PT103714B

PT103714B - Processo para a obtenção de um polímero à base de galactose

Info

Publication number: PT103714B
Application number: PT103714A
Authority: PT
Inventors: D'ascenção Carvalho Fernandes De Miranda Reis Maria; Manuel Freitas Oliveira Rui; Filomena Andrade De Freitas Maria; Manuel Delgado Alves Víctor; Oliveira Pais Joana; Paula Pereira Da Cunha Rodrigues Oliveira Cristina
Original assignee: 73100 - Setenta E Três Mil E Cem, Lda.
Priority date: 2007-04-11
Filing date: 2007-04-11
Publication date: 2020-07-28
Also published as: JP5559032B2; CA2683817C; CN101707894B; PT103714A; US9428591B2; US20100113765A1; AU2008239866A1; CN101707894A; KR20100016250A; US8679796B2; BRPI0810170A8; WO2008127134A1; EP2144938B1; JP2010523789A; BRPI0810170B1; KR101575365B1; WO2008127134A4; US20140190367A1; BRPI0810170A2; EP2144938A1

Abstract

A PRESENTE INVENÇÃO DIZ RESPEITO AO PROCESSO DE PRODUÇÃO DE UM BIOPOLÍMERO QUE CONSISTE NUM POLISSACÁRIDO CONSTITUÍDO POR GALACTOSE (50-90% M/M), GLUCOSE (1-25% M/M), MANOSE (1-25% M/M) E RAMNOSE (0,5-20% M/M), PODENDO CONTER, TAMBÉM, EM QUANTIDADES VESTIGIAIS, XILOSE, FUCOSE, RIBOSE, ARABINOSE E/OU FRUTOSE. O POLÍMERO À BASE DE GALACTOSE CONTÉM, AINDA, COMPONENTES NÃO SACARÍDEOS, NOMEADAMENTE, ÁCIDOS ORGÂNICOS E GRUPOS FOSFATO. O PROCESSO DE PRODUÇÃO DO POLÍMERO À BASE DE GALACTOSE DA PRESENTE INVENÇÃO É UM PROCESSO POR FERMENTAÇÃO MICROBIANA, UTILIZANDO COMO FONTE DE CARBONO GLICEROL OU MISTURAS CONTENDO GLICEROL, E RECUPERAÇÃO DO POLISSACÁRIDO DO MEIO DE CULTURA. O PROCESSO DE PRODUÇÃO DO POLÍMERO À BASE DE GALACTOSE PODE RESULTAR NA CO-PRODUÇÃO DE BIOPOLÍMEROS INTRACELULARES, NOMEADAMENTE, POLI-HIDROXIALCANOATOS.

Description

DESCRIÇÃO PROCESSO PARA A OBTENÇÃO DE DM POLÍMERO À BASE DE GALACTOSE

Domínio técnico da invenção

A presente invenção relaciona-se com o processo de produção de um biopolimero que consiste num polissacárido constituído por galactose (50-90% m/m), glucose (1-25% m/m) , manose (1-25% m/m) e ramnose (0,5-20% m/m), podendo conter, também, em quantidades vestigiais, xilose, fucose, ribose, arabinose e/ou frutose, e outros componentes não sacarideos, tais como ácidos orgânicos e grupos fosfato. O referido processo realiza-se através de fermentação microbiana, utilizando como fonte de carbono glicerol ou misturas contendo glicerol.

Estado da Técnica

Os polissacáridos são hidratos de carbono de elevado peso molecular, constituídos por monossacáridos iguais ou diferentes, que formam unidades repetitivas, polimerizando. São as macromoléculas mais abundantes nos seres vivos, existindo em todas as plantas e algas, em vários animais e em alguns microrganismos. Devido às suas propriedades físico-químicas, nomeadamente, a sua capacidade de retenção de água, de formação de filmes e a sua reologia (viscosidade, gelificação, emulsificação, etc.), os polissacáridos são largamente utilizados numa variedade de sectores industriais.

Actualmente, os polissacáridos extraídos de plantas (ex. goma de guar, goma arábica, pectinas), de algas (ex. alginatos, carragenos, agar) ou crustáceos (ex. quitina) ainda dominam o mercado, representando os polissacáridos microbianos uma pequena fracção do mercado de biopolimeros. Os principais factores limitantes para a utilização de polissacáridos microbianos estão associados ao seu custo de produção, em particular ao custo do substrato, e ao facto de muitas das espécies produtoras serem patogénicas ou ser difícil obter aceitação por parte do público para utilização desses polímeros em certas aplicações. Apesar disso, nos últimos anos, verificou-se um interesse crescente no isolamento e identificação de novos polissacáridos microbianos, que, devido às suas propriedades físico-químicas e reológicas, possam competir com os polissacáridos de outras origens. A produção de polissacáridos por plantas e algas, em particular, está sujeita ao impacto das condições climatéricas e de factores ambientais, tais como a poluição, que originam variabilidade tanto na quantidade como na qualidade dos polímeros produzidos. Por outro lado, os polissacáridos microbianos possuem uma variedade de propriedades que não são encontradas nos polímeros de origem vegetal, incluindo actividade biológica, como, por exemplo, actividade antitumoral, antiviral, anticoagulante, anti-inflamatória ou imuno-estimuladora.

Entre os polissacáridos microbianos extensivamente estudados e que foram ou estão a ser desenvolvidos comercialmente destacam-se: a celulose bacteriana, produzida por Acetobacter xylinium, que possui propriedades semelhantes ao produto de origem vegetal; o dextrano, produzido por bactérias do género Leuconostoc, e o levano, produzido por bactérias dos géneros Bacillus, Zymomonas e Lactobacillus, que ocorrem exclusivamente em bactérias; o xantano, produzido por bactérias do género Xanthomonas, e o gelano, produzido por Sphingomonas paucimobilis, que possuem propriedades físicas superiores aos polissacáridos de origem vegetal tradicionais (ex. alginato, carrageno); o ácido hialurónico, produzido por Streptococcus equii, e os succinoglicanos, produzidos por bactérias dos géneros Pseudomonas, Rhizobium, Agrobacterium e Alcaligenes, que, por serem biologicamente semelhantes a polímeros eucariotas, são utilizados em aplicações médicas, farmacêuticas e cosméticas.

Devido ao crescente interesse em recursos renováveis, como alternativa aos produtos da indústria química, será, certamente, intensificada a procura de novos produtos, sendo provável que surjam, nos próximos anos, novos polissacáridos microbianos com interesse comercial. 0 valor comercial de um determinado polissacárido dependerá da sua composição, da quantidade produzida pela cultura e da facilidade de extracção e processamento. 0 desenvolvimento industrial dependerá das suas propriedades reológicas, particularmente, da sua capacidade para formar soluções com excelente viscosidade, estáveis para gamas de temperatura e pH alargadas, e das suas propriedades biológicas serem únicas e/ou poderem ser utilizadas em novas aplicações.

De entre os polissacáridos com potencial interesse industrial encontram-se os polissacáridos ricos em galactose. Estes polímeros podem ser encontrados em plantas (ex. goma arábica), algas (ex. carrageno e ágar), assim como em vários microrganismos, nomeadamente, protozoários, fungos, leveduras e bactérias. A presença de galactose é relativamente comum em polissacáridos microbianos, embora o tipo de ligações glicosídicas envolvidas varie. Esses polissacáridos microbianos podem ser homopolímeros de galactose (galactanos) ou heteropolímeros, contendo, para além de quantidades variáveis de galactose, outros monómeros sacarideos, sendo os mais comuns a glucose, a manose, a ramnose, a arabinose e a fucose. Muitos destes polímeros contêm, para além de açúcares neutros, também açúcares ácidos (ex. ácido glucurónico, ácido galacturónico), assim como outros constituintes não sacarideos, tais como ácidos orgânicos (ex. acetato, succinato, piruvato) ou resíduos inorgânicos (ex. sulfato, fosfato).

Os homopolímeros de galactose são produzidos, por exemplo, pelas bactérias Bifidobacterium infantis (Tone-Shimokawa et al., 1996), Bifidobacterium catenulatum (Nagaoka et al., 1996), Klebsiella pneumoniae (Whitfield et al., 1991), Pasteurella haemolytica (Lacroix et al., 1993), Serratia marcescens (Aucken et al., 1998), Azorhizobium caulinodans (D'Haeze et al., 2004) e Methylobacterium sp. VTT-E-11929 (Verhoef et al., 2003).

O polissacárido a que se refere esta invenção é um heteropolímero, que contém, para além de galactose como o seu componente maioritário, outros açúcares neutros, nomeadamente, glucose, manose e ramnose, o que lhe confere uma maior complexidade estrutural. Por outro lado, nos galactanos produzidos por Bifidobacterium infantis e Bifidobacterium catenulatum, os resíduos de galactose encontram-se na forma de anel de furanose, enquanto que, no polissacárido da invenção, todos os resíduos de galactose se encontram na forma de anel de piranose. Além disso, os galactanos produzidos por estas bactérias são componentes das respectivas paredes celulares, o que torna o processo de extracção do polímero extremamente mais difícil, em comparação com o polissacárido da invenção, que é um produto extracelular. Os galactanos produzidos pelas bactérias Klebsiella pneumoniae, Pasteurella haemolytica e Serratia marcescens são lipopolissacáridos, constituídos por unidades de galactose alternadamente na forma de piranose e de furanose. Estas bactérias são microrganismos patogénicos para o Homem (K. pneumoniae e S. marcescens) e animais, como gado bovino e ovino (P. haemolytica), estando os galactanos por elas produzidos associados ao desenvolvimento de infecções. Por esta razão, o interesse destes polímeros restringe-se ao estudo da patogénese das infecções causadas por estas bactérias, sendo o seu desenvolvimento comercial pouco provável. Além disso, por serem lipopolissacáridos, o processo de extracção e purificação destes galactanos é mais difícil em comparação com o polímero da invenção, que é um exopolissacárido.

Heteropolímeros contendo galactose como o seu componente maioritário, são produzidos por diversos microrganismos, nomeadamente, bactérias dos Géneros Bifidobacterium, Klebsiella, Erwinia, Methylobacterium, Pseudomonas, Lactobacillus e Streptococcus.

Bactérias do Género Bifidobacterium possuem como componentes típicos da parede celular, para além de galactanos (ex. Bifidobacterium infantis e Bifidobacterium catenulatum), ramnogalactanos (polissacáridos constituídos por galactose e ramnose). Bifidobacterium longum, por exemplo, possui, na sua parede celular, um polímero constituído por galactose (cerca de 60%) e ramnose (cerca de 40%), ambos na forma de anel de piranose (Nagaoka et al., 1995). O polímero da invenção, para além de ser extracelular, também difere do polissacárido de

Bifidobacterium longum por ter uma menor percentagem de ramnose e por possuir glucose e manose.

Algumas bactérias do Género Klebsiella, também produzem heteropolissacáridos extracelulares ricos em galactose, tais como, por exemplo: Klebsiella sp. estirpe K32, que produz um polissacárido constituído por galactose (45 63%) e ramnose (12 - 55%), com um conteúdo variável de piruvato (Bryan et al., 1986); Klebsiella sp. Sll, que produz um polissacárido constituído por galactose (62,5%), glucose (25%) e manose (12,5%), com um conteúdo inferior de ácidos urónicos (Dermlim et al., 1999); e Klebsiella planticola DSM 3092, que produz um polissacárido constituído por galactose (38,2%), manose (15,9%), glucose (1,7%), ácido glucurónico (17,5%), acetato (5,3%), succinato (2,6%) e sulfato (14,6%) (EP0184755). 0 polímero da invenção difere dos polissacáridos produzidos por estas bactérias por ter na sua composição, simultaneamente, monómeros de galactose, glucose, manose e ramnose. Além disso, não contém ácidos urónicos, o que o distingue do polissacárido produzido por Klebsiella planticola.

A produção de heteropolissacáridos ricos em galactose também ocorre em bactérias do Género Methylobacterium, tal como, por exemplo, a bactéria Methylobacterium organophilum, que produz metilano, um exopolissacárido constituído por galactose, glucose e manose (razão molar 4:3:3), ácidos orgânicos (piruvato e acetato) e ácidos urónicos (US5064759). O polímero da invenção difere do polissacárido metilano por ter um conteúdo mais elevado em galactose e por não conter ácidos urónicos.

Entre as bactérias fitopatogénicas do Género Erwinia encontram-se algumas estirpes produtoras de polissacáridos ricos em galactose. Exemplos destas estirpes incluem: Erwinia amylovora, que produz amilovorano, um exopolissacárido constituído por galactose (cerca de 80%) e ácido glucurónico (cerca de 20%), ácidos orgânicos (acetato e piruvato) e, numa percentagem reduzida, glucose (Eastgate et al., 2000); Erwinia pyrifoliae, que produz um exopolissacárido semelhante ao amilovorano, mas com um maior conteúdo em acetato e sem glucose (Kim et al., 2002); Erwinia stewartii (Pantoea stewartii ssp. stewartii} , que produz stewartano, um polissacárido capsular, com uma composição semelhante ao amilovorano, mas com um maior conteúdo em glucose (Minogue et al., 2005); Erwinia chrysanthemi Ech6, que produz um exopolissacárido, também constituído por galactose, glucose e ácido glucurónico, mas contendo adicionalmente fucose numa percentagem idêntica ao conteúdo em galactose (Yang et al., 2001). O polímero da invenção difere destes polissacáridos, principalmente, por não possuir ácido glucurónico na sua composição e possuir adicionalmente manose e ramnose.

Várias espécies de Enterobacter (ex. Enterobacter amnigenus, Enterobacter cloacae} produzem heteropolissacáridos ricos em galactose (21 - 24%) e fucose (16 - 27%), contendo quantidades variáveis de glucose, manose e ramnose, assim como ácidos orgânicos (acetato e piruvato) e ácidos urónicos (ácido glucurónico e/ou ácido galacturónico) (Verhoef et al., 2005). Um dos exopolissacáridos típicos de bactérias do Género Enterobacter é o ácido colanico, que é constituído por galactose, fucose, glucose e ácido glucurónico (Ratto et al., 2006). O polímero da invenção difere destes polissacáridos pelo seu conteúdo mais elevado em galactose, por o conteúdo em fucose ser nulo ou vestigial e pela ausência de ácidos urónicos.

A produção de heteropolissacáridos ricos em galactose também ocorre em bactérias do Género Vibrio, tal como, por exemplo, Vibrio harveyi, que produz um polissacárido constituído por galactose e glucose, como componentes maioritários, e ramnose, fucose, ribose, arabinose, xilose e manose, como componentes minoritários (Bramhachari et al., 2006). Este polissacárido contém também quantidades elevadas de ácidos urónicos, nomeadamente, ácido galacturónico, o que o distingue do polissacárido da invenção.

Várias bactérias lácticas dos Géneros Lactobacillus, Lactococcus e Streptococcus produzem uma variedade de heteropolissacáridos constituídos principalmente por galactose e glucose. Espécies de Lactobacillus produtoras de polissacáridos ricos em galactose incluem: Lactobacillus delbrueckii, que produzem vários polissacáridos constituídos por galactose e glucose contendo, alguns deles, também ramnose ou manose; Lactobacillus rhamnosus e Lactobacillus kefiranofaciens, que produzem polissacáridos constituídos por galactose e glucose; e Lactobacillus paracasei, que produz um polissacárido constituído por galactose e N-acetilgalactosamina (Faber et al., 2001; Vanhaverbeke et al., 1998; Yang, 2000). Estirpes de Lactococcus lactis ssp. cremoris produzem polissacáridos constituídos por galactose e glucose ou constituídos por galactose, glucose e ramnose (Yang, 2000). Espécies de Streptococcus produtoras de polissacáridos ricos em galactose incluem: Steeptococcus salivarius, que produzem vários polissacáridos constituídos por galactose e glucose, ramnose, manose ou N-acetilgalactosamina (Yang, 2000); Streptococcus thermophilus, que produzem, por exemplo, polissacáridos constituídos por galactose e ramnose (Vaningelgem et al., 2004) ou polissacáridos constituídos por galactose, ramnose e glucose (US5965127).

A produção de heteropolissacáridos ricos em galactose também ocorre em bactérias do Género Pseudomonas, tais como, por exemplo: Pseudomonas marginalis, que produz marginalano, um exopolissacárido constituído por galactose e glucose, em razões equimolares (Osman et al., 1989); e Pseudomonas fluorescens, que produz um exopolissacárido constituído por galactose, manose e arabinose, como principais componentes (Hung et al., 2005). 0 polímero da invenção difere do polissacárido marginalano por possuir na sua composição, para além de galactose e glucose, também, manose e ramnose, como componentes maioritários. A presença de arabinose como um dos componentes maioritários no polissacárido produzido por Pseudomonas fluorescens diferencia-o do polissacárido da invenção, no qual não há arabinose ou este existe apenas em quantidades vestigiais.

O polímero da invenção possui uma composição que o distingue de outros polissacáridos microbianos caracterizada pela presença de galactose como principal componente e a presença simultânea de glucose, manose e ramnose em quantidades consideráveis, assim como a ausência de ácidos urónicos ou de açúcares aminados.

O polímero da invenção é um produto extracelular, pelo que o processo de extracção é relativamente fácil, em comparação com alguns polissacáridos que são constituintes das paredes celulares microbianas ou das paredes celulares de algas ou plantas.

polímero à base de galactose é biodegradável, pelo que não causa problemas de poluição ambiental. 0 polissacárido da invenção possui propriedades reológicas interessantes, nomeadamente, o seu comportamento como fluido pseudoplástico e a sua capacidade para formar soluções aquosas com excelente viscosidade, estáveis para gamas de temperatura e pH alargadas.

Embora a composição e a quantidade do polissacárido produzido por um microrganismo sejam determinados geneticamente, é possível influenciar ambos, alterando as condições de cultura. A produção de polissacáridos pode ser desencadeada como parte da resposta a uma situação de stress, sendo geralmente favorecida por: presença de fonte de carbono em excesso, acompanhada pela limitação de outro nutriente (ex. azoto ou fósforo); temperaturas baixas; microaerofilia ou anaerobiose ou arejamento excessivo; stress salino; presença de catiões (ex. Ca²⁺ ou Sr²⁺) ; ou a presença de compostos tóxicos ou inibidores para o crescimento microbiano (ex. H2O2 ou antibióticos). A quantidade de polissacárido produzida é dependente da composição do meio de cultura e das condições de incubação, em particular, da disponibilidade de fonte de carbono, tanto intra como extracelular, e do balanço entre o carbono e outros nutrientes limitantes.

A produção de polissacáridos microbianos é, normalmente, realizada por fermentação em condições aeróbias, sendo as fontes de carbono mais utilizadas açúcares (ex. glucose, sacarose, amido). Na maioria dos processos utilizados para a obtenção dos polissacáridos ricos em galactose descritos atrás, são utilizados açúcares, como fontes de carbono, principalmente, glucose, ou, em alguns casos, sacarose ou lactose. 0 processo de produção de metilano por Methylobacterium organophilum é baseado na utilização de metanol ou de misturas de metanol com glucose, manose, galactose ou succinato. 0 processo da presente invenção prevê a utilização de glicerol ou misturas contendo glicerol como fonte de carbono preferencial para a fermentação microbiana. A utilização de glicerol constitui uma vantagem, já que permite a utilização de resíduos contendo glicerol (ex. subproduto da produção de biodiesel), reduzindo os custos com a fonte de carbono. 0 processo da invenção prevê, também, a utilização de outras fontes de carbono (ex. açúcares, metanol), em alternativa ao glicerol ou em mistura com este, o que torna o processo mais versátil.

Numa fermentação aeróbia, em que a viscosidade do meio aumenta continuamente, atingindo valores consideráveis, uma das dificuldades do processo é a distribuição eficiente de oxigénio e nutrientes através do caldo de fermentação, o que é, frequentemente, conseguido mantendo o arejamento e/ou a agitação elevados. No processo de fermentação da presente invenção, a produção do polímero à base de galactose ocorre com baixas concentrações de oxigénio dissolvido, o que permite minimizar o arejamento e, desse modo, reduzir os custos de operação.

A co-produção de polissacáridos e biopolímeros intracelulares, nomeadamente, polihidroxialcanoatos, ocorre naturalmente em vários microrganismos, em condições específicas de crescimento. Exemplos de microrganismos capazes de produzir simultaneamente polissacáridos e polihidroxialcanoatos incluem, por exemplo: bactérias do Género Rhizobium (ex. Rhizobium meliloti), que armazenam intracelularmente polyhydroxibutirato, como reserva de carbono e energia, e produzem um exopolissacárido constituído por glucose, galactose e ácido glucurónico (Tavernier et al., 1997); as bactérias Azotobacter vinelandii e Pseudomonas aeruginosa, que produzem um exopolissacárido, alginato, e acumulam intracelularmente polihidroxibutirato (Galindo et al., 2007; Pham et al., 2004). 0 processo de fermentação da presente invenção prevê a sua utilização para a produção de biopolímeros intracelulares, nomeadamente, polihidroxialcanoatos, em simultâneo com a produção do polímero à base de galactose.

Os polissacáridos, nomeadamente os polissacáridos ricos em galactose, apresentam aplicação numa grande variedade de áreas.

Na indústria alimentar os polissacáridos à base de galactose podem ser usados como agentes espessantes, agentes ligantes, gelificantes, texturizantes, emulsionantes, estabilizantes, em alimentos como molhos de salada, vinagre, gelados, condimentos (como, por exemplo, ketchup ou mostarda), sumos de vegetais e de frutas, produtos desidratados (como, por exemplo, sopas, molhos, cereais e papas) e produtos à base de carne (salsichas e enchidos). Já na indústria farmacêutica, este tipo de compostos têm sido usados como agentes ligantes e em sistemas de libertação controlada de fármacos.

Os polissacáridos apresentam muitas vezes actividade floculante. Os agentes floculantes são úteis na agregação de colóides e células, por exemplo, sendo largamente utilizados em aplicações industriais, tais como, tratamento de águas residuais, tratamento de água potável, alimentos, entre outras. Apesar dos agentes floculantes inorgânicos e orgânicos sintéticos serem de custo reduzido, a sua degradação no ambiente é difícil. Por outro lado, alguns deles, são perigosos para a saúde humana, nomeadamente, as poliacrilamidas, cujos monómeros são neurotóxicos e carcinogénicos, e o poli(cloreto de alumínio), que induz a Doença de Alzheimer, devido à presença de alumínio. Os biofloculantes naturais, embora possuam menor actividade floculante, são seguros e biodegradáveis, pelo que a sua utilização deverá aumentar no futuro. Alguns dos biofloculantes mais utilizados, principalmente na indústria alimentar, incluem: quitosano, goma de guar, alginato e gelatina.

Muitas das substâncias exopoliméricas produzidas por microrganismos, como os exopolissacáridos, possuem a capacidade de imobilizar metais tóxicos. Esta capacidade depende grandemente da composição química e da estrutura molecular do polissacárido. Polissacáridos bacterianos, tais como o alginato ou o xantano, por exemplo, possuem a capacidade de imobilizar actinídeos (ex. plutónio) em agregados resistentes a erosão. A utilização de polissacáridos microbianos na remoção de metais tóxicos (metais pesados e radionucleótidos) de solos e meios aquáticos contaminados, é uma estratégia com grande potencial e que tem motivado grande interesse).

Os polissacáridos ricos em galactose, nomeadamente a goma de guar, encontram também aplicação noutras áreas, tais como na indústria do papel, para melhorar as propriedades mecânicas do papel e as condições da superfície para a impressão; na indústria dos explosivos, como agente ligante em explosivos aquosos e como agente protector contra a entrada de água quando misturado com explosivos sólidos (ex. nitrato de amónia e nitroglicerina); na indústria têxtil, como agente espessante com a função de facilitar a aplicação das tintas; no processo de estimulação dos poços de gás natural e petróleo, em que se usa uma suspensão contendo areia e o polissacárido para provocar fracturas nas paredes dos poços e aumentar a sua produtividade; e na prevenção da erosão dos solos quando, em solução aquosa, são pulverizados sobre os mesmos.

Devido ao facto dos polissacáridos serem compostos biodegradáveis, tem crescido o interesse da sua aplicação na produção de filmes para embalagens. Compostos como o alginato, quitosano, amido, gelano e pectina, têm sido usados no desenvolvimento de filmes biodegradáveis aplicáveis em produtos alimentares, uma vez que apresentam uma baixa permeabilidade a gases (dióxido de carbono e oxigénio).

Os polissacáridos ricos em galactose podem ainda ser usados como fonte de oligossacáridos, que podem ser aplicados na indústria alimentar. Os oligossacáridos são polímeros com graus de polimerização entre 2 e 10, podendo também incluir polímeros de 20 - 25 monómeros.

À medida que os aditivos químicos alimentares se tornam menos populares por parte dos consumidores, cresce o interesse na utilização dos oligossacáridos naturais como aditivos prebióticos (compostos não cariogénicos, indigestíveis e com poucas calorias, que estimulam o crescimento e o desenvolvimento da microflora gastrointestinal benéfica). Actualmente, a principal estratégia para obtenção de oligossacáridos em grandes quantidades reside principalmente na degradação de polissacáridos por tratamentos físicos (microondas, térmicos, irradiação, ultrassonicação), químicos (hidrólise ácida), enzimáticos (por acção de enzimas microbianas: hidrolases e liases) ou biológicos (por acção de microrganismos). Os polissacáridos ricos em galactose podem ser usados como fonte de oligossacáridos prebióticos, na indústria alimentar.

Descrição Geral da Invenção

A presente invenção relaciona-se com o processo de produção de um biopolímero, cujo principal constituinte é um polissacárido de elevado peso molecular, constituído por galactose, glucose, manose e ramnose, podendo conter, também, em quantidades vestigiais, xilose, fucose, ribose, arabinose e/ou frutose, e outros componentes não sacarídeos, tais como ácidos orgânicos e grupos fosfato. 0 polímero da invenção é insolúvel em solventes orgânicos e tem um comportamento de fluido pseudoplástico, formando soluções aquosas de elevada viscosidade. A viscosidade das soluções aquosas do polímero da invenção é constante para a gama de pH entre 3 e 10, e diminui com o aumento da temperatura entre 0 e 100 °C. O polímero da invenção possui actividade floculante e actividade emulsionante.

O processo da presente invenção é um processo para a produção de um polímero à base de galactose, por fermentação por meio de microrganismos, utilizando como fonte de carbono glicerol ou misturas contendo glicerol, num reactor agitado e arejado. O processo de produção do polímero da invenção prevê a utilização de outras fontes de carbono, em alternativa ao glicerol ou em mistura com este, tais como, por exemplo, açúcares, alcoóis, ácidos orgânicos ou alcanos. 0 processo da invenção prevê, ainda, a utilização de resíduos alimentares ou industriais, tais como, por exemplo, subproduto da produção de biodiesel, soro de leite ou resíduos da produção de azeite.

A cultura microbiana utilizada no processo de fermentação da invenção pode ser uma bactéria pertencente, por exemplo, aos Géneros Pseudomonas, Klebsiella, Methylobacterium, Erwinia, Alcaligenes, Lactobacillus, Streptococcus ou Ralstonia. A cultura microbiana é, preferencialmente, uma estirpe de Pseudomonas oleovorans. A cultura microbiana pode ser um microrganismo selvagem, uma variante ou um mutante, desde que possua a capacidade de produzir o polissacárido à base de galactose. Pode, ainda, ser utilizada uma cultura pura ou uma cultura mista de vários microrganismos, entre os quais se encontra, pelo menos, um dos microrganismos capazes de produzir o polissacárido à base de galactose.

processo de fermentação para a produção do polímero à base de galactose consiste em crescer uma cultura microbiana num meio nutriente aquoso, arejado. A concentração em oxigénio dissolvido no meio de cultura é elevada, no início da fermentação, mas, concomitante com o crescimento celular, diminui gradualmente, sendo controlada a valores inferiores a 30%, preferencialmente, inferiores a 10% ou nula. O polímero à base de galactose é produzido em condições de limitação da fonte de azoto e de disponibilidade da fonte de carbono, em simultâneo com a manutenção de baixas concentrações em oxigénio dissolvido.

A presente invenção descreve a obtenção do polímero à base de galactose, no final da fermentação, por utilização directa do caldo de fermentação, após secagem. A presente invenção descreve, ainda, um processo para a extracção do polímero à base de galactose, na sua forma nativa, assim como o processo de purificação do mesmo. 0 processo de extracção do polímero da invenção consiste na remoção de células por centrifugação do caldo de fermentação, no final da fermentação, seguida de precipitação do polissacárido por adição de um agente precipitante (ex. etanol, acetona). A purificação do polissacárido envolve a utilização de um ou vários processos adicionais (ex. diálise, ultrafiltração ou diafiltração de soluções aquosas do polímero).

Embora a utilização do polímero à base de galactose não faça parte da presente invenção, é de destacar as suas várias aplicações nas indústrias alimentar, farmacêutica, mineira, do papel, têxtil e dos explosivos, bem como fonte de oligossacáridos e na produção de filmes biodegradáveis.

Descrição das Figuras

Figura 1 - Representa a evolução do consumo da fonte de carbono (glicerol) e da fonte de azoto (amónia), da produção de biomassa e de polímero nativo, durante o processo de fermentação para a produção do polímero da invenção.

Figura 2 - Representa as propriedades reológicas do polissacárido da invenção.

Descrição detalhada da invenção

1. Caracterização do polímero presente pedido de patente descreve um biopolimero, cujo principal constituinte é um polissacárido de elevado peso molecular (superior a 1,0 x 10⁶ g/mol), constituído por: galactose (50-90% m/m), glucose (1-25% m/m), manose (1-25% m/m) e ramnose (0,5-20% m/m). O polissacárido aqui descrito pode, ainda, conter, em quantidades vestigiais, xilose, ribose, fucose, arabinose e/ou frutose. O polímero à base de galactose contém, ainda, componentes não sacarídeos: ácidos orgânicos, nomeadamente, acetato, succinato e piruvato; e resíduos inorgânicos, nomeadamente, fosfato. O polissacárido aqui descrito não possui, na sua composição, ácidos urónicos.

As propriedades físicas do polissacárido descrito no presente pedido de patente, nomeadamente, a solubilidade e a viscosidade de soluções aquosas, foram comparadas com outros polissacáridos de diferentes origens, nomeadamente, extraídos de plantas (goma de guar, goma arábica e pectina de citrinos), extraídos de algas (alginato de sódio, kcarrageno e agar) e bacterianos (xantano de Xanthomonas campestris e gelano de Sphingomonas paucimobilis). Verificou-se que o polissacárido do presente pedido de patente possui um comportamento idêntico aos polissacáridos de diferentes origens referidos, sendo insolúvel em compostos orgânicos (ex. hexano, butanol, acetato de etilo, clorofórmio e tolueno) e formando soluções aquosas viscosas.

Tendo em conta a viscosidade em solução aquosa, verificouse que o polímero à base de galactose apresenta um comportamento de fluido pseudoplástico (Figura 2). A viscosidade de soluções aquosas do polissacárido do presente pedido de patente é constante na gama entre pH 3 e 10 (viscosidade média de 5,46 cps, para soluções com concentração em polímero de 0,5 g/1), sofrendo uma redução parcial para valores de pH inferiores (viscosidade média de 2,50 cps, a pH 2 - 3, para soluções com concentração em polímero de 0,5 g/1) ou superiores (viscosidade média de 4,00 cps, a pH 11, e de 2,47 cps, a pH 13, para soluções com concentração em polímero de 0,5 g/1), o que está relacionado com uma degradação parcial do polímero quando sujeito a condições de pH inferior a 3 ou superior a 10. A viscosidade das soluções diminui gradualmente com o aumento da temperatura de 4 °C (viscosidade média de 15,5 cps, para soluções com concentração em polímero de 1,0 g/1) até 100 °C (viscosidade média de 1,6 cps, para soluções com uma concentração em polímero de 1,0 g/1), apresentando à temperatura ambiente (20 - 25 °C) uma viscosidade média de 9,0 - 10 cps (soluções com concentração em polímero de 1,0 g/1) . O polímero não sofre degradação quando submetido a temperaturas elevadas, nomeadamente, 80 - 100 °C, ou quando autoclavado (120 °C, 1 bar, durante 20 minutos), mantendo as soluções, após arrefecimento, a viscosidade que apresentavam antes do aquecimento.

O polissacárido à base de galactose apresenta actividade floculante e actividade emulsionante.

2. Produção do polímero

2.1. Cultura microbiana

O polímero à base de galactose é obtido através de um processo de fermentação por meio de microrganismos. A cultura microbiana pode ser uma bactéria pertencente, por exemplo, aos Géneros Pseudomonas, Klebsiella,

Methylobacterium,

Streptococcus ou preferencialmente,

Erwinia, Alcaligenes, Lactobacillus,

Ralstonia. A cultura microbiana é, uma estirpe de Pseudomonas oleovorans.

A cultura microbiana pode ser um microrganismo selvagem, uma variante ou um mutante, desde que possua a capacidade de produzir o polissacárido à base de galactose. Pode, ainda, ser utilizada uma cultura pura ou uma cultura mista de vários microrganismos, entre os quais se encontra, pelo menos, um dos microrganismos capazes de produzir o polissacárido à base de galactose.

2.2. Meio de cultura meio de cultura para a fermentação microbiana consiste num meio nutriente aquoso, contendo uma fonte de carbono, uma fonte de azoto e sais inorgânicos. A fonte de carbono pode ser, preferencialmente, glicerol ou misturas contendo glicerol. Alternativamente, a fonte de carbono pode ser um açúcar monomérico, dimérico ou oligomérico (ex. glucose, frutose, sacarose, maltose, lactose); um álcool (ex. metanol, etanol, manitol, sorbitol); um ácido orgânico (ex. citrato, acetato, malato, succinato, lactato, octanoato); um alcano (ex. hexano, octano); ou misturas contendo dois ou mais dos compostos referidos. A fonte de carbono pode ser, também, um resíduo alimentar ou industrial, contendo um ou vários dos compostos referidos, tal como, por exemplo, melaço, subproduto da produção de biodiesel, soro de leite ou resíduos da produção de azeite.

A fonte de azoto utilizada na ser um sal inorgânico (ex. compostos orgânicos azotados misturas contendo dois ou mais fermentação microbiana pode sais de amónia, nitratos) ; (ex. ureia, aminoácidos); dos compostos referidos; ou um resíduo alimentar ou industrial contendo compostos azotados, tais como, por exemplo, farinha de soja, extracto de levedura, farelo de trigo ou ureia.

São também incorporados, no meio de cultura, sais capazes de originar em solução os seguintes iões: Na⁺, K⁺, Ca²⁺, PO4³-, SO4²-, Cl, CO₃ ², entre outros. São, também, incluídos metais em quantidades vestigiais, tais como, cobalto, manganésio, ferro e magnésio.

meio descrito é meramente ilustrativo da grande variedade de meios que podem ser utilizados, não sendo, portanto, limitativo.

2.3. Condições de fermentação processo de fermentação é iniciado pela inoculação da cultura microbiana no meio nutriente aquoso, descrito atrás, arejado com ar comprimido. Ao longo da fermentação, a temperatura é controlada entre 5 e 75 °C, preferencialmente, entre 26 e 37 °C, e o pH é controlado entre 4,0 e 9,0, preferencialmente entre 6.0 e 7.5. O caudal de arejamento com ar comprimido pode ser mantido constante, num valor entre 0,1 e 2,0 vvm, ou variar ao longo da fermentação, entre 0 e 2,0 vvm.

No início da fermentação, a concentração em oxigénio dissolvido é mantida elevada, preferencialmente acima de 80%, com o objectivo de favorecer o crescimento celular. Concomitante com o crescimento celular, a concentração em oxigénio dissolvido diminui gradualmente, de um valor inicial igual ou superior a 80%, para cerca de 50%. A partir desse momento, é iniciada a alimentação do fermentador, por pulsos ou em contínuo, com uma solução de alimentação de composição igual ao meio de cultura, ou com a concentração da fonte de carbono 2 a 5 vezes superior. A solução de alimentação pode, em alternativa, não conter fonte de azoto. Deste modo, são criadas, no fermentador, condições de limitação em amónia (concentração nula ou inferior a 0,3 g/1, preferencialmente, inferior a 0,1 g/1) e de disponibilidade em fonte de carbono (concentração entre 10 e 100 g/1, preferencialmente, entre 10 e 20 g/1).

A concentração em oxigénio dissolvido diminui gradualmente, concomitante com o crescimento celular, para valores inferiores a 30%, sendo, a partir desse momento, controlada abaixo de 30%, preferencialmente, abaixo de 10% ou nula, por variação da agitação mecânica entre 0 e 2000 rpm, preferencialmente, entre 400 e 800 rpm. Ao fim de cerca de 10 a 30 horas nestas condições, nomeadamente, limitação em amónia e de disponibilidade em carbono, em simultâneo com uma concentração em oxigénio dissolvido inferior a 10%, ou nula, verifica-se o aumento muito rápido da viscosidade do caldo fermentativo, o que se relaciona com a produção do polissacárido à base de galactose.

A produção do polissacárido à base de galactose pode ser mantida por um período entre 96 e 160 horas de fermentação, ou seja, até ao momento em que, devido à elevada viscosidade do caldo de fermentação, se torna impossível manter uma distribuição homogénea de oxigénio e dos nutrientes no fermentador. A produção máxima de polímero à base de galactose pode variar entre 1-50 g/1, dependendo da cultura utilizada, das condições de fermentação e do tempo de cultura, assim como do grau de purificação do polímero.

Do processo de produção do polissacárido descrito no presente pedido de patente pode resultar a co-produção de biopolímeros intracelulares, nomeadamente, a produção de poli-hidroxialcanoatos, que podem representar até cerca de 60% do peso celular.

3. Extracção e purificação dos produtos de fermentação No final da fermentação, o polímero produzido pode ser obtido directamente do caldo de fermentação, nomeadamente, por secagem a temperaturas até 80 °C ou por liofilização.

Alternativamente, o polímero, na sua forma nativa, pode ser extraído do caldo de fermentação no final da fermentação, preferencialmente por precipitação, o que pode ser conseguido por adição de um agente precipitante, que consiste num solvente miscível com água no qual o polímero é insolúvel, tal como, por exemplo, um álcool (ex. metanol, etanol, isopropanol) ou uma cetona (ex. acetona). O polissacárido à base de galactose é precipitado por adição de um 1 a 5 litros de agente precipitante por cada litro de meio de cultura. O polissacárido co-precipita com as células e sais, podendo ser seco a temperaturas até 80 °C ou liofilizado. Alternativamente, o polissacárido precipitado pode ser dissolvido em água antes de ser seco ou liofilizado.

Num processo de extracção alternativo, o polissacárido obtido pelo processo da invenção pode ser parcialmente purificado, por um processo que envolve a remoção das células por centrifugação do caldo de fermentação (20000 rpm, 30 minutos) , seguida de precipitação do polissacárido por adição de um agente precipitante (1 a 5 litros de agente precipitante por cada litro de meio de cultura).

Sendo o caldo de fermentação muito viscoso, a separação das células é facilitada por diluição (adição de 1 a 9 litros de água desionizada por cada litro de caldo de fermentação) antes da centrifugação. 0 polissacárido precipitado pode ser seco a 80 °C ou liofilizado, logo após a precipitação ou a partir de uma solução aquosa.

A obtenção do polissacárido com um grau de pureza superior envolve, adicionalmente, um ou vários dos seguintes processos: re-precipitação do polissacárido a partir de soluções aquosas de concentração reduzida (0,1 - 5,0 g/1); utilização de enzimas proteoliticas (ex. tripsina) ou enzimas de lise celular (ex. lisozima); adição de agentes que precipitam proteínas (ex. ácido tricloroacético) e/ou ácidos nucleicos; diálise, ultrafiltração ou diafiltração de soluções aquosas do polissacárido. Após o processo de purificação, o polissacárido pode ser seco a temperaturas até 80 °C ou liofilizado.

4. Aplicações do polissacárido à base de galactose

O polissacárido aqui descrito apresenta actividade floculante e emulsificante, e forma soluções cuja viscosidade é pouco sensível à força iónica do meio, ao pH e à temperatura. Assim sendo, pode substituir outros polissacáridos, tais como, por exemplo, o xantano, o alginato, o carrageno, a goma de guar e a goma arábica, nas suas numerosas aplicações, nomeadamente na indústria agroalimentar, farmacêutica e cosmética.

O polissacárido da invenção obtido pelo processo da presente invenção pode ser utilizado como agente espessante, agente ligante, gelificante, texturizante, emulsionante, estabilizante, sozinho ou em mistura com outros agentes conhecidos, tais como, por exemplo, carrageno, xantano, alginato, goma de guar, pectina ou gelatina, em aplicações técnicas ou alimentares. Exemplos de alimentos nos quais se pode utilizar o polissacárido à base de galactose como agente espessante, agente ligante, gelificante, texturizante, emulsionante, estabilizante, incluem: molhos de salada, vinagre, gelados, condimentos (como, por exemplo, ketchup ou mostarda), sumos de vegetais e de frutas, produtos desidratados (como, por exemplo, sopas, molhos, cereais e papas) e produtos à base de carne (salsichas e enchidos).

Este polissacárido pode encontrar aplicação na indústria do papel como espessante de modo a originar uma superfície mais densa para a impressão. Adicionalmente, tal como acontece com a goma de guar, pode melhorar a formação das folhas, aumentar a sua resistência e proporcionar um melhor acabamento do papel.

Na indústria farmacêutica encontra aplicações como agente ligante e desintegrante. Na área da cosmética pode ser usado como espessante (em produtos como pasta de dentes, por exemplo).

polissacárido rico em galactose pode ser usado, isoladamente ou em conjunto com outros polímeros biodegradáveis, como por exemplo amido, pectina, alginato, carragenato, glúten, gelano e quitosano, na produção de filmes biodegradáveis. Estes filmes podem ser aplicados na produção de embalagens, e como apresentam uma baixa permeabilidade a gases (oxigénio e dióxido de carbono), são potencialmente aplicáveis em embalagens específicas para produtos alimentares.

Polissacáridos como o quitosano, amido e a goma de guar têm sido testados na preparação de microesferas para a libertação controlada de fármacos. 0 polissacárido a que se refere esta invenção, poderá ser usado, isoladamente ou em conjunto com outros polissacáridos, para o mesmo efeito.

Polissacáridos, como por exemplo a goma de guar, com uma composição semelhante ao polissacárido a que se refere esta invenção, encontram aplicações noutras áreas, tais como: • na indústria dos explosivos, como agente ligante em explosivos aquosos e como agente protector contra a entrada de água quando misturado com explosivos sólidos (nitrato de amónia e nitroglicerina, p. e.).

• na estimulação de poços de petróleo e gás natural, depois de incluído numa suspensão aquosa contendo areia que é usada para provocar fracturas nas paredes desses poços, de modo a aumentar a sua produtividade.

• na prevenção da erosão dos solos, quando introduzido em suspensões aquosas que são pulverizadas sobre os mesmos.

• na indústria têxtil, para facilitar a aplicação das tintas.

• como agente floculante no tratamento de água, e nas indústrias mineira e alimentar.

polissacárido à base de galactose pode ainda ser usado como fonte de oligossacáridos, obtidos a partir do polímero original usando tratamentos físicos (microondas, térmicos, irradiação, ultrassonicação), químicos (hidrólise ácida), enzimáticos (por acção de enzimas microbianas: hidrolases e liases) ou biológicos (por acção de microrganismos). Os oligossacáridos produzidos poderão ter propriedades prebióticas, estimulando o crescimento e o desenvolvimento da microflora gastrointestinal (Bifidobacteria e Lactobacilli), bem como inibindo a proliferação de microorganismos nocivos (Escherichia coli, Clostridium sp. e Salmonella).

Adicionalmente, esses oligossacáridos podem reunir ainda propriedades terapêuticas, nomeadamente, a prevenção de cancro do cólon e acção anti-inflamatória.

EXEMPLOS

Exemplo 1: Produção do polissacárido à base de galactose a partir de glicerol, por fermentação com Pseudomonas oleovorans

Uma cultura de Pseudomonas oleovorans NRRL B-14682 foi inoculada em 8 litros de meio nutriente com a composição descrita na Tabela 1. 0 fermentador (Biostat B-plus, Sartorius) foi operado nas seguintes condições: temperatura controlada a 30 °C; pH controlado entre 6,75 e 7,00, por adição automática de NaOH 1M ou H2SO4 1M; arejamento constante de 4 1/min (0,5 vvm) . Concomitante com o crescimento celular, a concentração em oxigénio dissolvido e o pH diminuíram gradualmente, de 80%, no início da fermentação, para cerca de 50%, ao fim de 20 horas.

A partir desse momento, foi iniciada a alimentação do fermentador, em contínuo (cerca 21 ml/h), com uma solução de alimentação, cuja composição é a descrita na Tabela 1, excepto pelo facto da concentração em glicerol ser 200 g/1. Deste modo, foram criadas, no fermentador, condições de limitação em amónia (concentração inferior a 0,3 g/1) e de disponibilidade em fonte de carbono (concentração de glicerol não inferior a 20 g/1).

Tabela 1: Composição do meio de cultura.

componente	concentração
Glicerol K2HPO4 KH2PO4 (NH₄) 2HPO4 Solução mineral⁽¹⁾MgSO₄ 100 mM	25 g/1 5,8 g/1 3,7 g/1 3,3 g/1 10 ml 10 ml
⁽¹> composição da solução mineral (para 1 litro de HC1 IN): FeSO₄-7H₂O, 2,78 g; MnCl₂-4H₂O, 1,98 g; CoS0₄-7H₂0, 2,81 g; CaCl₂-2H₂O, 1,67 g; CuCl₂-2H₂O, 0,17 g; ZnSO₄-7H₂O, 0,29 g)

A concentração em oxigénio dissolvido diminuiu gradualmente, concomitante com o crescimento celular, até cerca de 10% (ao fim de cerca de 46 horas), sendo, a partir desse momento, controlada abaixo de 10%, por variação da agitação entre 400 e 800 rpm. Ao fim de cerca de 20 horas nestas condições, verificou-se o aumento muito rápido da viscosidade do caldo de fermentação, o que se relaciona com a produção do polissacárido à base de galactose.

A produção do polissacárido à base de galactose foi mantida até às 96 horas de fermentação, altura em que, a concentração em polímero nativo atingiu um valor de 23 g/1 (Figura 1). A partir desse momento, devido à elevada viscosidade do meio de cultura, foi impossível manter uma distribuição homogénea de oxigénio e dos nutrientes no fermentador, sendo a fermentação terminada e o meio de cultura recolhido.

Exemplo 2; Extracção e purificação do polissacárido à base de galactose produzido por Psendomonas oleovorans, a partir de glicerol

No final da fermentação, o polímero nativo foi precipitado por adição de etanol (3 litros de etanol a 96% para 1 litro de meio de cultura), sendo a mistura agitada e colocada a 20 °C, durante 1 hora. 0 polissacárido precipitado foi recolhido por centrifugação (10000 rpm, 5 minutos), sendo uma parte do polímero seca a 37 °C, durante 48 h, e outra parte liofilizada (24 h). Com o objectivo de obter o polissacárido numa forma mais purificada, uma amostra do polímero seco foi dissolvida em água desionizada (numa concentração de 1 g/1), centrifugada (20000 rpm, 30 minutos) para remoção de células, re-precipitada com etanol, novamente redissolvida em água desionizada e, finalmente, liofilizada.

Exemplo 3: Análise química do polissacárido à base de galactose produzido por Pseudomonas oleovorans, a partir de glicerol

A composição glicosídica do polímero obtido pelo processo de fermentação descrito no Exemplo 1, extraído e purificado, como descrito no Exemplo 2, foi determinada por análise combinada por cromatografia gasosa/espectroscopia de massa (GC/MS).

A amostra seca foi submetida a metanólise ácida (HC1 1M em metanol, a 80 °C, durante 18-22 horas), seguida de re-Nacetilação com piridina e anidrido acético em metanol (para a detecção de açúcares aminados). A amostra foi, em seguida, per-O-trimetilsililada por tratamento com Tri-Sil (Pierce), a 80 °C, durante 30 minutos. A análise por GC/MS dos metil glicósidos TMS foi efectuada num GC HP 5890, com uma interface 5970 MSD (mass selector detector, modo de inonização por impacto), utilizando uma coluna All Tech EC1 (30 m x 0.25 mm ID) . Foi adicionado inositol (20 μρ) antes da derivatização, como padrão interno. Os monossacáridos presentes na amostra de polímero analisada foram identificados através dos tempos de retenção relativamente aos padrões, autenticados pelos seus espectros de massa, sendo os principais constituintes glicosídicos os açúcares neutros galactose, glucose, ramnose e manose.

A análise das ligações glicosídicas foi efectuada por permetilação, sendo a amostra em solução aquosa submetida a tratamento com hidróxido de sódio e iodeto de metilo em DMSO seco (este tratamento foi repetido por duas vezes, de modo a garantir a metilação completa do polímero). A amostra permetilada foi hidrolizada com ácido trifluoracético (TFA) 2 M (2 horas, 121 °C) , reduzida com NaBDí e acetilada com anidrido acético/TFA. A amostra resultante foi analisada num GC HP 5890, com interface 5970 MSD (mass selector detector, modo de inonização por impacto), sendo a separação realizada com uma coluna de sílica fundida, Supelco 2330. Os resultados obtidos revelam que o polímero possui uma complexidade significativa, estando todos os monómeros detectados na forma de anel de piranose.

A presença de ácidos orgânicos no polímero foi realizada por HPLC. A amostra de polímero purificado foi hidrolisada usando ácido trifluoroacético (TFA) a 99 % (25 μΐ de TFA para 2 ml de solução aquosa de polímero; 100 °C, 10 horas) e analisada por HPLC usando uma coluna Aminex HPX-87H (Biorad) acoplada a um detector de UV. O eluente utilizado foi H2SO4 (0,01 N) com um caudal de 0,6 ml/min, à temperatura de 50 °C. Foram detectados vários ácidos orgânicos, tais como piruvato, acetato, succinato, entre outros. A presença de grupos fosfato no polímero foi realizada por SKALAR (Análise por Fluxo Segmentado) em amostras hidrolisadas como descrito atrás. O conteúdo em ácidos orgânicos e em fosfato é variável consoante o grau de purificação a que o polímero é sujeito, verificando-se que o conteúdo em resíduos não sacarídeos diminui do polímero nativo para o polímero semi-purifiçado e, deste, para o polímero purificado.

Exemplo 4: Determinação da viscosidade de soluções aquosas do polissacárido à base de galactose produzido por Pseudomonas oleovorans, a partir de glicerol

Foi medida a viscosidade do caldo de fermentação (Viscosimetro digital Brookfield), ao longo da fermentação, tendo se verificado que o polímero produzido pela cultura de Pseudomonas oleovorans, a partir de glicerol, apresenta um comportamento pseudoplástico (Figura 2).

Foram obtidas curvas de viscosidade do polímero à base de galactose em solução aquosa de concentração 0,5 g/1, em função do pH, por adição de base ou ácido, tendo-se verificado que a viscosidade da solução se mantém na gama entre pH 3 e 10 (viscosidade média de 5,46 cps) , sofrendo uma redução parcial para valores de pH inferiores (viscosidade média de 2,50 cps, a pH 2 - 3) ou superiores (viscosidade média de 4,00 cps, a pH 11, e de 2,47 cps, a pH 13.

Foram obtidas curvas de viscosidade em função da temperatura, por aquecimento ou arrefecimento de uma solução aquosa com 1,0 g/1 do polissacárido. A viscosidade da solução diminui gradualmente com o aumento da temperatura de 4 °C (viscosidade média de 15,5 cps) até 100°C (viscosidade média de 1,6 cps), apresentando à temperatura ambiente (20 - 25 °C) uma viscosidade média de 9,0 - 10 cps.

Exemplo 5; Preparação de filmes biodegradáveis com o polissacárido à base de galactose produzido por Pseudomonas oleovorans, a partir de glicerol

Efectuou-se a extracção de polissacárido usando o seguinte procedimento: centrifugação do caldo de fermentação para a separação das células, precipitação das proteínas do sobrenadante por adição de ácido tricloroacético (25 ml de solução a 100% para um total de 275 ml) e sua remoção por centrifugação, e a precipitação do polissacárido por adição de etanol 96% (1:3).

Dissolveu-se cerca de 0,5 g de polímero em 100 ml água desmineralisada e deixou-se a agitar até se formar uma mistura homogénea. A esta mistura adicionou-se 0,1 g de azida de sódio para inibir o crescimento de microrganismos.

Deixou-se repousar a mistura, sob vácuo, com o objectivo de remover as bolhas de ar. Transferiu-se a mistura para um contentor com um revestimento de teflon e deixou-se secar à temperatura ambiente. Obteve-se um filme translúcido, com 25 ±5 pm de espessura e com uma aparência muito idêntica à dos filmes obtidos com outros polissacáridos, nomeadamente alginato, carrageno e pectina.

O filme obtido foi colocado num excicador com uma humidade relativa de 58%, contendo no equilíbrio um teor de água igual a 15,6%. Nestas condições, o filme apresenta um módulo de Young igual a 107 MPa, uma tensão na ruptura de 21,2 MPa, um alongamento na ruptura de 3,6% e uma temperatura de transição vítrea igual a 73 °C.

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Claims

1- Processo de produção de um polímero à base de galactose, caracterizado pelo facto do polímero à base de galactose ser obtido por fermentação microbiana de Pseudomonas oleovorans, em que o processo de produção compreende, sequencialmente, os seguintes passos:

a) Inoculação de uma cultura microbiana, em meio nutriente aquoso, contendo uma fonte de carbono, uma fonte de azoto e sais inorgânicos, arejado de modo a que a concentração em oxigénio dissolvido seja igual ou superior a 80%, a uma temperatura entre 5 e 75 °C, preferencialmente, entre 26 e 37 °C, e pH entre 4,0 e 9,0, preferencialmente, entre 6,0 e 7,5, em que fonte de carbono é glicerol ou misturas contendo glicerol;

b) Alimentação da cultura microbiana com um meio nutriente aquoso, contendo uma fonte de carbono e sais inorgânicos, podendo conter ou não fonte de azoto, a partir do momento em que a concentração em oxigénio dissolvido no meio de fermentação seja igual a 50%, de modo a manter a fonte de carbono com uma concentração entre 10 e 100 g/1, preferencialmente, entre 10 e 20 g/1, e a fonte de azoto com uma concentração nula ou inferior a 0,3 g/1;

c) Controlo do oxigénio dissolvido no meio de fermentação a uma concentração inferior a 30%, preferencialmente, inferior a 10%, mantendo, simultaneamente, a concentração da fonte de carbono entre 10 e 100 g/1, preferencialmente, entre 10 e 20 g/1, e a concentração de fonte de azoto nula ou inferior a 0,3 g/1;

d) Extração do polímero à base de galactose da reivindicação 1 do caldo de fermentação;

e) Purificação do polímero à base galactose obtido no passo anterior.

2- Processo, de acordo com a reivindicação anterior, caracterizado pelo facto do microrganismo ser uma variante ou um mutante do referido microrganismo.

3- Processo, de acordo com as reivindicações 1-2, caracterizado pelo facto de ser utilizada uma cultura pura ou uma cultura mista de vários microrganismos, entre os quais se encontra, pelo menos, um dos microrganismos referidos nas reivindicações 1 e 2.

4- Processo, de acordo com a reivindicação anterior, caracterizado pelo facto da fonte de carbono ser glicerol ou misturas contendo glicerol, em que as misturas contendo glicerol compreendem pelo menos um dos seguintes compostos:

a) um açúcar monomérico, dimérico ou oligomérico, preferencialmente, glucose, frutose, sacarose ou lactose;

b) um álcool, preferencialmente, metanol;

c) um ácido orgânico, preferencialmente, citrato, acetato, lactato ou octanoato;

d) um alcano, preferencialmente, hexano ou octano.

5- Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-4, caracterizado pelo facto de cumulativamente à utilização como fonte de carbono glicerol ou misturas contendo glicerol, serem utilizados como fonte de carbono resíduos alimentares ou industriais, podendo conter um ou vários dos compostos referidos na reivindicação anterior, tal como, por exemplo, melaço, sub-produto da produção de biodiesel, soro de leite ou resíduos da produção de azeite.

6- Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto da fonte de azoto ser um sal inorgânico, um composto orgânico azotado, ou misturas destes compostos.

7- Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto da fonte de azoto ser um resíduo alimentar ou industrial contendo compostos azotados, tais como, por exemplo, farinha de soja, extracto de levedura, farelo de trigo ou ureia.

8- Processo, de acordo com as reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo facto do polímero da reivindicação 1 ser recuperado directamente do caldo de fermentação, por secagem ou liofilização, ou, alternativamente, ser submetido a um processo de extracção, que consiste em submeter sequencialmente o caldo de fermentação aos seguintes passos:

a) Separação das células, do caldo de fermentação, preferencialmente por centrifugação, filtração, sedimentação ou hidrociclones;

b) Precipitação do polissacárido por adição de um solvente polar, preferencialmente, acetona, etanol ou propanol;

c) Separação do polissacárido precipitado, preferencialmente por centrifugação ou filtração.

9- Processo, de acordo com as reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo facto da purificação do polissacárido à base de galactose da reivindicação 1, consistir em pelo menos um dos seguintes passos: a) Diálise;

b) Ultrafiltração;

c) Eliminação de proteínas solúveis, por precipitação com ácido tricloroacético, seguida de centrifugação, ou por adição de proteases;

d) Eliminação de ácidos nucleicos, por adição de nucleases.