KR20110036821A - 효모 피치아 파스토리스의 발효에 의해 키틴, 그의 유도체, 및 루코오스, 만노오스 및/또는 갈락토오스를 함유하는 폴리머를 공동 생산하는 방법 - Google Patents

효모 피치아 파스토리스의 발효에 의해 키틴, 그의 유도체, 및 루코오스, 만노오스 및/또는 갈락토오스를 함유하는 폴리머를 공동 생산하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 호기성 조건하, 바람직하게는 바이오디젤 산업으로부터 얻은 글리세롤 부산물을 탄소원으로 사용하는 바이오리액터에서 효모 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)의 높은 세포 밀도 발효에 의해 글루코사민 폴리머 (키틴, 키토산 또는 그의 유도체) 및 글루코오스, 만노오스 및/또는 갈락토오스를 함유하는 폴리머를 공동생산하는 방법에 관한 것이다. 순수한 글리세롤, 순수한 메탄올, 글리세롤-풍부 또는 메탄올 풍부 혼합물이 탄소원으로 사용될 수 있다. 본 발명은 또한 높은 세포 밀도와 높은 세포벽 키틴 함량 뿐만 아니라 글루코오스, 만노오스 및/또는 갈락토오스를 함유하는 폴리머를 얻기 위해 최적화된 피. 파스토리스(P. pastoris) 발효 공정에도 관한 것이다.

Description

효모 피치아 파스토리스의 발효에 의해 키틴, 그의 유도체, 및 루코오스, 만노오스 및/또는 갈락토오스를 함유하는 폴리머를 공동 생산하는 방법{Process for the co-production of chitin, its derivatives and polymers containing glucose, mannose and/or galactose, by the fermentation of the yeast pichia pastoris}
본 발명은 저가의 원료를 사용하여 다량의 키틴 및 글루코오스, 만노오스 및/또는 갈락토오스를 함유하는 폴리머, 및 이들의 유도체를 미생물 생산하는 방법에 관한 것이다. 따라서, 바이오디젤 제조로부터 얻은 글리세롤 부산물을 우선적 탄소원으로 사용하는, 효모 피. 파스토리스(P. pastoris)의 높은 세포 밀도 바이오리액터(bioreactor) 배양을 기본으로 하는 제조 방법이 개시되어 있다.
상기 바이오폴리머(biopolymer)는 다른 산업 중에서도 농식품 산업, 화장품, 생체의료, 직물, 폐수 처리 방법 및 의료 장치에 널리 사용되고 있다.
폴리머는 고분자량 분자로서, 모노머라 불리는 1 이상의 구조 단위의 중합화를 통하여 형성된다. 탄수화물 모노머(단당류)에 의해 형성된 폴리머를 다당류라 칭한다. 더 작은 분자(올리고당류)는 다당류를 화학적 또는 효소적 부분적 가수분해에 의해 얻을 수 있다.
키틴은 b-(1-4) 결합을 통하여 결합된 D-글루코사민(GlcN) 및 N-아세틸-D-글루코사민(GlcNAc) 잔기에 의해 구성된 선형 다당류이다(하기 화학식 참조, (1) 및 (2)는 각각 GlcN 및 GlcNAc를 나타낸다). 키틴 분자는 이들의 배열에 따라서 3개의 상이한 결정 형태를 초래하는 분자간 수소 결합을 형성하며, 가장 흔하고 안정한 형태인 a-키틴은 사슬의 반평행(antiparalled) 배열을 특징으로 하는 반면에, b-키틴은 평행층(parallel layers)에 의해 형성된다. 가장 드문 형태인 g-키틴은 1개의 반평행 및 2개의 평행 사슬을 특징으로 한다.
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수소 결합은 물 및 대부분의 유기 용매에서 키틴이 낮은 용해도를 갖는데 관여되어 있다. 산 또는 알칼리 용액은 폴리머 가수분해 및 데아세틸화(deacetilation)를 유발하므로, 그의 용해에는 적합하지 않다. 수소 결합은 키틴성 물질의 분명한 융점 부재뿐만 아니라 키틴성 물질의 폴리머의 높은 강성과 낮은 투과성에도 관여되어 있다.
키틴의 이화학 특성은 2개의 구조 모노머의 비율에 밀접하게 관련되어 있다. 폴리머 중의 GlcN의 몰 비율(데아세틸화 정도로 지칭, %DD)이 50% 보다 높으면, 그러한 폴리머는 키틴의 주요 유도체인 키토산이라 칭한다. 아세틸 라디칼에서 낮은 함량으로 인하여, 키토산은 약산에 용해성이고, 고분자 전해질 특징과 더 높은 반응성을 갖는다. 키토산은 흔히 키틴을 데아세틸화하는 것에 의해 얻는다.
이러한 특징들로 인하여, 키토산은 현재 키틴보다 더 많은 분야에서 이용되고 있다. 그의 높은 특이적 결합능은 폐수로부터 오일, 중금속, 단백질 및 미립자 물질을 제거하는데 이용된다(Hennen, 1996). 동일 특성은 친화성 크로마토그래피 에서 이용될 수 있게 하며(Synowiecki et al., 2003) 콜레스테롤 흡수 감소를 위해서도 이용될 수 있게 한다. 키토산 인간의 소화기관을 통과하여, 저밀도 콜레스테롤에 결합되는 것에 의해, 혈류에 흡수되는 것을 제한한다(ICNHP, 1995; Hennen, 1996).
식품 산업에서, 키토산은 달걀 및 과일 코팅에 주로 사용(Hennen, 1996; Kim et al., 2007)되어, 이산화탄소 및 병원성 미생물에 대한 차단제로 작용하므로, 식품 제품의 수명을 증가시킨다. 키토산은 또한 음료에 대한 유화제, 및 보존제 및 투명화제로서 사용된다(Kim, 2004; Synowiecki et al., 2003). 키토산은 또한 그의 높은 안정성과 더 낮은 정전 특징으로 인하여 화장품, 즉 헤어 제품에 사용된다(Kim, 2004).
키토산 생체의료 용도는 그의 유도체의 생체적합성과 생분해성으로 인하여 점점 상관이 있으며 그 중에서 상처 치료(Hamliyn et al., 2004; Tanabe et al., 2006; Singh et al., 2000), 조직 스캐폴드(Tangsadthakun et al., 2007), 약물 방출 시스템 (Singh et al., 2000)에서 그의 사용을 허용한다.
키틴의 주요 용도는 수술용실 재료(Hamliyn et al., 2004; Okada et al., 2000; Singh et al., 2000), 세균 또는 진균에 의해 감염된 동물에서 항원(Singh et al. , 2000) 또는 이들의 세포벽에서 키틴을 갖는 생물에 의해 오염된 오일에서 키티나아제 생산 향상제(Okada et al., 1999; Hallman et al., 1999)로서 용도를 포함한다. 키틴은 또한 양말과 같은 통기성 직물의 제조를 위해서도 사용된다(ICNHP, 1995).
합성 폴리머와 대조적으로, 키틴 및 키토산은 생분해성이어서 환경적 이점을 가지고 사용될 수 있다.
키토산 이외에, 키틴 유도체는 GlcNAc C6 히드록실 기가 예컨대 알킬 또는 카복실기와 같은 다른 라디칼에 의해 치환된 다당류를 포함한다. 이들 새로운 라디칼의 삽입은 폴리머 관능성을 증가시켜, 신규 섬유, 젤 등과 같은 새로운 용도를 개발할 수 있게 하였다.
셀룰로오스에 이어, 키틴은 천연에서 두번째로 풍부한 바이오폴리머이다. 키틴은 절지동물문(Phylum Arthropoda) 및 갑각류(Crustacea) 생물의 큐티클과 외골격(exoskeleton) 및 효모 및 진균의 세포벽에서 주로 발견된다. 이들 생물에서, 키틴은 세포 강성과 기계적 강도를 유지하고, 또 감수분열 동안 중요한 역할을 한다(Keller et al., 1970; Momany et al., 1997). 키틴 또는 그의 유도체의 존재는 세균에서도 믹소미아세테스(Myxomycetes) 진균에서도 검출되지 않았다. 갑각류 및 절지동물문으로부터 추출된 키틴은 더욱 강성이고 또 미생물성 키틴에 비하여 고도의 데아세틸화를 갖는다.
상업적으로 입수가능한 대부분의 키틴 및 키틴 유도체는 게, 새우 및 랍스터와 같은 갑각류의 껍질로부터 얻는다. 추출 과정은 보통 3단계를 포함한다: 미네랄제거, 단백질 및 지질 제거, 및 탈색. 첫 단계는 상기 껍질을 산(보통 HCl)과 혼합하는 것에 의해 실시하고, 단백질 및 지질 제거는 에탄올 존재하의 알칼리성 매질(NaOH 또는 KOH)에서 실시한다.
색소(특히 카로티노이드) 제거는 아세톤, 클로로포름 또는 에탄올과 에테르의 혼합물과 같은 유기 용매를 사용한 세척에 의해 달성한다.
그럼에도 불구하고, 상기 원료의 계절적 특징 및 동물 종 및 연령에 따라 껍질의 조성의 다양성으로 인하여 상기 과정은 비교적 고가이며 재생산성이 낮다. 랍스터 및 게와 같은 종의 외골격의 강성은 추출을 어렵게 만들어서 더욱 비용을 증가시킨다. 또한, 갑각류의 껍질로부터 추출된 키틴은 동물원에서 기인하므로, 약학적 및 생체의료용으로 사용하는 것이 식품의약국(FDA) 규칙에 의해 엄격하게 제한된다. 또한 동물이 흡수한 단백질 및 오염물질의 존재는 키틴 정제를 또한 어렵게 만든다. 알레르기 반응의 가능성으로 인하여, 갑각류로부터 추출된 폴리머는 생체의료용으로서는 적합성이 떨어진다.
절지동물문 및 갑각류에서 키틴은 껍질의 단백질 및 미네랄(주로 칼슘염)에 응집되지만, 미생물에서는 다른 세포벽 다당류와 결합된다. 그의 환원성 사슬 종결은 b-(l,3)-글루칸 (글루코오스 폴리머)의 비환원성 말단에 결합되어, b-(l,6)-글루칸, 갈락토만노오스(갈락토오스 및 만노오스 잔기에 의해 형성된 폴리머) 및 당단백질에 결합된다. 세포벽 조성은 균주에 따라 다르며 생물의 성장 상 동안 다양할 수 있다. 배지 조성 및 농도(예컨대 기질 유용성), 온도 또는 용존 산소 농도와 같은 발효 조건을 변경(Aguilar-Uscanga et al., 2003)하는 것은 각 세포벽 성분의 상대적 비율 변경을 초래할 수 있다.
키틴의 미생물 생산은 저렴한 원료의 비용이 가능하고, 거의 제한되지 않은 유용성 및 상기 공정의 연속적인 최적화를 허용한다. 세포벽을 환경 조건에 적응시키는 것은 상기 공정을 최적화하는데 유리하게 이용될 수 있다. 실제로, 발효에 의한 키틴 생산은 키틴의 효소 합성을 위한 특정 이온과 전구체를 갖는 배지를 공급하는 것에 의해 향상될 수 있는 것이 밝혀져 있다(Camargo et al. , 1967; Keller et al., 1970). 이러한 폴리머의 조성 및 특성은 갑각류로부터 전통적인 추출 방법에 의해 얻은 것에 비하여 더욱 안정하다.
현재, 유전자 조작된 생물이 이용되는 것을 제외하고는 미생물을 사용하여 키틴을 제조하기 위한 최적화된 방법이 존재하지 않고 있다(Hammer et al., 2006). 상업적으로 유용한 미생물성 키틴의 대부분은 맥주 산업의 사카로마이세스 칼스베르겐시스(Saccharomyces carlsbergensis) 또는 시트르산 제조로부터 아스페르길루스 니거(Aspergillus niger)로부터 추출된다(Versaliet al., 2003). 후자의 경우, 키틴은 미생물 세포벽의 42%까지가 키틴이다. 그럼에도 불구하고, 수생 아스페르길루스 니거(Aspergillus niger) 배양물은 일부 효모가 도달한 것과 같이 높은 세포 밀도에 도달하지 않는다. 한편, 사카로마이세스(Saccharomyces) 종에 의한 키틴 생산은 세포 건조 중량의 8% 이상을 넘지 못한다. 아가리쿠스 비스포러스(Agaricus bisporus) 및 에이. 캄페스트리스(A. campestris)와 같은 일부 식용 버섯의 배양물로부터 얻은 폐기물도 또한 사용(GB2259709)될 수 있지만, 키틴 함량은 그 생물들의 건조 중량의 8%보다 높지 않다.
피치아 파스토리스(Pichia pastoris)는 이종 단백질의 발현을 위해 통상적으로 사용되는 헤미아스코마이세테스/사카로마이세테스(Hemiascomycetes / Saccharomycetes) 효모이다. 키틴 생산에 사용되는 다른 미생물에 비하여 상기 종들의 주요한 이점은 그의 세포벽에서 키틴의 높은 %를 유지하면서도 발효하는 동안 글루코오스, 메탄올 또는 원료 글리세롤을 비롯한 다양한 기질에 대하여 높은 세포 밀도를 달성한다는 사실이다. 또한, 글리세롤은 바이오디젤 산업에서 다량으로 얻을 수 있는 저가의 부산물로서 피. 파스토리스(P. pastoris) 생산을 위해 효과적으로 사용될 수 있는 것으로 보고되어 있다(Celik et al., 2008). 따라서, 피. 파스토리스(P. pastoris)에 의해 키틴 및 키토산 제조를 위해 바이오디젤 산업으로부터의 글리세롤 부산물을 사용하는 것은 가치부가적 방법일 수 있다. 또한, 배양액이 성장하는데 높은 용존 산소 농도의 사용을 필요로 하지 않기 때문에 작업 비용도 감소될 수 있다.
현재로서, 본 발명의 목적인 바이오폴리머의 공업적 제를 위해 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)를 사용하는 것은 보고되어 있지 않다.
본 발명의 일반적 기재
본 발명은 바이오디젤 산업으로부터 얻은 글리세로 부산물과 같은 저비용의 기질을 사용하여 키틴, 글루코오스, 만노오스 및/또는 갈락토오스를 함유하는 폴리머와 같은 세포벽 다당류, 또는 이들의 유도체 산물을 생산하는 생물로서 효모 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)의 사용을 개시한다.
상기 목적을 위해 사용된 생물은 야생형(wild type) 피치아 파스토리스(Pichia pastoris) 균주, 이들의 변종 또는 돌연변이체, 또는 유전공학처리된 균주일 수 있고, 이들은 하류 공정에 사용되는 효소의 발현을 위해 이종 단백질 발현을 위한 구성적 또는 메탄올 이용(MUT) 균주일 수 있다.
이들 다당류의 생산성은 미생물 세포 성장과 밀접한 관련이 있다. 따라서, 상기 공정은 경제적으로 생존성인 피. 파스토리스(P. pastoris)에 의한 키틴 또는 키토산 생산을 위하여, 높은 세포 성장 속도 및 높은 세포 밀도를 얻도록 최적화된다.
상기 측면에서, 본 발명은 바이오디젤 산업으로부터 얻은 우선적인 탄소원으로서 글리세롤 부산물을 사용하여 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)의 호기성 발효에 의해 글루코사민, 글루코오스, 갈락토오스 및/또는 만노오스를 함유하는 세포벽 다당류를 생산하는 방법을 개시한다. 다른 탄소원은 순수한 글리세롤, 메탄올 및 글루코오스 또는 이들의 혼합물을 포함한다.
주요 탄소원으로서 저가의 글리세롤 부산물을 사용하는 것은 고순도이며 고가인 기질과 비교하여 생산 비용을 감소시킬 수 있으므로 중요한 이점이다. 상기 공정의 체적 생산성은 바람직하게는 산소 전달능을 증가시키는 압력하에서 동작되는 연속 모드로 동작되는 발효 공정을 채용하는 것에 의해 더 높은 세포 밀도를 가능하게 하여 최대화될 수 있다.
피. 파스토리스(P. pastoris) 발효 동안, 용존 산소 농도는 포화 농도의 5% 이상으로 유지된다. 이러한 변수는 탄소원 부가에 의해 제어되며, 연속적으로 또는 반연속적으로 실시될 수 있다. 이렇게 하여, 높은 세포 밀도를 달성할 수 있고, 호기성 조건을 피하고 또 최대 대사 활성을 달성한다.
발효하는 동안 생산된 다당류의 추출은 진균 또는 효모의 세포벽으로부터 폴리머를 추출하기 위해 문헌에 기재된 방법에 의해 실시할 수 있다(예컨대 Synowiecki et al., 2003). 본 발명에 이용된 화학 공정은 키틴이 풍부한 다당류 혼합물을 생성하는 이외에, 몇개의 농식품 및 생체의료 용도를 가질 수 있는 글루코오스, 만노오스 및/또는 갈락토오스를 함유하는 기타 다당류의 상이한 분획 생산을 초래하는 것이다.
화학 추출 작업은 폴리머 분해의 우려가 있을 수 있다. 다르게는, 단백질성 물질 및 세포벽 글루칸을 각각 분해하기 위하여 프로테아제 및 라이소자임을 사용한 효소 추출 과정도 채용될 수 있다. 이들은 덜 오염시키는 방법이긴 하지만, 이들은 비교적 비용이 높은 결점이 있다.
도 1 - 바이오디젤 산업으로부터 얻은 순수한 글리세롤 (99%) 또는 글리세롤 부산물 (86%)을 탄소원으로 사용하는 발효 동안 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)의 세포 건조 중량의 프로파일을 도시함.
본 발명의 상세한 설명
1. 폴리머 생산
1.1. 미생물 - 본 발명은 피치아 파스토리스(Pichia pastoris) 야생형 균주, 이들의 변종 및 돌연변이체의 발효에 의해 키틴 및 글루코오스, 만노오스 및/또는 갈락토오스를 함유하는 폴리머 뿐만 아니라 이들의 유도체를 생산하는 것에 관한 것이다.
1.2. 발효 배지 - 피치아 파스토리스(Pichia pastoris) 발효는 탄소원, 질소원 및 무기염을 함유하는 수성 배지에서 실시된다.
탄소원은 바람직하게는 바이오디젤 산업에서 생성된 글리세롤이 풍부한 혼합물이다. 순수한 글리세롤, 메탄올, 글루코오스 또는 이들의 혼합물이 사용될 수 있다. 다르게는, 피. 파스토리스(P. pastoris)는 모노머, 이합체 또는 올리고머 형태의 알코올, 당, 유기산, 지방산 또는 아미노산을 비롯한 다른 몇개 화합물 상에서 성장할 수 있다.
이들 모든 기질은 순수한 화합물이거나 또는 바람직하게는 바이오디젤 산업과 같은 농공업 폐수 또는 부산물로부터 기인할 수 있다. 질소원은 바람직하게는 암모니아이지만, 암모늄 염 또는 유기 질소성 화합물(예컨대 효모 추출물, 우레아 또는 펩톤)도 사용될 수 있다.
발효 배지는 또한 이온(예컨대 Ca2 +, K+, Mg2 +, SO 42~, PO4 3 ) 및 미량의 금속, 예컨대 코발트, 구리, 망간 및 철을 함유하는 염을 포함한다. 상기 배지는 피. 파스토리스(P. pastoris) 성장에 사용될 수 있는 다양한 기질 중의 하나로 예시한 것이며, 제한되지 않는다.
1.3. 발효 조건
본 발명은 피치아 파스토리스(Pichia pastoris) 발효를 이용하여 키틴, 글루코오스, 만노오스 및/또는 갈락토오스를 함유하는 폴리머와 같은 세포벽 다당류, 또는 이들의 유도 산물을 생산하기 위한 과정 또는 수순에 관한 것이다. 더욱 자세하게는, 본 발명은 높은 세포 밀도 및 미생물 세포벽에서 높은 키틴/글루칸 함량을 얻기 위하여 피. 파스토리스(P. pastoris) 성장을 선호하는 일부 방법을 개시한다.
발효는 압축 공기를 갖는 통기하의 수성 배지에서 실시한다. 온도는 10 내지 60℃, 바람직하게는 20 내지 40℃로 제어되며, 또 pH는 알칼리(예컨대 NaOH, KOH 또는 NH3)의 자동 부가에 의해 1.0 내지 10.0, 바람직하게는 3.0 내지 8.0으로 제어된다. 암모니아 또는 수산화 암모늄이 사용되면, 이들은 질소원으로 작용한다. 발효 브로쓰(fermentation broth) 중의 용존 산소 농도는 세포 성장과 함께 점점 감소한다. 이러한 감소는 균주의 특정 성장 속도에 의해 결정된다. 산소 제한은 바이오리액터의 능력 및 제한에 따라서 교반속도, 공기 유동 비율, 압력, 온도 및/또는 제한적 탄소원의 공급 속도의 조작을 통하여 피한다.
높은 세포 밀도를 얻기 위하여, 작업 모드는 연속적 또는 유가식(fed-batch)일 수 있고 또 초기 배치 상(batch phase)을 가질 수 있다.
상기 방법이 배치 모드로 출발하면, 발효액의 공급은 탄소원이 성장 제한 농도에 도달할 때 개시된 다음, 바람직하게는 리액터 특성을 기본으로 정의된 바와 같은 용존 산소 농도가 중요 임계값에 도달할 때까지 지수적(exponential) 공급 속도로 유지된다. 공급 용액은 탄소원 및 2% (v/v) 염수 용액으로 구성된다. pH가 암모니아에 의해서 보다는 염기에 의해 제어되면, 상기 공급 용액은 초기 배양 배지에 존재하는 동일 탄소/질소 비율(약 3:1)로 질소원을 포함해야 한다.
세포벽 다당류 생산은 성장과 관련된다. 따라서, 유가식(fed-batch) 발효는 배양이 정지 성장상에 들어갈 때 종료된다. 상기 공정이 연속 모드로 동작되면, 용존 산소 농도가 0%로 떨어지지 않는 한 희석 속도는 워시아웃(washout) 임계치에 가깝게 유지된다.
키틴 및 키토산 생산은 각각 10 내지 40 g/L, 및 10 g/L까지 다양할 수 있다. 이들 값은 보통 150 g/L 이상인 보통 얻어지는 세포 밀도에 따라 달라진다. 바이오매스 중의 키틴/키토산 함량은 세포 성장과 커플링되지 않은 이들의 생산을 선호하는 조건하에서 발효를 연장하는 것에 의해 증가될 수 있다. 이러한 조건은 정지 성장상 동안 온도 (30℃ 이하), pH (5 내지 8) 또는 이온 세기를 증가시키는 것을 포함한다.
키틴/키토산 생산과 관련하여, 본 발명의 방법은 글루코오스, 만노오스 및/또는 갈락토오스를 함유하는 세포벽 다당류의 공동생산도 예상하며, 이는 세포 건조 중량의 45% 이하에 달할 수 있다.
2. 발효 산물의 추출 및 정제
본 발명에 기재된 다당류를 추출 및 정제하기 위해 이용될 수 있는 방법은 다음과 같다:
세포는 여과, 따라내기 또는 원심분리에 의해 발효 브로쓰로부터 분리하며, 후자의 경우가 가장 효과적인 방법이다.
바람직하게는 원심분리에 의해 분리된 세포는 지질, 단백질 및 핵산을 제거하기 위하여 알칼리성 용액(pH 10.0 이상)에 의해 처리된다. 단백질 및 핵산은 고농도의 강한 염기(NaOH 또는 KOH)와의 반응에 의해 분해되는 반면에, 지질은 유기 용매(예컨대 에탄올, 메탄올, 아세톤) 또는 세제와의 반응에 의해 제거한다. 상기 과정들은 온도(65-90℃)에 따라서 30분 내지 3시간 소요되었고 또 연속적으로 또는 동시에 실시될 수 있고, 이는 그 방법을 덜 비싸게 하고 수율도 증가시킨다.
이렇게 하여 얻은 불용성 물질은 주로 무기 물질, 키틴 및 그의 유도체, 및 글루칸 및 만난과 같은 기타 불용성 다당류에 의해 구성된다. 용해성 다당류, 즉, 고분기된 b-글루칸 및 a-1,3-글루칸 및 갈락토만난(만노오스 및 갈락토오스 잔기로 이루어진 폴리머)이 상청액에 남는다.
원심분리 및 물 및 에탄올(또는 메탄올, 디에틸 에테르 또는 아세톤과 같은 기타 유기 용매)을 사용한 세척 후, 키틴은 다른 불용성 다당류로부터 분리된다. 그 목적을 위하여, 부분적 가수분해는 아세트산(또는 다른 약산)을 사용하여 75℃ 이상의 온도에서 실시하거나, 또는 희석된 HCl(또는 다른 무기산)을 사용하여 50℃의 온도에서 실시한다. 이 과정은 이전에 추출되지 않았던 일부 분기된 b-1,6-글루칸의 용해화를 허용한다. 알칼리성 추출에 의해 대부분의 글루칸을 회수한 다음 원심분리하여 키틴이 포함되어 있는 불용성 분획을 얻는다.
불용성 물질은 알칼리성- 용해성 글루칸을 용해시키기 위하여 뜨거운 강 알칼리(NaOH)에 현탁시킨다. 상기 온도는 20℃이상이어야 하지만 키틴 분해를 피하기 위하여 75℃ 아래여야 한다.
불용성 물질은 원심분리에 의해 회수되며 또 물 및 에탄올(또는 기타 유기 용매)에 의해 완전히 세척된다. 그 후, 키토산은 2% (v/v) 아세트산에 용해시키는 것에 의해 추출되며 또 원심분리에 의해 분리된다. 키토산은 상청액에 잔류하는 반면에, 펠릿은 키틴 및 기타 불용성 폴리머를 함유한다. 키토산은 pH를 6.0으로 조절하는 것에 의해 석출되며 또 원심분리에 의해 회수한다.
키틴 및 기타 불용성 폴리머(키틴/글루칸 복합체)를 함유하는 펠릿은 디메틸아세트아미드(DMAC) 또는 디메틸설폭사이드(DMSO) 중의 5% 염화리튬 용액에 용해된다. 이 용액은 폴리머의 완전한 용해를 위하여 일정한 교반하에서 적어도 12 시간 유지시킨다. 용해되지 않았던 물질을 제거하기 위하여 원심분리한 후, 키틴/글루칸 복합체는 물을 부가하는 것에 의해 석출된다. DMAC(또는 DMSO) 용액은 더 이상의 석출물 형성이 없을 때까지 물과 수회 혼합한다. 추출된 키틴/글루칸 복합체를 물에 의해 완전히 세척하여 모든 용매를 제거한다. 최종 단계는 60℃까지의 온도에서 건조시키거나 또는 동결 건조시키는 것으로 이루어진다.
다르게는, 강 알칼리를 사용하여 처리하는 동안 더 지독한 조건이 이용될 수 있으므로, 키틴을 완전히 데아세틸화시켜 키토산을 얻는다. 이러한 극한 조건은 온도를 128℃로 증가시키거나, 15N의 알칼리 농도를 이용하거나 또는 7 시간 까지의 반응 시간을 이용하는 것을 포함한다.
상기 기재된 추출 및 정제 과정은 키틴/글루칸 복합체 이외에, 기타 폴리머의 분획의 수회 생성을 초래한다. 이들 폴리머는 주로 글루코오스, 만노오스 및/또는 갈락토오스 잔기로 이루어진 다당류이다.
알칼리성 용해성 세포벽 글루칸은 주로 β-(l,3) 및 β-(1,6) 글리코시드 결합으로 구성된다. 이들은 알칼리성 용액에 용해시키는 것에 의해 추출된 다음, 섞이지 않는 용매에서 석출시키는 것에 의해 또는 약 4%의 알칼리성 용해성 글루칸에 투석하는 것에 의해 회수한다.
실시예
실시예 1: 글리세롤에서 피치아 파스토리스(Pichia pastoris) 발효
표 1에 기재된 조성을 갖는 발효 배지 14.25 L에 750 mL의 피치아 파스토리스(Pichia pastoris) DSMZ 70877 배양액을 접종하였다. 제어되는 온도 및 pH(30℃ 및 5.0, 각각)를 갖는 파일럿 규모의 바이오리액터(LP351, 50 L, 바이오엔지니어링 제조, 스위스 소재)에서 발효를 실시하였다. 전체 실험동안 공기 유동 비율은 30 L/분으로 유지하였고 또 압력은 0.10 바아로 유지하였다. pH는 수산화 암모늄의 부가에 의해 제어하였다. 초기 교반속도는 300 rpm이었다.
30시간의 발효 후에, 용존 산소 농도(pO2)는 50%로 떨어졌다. 그 지점으로부터, 교반속도를 1000 rpm 까지 증가시키는 것에 의해 20%로 제어하였다. 교반 속도가 440 rpm에 도달하면, 바이오리액터에는 표 1에 기재된 글리세롤(990 g/L)을 함유하는 용액 및 24 g/L의 무기 용액을 공급하기 시작하였다. 상기 공급 속도는 지수 함수적이며 또 목적한 세포 성장 속도에 따라 산출하였다.
Figure pct00002
(*미네랄 용액 조성: 6.0 g/L CuSO4.5H2O, 0.08 g/L NaI, 3.0 g/L MnSO4.H2O, 0.2 g/L Na2MoO4.2H2O, 0.02 g/L H3BO3, 0.5 g/L CoCl2, 20.0 g/L ZnCl, 65.0 g/L FeSO4JH2O, 0.2 g/L 비오틴 및 5.0 mL/L H2SO4.)
최대 교반속도(1000 rpm)에 도달하면(약 44시간의 발효), pO2는 기질 제한에 의해 20%로 제어하였다. 공급 용액 부가 속도는 pO2가 20% 아래에 떨어지지 않게 하기 위하여 연속적으로 조절하였다.
70시간의 발효 이내에, 배양액은 정지 성장상으로 들어가며 실험은 중지하였다. 세포는 발효 브로쓰의 원심분리(8000 rpm, 45 분)에 의해 회수하고 또 동결 건조시켰다. 각 발효 브로쓰 리터에 대하여 237 g의 세포를 얻었다.
실시예 2: 바이오디젤 산업으로부터 얻은 글리세로 부산물에서 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)의 발효에 의한 키틴/글루칸 복합체 생산
실시예 1에 기재된 순서를 이용하여 피치아 파스토리스(Pichia pastoris) DSMZ 70877를 성장시켰다. 순수한 글리세롤은 86% 글리세롤을 함유하는 바이오디젤 산업으로부터 얻은 글리세로 부산물로 치환하였다. 공급 용액 유동 속도는 새로운 기질 조성을 고려하여 수정하였다. 양쪽 실험의 세포 건조 중량은 도 1에 나타낸다.
발효 말기에, 224 g/L의 바이오매스를 얻었다. 순수한 글리세롤을 사용한 발효에서 보다 약 6시간 일찍 정지 성장상에 도달하였다.
Synowiecki et al.(2003)에 의해 제안된 추출 과정을 이용하여, 0.352 g의 키틴/글루칸 복합체를 얻었고, 이는 11.7%의 피. 파스토리스(P. pastoris) 바이오매스에 상응한다. 발효의 말기에 얻은 세포 밀도를 고려하면, 폴리머 생산성은 8.99 kg/m3일이었다.
글루칸 분석(K-YBG, 메가자임 제조)용 효소 키트 이용시, 글루칸 상의 바이오매스 함량은 14%인 반면에, 추출된 키틴/글루칸 복합체는 38.2% 글루칸을 함유하였다. 글루코오스 및 글루코사민은 산 가수분해 후 액체 크로마토그래피에 의해 검출된 유일한 당 모노머였다. 따라서, 추출된 키틴/글루칸 복합체는 9%의 키틴, 1%의 습도, 4%의 재 및 6%의 단백질을 가졌다.
이들 결과를 고려하면, 실시예 2에서 얻은 바이오매스는 키틴 함량이 3%라고 결론지었다.
Figure pct00003

Claims (12)

  1. 바이오디젤 산업으로부터 얻은 글리세롤-풍부 부산물을 탄소원으로 사용하여 피치아 파스토리스(Pichia pastoris) 야생형 균주의 발효로 이루어지는 것을 특징으로 하는, 키틴 및 글루코오스, 만노오스 및/또는 갈락토오스를 함유하는 폴리머를 공동생산하는 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 바이오디젤 산업으로부터 얻은 글리세롤-풍부 부산물 대체물로서, 탄소원은 모노머, 이합체 또는 올리고머 형태의 글리세롤, 알코올, 당, 유기산, 폴리올, 지방산 또는 아미노산을 함유하는 혼합물일 수 있는 것을 특징으로 하는 다당류를 공동생산하는 방법.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 탄소원은 식품 또는 공업 폐기물 또는 청구항 1에 언급된 1 이상의 화합물, 즉, 모노머, 이합체 또는 올리고머 형태의 글리세롤, 알코올, 당, 유기산, 폴리올, 지방산 또는 아미노산을 함유하는 부산물일 수 있는 것을 특징으로 하는 다당류를 공동생산하는 방법.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 세포벽 다당류 함량은 상기 목적을 위해 특이적으로 사용되는 비타민, 양이온, 음이온 또는 기타 유기 화합물 또는 미네랄을 부가하는 것에 의해 증가되는 것을 특징으로 하는 다당류를 공동생산하는 방법.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 생물은 청구항 1에서 지칭된 종의 변종 또는 돌연변이체이거나 또는 키틴 및/또는 글루칸 추출 및/또는 각 유도체 또는 기타 재조합 단백질의 정제 및/또는 가공을 위해 사용된 효소를 발현하도록 청구항 1에서 지칭된 종의 유전적으로 변형된 균주인 것을 특징으로 하는 다당류를 공동생산하는 방법.
  6. 제 1항에 있어서, 세포벽 다당류 중의 세포 밀도 및 특정 부피 생산성은 탄소원을 함유하는 배지의 자동적 부가를 통하여 용존 산소 농도를 제어하는 것에 의해 최대화되는 것을 특징으로 하는 다당류를 공동생산하는 방법.
  7. 제 1항에 있어서, 상기 발효는 다음 변수: 압력, 온도, 교반 속도, 통기, 산소 풍부화, 유체 또는 자성 나노입자의 사용, 탄소원 부가 속도의 조작에 의하여 1% 이상의 용존 산소 농도를 이용하여 실시되는 것을 특징으로 하는 다당류를 공동생산하는 방법.
  8. 제 1항에 있어서, 발효 브로쓰의 온도가 10 내지 50℃, 바람직하게는 20 내지 40℃로 유지되는 것을 특징으로 하는 다당류를 공동생산하는 방법.
  9. 제 1항에 있어서, 발효 브로쓰의 pH가 3.0 내지 10.0, 바람직하게는 pH 5.0 내지 7.0으로 제어되는 것을 특징으로 하는 다당류를 공동생산하는 방법.
  10. 제 1항에 있어서, 발효 브로쓰의 pH가 알칼리, 암모니아 또는 암모늄 염의 부가에 의해 제어되는 것을 특징으로 하는 다당류를 공동생산하는 방법.
  11. 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, 배치식, 유가식 또는 연속식 작업 모드에서 높은 세포 밀도를 얻는 최적화된 발효 조건에서 실시되는 것을 특징으로 하는 다당류를 공동생산하는 방법.
  12. 제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 있어서,
    발효 동안 얻어진 바이오폴리머는 기타 세포 성분으로부터 분리하고 또 다음 단계
    a. 여과 또는 따라내기에 의해 발효 브로쓰로부터 세포를 분리하는 단계, 상기 세포는 원심분리에 의해 더욱 효과적으로 분리되며;
    b. 1:0 - 1:3 비율의 진한 알칼리성 용액(0.5-5.0 M KOH, NaOH 또는 기타 강 알칼리) 및 유기 용매(메탄올, 에탄올 또는 기타 유기 용매)를 부가하는 것에 의해 단백질, 지질 및 핵산을 제거하는 단계 ;
    c. 산 (0.1-5.0 M HCl) 및 알칼리(0.5-5.0 M NaOH)를 부가하는 것에 의해 중성 당 만을 함유하는 폴리머의 순차적인 용해화에 의해 기타 폴리머로부터 기틴/글루칸 복합체를 분리하는 단계;
    d. 유기 용매 또는 약산, 바람직하게는 아세트산 중에서 석출시키는 것을 포함하는 단위 작업을 사용하여 b) 및 c)에 기재된 바와 같이 추출된 글루코오스, 만노오스 및/또는 갈락토오스를 함유하는 폴리머를 회수 및 정제하는 단계;
    e. 효소적 또는 화학적 방법에 의해 선택적 가수분해에 의해 키틴/글루칸 복합체로부터 기팀 및/또는 글루칸을 정제하는 단계를 통하여 정제되는 것을 특징으로 하는 다당류를 공동생산하는 방법.

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