HU191609B

HU191609B - Improved process for the isomerization of sugar juice with glucose content

Info

Publication number: HU191609B
Application number: HU832355A
Authority: HU
Inventors: Norman E Lloyd; Robert O Horvath
Original assignee: Nabisco Brands Inc
Priority date: 1982-06-30
Filing date: 1983-06-29
Publication date: 1987-03-30
Also published as: SE8303725D0; GB2123001A; PT76958B; NZ204750A; FI79557C; IT8321885A0; SE8303725L; FR2529572A1; CA1200521A; GB8317391D0; AU558696B2; FR2529572B1; AU1645383A; FI79557B; IT1163640B; PT76958A; US4410627A; DE3323617C2; JPH0739B2; JPS5925696A

Description

A találmány tárgya eljárás glükóz-tartalmú eukorlé legalább 53—60 tÖineg% közötti fruktózt tartalmazó eleggyé való enzimes izomerizálására.

A legtöbb glükóz-típusú takarmány a kukorica-keményítő enzimes hidrolizátumát, azaz kereskedelmi kukorica-szirupot tartalmaz. A glükózt általában olyan cukornak tekintik, melynek édessége 60—80 %ra megközelíti a szacharózét, ezért az ára megfelelően alacsonyabb is. Régóta ismert a glükóz fruktózzá (a szacharóznál még édesebb cukorrá) izomerizálása glükóz-izomerizációt előidéző enzim segítségével, előnyösen olyannal, amelyik inért hordozón, — mint például dietil-amino-etil-cellulóz, porózus üveg vagy kitin — rögzítődik.

Glükóznak glükóz-izomeráz enzim segítségével történő fruktózzá alakításáról részletes leírás található az alábbi szakirodalmi közleményekben: Hamilton és munkatársai: „Glükóz-izomeráz: Egy enzimmel katalizált technológiai folyamat esettanulmánya”; Immobilized Enzymes in Food and Microbial Processes, Olson és munkatársai szerkesztésében, Plenum Press, New York (1974), p. 94-106, 112, 115-137; Antrini és munkatársai: „Magas fruktóz-tartalmú szirupok glükóz-izomeráz enzimmel történő termelése”, Applied Biochemistry and Bioengineering, 2. kötet, Academic Press (1979); Chen és munkatársai: „Glükóz-izomeráz (Áttekintés)”, Process Biochem., (1980), p. 30—35, 36—41; Takasaki: „Giükóz-izomerázzal történő fruktóz-előáUítás”,C7jem. Abstracts, 81. kötet, (1974), 76474a jelű referencia.

Fentieken túlmenően számos szabadalom foglalkozik a glükóz izomerizációjával, melyek közül a 3 616 221, 3 623 953 (utánnyomás 28 885 szám alatt), 3 694 314, 3 708 397, 3 715 276, 3 788 945,

826 714, 3 843 442, 3 909 354, 3 960 663,

144 127 és 4 308 349 számú amerikai szabadalmi leírások emelhetők ki.

Glükóz szirupok glükóz-izomeráz enzimes izomerizációval elérhető fruktóz, szintjét az izomcrizálási reakció egyensúlya szabja meg. Tiszta glükózból történő kiindulás esetén 65 °C hőmérsékleten az egyensúlyi koncentráció 51 tömeg% fruktóz. Ha tisztított (legfeljebb 6 tömeg% nem-monoszacharid tartalmú) glükóz deríték az alapanyag, és ésszerű tartózkodási időt engedünk meg az enzim reaktorban, úgy közelítőleg 48—52 % fruktóz szirup az előbbi eljárás körülményei között kitermelhető mennyiség. Magasabb fruktóztartalom elérésére frakcionáló rendszereket kell alkalmazni, melyek jócskán megnövelik a végtermék költségét. Magasabb hőmérsékleteken azonban az egyensúly kedvező irányba tolódik el. Például egy olyan, glükóz-izomeráz enzimes eljárás, melyet 90— 140 °C körüli hőmérsékleten lehet lefolytatni, alkalmas arra, hogy a frakcionálási és recirkulálásí elkerülve közvetlenül 53—60 tömeg% fruktóz-koncentrációjú, un. magas fruktóztartalmú (kukorica) keményítő szörpöt (HFCS) állítsunk elő. Az ismert glükózizomeráz rendszerek nagyfokú aktivitáscsökkenéssel járó termikus denaturálódásra való hajlama mindeddig meghiúsította az izomerizációs reakció egyensúlyának a fruktóz képződés irányába történő eltolása érdekében magasabb hőmérsékletű üzemmódok alkalmazására irányuló kísérleteket.

Ezen túlmenően a lí uklóz igen labilis cukoríélcség, mely nemkívánatos melléktermékek keletkezése közben könnyen elbomlik, amikor az 53—60%-os fruktóz-konverzióhoz szükséges hőmérsékletre melegítjük. Pszikóz, mannóz, tagatóz, fruktóz dianhidridek, szerves savak, színes termékek és elővegyületek képezik azokat a legközönségesebb melléktermékeket, melyek fruktóz oldatok túlzott melegítésekor képződnek.

Meglepő módon azt tapasztaltuk azonban, hogy a következőkben ismertetendő enzim-reaktorban bizonyos kritikus pH- és tartózkodási idő értékhatáron belül vezetett glükóz izomerizációs eljárás során mintegy 90 és 140 °C közötti hőmérsékleten közvetlenül kiváló minőségű KFCS-szörpöt kaptunk elfogadható mértékű melléktermék keletkezése mellett. Az így előállított szörp 50—60 tömeg% fruktózt tartalmazott, s ezáltal nem volt szükség a költséges és műveletilcg bonyolult frakcionálási, illetőleg recirkulálásí lépésekre, melyeket az eddig ismert glükóz-izomerizációs eljárásokban az említett minőségű HFCS-szörpök nyerése érdekében nem lehetett elkerülni.

Jelen találmány értelmében a glükóz fruktóz-tartalmú szörppé izomerizálható olyan eljárás keretében, melynek során glükóz-tartalmú kiindulási levet és glükóz-izomeráz enzimet érintkeztetünk 90—140 °C hőmérsékleten, 3—8 közötti pll-érték mellett, akkora tartózkodási idővel, hogy a betáplált lé összes szénhidrát tartalmára számítva 53—60 tömeg% fruktóz-koncentrációt érjünk el pszikóz és/vagy egyéb nem-fruktóz, nem-glükóz jellegű cukrok jelentősebb keletkezése nélkül.

A szóbanforgó eljárás nem igényel valamiféle különleges glükóz-izomeráz enzimet, csupán olyat, amelyik elegendő stabilitással rendelkezik 90°C-os vagy még magasabb hőmérsékletek inaktiváló hatásával szemben annyi ideig, hogy a továbbiakban meghatározott kielégítő izomerizációs fok megvalósulhasson. Mindazonáltal, jelen találmány körében kifejezetten hőstabilitásukról nevezetes olyan glükóz-izoincrázokat kell használni, mint például a 3,826,714 számú USA szabadalmi leírásban leírt, a Bacillus stearothermophilus által termelt, és a 4,308,349 számú USA szabadalmi leírásban leírt, az Ampullariellaféiékhez tartozó mikroorganizmusok által termelt glükóz-izomerázok. Hőellenálló glükóz-izomeráz nyerhető még a 41,313 számú Európai szabadalmi bejelentésben leírt Bacillus licheniformis, valamint a 74 30588 számú japán bejelentésben leírt hőkedvelő Thermoactinomyces-, Thermopolyspora-, Thermomonospora- és Pseudonocardia-félék alkalmazása révén (C. A. 81, 76474a).

A találmány szerint fruktózzá izomerizálható glükóz bármelyik ismert forrásból származhat. Gazdasági célszerűségből a glükózt rendszerint cellulóz vagy keményítő savas és/vagy — többnyire — enzimes hidrolízisével nyerjük, az ismert eljárásoknak megfelelően. Az ily módon kapott glükóz-tartalmú levek az alkalmazott szénhidrát-forrástól és hidrolízis-módszertől függően tipikusan kevés poliszacharidot, oligomer cukrokat stb. tartalmaznak. A gabonamagvak, mint kukorica, cirok, búza, rozs és hasonlók, valamint keményítőtartalmú gyökerek és gumók, mint a burgonya, jamgyökér, répafélék, manióka és hasonlók,

191 609 kiváló forrásai a találmány kiindulási anyagát képező, glükózzá konvertálandó keményítőnek. Az Egyesült Államokban a kukorica-keményítő különösen kedvelt erre a célra alacsony ára és könnyű előállíthatósága miatt. Minthogy az élelmiszer minőségű glükóz termelése leginkább az enzimes keményítő-hidrolizálási eljárásokkal történik, ehelyütt is ezeket a módszereket részesítjük előnyben. Enzimes hidrolízis eljárásokat írnak le a 4,017,363; 3,912,590; 3,922,196; 3,922,197—201 és 4,284,722 számú amerikai szabadalmi leírások.

Tekintve, hogy a jelen találmány szerint előállított friiktóz glükózból származik, célszerű az izomerizálásra szánt bármely keményítő-hidrolizátum glükóz tartalmát a lehető legnagyobbra beállítani. A glükóz termelésére legelőnyösebbek az enzimes eljárások, különösen azok, amelyek olyan enzimek mint a glükoamiláz, valamint a GB 2 097 4O5A szánni brit szabadalmi leírásban szereplőhöz hasonló elágazásaiéntesítő enzim kombinációját alkalmazzák. Különösen kedveltek az olyan enzimkombinációk, melyek képesek a folyékony keményítőt párhuzamosan glükózzá és fruktózzá konvertálni. Egyik ilyen kombináció a glükoamiláz, a pullulanáz és glükóz-izomeráz 4,111,750 számú USA szabadalmi leírásban közölt elegye. Ez utóbbi eljárással a szárazanyagra számítva 48 % fruktózt és 50 % glükózt tartalmazó izomerizált hidrolizátum állítható elő, ami ideális a jelen találmány szerinti 53—60% fruktóz-tartalmat eredményező konverzió megvalósításához. A poliszacharidok keményítő-hidrolizátuinból való eltávolítására féligáteresztő hártyát alkalmazó eljárások is lehetségesek; ily módon több mint 99 % glükózt tartalmazó frakciók jönnek létre, melyek szintén ideális kiindulási anyagai a jelen találmány szerinti eljárásnak. Természetesen, keményítő-hidrolizátumból kristályosítással előállított glükóz oldatok is alkalmas nyersanyagait képezik a jelen találmány szerinti módszernek.

Előnyös, ha a kiindulási anyagként szolgáló glükóz és/vagy glükóz/fruktóz oldatokat előállításuk egyes fokozataiban tisztítják, abból a célból, hogy nemszénhidrát szennyeződések glükóz-izomerázra gyakorolt káros hatását, továbbá a jelen találmány szerinti magas hőmérsékletű izomcrizáció folyamán színezőanyagok keletkezését elkerüljék, ill. minimálisra szorítsák. Mindamellett nem tisztított keményítő-hidrolizátumok is megfelelők, feltéve, hogy az előállításukra vonatkozó — a 4,376,824 számú USA szabadalmi leírásban előírt - követelményeket betartották.

Ha a helyzet úgy kívánja, tisztán glükózt tartalmazó oldat alkalmazása helyett olyan glükóz oldat is felhasználható jelen eljárás szubsztrátumaként, melynek egy része már fruktózzá Izomerizálódott. Például, egy 52 % fruktózt tartalmazó izomerizált glükóz oldatot jelen eljárás szerint kezelhetünk úgy, hogy a fruktóz koncentrációja az 52% feletti szintre, az 55— 56 %-os előnyös, vagy akár még magasabb szintre emelkedjék.

A jelenlévő szénhidrátok 50 tömeg%-ánál kevesebb fruktózt tartalmazó glükóz oldatokat ismert eljárásokkal állíthatunk elő.

A magas hőmérsékletű izomerizációs reakció során keletkező színanyagok túlzott mennyiségének megakadályozására biszuHit-képző adalékokat adhatunk a glükóz/fruktóz alapoldathoz a 3,623,953 számú (28,885 jelű újrakiadás) amerikai szabadalmi leírás ajánlásai szerint. Előnyös, ha a glükóz-izomerázzal érintkezésbe kerülő minden oldatból kiűzzük az oxigént, mert így csökkenthetjük az enzimnek a magas hőmérsékletű izomerizációs reakció során bekövetkező oxidációját, ami inaktiválódáshoz vezethet.

Az általunk alkalmazott glükóz-izomeráz enzim az ismert glükóz-izomeráz termelő mikroorganizmusok — nevezetesen Streptomyces flavovirens, Streptomyces achromogenes, Streptomyces echinatus, Streptomyces albus, Streptomyces wedmorensis, Streptomyces phaeochromogenes, Streptomyces bobiliae, Streptomyces olivochromogenes, Streptomyces venezuelae, Aerobacter aerogens, Aerobacter cloacae, Bacillus coagulans, Bacillus megaterium, Bacillus fruclosus, Acetobacter oxydans, Acetobacter suboxydans, Acetobacter roseus, Acetobacter melanogenus, Lactobacillus fermenti, Lactobacillus brevis, Lactobacillus gavonii, Lactobacillus lycopersici, Lactobacillus manitopoeus, Lactobacillus pentoaceticus, Pseudomonas hydrophilia, Brevibacterium pentaaminoacidicum, Escherichia intermedia, Leuconostoc mesenteroides, és Paracolobactrum aerogenoides — bármelyikéből elkülöníthető. A Streptomyces sp. ATCC 21,175 kiváló termelője a jelen találmány szerinti eljárásban alkalmazott glükóz-izomeráznak. Mint a korábbiakban említettük, olyan glükóz-izomeráz enzim használata lehet előnyös, amelyik az eljárásunkban alkalmazott viszonylag magas hőmérsékleteken stabilitást mutat. Ilyen például a Bacillus stearothermophilus termelte glükóz-izomeráz, különösen pedig az ATCC 21,365, az NRRL B-3680, NRRL B-3681, NRRL B-3682 jelű Bacillus stearothermophilust tartalmazó csoportból kiválasztott törzsek termelte glükóz-izomeráz, továbbá az Ampullariellafélékhez tartozó mikroorganizmusok, mint Ampullariella digitata, Ampullariella lobata, Ampullariella campanulata, és Ampullariella reguláris (4,308,349 számú USA szabadalmi leírás) által, a Bacillus licheniformis 41 213 sz. Európai szabadalmi bejelentés által, valamint a 74 30588 számú japán bejelentésben leírt fajták hőkedvelő változatai által termelt glükóz-izomeráz.

A fentebb említett mikroorganizmusokon túlmenően jelen találmány számításba veszi ezek mutációinak és variációinak legtágabb értelemben vett használatát. A mutáns glükóz-izomeráz gének ilyen célra kiválasztott egyedei azok, amelyek magasabb hőmérsékleten, nevezetesen 90 °C feletti, előnyösen 140 °C-ig terjedő hőmérsékleten stabilak. Ilyen gének a mikroorganizmusok mutációjának előidézésére kidolgozott szokványos technikák — mint besugárzásos és kémiai módszerek - segítségével készíthetők. Másrészt azok a glükóz-izomeráz gének, melyek mérsékelt hőstabilitású enzimet produkálnak, mint pl. bizonyos Streptomyces törzsek, in vitro mutálhatok. A megfelelő mutánsok kiválasztása a mutánsnak a termelő, vagy más organizmusba való visszavezetésével történik, melynek növekedését és újraképződését figyelemmel kísérik, végül pedig vizsgálják a képződő glükózizomeráz termikus stabilitását.

191 609

Tekintve, hogy a glükóz-izomeráz az említett és egyéb más mikroorganizmusok tipikusan sejtközi terméke, glükóz-izomeráz forráshoz egyszerűen a sejtek kinyerésével juthatunk. A sejtekből a glükóz-izoincrázt a szakmában ismeretes technikákkal, például hanghullámokkal történő roncsolással választhatjuk el, és ismert, hagyományos tervezésű enzim-reaktorban hasznosíthatjuk. A jelen találmányban hasznosított glükóz-izomerázt — tekintet nélkül származási módjára - előnyösen egy inért szubs/.trátuinon rögzítjük szokványos módszerekkel. Az enzimek rögzítésére használt anyagok és eljárások jól ismertek, és számos közleményben ismertetésre kerültek, köztük Wang és munkatársaiéban (Fermentation et Enzyrne Technology, John Wiley et Sons Inc., New York, ,1979, pp. 318—338), valamint Kirk-Othmerében (Encyclopsdia of Chemical Technology, 3. kiadás,^:John Wiley et Sons Inc., New York, 1980, 9. kötet, pp. 148-172).

A glükóz-izomeráznak az eljárás megvalósítása során bekövetkező denaturálódását csökkentendő, illetve inlubitálaiidő, kismennyiségű kobalt kation és/vagy a kénessav valamely vizoldható sójának, mint nátrium-szulfit, nátrium-biszulfit, magnézium-szulfit és/vagy magnézium-biszulfit jelenlétével is számoltunk - a 28,885 számú újkiadású USA-szabadalomban leírtak nyomán. Célszerű, hogy a glükóztartalmú kiindulási lé szénhidrát koncentrációja 20 és 85, előnyösen 40 és 65 tömeg% közé essék, ha a kívánt eredményt akarjuk elérni.

Az is szükséges, hogy az izomerizációs reakció

3-tól 8-ig, előnyösen 4-től 7-ig terjedő pH-értékű közegben játszódjék le. Az eredmény akkor a legjobb, ha a pH 5 és 6,5 között van. Amennyiben az izomerizációs reakció során a pH értéke az előbb említett határok alá, vagy fölé kerül, nemkívánatos melléktermékek keletkezése kerül előtérbe, mint például a pszikóz, szerves savak, színes termékekés elővegyületek, fruktóz-dianhidridek és hasonlók.

Úgy találtuk, hogy a glükóz-izomeráz optimális aktivitásához tartozó pH-érték a hőmérséklet emelkedésével jelentősen lefelé tolódik. így a Streptomyces rtibingenosusból termelt glükóz-izomerázra nézve az aktivitás-optimum 25 °C-on 8.6-9.2 pH-értéknél, 75 °C-on 6.9-7.5 pH-értéknél, 125 “C-on pedig 5.6— 6.2 pH-értéknél van. Ezért ha a hőmérséklet az izomerizáció közben emelkedik, a pH-t csökkenteni kell, hogy fenntartsuk a maximális enzim-aktivitást és azonkívül elkerüljük melléktermékek jelentkezését.

A jelen eljárást illetően a kontaktidő arra az időtartamra korlátozódik, amely ahhoz szükséges, hogy a reakciókeverékben jelenlévő összes szénhidrátra számítva legalább 53-60 tomeg%-os fruktóz-koncentrációt érjünk el. Miután a glükóz-tartalmú kiindulási lé összetétele a majdnem fruktóz nélküli, vagy fruktózt egyáltalán nem tartalmazó tiszta glükóz oldattól akár 52 % fruktózt tartalmazó glükóz oldatig mehet, a reakcióidő a kiindulási lé természetétől függően változhat. Ennek következtében 1 másodperctől több óráig terjedő kontaktidő is előfordulhat, noha a rendszerint előnyösnek bizonyult érintkezési időtartam 2 és 30 perc közé esik.

A glükóz-izomeráz és a glükózt tartalmazó lé kö4 zötti előnyös kontaktidő nagymértékben függ attól a pH-értéktől, amelyen az izomerizációs reakciót vezetjük. Alacsonyabb pH-nál hosszabb kontaktidő engedhető meg anélkül, hogy a glükóz és fruktóz pszikózzá, illetőleg egyéb nemkívánatos bomlástermékekké degradálódását okoznánk. Az ajánlott pH-tartomány felső értékeinél rövidebb kontaktidő szükséges a pszikóz és színanyagok képződésének elkerüléséhez. A gyakorlatban azt az időt vesszük effektív kontaktidőnek, amelyet a glükóz-tartalmú szörp a reakció véghőmérsékletén, vagy alihoz közelálló értéken tölt, mivel a cukorbomlási reakciók, melyek itt előfordulnak, nem enzimatikus jellegűek, és lejátszódnak, akár érintkezik a lé a glükóz-izomerázzal, akár nem. Emiatt, 90 °C hőmérséklet felett vezetett izomerizációs reakciók esetén fontos minimalizálni a glükóz lé kívánt izomerizációs hőmérsékletre melegítésének időtartamát (például a lének gőzzel való keverése útján az izomerázzal történt érintkeztetés alatt vagy azt közvetlenül megelőzően), és amint elértük a kitűzött fruktóz szintet, azonnal el kell választani a reakcióelegyet az aktív izomeráztól, és amilyen gyorsan csak lehet, le kell hűteni legalább 90 °C, de inkább 70 °C alá. Ha glükóz-izomerázt oldható formában alkalmazunk, inaktiválni kell (például a pH olyan mértékű csökkentésével, mely inaktiválja az izomerázt) még a lehűtés előtt, hogy elkerüljük a magas hőfokú izomerizáció folyamán keletkezett fruktóz glükózzá történő visszaalakulását, lévén az izomerizációs reakció természetesen reverzibilis.

A glükóz fruktózzá alakulásának elérhető legnagyobb mértékét a glükóz és fruktóz közötti termodinamikai egyensúly határozza meg, amely viszont a reakció hőmérsékletének függvénye. Glükóz és fruktóz egyensúlyi clegycinck igen gondos elemzéséből az alábbi összefüggést állítottuk fel:

F = 100/(K+l) (1)

755

InK = - + 2.3005 (2) ahol F a glükóz és fruktóz összsúlyára vetített egyensúlyi fruktóz-koncentráció tömeg%-ban, T az a °Cban kifejezett hőmérséklet, amelyen a reakciót lejátszatjuk, K pedig a glükóz/fruktóz egyensúlyi állandó.

A glükóz-tartalmú szörp és az izomeráz közötti aktuális kontaktidőt az esetben, ha a reaktorban az izomeráz rögzített formában van jelen, a következő képlettel számíthatjuk ki:

ahol t = az aktuális konlaktidő,

C = a glükóz és fruktóz együttes koncentrációja,

V = a töltet szabad folyadéktérfogata (töltet-47 19 térfogat mínusz a rögzített cnzimrészccskék térfogata),

F_e = a fruktóz egyensúlyi törtje a glükóz/fruktóz elegyben az izomerizáció hőmérsékletén,

F_c = a fruktóz belépési koncentrációja (a glükóz + fruktóz összegre vetítve),

F = a fruktóz kilépési koncentrációja (fenti módon számítva), k = reakciósebességi állandó az izomerizációs reakció feltételei között,

A = a töltetben lévő izomeráz aktivitása.

A soronkövetkező példák szerint készített rögzí-, tett izomeráz k értékei O.O7-től 5 glir^_1IGIU -ig!

(az IGIU meghatározását lásd az 1. példában) változ-: nak a 90—140 °C hőmérséklettartományban. Ez az összefüggés annak szükségességére mutat rá, hogy | magasabb hőfokon a lehetőség szerint minimális kon- j taktidőt érjünk el egységnyi térfogatra vonatkozta-¹tott nagy fajlagos aktivitású töltet alkalmazásúval.

Az ismertetendő példákban szereplő eljárások szerint kialakított töltetek maximálisan 2000 IGIU/ml tartalmúak, amivel 99.5 % egyensúlyi fruktóz hozam érhető el kevesebb mint 1 perc alatt egy nagyhőmérsékletű reaktorban, amennyiben kétlépcsős, hőfokfokozatú reaktort alkalmazunk, és az első lépcsőben alacsony hőmérsékleten izomerizálunk, majd a kilépő anyagáramot visszük a második, magasabb hőmérsékletű izomerizációs reaktorfokozatba. Midőn ilyen lépcsőzetes reaktorrendszert használunk, az enzimes glükóz/fruktóz konverzió céljára olyan eljárást előnyös követni, melynek során mintegy 20 és 85*40meg% szénhidrátot tartalmazó glükózos levet glükózizomerázzal hozunk érintkezésbe 20—80 °C körüli hőmérsékleten, 6.0-tól 9.0-ig terjedő pH-érték mellett 0.5 és 2 óra közötti kontaktidővel annak érdekében, hogy az összes szénhidrátra számítva 52 tömeg# fruktóz-koncentrációt ériünk el a kiindulási lében, maid az elegy hőmérsékletét 90 és 140 °C közé emelve, továbbá a pH-t szükség szerint 3 és 8 érték közé beállítva, a fruktóz-tartalmú levet újabb, 1 másodperctől 5 óra hosszáig terjedhető időre glükóz-izomerázzal érintkeztetjük az eredeti glükóz-tartalmú kiindulási lében jelenlévő glükóz konverziós szintjét 53-60 tömeg#, közé emelendő, és a pszikóz, valamint egyéb nem-fruktóz, nem-glükóz jellegű cukrok keletkezését visszaszorítandó. Következésképpen nagy aktivitású töltetek alkalmazása igen alacsony kontaktidőket tesz lehetővé, ami viszont a jelen találmány szerinti magasabb hőmérsékleteken előforduló fruktóz-bomlást csökkenti.

A glükóz-izomeráz rögzítési technikák kiválasztásakor azt a módszert előnyös figyelembe venni, amelyik kisméretű, gyakorlatilag összenyomhatatlan, pórusos katalizátor szemcsékkel képes dolgozni, amiáltal a diffúziós hatások okozta izomerizációs reakciósebesség-gátlás minimálisra csökken. Egy másik metódus szerint az izomeráz egy membrán pórusaiban kerül rögzítésre, mely membránon kcresztülárninoltatjuk a glükóz oldatot a magas hőmérsékletű izomerizáció során elősegítve ezáltal az enzim és a szubsztrátum közötti jó érintkezést a diffúziós gátlás ellensúlyozására. A rögzítésre használt hordozó előnyösen valamilyen teljesen oldhatatlan és közömbös anyag, hogy elkerüljük a szubsztrátum oldat glükóz/ fruktóz komponenseinek nemkívánatos szennyeződését vagy bomlását.

Mindazonáltal, a kereskedelmi gyakorlatban a fruktóz-tartalmú szörpöket nem tiszta glükózból gyártják. Glükóz forrásul inkább keményítő hidrolizátumok szolgálnak (az említett szakirodalmi hivatkozások szerint készítve), ezek pedig mindig tartalmaznak nem-glükóz és nem-fruktóz jellegű (továbbiakban poliszacharidok) szacharidokat, melyek a keményítő tökéletlen hidrolíziséből, illetve a glükóz átalakulásából származnak. Tipikusan ezek a komponensek alkotják a keményítő hidrolízissel előállított szacharidok szárazanyagra számított 3—8 tömegszázalékát. Ezért szükség van arra, amikor a végrehajtandó izomerizáció reakcióhőmérsékletét kiszámítjuk, hogy figyelembe vegyük poliszacharidok jelenlétét a glükózlében, valamint egyéb olyan tényezőket, mint az elérendő teljes száraz fruktóz-tartalom, továbbá pszikóz és ncm-gliikóz., nem-fruktóz jellegű egyéb termékek képződése a glükóz-lé és az Izomeráz közötti érintkezés folyamán. Az izomerizáció hőmérsékletének kiszámítására szolgáló összefüggés az alábbi:

2.3005 - InK

10,000 (M + C) Q(100-P)

T = izomerizációs hőmérséklet,

F = egyensúlyi fruktóz-tartalom (a teljes glükóz + fruktóz-tartalom %-ában) a T hőmérsékleten,

M = az izoinerizált termékben elérni szándékozott száraz fruktóz %,

C = pszikóz.% +egyéb, a tényleges izomerizációs kontaktidő folyamán képződött bomlástermékek,

Q = az izomerizációs reakció során elért egyensúly százaléka,

P = a glükózlé százalékos poliszacharidtartalma.

Az esetek többségében kevesebb mint 1 % — előnyösen kevesebb mint 0.5 % — pszikóz és más bomlástermék, továbbá 99.5 %-os egyensúlyi állapot érhető el. Emiatt, 55,5 % (szárazanyagra számított) fruktóztartalmú szirupok készítéséhez az alábbi izomerizációs hőmérsékletek szükségesek a jelzett poliszacharid koncentrációjú glükóz levek esetében:

191 609

Szárazanyagra számított políszacharid-tartalom a glükózlében (%)	Izomerizációs hőmérséklet (°C)
0	95.7
1	99.1
2	104.3
3	108.9
4	113.8
6	124.3
8	136.1

Az elfogadott kereskedelmi termék átlagosan 55.5 % szárazanyagra számított fruktózt tartalmaz. Azért ennyit, mert a magas fruktóz-tartahnú knkoricaszörp (HFCS) ennél a fruktózszintnél éri el a szacharózzal azonos édességet szárazanyag súlyban számítva. Azonkívül, az 55.5% fruktóz-tartalmú HFCS bevezetett kereskedelmi cikk, amelyet mint teljes vagy részleges szacharóz-helyettesítőt használnak nagy on sok élelmiszeripari termékben, különösen szénsavas üdítőitalokban. Az ilyen típusú HFCS fogyasztása az Egyesült Államokban 1982-ben 1,3 milliárd kg körül alakul majd, és 1983-ban 1,8 milliárd kg-ra növekszik. A velejáró szállítási, raktározási, mérési és kiszerelési nehézségek következtében általános igény mutatkozik a termék uniformizálására annak érdekében, hogy a különböző forrásból származó HFCS-készítmények egymással cserélhetők, és egyidejűleg alkalmazhatók lehessenek. Ezért a szárazanyagra számított 5556 %-os fruktózszint kereskedelmi-piaci sztenderdként különös jelentőséggel bír a HFCS gyártással kapcsolatos technológiában.

Jelen eljárás legalább 53 %-os, előnyösen legalább 54 %-os, és legelőnyösebben minimum 55 %-os fruktózszintet biztosít.

Eljárásunk terméke szintén jellemezhető megfelelő színnel, ami a finomítás! költségek csökkentése miatt igen kívánatos. A színesség mérőszámának növekedése rendszerint nem éri ci az 55-öt, (C1RFX100), előnyösen kevesebb 20-nál, és legelőnyösebben kisebb mint

10.

Az említett pH és kontaktídő-követelményeket adaptálva, az ismert glükóz-izomerizációs eljárások megfelelően vezethetők 90 és 140 °C, előnyösen 100 és 110°C közötti hőmérsékleten a jelen találmány szerinti magas glükóz-fruktóz-tartalmú szörpök készítése céljából.

A következő példákkal további bemutatását adjuk a jelen találmány szerinti eljárásnak.

1. példa

Ez a példa glükóz közvetlen izomerizációját mutatja, szárazanyagra számított 55.5 % fruktóz-tartalmú készítmény előállítására magas hőmérsékleten, kétlépcsős rendszerben.

A glükóz-izomerázt oldható formában a 3 788 945 számú amerikai szabadalmi leírásban leírthoz hasonló módszerrel készítettük.

Streptomyces rubigenosus ATCC 21175-ből származó egyik Strep. rubigenosus fajt merített aerob fermentációval az alábbi összetételű tápközegen tenyésztettük :

Glükóz

Kukoricalekvár Diaimnónium-foszfát Mangán-szulfát Habzásgátló (Pluronic PL-61)

9t%

1.61% (szárazanyag) 0.08 t%

0.06 t%

0.003 t%

A tápközeget 121 °C hőmérsékleten 45 percen keresztül sterilizáltuk, majd hűtés után 6.8-7.0 pHértékre állítottuk be. Ezt követően az említett5. rubigenosus variánssal készített inokulum (crmcntorbnn előállított 14 tf% oltóanyaggal beoltottuk. A fermentáció 30 °C-on aszeptikus körülmények között mintegy 60 óra alatt 0.65 térf./térf. mértékű levegőztetéssel játszódott le. A 5. rubigenosus ATCC 21175 is használható oltásra és izomeráz-termelésrc; ebben az esetben a következő összetételű tápközeget alkalmaztuk:

0.24 tömeg%

1.5 tömeg%

1.6 tömeg%

0.02 tömeg%

0.56 tömeg%

1.0 tömeg%

Glükóz

Kukoricalekvár

Szorbit

Kobalt(II)-klorid

Diaimnónium-foszfát

Xilóz

A glükóz-izomerázt a S. rubigenosusból oly módon vontuk ki, hogy 0.35% Maquat MC 1412-t (Mason Chemical Co.), valamint 10 ppm mennyiségű tyúktojás-lizozimet adtunk hozzá, és 6.3—6.6 pH-érték mellett, 40 C hőmérsékleten, 5 órán át kevertük az elegyet, majd leszűrtük, és így nyers, tisztítatlan glükóz-izomeráz oldathoz jutottunk.

Ezt az oldatot DEAE-cellulózon való adszorpcióval tisztítottuk (a 3,823,133 számú amerikai szabadalini leírás szerint készítve), azután szűrtük és 0.1 M konyhasó-oldattal mostuk a szennyezések eltávolítása végett, ezt követően pedig 0.45 M töménységű konyhasó-oldattal deszorbeáltuk. Mindegyik oldat pH-ját 7.5 értéken tartottuk a tisztítási lépések folyamán. Az így kapott részleges tisztaságú izomeráz-oidatot 0 °C-on 3 térfogatrész 95 %-os etanollal ezután összekevertük, hogy az izomeráz kicsapódjék. Perlites derítést alkalmaztunk, a szilárd részeket kiszűrtük, és levegőn szárítottuk; ily módon 2500 IGIU/g koncentrá55 ciójú oldható izomeráz készítményhez jutottunk. Az izomeráz készítmény fajlagos aktivitása 40 IGIU/mg protein mértékű volt.

Alacsony hőmérsékletű (70 °C) izomcrizációhoz 2,54 cm átmérőjű üvegkolonnában a 3,788,945 számú amerikai szabadalmi leírás szerint készített rögzített izomerázt tartalmazó reaktort készítettünk elő, amely 5 cm magas töltetágyban 20.000 IGIU aktivitással rendelkezett. A töltött ágy feletti térben hőmérőt és üveggyöngyöket helyeztünk el, azért, hogy

-611

191 609 a holtteret amennyire lehet, csökkentsük. Az oszlo- i pót ki- és belépőcsonkkal láttuk el, valamint kettős j fallal, a termosztált víz cirkulálásának biztosítása cél- ΐ jából. '

A másik, magas hőmérsékletű (93 °C) reaktort, 5 melyben a fent leírt, DEAE-cellulózon történő ad- j szorpcióval tisztított rögzített izomerázt használtunk, hasonló módon készítettük elő. A töltött ágy 97,000 IGIU-t tartalmazott és 15 cm magas volt.

Az oldható izomeráz készítmény aktivitását a 10 Lloyd és munkatársai részéről leírt módon (Cereal Chemistry, 49, No.5., pp. 544—553, 1972) határoztuk meg. E szerint egységnyi IGIU-nak az az izomeráz mennyiség felel meg, amely percenként 1 mikromól glükózt alakít át fruktózzá 60 °C hőmérsékleten, lite- 15 renként 2 mól glükózt, 0.02 mól magnézium-szulfátot és 0.001 mól kobalt(II)-kloridot tartalmazó, 6.85 pHértékű (0.2 M nátriuin-inalcát) oldatban.

Kristályos glükóz (Clintose A granulation, Clinton Corn Processing Co.) feloldása útján 48 tömeg% szá-: razanyagot tartalmazó sómentes oldatot készítettünk ¹ioncserélt vízzel. Az aktivátor és stabilizátor komponenseket úgy oldottuk fel a glükóz-oldatban, hogy 25 mM metabiszulfit-, 5 mM magnézium-szulfát és 0.1 mM kobalt(H)-klorid-koncentráció jöjjön létre.

Az így keletkezett elegy pH-ját nátrium hidroxiddal 6.8-ra állítottuk be.

Először alacsony hőmérsékletű izomerizációt végeztünk 70 °C-on a fenti glükóz-oldat 3.7 ml/perc sebességgel való átáramoltatásával az alacsony hőmérsékletű reaktoron. A lejövő termék első 2500 ml-ét elöntöttük, az ezután kilépő részt pedig a következő magas hőmérsékletű izomerizáció céljára összegyűjtöttük. Ez utóbbi reakció folyamán a 70 °C-on végrehajtott izomerizáció produktumát 5 ml/perc sebességgel áthajtottuk a 93 °C hőmérsékleten tartott reaktoron (magas hőmérsékletű reaktor), amelyben az oldat és a rögzített enzim közötti kontaktidő 12 perc körül alakult. Az oldat 93 °C-on töltött összes tartózkodási ideje kb. 18 perc volt. Ezután a magas hőmérsékletű reaktorból való kilépést követően jégfürdő segítségével az oldatot gyorsan lehűtöttük, és pH-ját 4.0 értékre szabályoztuk. A magas hőmérsékletű reaktorból távozó termékből az első óra alatt keletkezett részt öntöttük el.

Mind az alacsony-, mind a magas-hőmérsékletű reaktor termékét elemeztük szénhidrát-összetétel és színanyag szempontjából, majd az eredményeket az izomerizálatlan glükóz-oldatéval hasonlítottuk össze az 1. táblázat szerint.

Az eredmények azt mutatják, hogy 55.5 % fruktóztartalom volt elérhető, míg a pszikóz mennyisége 0.5 % alatt maradt, és a színanyag-növekedés nem érte el az 5 (CIRF X 100) értéket.

A szénhidrát-tartalmat az E-61 módszerrel, n színanyag-értéket az F-14 módszerrel határoztuk meg a Standard Analytical Methods of the Member Companies of the Corn Refíners Association szerint; Corn Refiners Association, 1001 Connecticut Avenue, Washington, D. C., 20036. Az F-14 módszerrel kapott színanyag-értékeket 100-zal megszoroztuk, és (CIRF X 100) jelöléssel közöltük.

2. példa

Ez a példa 55.2 % fruktózt tartalmazó termék készítését mutatja be, túlnyomórészt tisztított kukoricakeményítő lúdrolizátumból álló glükóz-oldatból kiindulva.

A hidrolizátumot a 3,644,126 valamint 3,280,006 számú amerikai szabadalmi leírásokban leírt elfolyósítási, illetve szach ári fikálási eljárások szerint készítettük kukorica-keményítőből. A szacharifikált levet a 3,834,940 számú amerikai szabadalmi leírásban leírtakat követve tisztítottuk, hogy összesen 50 % szárazanyag-tartalom mellett 95.3 % glükóz koncentrációjú alapanyagot kapjunk. Kristályos glükóz adagolásával az összes glükóz-tartalmat végülis 97.1 %-ra állítottuk be. Ebből az alábbi összetételű oldatot készítettük:

Összes szárazanyag (%) 42.4

Glükóz (% a szárazanyagra _{Q7 1}35 számítva)

Fruktóz (% a szárazanyagra számítva)

Poliszacharid (% a szárazanyagra számítva)

Pszikóz (% a szárazanyagra számítva)

NaHS0₃ (mM)

MgSO₄ (mM)

CoCI₂ (mM) pH

Az 1. példában leírt módon egy magas hőmérsékletű reaktort készítettünk elő, amely 16.5 cm magas töltet-ágyban 147,500 IGIU-t tartalmazott. A hőmér50 sékletet 97.4 °C-ra szabályoztuk, és a fenti oldatot 2.2 ml/perc sebességgel szivattyúztuk át a reaktoron.

1. táblázat

0.1

2.8

0.0

50.0

5.0

0.1

6.8 és 90 ° C-on izomerizált glükóz-oldatok összetétele

Kezelési mód

Szénhidrát-összetétel (hamumentes szárazanyagra tömeg%-ban)

Fruktóz Glükóz Pszikóz Poliszacharid

Színanyag (CIRF X 100)

Izomerizálatlan Izomerizáció 70 °C-on Izomerizáció 93 °C-on

52.3

55.5

99.6	0	0.4	0.6
47.3	0.1	0.4	2.1
43.7	0.4	0.4	4.8

-713

191 609

Az első 50 ml terméket elöntöttük, a többit pedig elemzés céljára félretettük. Az eredményeket — szembeállítva az izomerizálatlan glükóz oldat adataival — a 2. táblázat mutatja be.

Az alacsony hőmérsékletű (70 °C) izomcrizáció során az előzőek szerinti összetételű szubsztrátumot 3.2 ml/perc sebességgel szivattyúztuk át az alacsony hőmérsékletű reaktoron. Az oldatból ily módon ke2. táblázat

97.4 °C hőmérsékleten izomerizált glükóz-oldatok összetétele

Kezelési mód	Szénhidrát-tartalom (tömeg%-ban a hamumentes szárazanyag	:a számítva) Poliszacharid	Színanyag-érték (C1RF X 100)
Fruktóz	Glükóz	l’szikóz
Izomerizálatlan	0.1	97.1	0	2.8	0.6
97.4 °C-on izomerizált oldat	55.2	42.4	0.2	2.2	12.4

Az eredmények azt mutatják, hogy több, mint 55 % fruktó? koncentrációt értünk el mindössze 0.2 % pszikóz képződése mellett. Az e példában jelentkező nagyobb színanyag mennyiség annak tudható be, hogy az egész izomerizáció magas, 97.4 °C hőmérsékleten játszódott le. szemben az 1. példa kétlépcsős folyamatával, ahol a fruktóz döntő hányada az alacsony hőmérsékletű reaktorban keletkezett (70 °C-on), így viszont elkerülhettük két külön reaktor használatát. Mindenesetre, a színanyag-érték 13 alatt maradt (CÍRFX 100).

ι 3. példa

Ez a példa szárazanyagra számítva 55.3 % fruktózt tartalmazó termék készítését mutatja be, amely tisztított kukoricakeményítő hidrolízáturnból és kristályos glükózból kétlépcsős izomerizációval, a második lépcsőben kereskedelmi minőségű rögzített izomeráz alkalmazásával került előállításra.

Az első reakcióhoz szükséges oldható glükóz-izomerázt az 1. példában leírt módon készítettük és tisztítottuk. E készítmény fajlagos aktivitása 40.9 IGIU/mg protein volt. Az enzimből összesen 25,000 IGIU-nak megfelelő mennyiséget 10 g Whatman DE-23 típusú DEAE-cellulózon adszorpcióval rögzítettünk. Az így előállt rögzített enzimet az 1. példában leírt 2,54 cm átmérőjű kettősfalú üvegkolonnában mint alacsony hőmérsékletű (70 C) reaktorban helyeztük el, 13 cm töltetvastagsággal.

A szubsztrátumot lényegében a 2. példában ismertetett eljárás szerint készítettük, és összetétele az alábbi volt:

Összes szárazanyag (%)	50.2
Glükóz (a szárazanyag %-ában)	97.6
Fruktóz (a szárazanyag %-ában)	0.0
Poliszacharid (a szárazanyag %-ában)	2.4
Pszikóz	0.0
Na HSO₃ (niM)	50.0
MgSO₄ (mM)	5.0
CoCl₂ (mM)	0.1
pH	6.8

letkezett első 1000 ml réaktorterméket elöntöttük, a többit pedig a magas hőmérsékletű izomcrizáció alapanyagaként összegyűjtöttük.

A magas hőmérsékletű izomerizációs reakcióhoz 25 használt enzim az Enzyme Development Corporationtól származó, kereskedelmi úton hozzáférhető rögzített izomeráz volt. Ezt az enzimet (Maxazyme GI immob., batch K-12467) előbb mozsártörőben felaprítottuk, majd 0,841 mm lyukbőségű rostán átszitál30 tűk. Ebből a 0,180 mm lyukbőségű rostán fennmaradt részt a szubsztrátum-oldattal szuszpendáltuk, és 60 °C-on 60 percen keresztül laboratóriumi vákuum segítségével légtelenítettük. Az így gázmentesített pépet azután egy kettősfalú üvegkolonna 1.5 X 39 cm méretű tölteteként alkalmaztuk. A töltet 5200 IGIU értékű volt.

Az első' izomerizációs reakció (70 °C) produktumaként megjelent szubsztrátumot 6.5 pH-értékűre állítottuk be, és szárazanyagra számítva 42.6 %-osra hígítottuk. Az így kezelt szubsztrátmn-oldatot 6 ml/perc sebességgel 60 °C hőmérsékleten 30 percen keresztül adagoltuk a kolonnába. A kolonnán belül uralkodó hőmérsékletet közvetlenül a töltet fölött elhelyezeti termométerrel követtük, mely köré 0.5 cm méretű üveggyöngyöket raktunk a holttér lehető legkisebbre szorítása céljából. Amikor 97.8°C-os termosztált vizet cirkuláltattunk a reaktor két fala között, a kolonna hőmérséklete gyorsan emelkedni kezdett, és miután elérte a 97 °C-ot, a szub’sztrátum ⁵⁰ áramlási sebességét 2.0 ml/percre csökkentettük. Ennél a sebességnél a szubsztrátum és a rögzített enzim közötti kontaktidő 22 perc volt, míg az oldat reaktoron belüli tartózkodásának teljes időtartama mintegy 35 perc.

A kolonnából távozó terméket 50 és 58 % fruktóztartalom közötti érték leolvasására kalibrált írószerkezetes polariméterrel figyeltük, és midőn a kilépő reakcióelegy fruktóz-koncentrációja elérte a kívánt szinθθ tét, szedőt váltottunk, és a kapott terméket jégfürdőben azonnal lehűtöttük. A pH-t 1 M citromsavval 4.0 értékűre szabályoztuk. A kitépő terméket mindaddig gyűjtöttük, míg a fruktóz-szint 55 % alá nem esett.

A 70 °C-on, valamint 97 °C-on végrehajtott reak65 ciók termékeként kapott izomerizált oldatokat szén-815

191 609 hidrát- és színanyag-erősség szempontjából elemeztük, majd összehasonlítottuk az izomerizálatlan szubsztrátumon végzett hasonló elemzések adataival. Az eredményeket a következő táblázatban foglaltuk össze.

folyadékot félretettük. Az. oldhatatlan anyagot 250 ml 0.1 % Triton Χ-100-zai (Sigma Chemical Co.) ismét szuszpenzióba vittük 7.0 pH mellett, majd 8 órán keresztül 45 °C hőmérsékleten inkubáltuk. E szusz3. táblázat és 97°C-on izomerizált szubsztrátum-oldatok összetétele

Kezelési mód	Szénhidrát-összetétel (tömeg%-ban, hamumentes szárazanyagra számítva)	Színerősség (C1RFX100)
Fruktóz	Glükóz	Pszikóz	Poliszacharid
Izomerizálatlan	0	97.6	0	2.4	0.5
Izomerizáció 70 °C-on	51.3	46.4	0	2.3	0.7
Izomerizáció 97 °C-on	55.3	41.8	0.3	2.6	35.2

Ár. eredmények azt mutatják, hogy 55.3% fruktózkoncentrációt sikerült elérni, míg a pszikóz-tartalom 0,4 % alatt maradt.

4. példa

Ez a példa olyan magas hőmérsékletű glükóz-izomerizációt mutat be, melynek során 55.8 % fruktóztartalmat értünk el, a második izomerizácíós fokozatban Arthrobacter sp. által termelt rögzített izomeráz alkalmazásával.

Egy Arthrobacter citreus törzset tenyésztettünk merített aerob fermentációval az alábbi összetételű tápközegen:

	súly%	40
Xilóz	1.5
BHI (agy—szív infúziós oldat)	4.2
Élesztő kivonat	0.1	45
Nátrium-klorid	0.2
Kazein-aminosav	0.5
Magnézium-szulfát	0.024
PH	6.9-7.2	50

A fermentációt aszeptikus feltételek között 30 °C hőmérsékleten 44 órán keresztül végeztük. A sejtmasszát centrifugálással különítettük el. 0.85 %-os 55 nátrium-klorid-oldattal mostuk, majd ismét centrifugáltuk. Ily módon hetvenhat gramm összesen 10,260 IGIU aktivitású sejtmasszát kaptunk. A glükóz-izomerázt 45 grammnyi sejtmasszából úgy vontuk ki, hogy a sejteket 250 ml mennyiségű, 900 mg θθ tyúktojás-lizozimet, valamint 250 ing szárazanyagtartalmú BTC-835 (Onyx Chemical Co.) felületaktív anyagot tartalmazó vízben szuszpendáltuk 7.0 pHérték mellett, 45 °C-on 16 órás inkubálással. Ezt követően a szuszpenziót centrifugáltuk, és a felülúszó 65 penziót ugyancsak centrifugáltuk ezután, és a felülúszó folyadékot az első centrifugálás alkalmával kapottal egyesítettük. Az egyesített kivonatokat töményítettük, és ultraszűrésseí tisztítottuk Amicon 401 kevert sejtekkel, YM-30 membránt alkalmazva (Amicon Corporation). A kiszűrt anyagot (retentate) két ízben 5 térfogatrész 0.2 mM kobalt(II)-klorid és 1 mM magnézium-szulfát 7.0 pH-jú oldatával diaszűrtük. Az ultraszűrés után véglegesen visszamaradt anyag 3115 IGIU-t tartalmazott. Ezt az enzimet használtuk fel DEAE-cellulózon adszorpcióval rögzített izomeráz készítéséhez, követve a 3,788,945 számú amerikai szabadalmi leírás útmutatásait. Az oldathoz ezután összesen 4.0 g Whatman DE-23-at adtunk, a pH-t 7.0 értékre állítottuk be és a szuszpenziót szobahőmérsékleten 60 percen át keverésben tartottuk. A keletkező oldhatatlan enzimet szűréssel összegyűjtöttük, majd vízzel mostuk. A mosott rögzített enzim egy részéből a szubsztrátuinban való szuszpeudálás, gáztalanítás (60 °C-on 60 percen keresztül) után 1.5 X 13 cm méretű töltetet készítettünk a magas hőmérsékletű reaktorban.

A reaktorba kerülő szubsztrátumot lényegében az 1. példában leírt 70 °C-os izomerizációval készítettük elő (első reakciófokozat) Ez a szubsztrátum összetételére nézve a következő komponensekből állt:

Összes szárazanyag (%) 42.6

Glükóz (a szárazanyag %-ában) 46.9

Fruktóz (a szárazanyag %-ában) 52.3

Poliszacharid (a szárazanyag %-ában) 0.8

Pszikóz 0.0

Nátrium-hidrogén-szuífit (mM) 50.0

Magnézium-szulfát (mM) 5.0

Kobalt(II)-klorid (mM) 0.1 pH 6.7

A szubsztrátumot 60 °C hőmérsékleten 30 percen keresztül 6 ml/perc sebességgel szivattyúztuk át a reaktoron. A reakció megindulását követően a kolonna hőfoka gyorsan 97.8 °C-ra emelkedett, a sebességet

-917

191 609 ml/percre csökkentettük, s a távozó terméket ugyanúgy kísértük figyelemmel, mint az előző példában. A terméket végülis jégfürdőben fogtuk fel és citromsavval 4.0 pH-értékűre állítottuk be.

A 97.8°C-on lejátszódott reakció termékét, az első fokozatban 70 “C-on keletkezett szubsztrátumot, valamint az eredeti glükóz-oldatot, melyet a 70 C-os reakció kiindulási anyagaként kezeltünk, szénhidrátösszetételre és színanyag-tartalomra elemeztük. Az eredményeket a 4. táblázat foglalja össze.

4. táblázat és 97.8 °C hőmérsékleten izomerizált oldatok összetétele

Kezelési mód	Szénhidrát-összetétel (tömeg%-ban, hamumentes szárazanyagra számítva)	Színerősség (CIRFX100)
Fruktóz	Glükóz	Pszikóz	Poliszacharid
lzomcrizálatlan	0	99.2	0	0.8	0.6
70 °C-on izomerizált	52.3	46.9	0	0.8	0.7
97.8 °C-on izomerizált	55.8	43.8	0.2	0.2	5.7

Az eredmények azt mutatják, hogy 55.8 % fruktózkonverziót értünk el, miközben a pszikóz koncentrációja 0.2 %, a színanyagtartalom pedig 6 (CIRFX100) alatt maradt.

5. példa

E példa azt mutatja be, hogyan érhető el 55.5 % fruktóz-tartalmú termék olyan kétlépcsős izomerizációs rendszerrel, melyben a második reaktor-fokozat hőmérséklete 100 °C feletti.

A második reaktor-fokozatba betáplálandó szubsztrátumot a 3. példában leírtakkal teljesen egyező módon egy első-fokozatú reaktorral készítettük el, és pH-ját 6.6 értékre állítottuk be.

A második reaktor-fokozat rögzített izomeráz töltetéül rögzített Maxazyme GI szolgált, melyet a 3.

példa szerinti módon megőrültünk és átszitáltunk. Ezt az enzimet a szubsztrátummal szuszpenzióba vittük, a szuszpenziót gázmentesítettük 60°C-on, és a magas hőmérsékletű reaktorban 1.5 X 40.5 cm-es töltetet készítettünk belőle. A teljes izomeráz-aktivi3Q tás 5820 IGIU volt. A szubsztrátumot 60 °C hőmérséklet mellett 90 percen keresztül 6 ml/perc sebességgel szivattyúztuk át a reaktoron. Ezt követően a hőfokot 102 °C-ra növeltük, és a szubsztrátum adagolási sebességet 3 ml/percre mérsékeltük, ilyen körülmé35 nyék között a szubsztrátumnak az enzim-ággyal való kontaktideje kb. 16 percnek adódott, a teljes tartózkodási idő pedig 24 perc körül alakult.

Az oszlopról távozó terméket összegyűjtöttük, és a 3., valamint 4. példában leírt módon elemzésnek vetettük alá. Az eredményeket a következő táblázat foglalja össze.

5. táblázat és 102 °C-on izomerizált oldatok összetétele

Kezelés módja	Szénhidrát-összetétel (tömeg%-ban, hamumentes szárazanyagra számítva)	Színerősség (CIRFX100)
Fruktóz	Glükóz	Pszikóz	Poliszacharid
Izomerizálás nélkül	0	97.6	0	2.4	0.5
Izomerizáció 70 °C-on	51.3	46.4	0	2.3	0.7
Izomcrízáció 102 °C-on	55.5	42.0	0.2	2.3	53.6

-10191 609 ,19

A táblázat adataiból megállapítható, hogy 55.5 % fruktózt tartalmazó terméket kaptunk, miközben csupán 0.2 % pszikóz keletkezett.

Claims

1. Eljárás glükóz-tartalmú cukorlében a glükóz fruktózzá izomerizálására, a teljes szénhidrát-tartalom tömegére vonatkoztatva legalább 53—60 % fruktóztartalom elérésére, lényegében pszikóz és/vagy egyéb nem-fruktóz, nem-glükóz jellegű cukrok képződése nélkül, azzal jellemezve, hogy glükóz-tartalmú kiindulási cukorlevet glükóz-izomerázzal érintkeztetünk 90—140 °C hőmérséklettartományban, 3 és 8 közötti pH-értéken, a kívánt fruktóz-tartalom eléréséig.

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kiindulási glükóz-tartalmú cukoroldatként kukoricakeményítő hidrolízisével kapott cukorlevet alkalmazunk.

3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a glükóz-tartalmú kiindulási cukoroldatként kukoricakeményítő hidrolizátumának az összszénhidrát-tartaiomra számított legalább 52 % fruktóz-koncentrációig vezető izomérizálásával kapott cukorlevet alkalmazunk.

4. Az 1—3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a glükóz-izomerázként Streptomyces nembe tartozó mikroorganizmusból nyert enzimet alkalmazunk.

5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy glükóz-izomerázként az ATCC 21175 jelzésű Streptomyces fajból, annak mutánsaiból, vagy variánsaiból származó enzimet alkalmazunk.

6. Az 1—5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az izomerizációs közegben a kénessav valamely vízoldható sóját alkalmazzuk,

7. Az. 1—6. igénypontok bármelyike szerinti el5 járás, azzal jellemezve, hogy 40-65 töincg% szénhidrátot tartalmazó kiindulási cukorlét használunk.

8. Az 1—7. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a glükóz-tartalmú kiindulási cukorlevet 100 és 110°C közötti hőmérsékleten

10 érintkeztetjük a glükóz-izomerázzal.

9. Az 1—8. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az izomerizációs elegy pH-ját 5 és 6.5 között tartjuk.

10. Az 1—9. igénypontok bármelyike szerinti el15 járás, azzal jellemezve, hogy a kontaktidőt 2 és 30 perc között tartjuk.

11. Az 1—10. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a glükóz-izomcrázt rögzített formában használjuk.

⁰

12. A 11. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a glükóz-izomerázt dietil-amino-etilcellulózon rögzítve alkalmazzuk.

13. Az 1-12. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az első lépésben a glükóztartalmú cukorlevet 20-80 °C hőmérséklettartományban, 6 és 9 pH-érték között 0.5-től 2 óra közötti kontaktidő mellett érintkeztetjük a glükóz-izomerázzal, amíg az említett cukorlében az összes szénhidrátig ra számítva legalább 52 tömeg% fruktóz-koncentrációt érünk el, és ezt a kiindulási anyagot elkülönítés nélkül a második lépésben úgy kezeljük, hog^ az izomerizációs közeg hőmérsékletét 90 és 140 C közé emeljük, a pH-értéket 3 és 8 közöttire állítjuk be ig szükség szerint, majd a fruktóz-tartalmú levet a glükóz-izomerázzal addig érintkeztetjük, míg a fruktózszint 53 és 60 tömeg% közöttire növekszik.