JP2698226B2

JP2698226B2 - 高粘性ｂｓ−１物質の製造法

Info

Publication number: JP2698226B2
Application number: JP3089654A
Authority: JP
Inventors: 克己河口; 弘治里見; 理雄横山
Original assignee: 呉羽化学工業株式会社
Priority date: 1991-03-28
Filing date: 1991-03-28
Publication date: 1998-01-19
Anticipated expiration: 2013-01-19
Also published as: JPH04299986A

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は増粘剤または乳化安定剤
等の食品添加物として有用な高粘性ＢＳ−１物質の製造
法に関する。

【０００２】

【従来の技術】高粘性ＢＳ−１物質は水に容易に溶け、
低粘度で高い粘性を示すことから、増粘剤、タレ防止
剤、分散剤、食感改善剤、凍結安定剤、代用血漿等とし
て食品及び医薬品分野で広い用途を有し、また乳化安定
剤としても優れた性能を有する。

【０００３】特開昭62−282592号公報にはクレブシェラ
・ニューモニア(Klebsiella pneumoniae) ＫＰＳ5002
（微工研条寄第 625号）の培養物からこの高粘性ＢＳ−
１物質が得られることが開示されている。この培養に際
してはラクトースのような糖類を炭素源とし、トリプチ
ケースやペプトン、酵母エキスなどのような有機態の窒
素源およびリン酸塩および微量金属類を添加し、pHを４
〜８、特に好ましくは中性付近に調整することが望まし
いと記載されている。しかし、このような培養条件では
収量が比較的低く、最高でも培養液１ｌ当り９ｇ程度し
か得られなかった。従ってＢＳ−１物質の収量を更に上
げるような培養条件を見出すことが要望されていた。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明はクレブシェラ
属に属する微生物により生産される高粘性ＢＳ−１物質
の収量を増加せしめる製造法を提供することを課題とす
る。本発明者等はクレブシェラ属に属する微生物の培養
において培養液の初発pHをアルカリ側にすることにより
生産性が向上することを見出し、本発明をなすに至っ
た。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明の高粘性ＢＳ−１
物質の製造法はクレブシェラ属(klebsiella)に属する微
生物を培養液の初発pHを8.0 を越え11.0以下に調節する
ことにより培養し、培養物から高粘性ＢＳ−１物質を分
離、採取することを特徴とするものである。

【０００６】高粘性ＢＳ−１物質は次に示す理化学的性
質を有する高い水溶液粘度を持つものである。

【０００７】ａ外観：無味、無臭の白色粉末。

【０００８】ｂ溶解性：水に易溶、メタノール、酢酸
エチル、クロロホルム、ベンゼンに難溶、鉱酸により加
水分解。

【０００９】ｃ粘度：2000〜3000センチポイス（１％
水溶液、温度30℃、ずり速度 3.83sec^-1）。

【００１０】ｄ主要構成糖成分：ガラクトース50〜70
％、マンノース 0.5〜３％、グルコース１〜５％、グル
クロン酸25〜37％。

【００１１】ｅ呈色反応：フェノール硫酸反応：陽性カルバゾール硫酸反応陽性モーリッシュ反応陽性ニンヒドリン反応陽性ｆ分子量：（分子量はゲル濾過法により測定した。） 10万〜1000万ｇ元素分析値：Ｃ 5.0〜40.0％Ｈ 2.0〜 6.0％Ｎ 0 〜 1.0％ｉ赤外線吸収スペクトル：（ＫＢｒ錠剤法）（cm^-1） 3400，2920，1620，1420，1300，1140，1080，800 また、高粘性ＢＳ−１を更に精製した精製高粘性ＢＳ−
１の理化学的性質は以下の通りである。

【００１２】ａ外観：無味、無臭の白色粉末。

【００１３】ｂ溶解性：水に易溶、メタノール、酢酸
エチル、クロロホルム、ベンゼンに難溶、鉱酸により加
水分解。

【００１４】ｃ粘度：2400〜2600センチポイス（１％
水溶液、温度30℃、ずり速度 3.83sec^-1）。

【００１５】ｄ主要構成糖成分：ガラクトース60〜65
％、マンノース 1.5〜2.5 ％、グルコース２〜３％、グ
ルクロン酸30〜35％。

【００１６】ｅ呈色反応：フェノール硫酸反応：陽性カルバゾール硫酸反応陽性モーリッシュ反応陽性ニンヒドリン反応陰性ｆ分子量：200万〜1000万ｇ元素分析値：Ｃ 37.5〜39％Ｈ 5.5〜 6％Ｎ 0 〜 0.2％ｉ赤外線吸収スペクトル：（ＫＢｒ錠剤法） (cm^-1) 3400，2920，1620，1400，1360，1280，1220，1140，10
60， 920，860，800 ，760 高粘性ＢＳ−１物質を生産するのに利用されるクレブシ
ェラ属に属する菌種は東京都の隅田川より分離・同定し
たものであって、その菌学的性質を調べた結果、「バー
ジェイズ・マニュアル・オブ・システマティック・バク
テリオロジー（Bergey´s Mannual of Systematic Bact
eriology) 第１巻。1984版」に記載されたクレブシェラ
・プランティコーラ(klebsiella planticola) に属す
る。

【００１７】(1) 形態：莢膜を有する桿菌、単一細
胞、無胞子、 0.7〜0.9 × 1.0〜2.0 μm の大きさ。

【００１８】(2) グラム染色：陰性 (3) 寒天培地上の所見：白色、円形又は不定形のコロ
ニー、スライム状の粘質物形成。

【００１９】(4) 各培地における生育状態：イ肉汁寒天平板培養で良好に生育する。

【００２０】ロ肉汁寒天斜面培養で良好に生育する。

【００２１】ハ肉汁液体培養で良好に生育する。

【００２２】ニ肉汁ゼラチン穿刺培養で生育する。

【００２３】ホリトマス・ミルクでは良好に生育し、
カゼインの凝集が認められる。

【００２４】 (5) 運動性：陰性 (6) カタラーゼ：陽性 (7) オキシダーゼ：陰性 (8) β−ガラクトシターゼ：陽性 (9) グルコースからのガス産生：陽性 (10) 炭水化物からの酸生成：アラビノース、イノシトール、ラクトース、マルトース、マンニトール、ソルビトール、シュークロース、キシロース、ラムノース、ラフイノース、トレハロース、及びサリシンからの酸生成陽性アドニトールからの酸生成陰性 (11) クエン酸塩の利用：陽性 (12) マロン酸塩の利用：陽性 (13) グルコン酸塩の利用：陽性 (14) ＶＰ(Voges Proskauer）テスト：陽性 (15) ＭＲ（メチルレッド）テスト：陰性 (16) 硝酸塩の還元：陽性 (17) 尿素の加水分解：陽性 (18) アルギニンの加水分解：陰性 (19) ゼラチンの加水分解：陰性 (20) フェニルアラニンテスト：陰性 (21) インドールの生成：陰性 (22) リジンデカルボキシラーゼ：陽性 (23) オルニチンデカルボキシラーゼ：陰性 (24) 脱窒反応：陰性 (25) 硫化水素の生成：陰性 (26) でんぷんの加水分解：陽性 (27) 無機窒素源の利用：陽性無機窒素源として硝酸アンモニウム、硝酸カリウム、尿
素、リン酸２水素アンモニウム、リン酸水素２アンモニ
ウム、リン酸アンモニウムナトリウム及び硫酸アンモニ
ウムを利用。

【００２５】 (28) ウレアーゼ：陽性 (29) 生育の範囲：イ pH4.0 〜13.5（耐アルカリ性）。

【００２６】ロ温度10℃で増殖する。

【００２７】44.5℃でラクトースからガスを産生しな
い。

【００２８】(30) 酵素に対する態度：通性好気性。

【００２９】(31) ＯＦテスト：Ｄ−グルコース、シュ
ークロース、ラクトース、イヌリン、Ｌ−ソルボース、
Ｌ−アラビノース、ミオーイノシトール、Ｄ−マンニト
ール、Ｌ−ラムノース、ラフィノース、Ｄ−ソルビトー
ル、ドルシトールを基質とした時（Ｆ）、Ｄ−メリジト
ースの時（Ｏ）。

【００３０】 (32) 下記の糖類からの酸及びガスの生成：Ｄ−マンノース酸及びガス生成Ｄ−フラクトース同上Ｄ−ガラクトース同上グリセリン同上でんぷん同上 (33) 酵素法によるＧ（グアニン）＋Ｃ（シトシン）含
有量（モル％）54.8。

【００３１】上記菌学的性質を有する菌種は、クレブシ
ェラ・プランティコーラ(klebsiella planticola) ＫＰ
Ｓ5003の菌株名で工業技術院微生物工業技術研究所に微
工研条寄第3300号の受託番号で寄託されている。

【００３２】高粘性ＢＳ−１物質はクレブシェラ・プラ
ンティコーラＫＰＳ5003菌株を炭素源、窒素及びその他
の生育に必要な栄養成分を含む固体培地もしくは液体培
地中で、湯盪培養や通気撹拌培養のような好気的培養を
行うことにより生産される。ここで培地に用いる炭素源
としては、ラクトース、シュークロース、マルトース、
ガラクトース、グルコース、フラクトース等の糖類を例
示し得るが、中でもラクトースが好ましい。これら糖類
の培地中における濃度は使用菌が生育し得る程度であれ
ば特に限定されないが、通常１〜10％（Ｗ／Ｖ）、好ま
しくは３〜５％（Ｗ／Ｖ）である。また、窒素源として
は、ポリペプトン、酵母エキス、肉エキス、トリプチケ
ースのような有機物、又は硝酸塩、アンモニウム塩のよ
うな無機物を例示し得るが、ＢＳ−１物質の生産性の観
点からは有機態の窒素源が好ましいといえる。さらに、
培地には必要に応じて、リン酸一カリウムやリン酸二カ
リウムのようなリン酸塩、鉄、銅、マグネシウム、マン
ガン、モリブテン、亜鉛、ホウ素等の微量金属類及びビ
オチン、チアミン、ビタミンＢ₁₂等のビタミン類及び核
酸類等を添加してもよい。

【００３３】上記培地中での培養温度は、使用菌の増殖
至適温度範囲である20〜37℃好ましくは25〜32℃であ
る。

【００３４】本発明においては培養液の初発pHは極めて
重要である。初発pHはアルカリ側であることが必要で８
を越え11.0以下、特に好ましくは 8.2〜10.5であること
が必要である。培養液の初発pHが８以下であると高粘性
ＢＳ−１物質の収量が低下し、本発明の目的が達成され
ない。またpHが11.0以上の強アルカリ性領域では菌の増
殖は認められるが、高粘性ＢＳ−１物質の収量が低下す
る。

【００３５】培養時間は、培地の粘度が最大に達するま
で行えばよいが、実際上は生産効率の点から通常３〜７
日間でよい。

【００３６】上記菌株を、上述のような培養条件下に培
養すると、経時的に培地の粘度が上昇し、ＢＳ−１物質
が培地中に生産、蓄積されたことがわかる。

【００３７】培養終了後、培地中のＢＳ−１物質を常法
に従って分離、採取する。この分離、採取は、例えば液
体培地を用いた場合には、培養終了後培養液を水で希釈
し、遠心分離などにより菌体等の不純物を除去し、次い
で除菌した培養液にエチルアルコール、メチルアルコー
ル、イソプロピルアルコール、アセトンのごとき有機溶
媒またはセチルトリメチルアンモニウムやブチルアマイ
ドのような第４級アミンを加えると粗ＢＳ−１物質が沈
澱する。この沈澱を洗浄した後、さらにアセトンで脱水
及び脱脂した後乾燥させることにより、高粘性ＢＳ−１
物質が得られる。

【００３８】上記高粘性ＢＳ−１物質をエチルアルコー
ルを用いて再析出させる操作を繰返し行い、更に必要に
応じて透析処理もしくはクロマトグラフィーで処理して
精製することにより精製高粘性ＢＳ−１物質が得られ
る。

【００３９】以下、実施例によって本発明を具体的に説
明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものでは
ない。

【００４０】

【実施例】実施例１クレブシェラ・プランティコーラＫＰＳ5003（微工研
条寄第3300号）をラクトース３重量％、トリプチケース
0.35重量％、リン酸−カリウム 0.6重量％、硫酸マグネ
シウム0.07重量％、塩化マンガン0.0001重量％及び寒天
1.4重量％からなる斜面培地に増殖させたものを白金耳
でかき取り、上記培地において寒天を除いた培養液10ml
に接種し、30℃で１日間振盪培養で前培養を行なった。

【００４１】次いで、上記前培養に用いたものと同様な
組成で５ＮＮａＯＨでpH10.0 に調整した培養液を 120
℃、15分間加熱滅菌したものの１リットル（ｌ）に、上
記前培養したものを無菌的に接種して30℃で５日間振盪
培養(120rpm)を行なった。培養の進行に伴い培養液は粘
稠となり、ＢＳ−１物質の生産、蓄積が認められた。

【００４２】得られた培養液を４℃で18,000rpm(31,000
ｇ）で15分間遠心分離して菌体を除去したものに、２倍
量のエタノールを加えてＢＳ−１物質を析出させた。析
出したＢＳ−１物質を遠心分離により沈澱させ、この沈
澱をエタノールにより洗浄した後、アセトンを加えてホ
モゲナイズした。次いでアセトンを除去してデシケータ
ー内で乾燥し、乾燥物13.3ｇを得た。

【００４３】得られた乾燥物の理化学的性質を調べた結
果、下記に示すとおりであって、高粘性ＢＳ−１物質で
あると確認された。

【００４４】ａ外観：無味、無臭の白色粉末。

【００４５】ｂ溶解性：水に易溶、メタノール、酢酸
エチル、クロロホルム、ベンゼンに難溶、鉱酸により加
水分解。

【００４６】ｃ粘度：2273センチポイス（１％水溶
液、温度30℃、ずり速度 3.83sec^-1）。

【００４７】ｄ主要構成糖成分：ガラクトース62.1
％、マンノース1.5％、グルコース 3.2％、グルクロン
酸33.2％。

【００４８】ｅ呈色反応：フェノール硫酸反応陽性カルバゾール硫酸反応陽性モーリッシュ反応陽性ニンヒドリン反応陽性ｆ分子量：20万以上ｇ元素分析値：Ｃ 35.2％Ｈ 4.3％Ｎ 0.3％ｉ赤外線吸収スペクトル（cm^-1）（ＫＢｒ錠剤法、1.5mg ＢＳ−１／１ｇＫＢｒ）島津フーリエ変換赤外分光光度計ＦＴＩＲ−4200 3400，2926，1618，1419，1370，1150，1074，789 なお図１にここで得られた高粘性ＢＳ−１物質の赤外吸
収スペクトルを示す。上述のごとくして得た高粘性ＢＳ
−１物質13.3ｇを蒸留水に溶解し、４℃ 18000rpm(3100
0 ｇ）で遠心分離により夾雑物を除去したものに、エタ
ノールを加えてＢＳ−１物質を再析出させる操作を２回
繰り返して行なった後、析出物を蒸留水に溶解した。

【００４９】この水溶液を透析膜に入れ、純水に対して
24時間透析を行い、次いで真空凍結乾燥を行い、白色塊
状の精製物９ｇを得た。得られた精製物の理化学的性質
は下記に示すとおりである。

【００５０】ａ外観：無味、無臭の白色粉末。

【００５１】ｂ溶解性：水に易溶、メタノール、酢酸
エチル、クロロホルム、ベンゼンに難溶、鉱酸により加
水分解。

【００５２】ｃ粘度：2432センチポイス（１％水溶
液、温度30℃、ずり速度 3.83sec^-1）ｄ構成成分：ガラクトース56.1％、マンノース 1.3
％、グルコース 1.8％、グルクロン酸29.0％。

【００５３】（主要構成糖成分比率）：ガラクトース6
3.6％、マンノース 1.5％、グルコース 2.0％、グルク
ロン酸32.9％。

【００５４】ｅ呈色反応：フェノール硫酸反応陽性カルバゾール硫酸反応陽性モーリッシュ反応陽性ニンヒドリン反応陰性ｆ分子量： 200万以上ｇ元素分析値：Ｃ 38.5％Ｈ 5.8％Ｎ 0.1％ｉ赤外線吸収スペクトル（cm^-1） 3422，2926，1617，1412，1373，1300，1234，1150，10
73， 924， 889， 789， 662 なお、図２に、ここで得られた精製高粘性ＢＳ−１物質
の赤外吸収スペクトルを示す。

【００５５】実施例２〜３、参考例１〜２実施例１と同様の組成の培養液の初発pHを 7.4（参考
例１）、 8.2（実施例２）、 9.3（実施例３）、11.5
（参考例２）として実施例１と同じ条件で培養を行っ
た。

【００５６】培養時の培養液のpH、粘度、製品収量及び
製品粘度を実施例１を含め第１表に示した。

【００５７】

【表１】初発pHが本発明の範囲であると培養液の最終粘度（培養
５日間）が高く、ＢＳ−１物質の収量が大であることが
判る。

【００５８】尚、実施例２〜３、参考例１〜２は何れも
その理化学的性質が高粘度ＢＳ−１物質の理化学的性質
(a)〜(i) を満足し、高粘度ＢＳ−１物質であることが
確認された。

【００５９】

【発明の効果】本発明ではクレブシェラ属に属する微生
物を培養液の初発pHを8.0 を越え11.0以下に調整して培
養するため、得られた高粘性ＢＳ−１物質の培養液１リ
ットル当りの収量を顕著に改善することができた。従来
の方法ではpH４〜８で行なわれていた為、その収量は最
高でも9.0g／ｌであったが本発明では高粘度のＢＳ−１
物質を10〜13.3g ／ｌの高収量で得ることができた。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は実施例１で得られた高粘性ＢＳ−１物質
の赤外吸収スペクトルを示す。

【図２】図２は実施例１で得られた精製高粘性ＢＳ−１
物質の赤外吸収スペクトルを示す。

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】クレブシェラ属(klebsiella)に属する微
生物を培養液の初発pHを8.0 を越え11.0以下に調整する
ことにより培養し、培養物から高粘性ＢＳ−１物質を分
離、採取することを特徴とする高粘性ＢＳ−１物質の製
造法。
【請求項２】クレブシェラ属に属する微生物がクレブ
シェラ・プランティコーラ(klebsiella planticola) Ｋ
ＰＳ5003（微工研条寄第3300号）である請求項１記載の
高粘性ＢＳ−１物質の製造法。