita hajoamis-20 tuotteita ja voidaan saavuttaa tasapaino 99,5 %. Niinpä siirappien valmistamiseksi, jotka sisältävät 55,5 % fruktoosia (kuivapainosta), alla olevassa taulukossa mainitut glukoosiliuosten polysakkaridipitoisuudet edellyttävät seuraavia lämpötiloja: 25 Polysakkarideja glukoosiliuok- Isomerointilämpötila sessa (% kuivapainosta)_ _(°C)_ 0 95,7 1 99,1 2 104,3 30 3 108,9 4 113,8 6 124,3 8 136,1

Hyväksyttävä kauppatuote sisältää keskimäärin 35 55,5 % fruktoosia kuivapainosta. Tämä johtuu siitä, että J3 79557 tällä fruktoosipitoisuudella paljon fruktoosia sisältävä maissisiirappi (HFCS) on yhtä makeaa kuin sakkaroosi kuivapainosta laskettuna. Lisäksi HFCS, joka sisältää 55,5 % fruktoosia, on vakiintunut kauppatuote, jota vaih-5 toehtoisesti käytetään monissa elintarvikkeissa ja erityisesti hiilihapotetuissa virvoitusjuomissa korvaamaan sakkaroosi kokonaan tai osittain. Tämän tyyppisen HFCS:n kulutuksen oletetaan olevan Yhdysvalloissa 1,3 miljardia kiloa 1982 ja kulutuksen kasvavan 1,8 miljardiin kiloon 10 1983. Koska HFCS:n jakelu, varastointi, annostelu ja for mulointi elintarvikkeisiin on pakostakin monimutkaista, on yleisesti olemassa tarve tasalaatuistaa eri valmistajien HFCS-tuotteet siten, jotta eri lähteistä saatavia tuotteita voitaisiin käyttää vaihtoehtoisesti ja saman-15 aikaisesti. Niinpä HFCS:n valmistukseen liittyvässä tekniikassa fruktoosipitoisuudesta 55 - 56 % kuivapainosta on tullut merkitsevän tärkeä kohde, johon pyritään.

Käsiteltävänä olevassa menetelmässä saavutetaan fruktoosipitoisuus vähintään 53 %, mieluummin vähintään 20 54 % ja mieluiten vähintään 55 %.

Tämän menetelmän tuote tunnetaan myös siitä, että sen väri on hyväksyttävissä rajoissa. Tämä on tietenkin erittäin toivottavaa puhdistuskustannuksia pienentävänä tekijänä. Tavallisesti värin kasvu on pienempi kuin n.

25 55 (CIRF 100), mieluummin pienempi kuin 20 ja mieluiten pienempi kuin 10.

Ottamalla huomioon yllä mainitut pH-arvoon ja kon-taktiaikaan liittyvät vaatimukset tunnetut glukoosin isomerointiprosessit voidaan sopivasti adaptoida toimi-30 maan lämpötilassa n. 93 - 102°C, ja muodostamaan tämän keksinnön runsaasti glukoosia ja fruktoosia sisältäviä siirappeja.

Seuraavat esimerkit luovat lisävalaistusta tämän keksinnön menetelmään.

1« 79557

Esimerkki 1 Tässä esimerkissä demonstroidaan glukoosin suoraa isomerointia korkeassa lämpötilassa seoksen saamiseksi, joka sisälsi 55,5 % fruktoosia kuivapainosta laskettuna 5 käyttämällä kaksivaiheista isomerointisysteemiä.

Liukoinen glukoosi-isomeraasi valmistettiin US-patentissa 3 788 945 kuvatun menetelmän avulla.

Streptomyces rubigenosus ATCC 21 175:stä johdettua rubigenosus-lajia viljeltiin pinnanalaisena aerobi-10 sena fermentointina elatusalustalla, jonka koostumus oli:

Paino-% dekstroos ia 9,0 maissin liotusvettä (kiintoainesta) 1,6 diammoniumfosfaattia 0,08 15 mangaanisulfaattia 0,06 vaahdonestoainetta 0,003

Elatusalusta steriloitiin 121°C:ssa 45 minuuttia, jäähdytettiin ja pH säädettiin arvoon 6,8 - 7,0. Alusta siirrostettiin 14 tilavuus-%:illa siirrosta, jona oli siir-20 rosfermenttorin sisältö, joka oli valmistettu yllä mainitun S. rubigenosus-variantin avulla. Fermentointi suoritettiin aseptisissa olosuhteissa 30°C:ssa n. 60 tuntia ilmastaen 0,65 vvm. Siirrostuksesa ja isomeraasin tuottamisessa voidaan myös käyttää S. rubigenosus ATCC 21 175:tä, 25 jolloin elatusalustan koostumus on seuraava:

Paino-% dekstroosia 0,24 maissin liotusvettä (kiintoainesta) 1,5 sorbitolia 1,6 30 CoCl2:ta 0,02 diammoniumfosfaattia 0,56 ksyloosia 1,0

Glukoosi-isomeraasi uutettiin S. rubigenosuksesta lisäämällä 0,35 % Maquat MC 1 412:ta (Mason Chemical Co) ja 35 10 ppm kananmunalysotsyymiä ja ravistelemalla viisi tuntia li is 79557 40°C:ssa pHrssa 6,3 - 6,6. Sitten seos suodatettiin ja saatiin epäpuhtaan, puhdistamattoman glukoosi-isomeraasin liuos.

Epäpuhdas isomeraasi puhdistettiin adsorboimalla 5 se DEAE-selluloosaan (valmistettu US-patentin nro 3 823 133 mukaan), suodattamalla ja pesemällä adsorboitunut tuote 0,1-m NaCl-liuoksella epäpuhtauksien poistamiseksi ja desorboimalla sitten saattamalla kosketukseen 0,45-m NaCl-liuoksen kanssa. Puhdistusvaiheiden aikana 10 kaikkien liuosten pH pidettiin arvossa 7,5. Sekoitettiin näin saadun osittain puhdistetun isomeraasin liuosta ja 3 tilavuutta 95 %:ista etanolia 0°C:ssa isomeraasin saos-tamiseksi. Lisättiin Perlite-suodatusapuainetta, kiintoaines poistettiin suodattamalla, kuivattiin ilmassa ja 15 saatiin liukoinen isomeraasipreparaatti, joka sisälsi 2 500 IGIU/g. Isomeraasipreparaatin ominaisaktiivisuus oli 40 IGIU/mg proteiinia.

Matalassa lämpötilassa (70°C) toimiva reaktori preparoitiin pakkaamalla isomeraasia, joka oli valmistettu 20 US-patentin 3 788 945 mukaan, halkaisijaltaan 2,54 cm (1") olevaan lasikolonniin 5 cm pitkäksi kerrokseksi, jonka aktiivisuus oli 20 000 IGIUrta. Pakatun kerroksen päällä olevassa tilassa oli lämpömittari ja lasihelmiä kuol-luttilavuuden saamiseksi mahdollisimman pieneksi. Kolonni 25 oli varustettu syötöllä ja poistolla ja vaipalla veden kierrättämiseksi termostaatista.

Korkealämpötilareaktori (93°C) preparoitiin samalla tavoin käyttäen immobilisoitua isomeraasia, joka saatiin adsorboimalla yllä kuvattu puhdistettu isomeraasi DEAE-30 selluloosaan. Pakattu kerros sisälsi 97 000 IGIU:ta ja sen pituus oli 15 cm.

Liukoisen isomeraasivalmisteen aktiivisuus määritettiin Lloyd et ai., Cereal Chemistry, 49, nro 5, s. 544 -553 (1972) kuvaamalla tavalla. Yksi IGIU on isomeraasimää-35 rä, joka minuutissa muuttaa 1 mikromoolin glukoosia fruktoosiksi liuoksessa, jossa on 2 mol/1 glukoosia, 0,02 mol/1 16 79557

CoC^pHjssa 6,85 (0,2-m natriummaleaatti) lämpötilassa 60°C määritettynä yllä mainitun menetelmän avulla.

Glukoosipitoinen liuos valmistettiin liuottamalla glukoosia (Clintose A granulation, Clinton Corn Processing 5 Co.) deionisoituun veteen ja saatiin liuos, joka sisälsi 48 paino-% kuiva-ainetta. Aktivointi- ja stabilointiaineet liuotettiin glukoosiliuokseen ja saatiin liuos, jossa oli 25 millimoolia natriummetabisulfiittia, 5 milli-moolia magnesiumsulfaattia ja 0,1 millimoolia koboltti-10 kloridia. Liuoksen pH säädetiin arvoon 6,8 natriumhydrok-sidilla.

Ensimmäinen eli matalalämpötilaisomerointi suoritettiin 70°C:ssa pumppaamalla yllä kuvattu glukoosiliuos matalalämpötilareaktorin läpi virtausnopeudella 3,7 ml/min. 15 Reaktorista ensimmäiseksi poistuvat 2 500 ml liuosta hy lättiin ja tämän jälkeen reaktorista tuleva poistovirtaus otettiin talteen käytettäväksi toisessa eli korkealämpö-tilaisomeroinnissa. Korkealämpötilaisomeroinnissa liuos, joka saatiin isomeroimalla 70°C:ssa, pumpattiin yllä kuva-20 tulla tavalla preparoidun korkealämpötilareaktorin läpi virtausnopeudella 5 ml/min ylläpitäen reaktorin lämpötila 93°C:ssa. Liuoksen ja immobilisoidun entsyymin kontakti-aika korkealämpötilareaktorissa oli n. 12 minuuttia. Liuoksen kokonaisviipymisaika reaktorissa 93°C:ssa oli n. 18 25 minuuttia. Liuos jäähdytettiin jäähauteessa välittömästi korkealämpötilareaktorista poistumisensa jälkeen ja pH säädettiin arvoon 4,0. Ensimmäisen tunnin poistovirtaus korkealämpötilareaktorista hylättiin.

70°C:ssa ja 93°C:ssa toimivista reaktoreista saa-30 duista isomeroiduista glukoosiliuoksista analysoitiin hiilihydraattikoostumus ja väri ja tuloksia verrattiin taulukosta 1 ilmenevällä tavalla isomeroimattoman glu-koosiliuoksen vastaaviin analyysituloksiin.

17 79557

Taulukko 1 70°C:ssa ja 93°C:ssa isomeroitujen glukoosiliuos-ten koostumus:

Hiilihydraattikoostumus Väri

5 (paino-% tuhkattcmasta kuiva-aineesta) (CIRF

Tjuoksen käsittely Fruktoosi Glukoosi Psikoosi Polysakkar. xlQQ) isomeroimaton 0 99,6 0 0,4 0,6 iscmeroitu 70°C:ssa 52,3 47,3 0,1 0,4 2,1 isaneroitu 93°C:ssa 55,5 43.7 0,4 0.4 4,8 10 Tulokset osoittavat, että saatiin 55,5 % fruktoosia kuivapainosta ja psikoosipitoisuus jäi alle 0,5 % kuivapainosta. Värin kasvu oli pienempi kuin 5 (CIRFxlOO).

Hiilihydraattipitoisuus määritettiin menetelmän E-61 ja väri menetelmän F-14 mukaan, Standard Analytical 15 Methods of the Member Companies of the Corn Refiners Association, Corn Refiners Association, Inc., 1001 Connecticut Avenue, Washington, D.C., 20 036. Menetelmällä F-14 saadut väriarvot kerrottiin sadalla ja merkittiin (CIRFxlOO).

Esimerkki 2 20 Tämä esimerkki valaisee fruktoosipitoisen tuotteen valmistusta, joka sisälsi 55,2 % fruktoosia ja joka valmistettiin glukoosipitoisesta, pääasiassa puhdistetusta maissi-tärkkelyshydrolysaatista muodostuvasta liuoksesta.

Hydrolysaatti valmistettiin maissitärkkelyksestä 25 US-patentissa 3 644 126 (liuotus) ja US-patentissa 3 280 006 (sokerointi) kuvattujen menetelmien avulla. Sokeroitu liuos puhdistettiin US-patentin 3 834 940 mukaan ja saatiin tuote, joka sisälsi 95,3 % glukoosia kuivapainosta laskettuna koko-naiskuiva-ainepitoisuuden ollessa 50 %. Lisättiin niin pal-30 jon kiteistä glukoosia, että kokonaisglukoosipitoisuudeksi tuli 97,1 % kuivapainosta lasekettuna. Tästä valmistettiin liuos, jonka koostumus oli: kokonaiskuiva-ainepitoisuus (%) 42,4 glukoosia (% kuivapainosta) 97,1 35 fruktoosia (% kuivapainosta) 0,1 IS 79557 polysakkarideja (% kuivapainosta) 2,8 psikoosia (% kuivapainosta) 0,0

NaNSOj (millimoolia) 50,0

MgSO^ (millimoolia) 5,0 5 C0CI2 (millimoolia) 0,1 pH 6,8

Preparoitiin esimerkissä 1 kuvatulla tavalla korkea-lämpötilareaktori, joka sisälsi 147 500 IGIU:ta 16,5 cm pitkässä kerroksessa. Lämpötila pidettiin vakiona 97,4°C:ssa. 10 Yllä kuvattu liuos pumpattiin pakatun kerroksen läpi virtausnopeudella 2,2 ml/min. Ensimmäiseksi reaktorista tulevat 50 ml hylättiin ja tämän jälkeen kolonnista poistuvasta virtauksesta otettiin näytteitä analyysiä varten. Tulokset verrattuina isomeroimattoman glukoosiliuoksen koostu-15 mukseen ilmenevät alla.

Taulukko 2 97,4°C:ssa isomeroitujen glukoosiliuosten koostumus

Hiilihydraattikoostimus Väri

(paino-% tuhkattcmasta kuiva-aineesta) (CIRF

20 Liuosten käsittely Fruktoosi Glukoosi Psikoosi Polysakkar. xlQQ_ isaneroimaton 0,1 97,1 0 2,8 0,6 isomeroitu 97,4°C:ssa 55,2 42,4 0,2 2,2 12,4

Tulokset osoittavat, että saatiin yli 55 % fruktoo-25 siä ja että psikoosia muodostui vain 0,2 %. Suurempi värin-muodostus tässä esimerkissä johtui siitä, että isomerointi suoritettiin kokonaisuudessaan korkeassa lämpötilassa (97,4°C) vastakohtana esimerkin 1 kaksivaiheiselle menetelmälle, jossa fruktoosi muodostui suurimmaksi osaksi matalam-30 massa lämpötilassa (ts. 70°C:ssa), ja tämä värinmuodostus olisi voitu välttää käyttämällä kaksivaiheista reaktoria. Värinmuodostus oli kuitenkin alle 13 (CIRFxlOO).

Esimerkki 3 Tässä esimerkissä demonstroidaan fruktoosipitoisen 35 tuotteen valmistusta, joka sisälsi 55,3 % fruktoosia kuiva-painosta laskettuna, glukoosipitoisesta liuoksesta, joka i9 79557 muodostui puhdistetusta maissitärkkelyshydrolysaatista plus kiteisestä glukoosista, kaksivaiheisen isomerointi-systeemin avulla, jonka toisessa vaiheessa käytettiin kaupallista immobilisoitua glukoosi-isomeraasia.

5 Liukoinen glukoosi-isomeraasl ensimmäisen vaiheen reaktoria varten valmistettiin ja puhdistettiin esimerkissä 1 kuvatun menetelmän avulla. Tämän preparaatin ominais-aktiivisuus oli 40,9 IGIU/mg proteiinia. Tästä entsyymistä immobilisoitiin kaikkiaan 25 000 IGIUsta adsorboimalla 10 Whatman DE-23 DEAE-selluloosaan. Tällä immobilisoidulla entsyymillä preparoitiin 70°C:n reaktori halkaisijaltaan 2,54 cm (1") olevassa vaipoitetussa lasikolonnissa kuten esimerkissä 1 on kuvattu. Kerroksen pituus oli 13 cm.

Reaktorissa tarvittava substraatti valmistettiin 15 pääasiassa kuten esimerkissä 2 on kuvattu ja sen koostumus oli: kokonaiskuiva-ainepitoisuus (%) 50,2 glukoosia (% kuivapainosta) 97,6 fruktoosia (% kuivapainosta) 0,0 20 polysakkarideja (% kuivapainosta) 2,4 psikoosia 0,0

NaHSO.j (millimoolia) 50,0

MgSO^ (millimoolia) 5,0 C0CI2 (millimoolia) 0,1 25 pH 6,8

Matalalämpötilaisomerointi 70°C:ssa suoritettiin pumppaamalla yllä kuvattu substraatti matalalämpötilareak-torin läpi virtausnopeudella 3,2 ml/min. Ensimmäiseksi reaktorista tulevat 1 000 ml hylättiin. Tämän jälkeinen 30 poistovirtaus otettiin talteen käytettäväksi toisessa eli korkealämpötilaisomeroinnissa.

Korkealämpötilareaktorin preparoimiseksi käytetty entsyymi oli kaupallinen immobilisoitu isomeraasi, valmistaja Enzyme Development Corporation. Tämä entsyymi, Maxa-35 zyme® GI immob., erä K-12 467, jauhettiin ensin huhmaressa hiukkasten pienentämiseksi. Sitten jauhettu entsyymi seu- 20 79557 lottiin 20 meshin vakioseulan läpi ja seulalle 60 meshiä jäänyt osa suspendoitiin substraattiin ja ilma poistettiin laboratoriovakuumissa 60°C:ssa 60 minuuttia. Suspensiolla, josta ilma oli poistettu, preparoitiin kerros 5 1,5 x 39 cm vaipoitetussa lasikolonnissa. Pakattu kerros sisälsi 5 200 IGIUrta.

Ensimmäisen vaiheen eli 70°C:n isomeroinnissa valmistetun substraatin pH säädettiin arvoon 6,5 ja laimennettiin kuiva-ainepitoisuuteen 42,6 %. Sitten tämä subst-10 raatti pumpattiin kolonnin läpi virtausnopeudella 6 ml/min lämpötilassa 60°C 30 minuuttia. Lämpötilaa kolonnissa tarkkailtiin välittömästi kerroksen yläpuolella olevalla lämpömittarilla, jonka ympärillä oli 0,5 mm lasihelmiä kuolluttilavuuden pitämiseksi mahdollisimman pienenä.

15 Sitten kolonnin lämpötila nostettiin nopeasti kierrättämällä vaipan kautta vettä termostaatista, jonka lämpötila oli 97,8°C. Kun kolonnin lämpötila oli saavuttanut 97°C, substraatin virtausnopeus pienennettiin arvoon 2,0 ml/min. Tällä virtausnopeudella substraatin ja immobilisoidun 20 entsyymin kontaktiaika oli n. 22 minuuttia ja liuoksen kokonaisviipymisaika reaktorissa 97°C:ssa oli n. 35 minuuttia .

Poistovirtausta kolonnista tarkkailtiin rekisteröivällä polarimetrillä, joka oli kalibroitu alueelle 50 -25 58 % fruktoosia. Kun poistovirtauksen fruktoosipitoisuus oli saavuttanut halutun tason, poistovirtaus otettiin talteen ja jäähdytettiin välittömästi jäähauteessa. pH säädettiin arvoon 4,0 lisäämällä 1-m sitruunahappoa. Poisto-virtaus otettiin talteen, kunnes polarimetrin osoittama 30 fruktoosipitoisuus laski alle 55 %.

70°C:ssa ja 97°C:ssa toimivista reaktoreista saaduista isomeroiduista liuoksista analysoitiin hiilihyd-raattikoostumus ja väri ja tuloksia verrattiin seuraavas-ta taulukosta ilmenevällä tavalla isomeroimattoman subst-35 raattiliuoksen vastaaviin analyysituloksiin.

21 79557

Taulukko 3 o o 70 C:ssa ja 97 C:ssa isomeroitujen substraattiliuos-ten koostumus

Hiilihydraattlkoostxrnus Väri 5 (paino-% tuhkattomasta kuiva-aineesta) (CIKFxlOO)

Liuoksen käsittely Fruktoosi Glukoosi Psikoosi Polysakkar. _ i9omeroimaton 0 97,6 0 2,4 0,5 isaneroitu 51,3 46,4 0 2,3 0,7 isomeroitu 97°C:ssa 55,3 41,8 0,3 2,6 35,2 10 Tulokset osoittavat, että saatiin 55,3 % fruktoosia kuivapainosta ja psikoosipitoisuus jäi alle 0,4 % kuiva-painosta.

Esimerkki 4 Tässä esimerkissä demonstroidaan glukoosin suoraa 15 isomerointia korkeassa lämpötilassa seoksen saamiseksi, jossa oli 55,8 % fruktoosia, jolloin toisen vaiheen iso-merointi suoritettiin Arthrobacter sp:n muodostamalla im-mobilisoidulla isomeraasilla.

Arthrobacter citreus-kantaa viljeltiin pinnanalai-20 sena aerobisena fermentointina elatusalustalla, jonka koostumus oli:

Paino-% ksyloosia 1,5 BHI:ta (aivo-sydäninfuusioelatusalustaa) 4,2 25 hiivauutetta 0,1 natriumkloridia 0,2 kaseiiniaminohappoa 0,5 magnesiumsulfaattia 0,024 pH 6,9-7,2 30 Fermentointi suoritettiin aseptisissa olosuhteissa 30°C, 44 tuntia. Solumassa otettiin talteen sentrifugoi-malla, pestiin 0,85 %:isella natriumkloridiliuoksella ja sentrifugoitiin uudelleen. Saatiin 76 g solumassaa, jonka kokonaisisomeraasiaktiivisuus oli 10 260 IGIU:ta. Glukoosi-35 isomeraasi uutettiin 45 g:sta solumassaa suspendoimalla 22 79557 solut 250 mlraan vettä, jossa oli 900 mg kananmunalysot-syymiä ja 250 mg kuivapainosta laskettuna pinta-aktiivista ainetta BTC-835 (Onyx Chemical Co.), pH säädettiin arvoon 7,0 ja inkuboitiin 16 tuntia 45°C:ssa. Sitten sus-5 pensio sentrifugoitiin ja supernatanttineste pantiin syrjään. Liukenematon aines suspendoitiin uudelleen 200 ml saan 0,1 %:ista Triton X-100®:taa (Sigma Chemical Co.), pH 7,0, ja inkuboitiin 8 tuntia 45°C:ssa. Tämä suspensio sentrifugoitiin ja supernatanttineste ja ensimmäi-10 sestä sentrifugoinnista saatu supernatanttineste yhdis tettiin.

Yhdistetyt uutteet konsentroitiin ja puhdistettiin ultrasuodattamalla Amicon 401:llä, jossa oli sekoitettava kenno ja kalvo YM-30 (Amicon Corporation). Retentaatti 15 läpisuodatettiin kahden viisinkertaisen tilavuusannoksen kera 0,2 mmol CoC^-» 1 mmol MgSO^-liuosta pHsssa 7,0. Ultrasentrifugoinnin jälkeen saatu lopullinen retentaatti sisälsi kaikkiaan 3115 IGIUsta. Tällä entsyymillä preparoitiin immobilisoitu isomeraasi adsorboimalla DEAE-20 selluloosaan US-patentin 3 788 945 mukaan. Liuokseen lisättiin kaikkiaan 4,0 g Whatman DE-23:a, pH säädettiin arvoon 7,0 ja suspensiota sekoitettiin 60 minuuttia huoneenlämpötilassa. Muodostunut liukenematon entsyymi otettiin talteen suodattamalla ja pestiin vedellä. Osa pestys-25 tä immobilisoidusta entsyymistä suspendoitiin substraattiin, ilma poistettiin 60 minuutin ajan 60°C:ssa ja entsyymillä preparoitiin kerros 1,5 x 13 cm korkealämpötilareak-torissa.

Reaktoriin syötettävä substraatti valmistettiin 30 olennaisesti esimerkissä 1 kuvatulla tavalla ensimmäisen vaiheen eli 70°C:n isomeroinnin avulla. Tämän substraatin koostumus oli: kokonaiskuiva-ainepitoisuus (%) 42,6 glukoosia (% kuivapainosta) 46,9 35 fruktoosia (% kuivapainosta) 52,3 23 79557 polysakkarideja (% kuivapainosta) 0,8 psikoosia 0,0

NaHSO^ (millimoolia) 50,0

MgSC>4 (millimoolia) 5,0 5 CoCl2 (millimoolia) 0,1 pH 6,7

Substraatti pumpattiin reaktorin läpi 30 minuuttia o 60 C:ssa virtausnopeudella 6 ml/min. Sitten kolonnin lämpötila nostettiin nopeasti 97,8°C:seen, virtausnopeus pie-10 nennettiin arvoon 2 ml/min ja poistovirtausta tarkkailtiin kuten edellisessä esimerkissä. Poistovirtaus otettiin talteen jäähauteeseen ja sen pH säädettiin arvoon 4,0 1-m sitruunahapolla.

97,8°C:ssa toimivan reaktorin poistovirtauksesta, 15 ensimmäisessä vaiheessa eli 70°C:n isomeroinnissa valmistetusta substraatista ja 70°C:n reaktorin substraattina käytettävästä alkuperäisestä dekstroosiliuoksesta analysoitiin hiilihydraattikoostumus ja väri. Seuraavassa taulukossa on yhteenveto tuloksista.

20 Taulukko 4 70°C:ssa ja 97,8°C:ssa isomeroitujen liuosten koostumus

Hiilihydraattikoostunus Väri (paino-% tuhkattomasta kuiva-aineesta)(CIKFxlOO) 25 Liuosten käsittely Fruktoosi Glukoosi Psikoosi Polysakkar._ isaneroimaton 0 99,2 0 0,8 0,6 isameroitu 70°C:ssa 52,3 46,9 0 0,8 0,7 isaneroitu 97,8°C:ssa 55,8 43,8 0,2 0,2 5,7 30 Tulokset osoittavat, että saatiin 55,8 % fruktoosia, psikoosipitoisuus jäi alle 0,2 ja väri alle 6 (CIRFxlOO).

Esimerkki 5 Tässä esimerkissä demonstroidaan kaksivaiheisen iso-merointisysteemin käyttöä, jossa toisen vaiheen reaktori 35 toimi lämpötilassa yli 100°C, tuotteen saamiseksi, joka sisälsi 55,5 % fruktoosia.

24 79557

Toisen vaiheen reaktorissa käytettävä substraatti valmistettiin ensimmäisen vaiheen reaktorissa kuten esimerkissä 3 on kuvattu ja pH säädettiin arvoon 6,6.

Toisen vaiheen reaktorissa käytettävä immobilisoitu 5 isomeraasi oli Maxazyme GI immob., joka jauhettiin ja seulottiin kuten esimerkissä 3 on kuvattu. Tämä entsyymi suspendoitiin substraattiin, ilma poistettiin 60°C:ssa ja entsyymillä preparoitiin kerros 1,5 x 40,5 cm korkealäm-pötilareaktorissa. Kokonaisisomeraasiaktiivisuus oli 10 5 320 IGIU:ta. Substraatti pumpattiin reaktorin läpi vir tausnopeudella 6 ml/min kaikkiaan 90 minuutin aikana samalla pitäen lämpötila 60°C:ssa. Sitten kolonnin lämpötila nostettiin 102°C:seen ja substraatin virtausnopeus pienennettiin arvoon 3 ml/min. Näissä olosuhteissa subst-15 raatin ja entsyymikerroksen kontaktiaika oli n. 16 minuuttia ja kokonaisviipymisaika 102°C:ssa oli n. 24 minuuttia.

Poistovirtaus kolonnista otettiin talteen ja se analysoitiin esimerkeissä 3 ja 4 kuvatulla tavalla. Tulokset ilmenevät seuraavasta taulukosta.

20 Taulukko 5 70°C:ssa ja 102°C:ssa isomeroitujen liuosten koostumus Hiilihydraattikoostvmus Väri (paino-% tuhkattomasta kuiva-aineesta)(CIKFxlOO)

Liuoksen käsittely Fruktoosi Glukoosi Psikoosi Polysakkar._ 25 isomeroimaton 0 97,6 0 2,4 0,5 isaneroitu 70°C:ssa 51,3 46,4 0 2,3 0,7 isaneroitu 102°C:ssa 55,5 42,0 0,2 2,3 53,6

Saatiin tuote, joka sisälsi 55,5 % fruktoosia ja vain 0,2 % psikoosia.

Claims (13)

25 7 9 5 5 7

1. Menetelmä glukoosin isomeroimiseksi fruktoosiksi, tunnettu siitä, että glukoosipitoinen syöte- 5 liuos, joka sisältää n. 20 - 65 paino-% glukoosia, saatetaan kosketukseen glukoosi-isomeraasln kanssa, joka on eristetty mikro-organismeista Streptomyces rubigenosus tai Arthrobacter citreus, tai Maxazymd® G1 lämpötilassa n. 93-102*C ja pH:ssa 6,5 - 7,0 n. 10 s - 5 h kosketusajaksi, 10 jota fruktoosin lopulliseksi pitoisuudeksi liuoksessa saadaan vähintään n. 53-60 paino-% hiilihydraattien kokonaismäärästä laskettuna ilman olennaista psikoosin ja/tai muiden ei-fruktoosi-, el-glukoosisokerien muodostusta.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 15 tunnettu siitä, että glukoosipitoinen liuos saadaan maissitärkkelyksestä hydrolysoimalla.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että glukoosipitoinen syöteliuos saadaan isomeroimalla maissitärkkelyshydrolysaattia fruk- 20 toosipitoisuuteen n. 52 % saakka kokonaishiilihydraatti-määrästä laskettuna.

4. Jonkun patenttivaatimuksen 1-3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että glukoosi-isomeraasi saadaan mikro-organismista Streptomyces ATCC 21175.

5. Jonkun patenttivaatimuksen 1-4 mukainen menetel mä, tunnettu siitä, että glukoosi-isomeraasi on lämpöstabilll glukoosi-isomeraasi.

6. Jonkun patenttivaatimuksen 1-5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että isomerointiväliaineessa 30 on entsyymin denaturoimisen estävä määrä rikkihapokkeen vesiliukoista suolaa.

7. Jonkun patenttivaatimuksen 1-6 mukainen menetelmä, tunnettu siltä, että glukoosipitoinen syöte-liuos sisältää n. 40-65 palno-% hiilihydraatteja.

8. Jonkun patenttivaatimuksen 1-7 mukainen menetel- 26 79557 mä, tunnettu siitä, että glukoosipitoinen syöte-liuos saatetaan kosketukseen glukoosi-isomeraasin kanssa kosketusajan ollessa n. 2-30 minuuttia.

9. Jonkun patenttivaatimuksen 1-8 mukainen menetel-5 mä, tunnettu siitä, että glukoosi-isomeraasia käytetään immobilisoidussa muodossa.

10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että glukoosi-isomeraasi on immobi-lisoitu dietyyliaminoetyyliselluloosalle.

11. Jonkun patenttivaatimuksen 1-10 mukainen mene telmä, tunnettu siitä, että ensimmäisessä vaiheessa saatetaan glukoosipitoinen syöteliuos kosketukseen glukoo-si-isomeraasin kanssa lämpötilassa n. 20 - 80°C, pH:ssa n. 6-9 ja kosketusaikana n. 0,5 - 2 tuntia, jotta mainitun 15 liuoksen fruktoosinipitoisuus kohoaisi n. 52 paino-%:iin saakka hiilihydraattien kokonaismäärästä laskettuna, ja toisessa vaiheessa isomerointiväliaineen lämpötila nostetaan n. 93 - 102°C:seen, pH säädetään tarpeen mukaan alueelle n. 6,5 - 7,0 ja fruktoosipitoinen liuos saatetaan 20 kosketukseen glukoosi-isomeraasin kanssa vielä ajaksi, joka on riittävä fruktoosipitoisuuden nostamiseksi n. 53 -60 paino-%:iin.

12. Jonkun patenttivaatimuksen 1-11 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että tuotteena saatu fruk- 25 toosi-glukoosisiirappi jäähdytetään lämpötilaan alle n. 80 °C.

13. Jonkun patenttivaatimuksen 1-12 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että isomerointiseos jäähdytetään lämpötilaan n. 20 - 80eC entsyymin isomerointiseok- 30 sesta erottamisen jälkeen. 27 7 9 5 5 7