PT104149B

PT104149B - Processo de co-produção de quitina, seus derivados e polímeros contendo glucose, manose e/ou galactose, por cultivo da levedura pichia pastoris

Info

Publication number: PT104149B
Application number: PT104149A
Authority: PT
Inventors: D'ascenção Carvalho Fernandes De Miranda Reis Maria; Manuel Freitas Oliveira Rui; Filomena Andrade De Freitas Maria; Ferreira Chagas Bárbara; Luísa Braga Da Cruz Ana; Eduardo Pio Barbosa Pereira Da Cunha António; José Vazão Mano Clemente João
Original assignee: 73100 - Setenta E Três Mil E Cem, Lda.
Priority date: 2008-07-30
Filing date: 2008-07-30
Publication date: 2020-05-08
Also published as: KR101618903B1; CN107190032A; AU2009278045A1; EP2321419B1; PL2321419T3; US20140120584A1; ES2657441T3; JP2011529339A; CA2732234C; US8614070B2; PT104149A; NZ590760A; KR20110036821A; ZA201100530B; BRPI0916850A2; CN102112617A; DK2321419T3; US20110159546A1; CA2732234A1; BRPI0916850A8

Abstract

A PRESENTE INVENÇÃO REFERE-SE A UM PROCESSO PARA A COPRODUÇÃO DE POLÍMEROS DE GLUCOSAMINA (QUITINA, QUITOSANO OU QUALQUER UM DOS SEU DERIVADOS), E DE GLUCOSE, MANOSE E GALACTOSE, POR CULTIVO DA LEVEDURA PICHIA PASTORIS ATÉ ELEVADAS DENSIDADES CELULARES EM BIO-REACTOR EM CONDIÇÕES AERÓBIAS, USANDO PREFERENCIALMENTE O SUBPRODUTO DA INDÚSTRIA DO BIODIESEL RICO EM GLICEROL COMO PRINCIPAL FONTE DE CARBONO. PODE AINDA SER UTILIZADO GLICEROL DE ELEVADA PUREZA OU MISTURAS CONTENDO GLICEROL. A PRESENTE INVENÇÃO DIZ AINDA RESPEITO A UM PROCESSO DE CULTIVO DA LEVEDURA P. PASTORIS DEVIDAMENTE OPTIMIZADO PARA OBTENÇÃO DE ELEVADA DENSIDADE CELULAR E ELEVADA PERCENTAGEM MÁSSICA DE QUITINA NA PAREDE CELULAR, ASSIM COMO DE POLÍMEROS CONTENDO GLUCOSE, MANOSE E/OU GALACTOSE.

Description

DESCRIÇÃO

PROCESSO DE CO-PRODUÇÃO DE QUITINA, SEUS DERIVADOS E POLÍMEROS CONTENDO GLUCOSE_f MANOSE E/OU GALACTOSE, POR CULTIVO DA LEVEDURA PICHIA PASTORIS

Dominio Técnico da Invenção

A presente invenção diz respeito a um processo para produção, em elevadas quantidades, de quitina e de polímeros de glucose, manose e/ou galactose e seus derivados, por via microbiana usando matérias-primas de baixo custo. Desta forma, é descrito um processo de produção baseado no cultivo, em bio-reactor de elevada densidade celular, da levedura P. pastoris, usando preferencialmente como fonte de carbono um subproduto da produção de biodiesel, rico em glicerol.

Estes compostos têm uma vasta aplicação na industria agroalimentar, na biomedicina, nas industrias cosmética e dos têxteis, tratamento de efluentes, entre outros.

Estado da Técnica

Polímeros são macromoléculas químicas de elevado peso molecular, formados pela polimerização de uma ou mais unidades estruturais, denominadas por monómeros. Quando os monómeros são carbohidratos (monossacarídeos), o polímero denomina-se por polissacárido. Destes, podem-se obter moléculas mais pequenas (oligossacáridos) por hidrólise química ou enzimática.

A quitina é um polissacárido estrutural constituído por resíduos de D-glucosamina (GlcN) e N-acetil-D-glucosamina (GlcNAc) unidos linearmente entre si através de ligações β

- (1-4) (ver esquema onde (1) representa GlcN e (2) GlcNAc). 0 seu emparelhamento pode originar três formas cristalinas, dependendo do modo como as diferentes macromoléculas se associam por via de pontes de hidrogénio. A forma a, a mais estável e comum, caracteriza-se por um emparelhamento antiparalelo, enquanto a β-quitina é formada por camadas paralelas. A forma γ, mais rara, é caracterizada por duas cadeias paralelas e uma terceira antiparalela.

(1) (2)

A formação das pontes de hidrogénio é responsável pela baixa solubilidade da quitina tanto em água como na maioria dos solventes orgânicos. 0 uso de soluções básicas ou ácidas promove a sua desacetilação e hidrólise, pelo que não são indicadas para a solubilização do polímero. A formação de pontes de hidrogénio é também responsável pela aparente ausência de temperatura de fusão, assim como pela elevada rigidez e pouca permeabilidade dos materiais compostos por quitina.

Para além do peso molecular e arranjo espacial, as propriedades físico-químicas da quitina estão infimamente relacionadas com a proporção dos seus dois monómeros estruturais. A fracção molar de resíduos de GlcN no polímero é conhecida por percentagem de desacetilação (%DD) . Caso a %DD seja superior a 50%, o polímero é denominado por quitosano, o seu derivado mais importante. A menor quantidade de radicais acetil no quitosano permite que este seja solúvel em ácidos fracos, conferindo-lhe assim propriedades de poli-electrólito e maior reactividade. Em geral, este polissacárido é obtido por desacetilação da quitina.

Estas características fazem com que actualmente o quitosano tenha mais aplicações comerciais que a quitina. A sua elevada capacidade de ligação específica é aproveitada para tratamento de águas residuais uma vez que o polímero se liga a óleos, metais pesados, proteínas e matéria fina, que são usualmente de difícil tratamento nas unidades de tratamento de águas residuais (Hennen, 1996). Esta mesma propriedade do polímero permite a sua aplicação como resina para cromatografia de afinidade (Synowiecki et al._r 2003), e na restrição da absorção de colesterol para a corrente sanguínea. Uma vez que o quitosano não é digerível pelo sistema digestivo humano, ao ligar-se ao colesterol de baixa densidade no estômago, o polissacárido evita a absorção desta molécula para o organismo (ICNHP, 1995; Hennen, 1996).

Na industria alimentar, o quitosano tem como principal aplicação o revestimento de ovos e fruta (Hennen, 1996; Kim et ai., 2007), actuando como barreira para o dióxido de carbono e microrganismos patogénicos, aumentando assim o tempo de vida dos alimentos. É também usado como emulsionante, conservante e clarificador de bebidas (Kim, 2004; Synowiecki et al._f 2003) . Na industria cosmética, e dada a sua maior estabilidade e menor produção de electricidade estática, o quitosano é usado no fabrico de produtos para o cabelo (Kim, 2004) .

No entanto, é na área biomédica que este polímero tem ganho maior relevância, onde a biocompatibilidade e degradabilidade dos seus derivados permite a sua aplicação para cicatrização de feridas (Hamliyn et al._r 2004; Tanabe et al._r 2006; Singh et al., 2000), suporte de células (Tangsadthakun et al._r 2007), sistema de transporte de fármacos (Singh et al._r 2000), entre outros.

As principais aplicações da quitina incluem a sua utilização como material de sutura (Hamliyn et al._r 2004; Okada et al._r 2000; Singh et al._r 2000), como antigénio em animais infectados por bactérias ou fungos (Singh et al._r2000), ou como activador da produção de quitinase em solos contaminados por organismos que contêm quitina na sua parede celular (Okada et al._r 1999; Hallman et al._f 1999). É também usado no fabrico de têxteis transpiráveis, tais como meias e forros de peças de vestuário (ICNHP, 1995).

O facto de tanto a quitina como o quitosano serem biodegradáveis torna a sua utilização num benefício ecológico em comparação com polímeros sintéticos.

A partir da quitina, e para além do quitosano, são também derivatizados outros polissacáridos por substituição do grupo hidroxilo do C6 da GlcNAct. A inserção destes novos radicais, tais como alquilos, carboxilos, tióis, entre outros, aumenta a funcionalidade do polímero abrindo caminho para novas aplicações, tais como novas fibras, géis, etc.

A quitina é, loqo a sequir à celulose, o sequndo polímero mais abundante na natureza. Encontra-se principalmente na cutícula e exoesqueleto de orqanismos pertencentes ao filo Arthropoda e Crustacea, assim como na parede celular de leveduras e funqos. Nestes organismos, a quitina não só confere às células riqidez e resistência mecânica, como desempenha um importante papel na formação do septo primário durante a meiose (Keller et al._r 1970; Momany et al., 1997). Até ao momento não se detectou a presença de quitina ou qualquer um dos seus derivados em bactérias ou funqos pertencentes à classe Myxomycetes. A quitina presente nos crustáceos e artrópodes apresenta uma riqidez e grau de desacetilação superior ao da obtida por microrqanismos.

A maior parte da quitina e seus derivados presentes no mercado provêm da extracção da casca de crustáceos tais como caranguejo, camarão, laqosta e lavaqante. Usualmente o processo desenrola-se em três passos: desmineralização, desproteinização e remoção de lipidos e branqueamento. A primeira é obtida por mistura das cascas com um ácido (qeralmente ácido clorídrico, HC1) , enquanto a desproteinização e remoção de lipidos processa-se em meio básico (com hidróxido de sódio, NaOH ou hidróxido de potássio, KOH) na presença de etanol.

Para remoção dos piqmentos (principalmente carotenóides) recorre-se à lavagem com solventes orqânicos, tais como acetona, clorofórmio, ou misturas de etanol e éteres.

No entanto, a sazonalidade variação da composição das idade do animal, fazem com deste tipo de matéria-prima e a cascas em função da espécie e que este tipo de processo seja dispendioso e com pouca reprodutibilidade. A elevada rigidez dos exoesqueletos de espécies como lagosta e caranguejo tornam também a sua extracção bastante difícil e dispendiosa. Por outro lado, a presença de proteínas ou poluentes absorvidos pelo marisco dificulta a purificação da quitina. Dadas as reacções alérgicas que podem daqui advir, os polímeros extraídos de crustáceos não são indicados para aplicações biomédicas.

Enquanto nos artrópodes e crustáceos a quitina se encontra agregada aos minerais e proteínas das cascas (principalmente sais de cálcio), nos microrganismos esta apresenta-se associada a outros polissacáridos da parede celular. As suas extremidades redutoras encontram-se ligadas às extremidades não-redutoras de β-(1,3)-glucanos (polímeros de glucose), os quais, por sua vez, se ligam a β-(1,6)-glucanos, galactomananos (polímeros de galactose e manose) e glicoproteinas. Esta composição da parede celular, para além de depender das estirpes em causa, não é estática ao longo do tempo de vida do organismo. Alterações do meio de cultivo, tais como disponibilidade de substrato (McMurrough et al._f 1967), temperatura ou concentração de oxigénio (Aguilar-Uscanga et al._f 2003), podem provocar alterações nas proporções relativas de cada um dos componentes da parede celular.

A produção microbiana de quitina, para além de possibilitar uma optimização contínua do processo, permite o uso de matérias-primas baratas e disponíveis todo o ano. A adaptação da constituição da parede celular às condições do meio são uma mais-valia para possíveis optimizações, tendo já sido demonstrado que também a suplementação com alguns iões e precursores químicos da síntese enzimática da quitina favorecem a sua produção por fermentação (Camargo et âl,_f 1967; Keller et al._r 1970). A composição e propriedades dos polímeros são também mais consistentes do que as obtidas pelo método tradicional de extracção dos crustáceos.

Actualmente não existe um protocolo optimizado para a produção de quitina por via microbiana, exceptuando os casos em que se recorre a organismos geneticamente manipulados para esse fim (Hammer et al._r 2006) . A maior parte da quitina microbiana presente no mercado é extraída a partir de Saccharomyces carlsbergensis proveniente da industria da cerveja ou de Aspergillus niger usado na produção de ácido cítrico (Versali et al., 2003). Neste último caso, a quantidade de quitina pode ascender a 42% do seu peso seco. Contudo, não se conseguem atingir densidades celulares tão elevadas como com leveduras e os custos de operação são mais elevados devido à morfologia do fungo. Em contrapartida, a produção de quitina por espécies de Saccharomyces não parece ir além de 8% do peso seco da célula. Alguns desperdícios da cultura de cogumelos comestíveis, tais como as espécies Agaricus bisporus e A. campestris (GB2259709) podem também ser utilizados. Mas, uma vez mais, a quantidade de quitina extraída não é superior a 8% do peso seco dos cogumelos.

Pichia pastoris é uma levedura da classe Hemiascomycetes/Saccharomycetes, normalmente usada para expressão heteróloga de proteínas. Comparativamente a outros microrganismos usados na produção de quitina, esta espécie apresenta como principal vantagem as elevadas densidades celulares obtidas durante a sua fermentação, podendo para isso ser usados uma grande variedade de substratos, tais como glucose, metanol ou glicerol com baixos níveis de pureza. Dado que este último é um subproduto de baixo custo e abundante da industria do biodiesel, e que se sabe ser um bom substrato para o crescimento desta levedura (Çelik et ai., 2008), a produção específica de quitina e quitosano por Pichia pastoris pode ser uma mais-valia para o reaproveitamento e valorização do subproduto da industria do biodiesel. Dado que também não são necessárias concentrações muito elevadas de oxigénio no meio para que se dê o seu crescimento, os custos de operação são reduzidos.

Até ao momento não se encontrou na literatura qualquer referência ao uso de Pichia pastoris para produção à escala industrial dos polímeros referidos na presente invenção.

Descrição Geral da Invenção

A presente invenção introduz a levedura Pichia pastoris como organismo relevante para a produção de polissacáridos da parede celular tais como quitina, polímeros contendo glucose, manose e/ou galactose, ou quaisquer outros obtidos a partir destes por reacções de derivatização, usando substratos de baixo custo como o subproduto da industria de biodiesel.

As estirpes de Pichia pastoris utilizadas para este fim poderão ser selvagens, variantes ou mutantes da levedura.

Uma vez que a produtividade obtida destes polissacáridos está intimamente ligada ao crescimento microbiano, a obtenção de elevadas taxas específicas de crescimento e de elevadas densidades celulares foram optimizadas de forma a tornar economicamente viável a produção de quitina ou quitosano por Pichia pastoris.

Assim, é descrito na presente invenção, um método para produção de polissacáridos da parede celular contendo qlucosamina, qlucose, qalactose ou manose, nomeadamente por fermentação aeróbia em meio de cultura liquido, usando como fonte de carbono preferencialmente o subproduto da industria do biodiesel, rico em qlicerol. São ainda referidas outras fontes de carbono passíveis de ser usadas para o mesmo fim, tais como qlicerol de elevada pureza, metanol e qlucose.

uso de subproduto da industria do biodiesel como principal fonte de carbono, rico em qlicerol e de baixo custo, mas contendo várias impurezas, é uma mais-valia para redução dos custos de produção dos polímeros da presente invenção, uma vez que permite aumentar a produtividade volumétrica face a outros substratos de pureza e custo mais elevados. No entanto, estes últimos poderão ser usados caso as aplicações finais exijam substratos de composição bem definida, ou caso o processo de extracção de polissacáridos da parede celular de P. pastoris resulte da valorização da biomassa obtida noutros processos industriais (por exemplo, produção de anticorpos).

De forma a serem atinqidas elevadas densidades celulares e evitadas condições anaeróbias que prejudiquem a produção de quitina, a concentração de oxiqénio dissolvido é mantida acima dos 5% da sua concentração de saturação. Este parâmetro é controlado pela adição da fonte de carbono, podendo a fermentação decorrer em modo contínuo ou semicontínuo.

Em alternativa ao modo semi-contínuo, a fermentação pode ser realizada em modo continuo, o que permite maximizar a produtividade volumétrica do processo.

A extracção dos polissacáridos produzidos durante a fermentação pode ser realizada por qualquer método descrito na literatura para extracção de polímeros da parede celular de fungos ou leveduras (ver, por exemplo, Synowiecki et al._f 2003). Ressalva-se que, com o processamento químico utilizado na presente invenção, para além de uma mistura de polissacáridos rica em quitina, são paralelamente obtidas várias fracções de outros polissacáridos contendo glucose, manose e/ou galactose, com várias aplicações na industria alimentar e biomédica.

No entanto, e dado que a extracção química acarreta alguns riscos de degradação dos polímeros, a extracção enzimática é uma alternativa ao protocolo usado na presente invenção. Para tal recorrem-se, por exemplo, a proteases e lisozimas para a degradação, respectivamente, do material proteico e dos glucanos da parede celular. Apesar de menos poluente, este método tem a grande desvantagem dos custos associados serem bastante mais elevados que os do método químico.

Descrição das Figuras

Figura 1 - Evolução do peso seco da levedura Pichia pastoris ao longo de fermentações contendo glicerol puro (99%) ou subproduto da industria do biodiesel (86%) como fonte de carbono.

Descrição Detalhada da Invenção

1. Produção dos Polímeros

1.1. Cultura Microbiana

A presente invenção refere-se à produção de quitina e polímeros contendo glucose, manose e/ou galactose, assim como os seus derivados, por fermentação de estirpes selvagens, variantes ou mutantes da levedura Pichia pastoris.

1.2. Meio de Cultura

A fermentação de P. pastoris decorre em meio de cultura liquido, constituído por uma fonte de carbono, uma de azoto e sais inorgânicos.

A fonte de carbono é, preferencialmente, uma mistura rica em glicerol proveniente da industria do biodiesel. No entanto, poderá ainda ser utilizado glicerol puro, metanol, glucose ou misturas destes compostos. Em alternativa, a levedura P. pastoris consegue ainda metabolizar uma série de outros compostos, incluindo uma série de álcoois, açucares, ácidos carboxilicos, polióis, ácidos gordos ou aminoácidos, na sua forma monomérica, oligomérica ou polimérica.

Todos estes substratos poderão ser puros ou, preferencialmente, ter origem em resíduos industriais, tais como subprodutos da industria do biodiesel ou alimentar.

A fonte de azoto é, preferencialmente, amoníaco, podendo ser também utilizados sais de amónia ou compostos orgânicos azotados como, por exemplo, extracto de levedura, ureia ou peptona.

meio de cultura inclui ainda sais contendo os iões Ca2+, K+, Mg2+, SO42-, PO43-, e quantidades vestigiais de metais, tais como cobalto, cobre, manganês e ferro.

Para além da composição acima descrita, uma variedade de outros substratos podem ser utilizados para crescimento da espécie P. pastoris. Os componentes do meio não estão, por isso, confinados aos referidos nos parágrafos acima.

1.3. Condições de Fermentação

A presente invenção cobre qualquer procedimento ou protocolo de produção de quitina ou seus derivados por fermentação de Pichia pastoris. Serão, no entanto, referidas algumas metodologias que favorecem o crescimento da biomassa até elevadas densidades celulares e com elevada percentagem de quitina e glucanos na parede celular.

A fermentação ocorre em meio líquido e arejado com ar comprimido. A temperatura poderá ser controlada entre os 10 °C e os 60 °C, sendo mantida, preferencialmente, entre 20 e 40 °C. O pH poderá estar entre 1.0 e 10.0, sendo mantido, preferencialmente, entre 3.0 e 8.0 pela adição automática de base ao longo da fermentação. Esta pode ser qualquer base inorgânica, como por exemplo NaOH, KOH ου NH3, sendo que, neste último caso, a base adicionada substitui a alimentação da fonte de azoto.

O oxigénio dissolvido no caldo de fermentação decresce de acordo com o crescimento celular, sendo o seu decaimento tanto mais rápido quanto maior for a taxa específica de crescimento da estirpe usada. A limitação por oxigénio é evitada através da manipulação de variáveis, tais como velocidade de agitação do meio, caudal de arejamento, pressão e/ou caudal de alimentação, de acordo com as capacidades e limitações do reactor utilizado.

Para se obterem elevadas densidades celulares, o modo de operação poderá ser contínuo ou semi-cont1nuo.

A alimentação do caldo de fermentação é iniciada guando a fonte de carbono no meio de cultura inicial atinge concentrações limitantes ao crescimento, sendo, preferencialmente, mantido com um caudal exponencial até gue se atinja a concentração de oxigénio dissolvido definida como ponto estabelecido. A solução de alimentação é composta pela fonte de carbono e uma solução salina 2% (v/v). Caso o controlo de pH esteja a ser realizado com uma base gue não amónia, o caudal de alimentação deverá incluir a fonte de azoto nas mesmas proporções carbono/azoto presentes no meio de cultura inicial (aproximadamente 3:1).

Uma vez gue a produção de polímeros de glucosamina se encontra associada a um metabolismo primário, a fermentação é terminada guando o crescimento entra na fase estacionária, atingindo-se uma produção gue pode variar entre 10 e 40 gramas de guitina por litro de cultura, e até 10 gramas de guitosano por litro de cultura. Estes valores variam consoante a densidade celular obtida no final da fermentação, sendo gue esta é geralmente superior a 150 g/1.

De forma a aumentar a percentagem de guitina na biomassa, o tempo de fermentação pode ser estendido em condições de cultura que favoreçam a síntese de quitina ou quitosano separada do crescimento celular. Tais alterações incluem o aumento da temperatura, do pH ou força iónica durante a fase estacionária.

Associado à produção dos polissacáridos contendo quitina, o processo permite a co-produção de outros biopolímeros na parede celular contendo qlucose, manose e/ou qalactose, que podem representar até 45% do peso seco da biomassa.

2. Extracção e Purificação dos Produtos de Fermentação

Encontram-se em sequida descritos os protocolos que podem ser utilizados para extrair e purificar os polissacáridos descritos na presente invenção.

A separação inicial das células do caldo de fermentação é feita por filtração ou decantação, ou ainda centrifuqação, sendo este último o processo mais eficiente a separação por centrifuqação;

Após a separação das células do caldo de fermentação, preferencialmente por centrifuqação da suspensão celular, procede-se à extracção dos lípidos, proteínas e ácidos nucleicos presentes nas células, tratando as amostras com uma solução de pH suficientemente elevado (superior a 10,0). A deqradação das proteínas e ácidos nucleicos é efectuada através da reacção com concentrações elevadas de uma base forte (NaOH ου KOH) , enquanto os lípidos são extraídos por reacção com solventes orqânicos (entre os quais, etanol, metanol, acetona,...) ou deterqentes.

Estes passos podem ser feitos consecutivamente ou em simultâneo, o que torna o processo mais barato e aumenta o rendimento .

Estes passos demoraram entre 30 minutos a 3 horas, consoante a temperatura utilizada (65 a 90 °C).

A matéria insolúvel obtida é constituída essencialmente por matéria inorgânica, quitina e seus derivados, para além de outros polissacáridos, tais como glucanos e mananos. No sobrenadante encontram-se alguns polissacáridos solúveis em meio alcalino, nomeadamente β-glucanos e a-1,3-glucanos muito ramificados e galactomananos (polímeros de manose e galactose).

Após centrifugação e lavagem com água e etanol ou outros solventes orgânicos (tais como metanol, éter dietílico ou acetona), de modo a separar a matéria insolúvel do sobrenadante, procede-se à separação da quitina dos restantes polissacáridos contidos na matéria insolúvel.

Para tal, usa-se uma hidrólise parcial com ácido acético ou outro ácido fraco, a temperaturas superiores a 75 °C, ou a temperaturas inferiores a 50 °C com um ácido clorídrico ou outro ácido inorgânico diluído. Neste passo são solubilizados alguns β-l,β-glucanos ramificados, não extraídos durante a desproteinização. A matéria insolúvel contém os restantes polímeros já desprendidos entre si, enquanto a maioria dos glucanos são recuperados por extracção alcalina, seguida de centrifugação para reaproveitamento do sedimento.

A matéria insolúvel é suspensa numa base forte, a quente, para solubilização de glucanos alcano-solúveis. Utiliza-se NaOH, a temperaturas superiores a 20 °C e nunca superiores a 75 °C, para evitar a degradação da quitina. A extracção de glucanos hidrossolúveis é feita com água a temperaturas superiores a 30 °C.

Após centrifugação realizam-se várias lavagens com água e etanol ou outro solvente orgânico. Procede-se em seguida à extracção do quitosano por dissolução em ácido acético (2% (v/v)). Após nova centrifugação, separa-se o sobrenadante onde está solubilizado o quitosano, do sedimento (quitina e outros biopolimeros). De modo a precipitar o quitosano, o pH do sobrenadante é ajustado a 6.0, sendo o polissacárido recolhido após nova centrifugação e lavagem do sedimento com água desionizada.

O sedimento contendo a quitina é dissolvido numa solução 5% cloreto de litio em dimetilacetamida (DMAC) ou em dimetilsulfóxido (DMSO), durante períodos superiores a 12 horas, sob agitação constante, para dissolução completa do polímero. Após centrifugação, a quitina é precipitada por adição de água destilada e, de novo, centrifugada para remoção da quitina. Este passo é repetido até que não se observe qualquer formação de precipitado aquando da adição de água. A quitina extraída é lavada abundantemente com água destilada para remoção de quaisquer vestígios de solvente. O passo final consiste numa secagem a temperaturas não superiores a 60 °C ou numa liofilização.

Alternativamente, são utilizadas condições mais severas durante o tratamento com a base forte, de forma a desacetilar a quitina a quitosano. Tais condições incluem o aumento da temperatura até 128 °C, a concentração de base até 15N e o tempo de reacção até 7h.

Durante o processo de desproteinização, extracção e purificação da quitina e quitosano das células de Pichia pastoris, são obtidos como subproduto polímeros contendo glucose, manose, e/ou qalactose, assim como os seus derivados.

Os qlucanos da parede celular, solúveis em meio alcalino, contêm maioritariamente liqações β—(1,3) e β—(1,6) . Estes são extraídos pela solubilização em meio alcalino e posterior recuperação, que é feita através da adição de solventes imisciveis, por precipitação ou diálise.

Em alternativa é possível fazer a separação e purificação dos polímeros produzidos durante a fermentação através de cromatoqrafia de afinidade, adição de sulfato de amónia, ou adição de um solvente orqânico ou enzimas específicas, sendo o processo mais eficiente por adição de uma base forte e/ou um solvente orqânico.

Exemplos

Exemplo 1: Fermentação de Pichia pastoris em glicerol

14,25 L de meio líquido com a composição indicada na tabela 1 foi inoculado com 750 ml de uma pré-cultura de Pichia pastoris DSMZ 70877. A fermentação decorreu num fermentador de escala piloto (LP351, 50L, BioEnqineerinq, Suiça) a temperatura e pH constantes (respectivamente, 30 °C e 5,0). O arejamento foi mantido a 30 L/min e a pressão a 0,10 barq durante toda a fermentação. O pH foi controlado a 5,0 através da adição de hidróxido de amónia, enquanto a aqitação foi inicialmente estabelecida a 300 rpm.

Após 30 h de fermentação, a concentração de oxigénio dissolvido no meio (PO2) atingiu os 50% de saturação, tendo-se por isso iniciado o controlo de pO2 por aumento da agitação até um máximo de 1000 rpm. Quando a agitação atingiu os 440 rpm iniciou-se a adição da solução de alimentação, composta por 990 g/L de glicerol e 24 g/L da solução mineral descrita na tabela 1. O caudal de adição foi exponencial e calculado de acordo com a taxa de crescimento da biomassa pretendida.

Tabela 1: Composição do meio de cultura.

Componente	Concentração (g/L)
CaSO₄.2H₂O	0, 93
K₂SO₄	18,20
MgSO₄.7H₂O	14, 90
KOH	4,13
Glicerol (99%)	40, 00
Anti-espuma	0,40
H₃PO₄ (85%)	26,70 mL
Solução mineral*	4,35 mL

(*A solução mineral é composta por: 6,0 g/L CuSO4.5H₂O, 0,08 g/L Nal, 3,0 g/L MnSO₄.H₂O, 0,2 g/L Na₂MoO₄.2H₂O, 0,02 g/L H3BO3, 0,5 g/L CoCl₂, 20,0 g/L ZnCl, 65,0 g/L FeSO₄.7H₂O, 0,2 g/L biotina e 5,0 mL/L H2SO4. )

Atingidos os 1000 rpm (por volta das 44h de fermentação) , iniciou-se o controlo de pCt por limitação de substrato. O caudal da alimentação foi continuamente ajustado de forma a restringir o crescimento da biomassa para que pO₂ não descesse abaixo dos 20%.

Ao fim de 70 h, verificou-se o fim da fase de crescimento da biomassa, tendo-se por isso terminado a fermentação. A biomassa foi recolhida após centrifugação a 8000 rpm durante 45 min, e em seguida foi liofilizada. Por este processo obtiveram-se 237 g de células por cada litro de caldo de fermentação (peso seco).

Exemplo 2: Produção de quitina e glucanos por fermentação de Pichia pastoris no subproduto da indústria do biodiesel

O mesmo protocolo do exemplo 1 foi utilizado para crescimento da estirpe Pichia pastoris DSMZ 70877. No entanto, em vez de glicerol puro, foi utilizada uma mistura proveniente da indústria do biodiesel, contendo 86% de glicerol. Os caudais de alimentação foram corrigidos para ter em conta a nova composição do substrato. A figura 1 mostra a evolução do peso seco ao longo do tempo para as duas condições descritas.

A biomassa final obtida foi de 224 g/L (peso seco) . No entanto, a fase estacionária foi atingida cerca de 6h antes da observada em glicerol puro.

Realizando uma extracção semelhante à descrita por Synowiecki et al. (2003), obtiveram-se 0,352 g de polímero, o que equivale a 11,7% da massa de P. pastoris.

Tendo em conta a densidade celular obtida no final da fermentação, a produtividade obtida foi de 8,99 kg/m³.dia de polímero.

Utilizando um conjunto enzimático específico para análise de glucanos (K-YBG, Megazyme) determinou-se que a biomassa obtida continha 14% de glucanos e o polímero extraído 38,2% de glucose. Tendo em conta que, por hidrólise em meio ácido e análise qualitativa por cromatografia de troca aniónica de alta precisão com detector de pulso amperimétrico (sistema DIONEX ICS-3000, EUA) apenas se verificou a presença de picos referentes a glucose e glucosamina, estimou-se que a percentagem de quitina no produto seria

62,8%.

Tendo em conta estes resultados, concluiu-se que a biomassa obtida no exemplo 2 contém 8% de quitina.

Bibliografia

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Claims

Reivindicações

1. Processo de co-produção de quitina e polímeros contendo glucose, manose e/ou galactose caracterizado por compreender os seguintes passos:

- fermentação de estirpes selvagens de Pichia pastoris DSMZ70877, em condições aeróbias, num meio de cultura compreendendo uma fonte de azoto e uma fonte de carbono que compreende:

um subproduto da indústria do biodiesel rico em glicerol, qualquer mistura contendo: glicerol, um álcool, um açúcar, um ácido carboxilico, um poliol, um ácido gordo ou um aminoácido, qualquer um na sua forma monomérica, oligomérica ou polimérica; e um resíduo alimentar ou industrial, contendo um ou vários dos compostos selecionados de entre glicerol, um álcool, um açúcar, um ácido carboxilico, um poliol, um ácido gordo ou um aminoácido, qualquer um na sua forma monomérica, oligomérica ou polimérica; e - controlo do pH durante a fermentação.
2. Processo de co-produção de quitina e polímeros contendo glucose, manose e/ou galactose de acordo com as reivindicações anteriores, caracterizado por o subproduto gerado pela indústria do biodiesel ser composto por pelo menos 86% glicerol.
3. Processo de co-produção de quitina e polímeros contendo glucose, manose e/ou galactose, de acordo com as reivindicações anteriores, caracterizado por ocorrer em condições de fermentação em que é mantida uma concentração de oxigénio dissolvido superior a 1%, por manipulação dos

1/1 seguintes parâmetros: pressão, agitação, caudal de ar, enriquecimento em oxigénio, uso de fluidos ou nanopartícuias magnéticas ou caudal de fonte de carbono.
4. Processo de co-produção de quitina e polímeros contendo glucose, manose e/ou galactose, de acordo com as reivindicações anteriores, caracterizado por decorrer a uma temperatura do caldo fermentativo situada entre os 10 e os 50 °C, com as produtividades mais elevadas a ocorrerem entre os 20 e os 40°C.
5. Processo de co-produção de quitina e polímeros contendo glucose, manose e/ou galactose, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por decorrer em condições em que o pH do caldo fermentativo se situa entre 3,0 e 8, 0.
6. Processo de co-produção de quitina e polímeros contendo glucose, manose e/ou galactose, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por pelo pH do caldo fermentativo ser controlado através da adição de um sal de amónia.
7. Processo de co-produção de quitina e polímeros contendo glucose, manose e/ou galactose, de acordo com as reivindicações anteriores, caracterizado por os polímeros obtidos durante a fermentação compreenderem polissacáridos de glucose, manose e/ou galactose que representam até 45% do peso seco da biomassa.
8. Processo de co-produção de quitina e polímeros contendo glucose, manose e/ou galactose, de acordo com as reivindicações anteriores, caracterizado pelo facto de os polímeros produzidos durante a fermentação serem separados dos restantes constituintes celulares e purificados através dos seguintes passos:

a) Separação das células do caldo de fermentação ser feita por filtração ou decantação, sendo o processo mais eficiente a separação por centrifugação;

b) Remoção de proteínas, lípidos e ácidos nucleicos, ser efectuada pela adição de uma solução concentrada 0,5-5 M de KOH ou NaOH ou outra base forte e ainda metanol ou etanol ou outro solvente orgânico em proporções 1:0 a 1:3 volumes de base forte para volumes de solvente orgânico;

c) Separação da quitina dos restantes polímeros por solubilização sucessiva dos polímeros contendo açúcares não-aminados em meio ácido, nomeadamente ácido clorídrico 0,l-5M, e meio básico, nomeadamente NaOH 0,5-5 M;

d) Recuperação e purificação dos polímeros contendo glucose, manose e/ou galactose extraídos nas alíneas b) e c) , através de sucessivas operações unitárias que incluem a sua precipitação usando solventes orgânicos ou ácidos fracos, preferencialmente ácido acético.