JPH04268301A - 新規なセルロースおよびその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、新規なセルロースおよ
びその製造法に関し、詳しくは分子内，分子間で水素結
合を形成し易いアセトアミド基を持ち、またグルコース
の２位置換体であるＮ−アセチルグルコサミン残基を分
子中に含む新規なセルロースおよび微生物による該セル
ロースの製造法に関する。本発明の新規セルロースは、
生体適合性や生体内消化性にすぐれ、傷口治療剤，縫合
糸，薬物送達システム担体，化粧品等の素材として有用
であり、さらに透析膜，気体分離膜，アフィニティー膜
，物質選択透過膜などの分離膜素材や固定化担体、光学
分割，アフィニティー分離クロマトの担体などとしての
利用も期待される。

【０００２】

【従来の技術、発明が解決しようとする課題】キチンや
ヘパリン，ヒアルロン酸，コンドロイチン硫酸などのム
コ多糖は、ヘキソサミンを構成成分とするものであり、
これらとその誘導体の中には血液凝固作用などの生理活
性を示すものがあることが知られており、実用上有用な
化合物である。特に、キチンとその誘導体は高い生体適
合性，生体内消化性を示すことから、医用材料として注
目され、実用化が進められている。

【０００３】しかし、キチンは、潜在的な資源量は多い
けれども、現在はカニ，エビなどの甲殻類の食品廃棄物
から供給されているだけで、大量供給が困難である。ま
た、キチンは天然では蛋白質と結合しており、高純度の
ものを得るためには、分離精製の費用が高く、しかも強
固な結晶構造をとっているため、リゾチーム受容性や反
応性が低く、溶媒に難溶であり、化学反応に対する抵抗
性が大きいので、その利用は限られていた。

【０００４】そこで、キチンを化学的手法によりカルボ
キシメチル化や脱アセチル化することにより、上記の欠
点を改良する試みがなされている。特に、脱アセチル化
キチン（ＤＡＣ）は、キチンの結晶構造が崩れ、溶媒へ
の溶解度やリゾチームへの受容性が飛躍的に向上し、種
々の用途への利用が検討されている。しかし、リゾチー
ムへの受容性は、脱アセチル化度７０％周辺までは、７
０％周辺を極大として増加するが、それ以上では急激に
低下することが明らかにされている。

【０００５】これは、リゾチームの触媒は、キチンを構
成するＮ−アセチルグルコサミン（以下、ＧｌｃＮＡｃ
と略記することがある。）　残基が存在しなくてもその
脱アセチル化物であるグルコサミン残基が存在すればよ
いのに対し、リゾチームと基質の吸着には、ＧｌｃＮＡ
ｃ残基の存在が必要であるからである。このため、脱ア
セチル化度が高すぎると、分子中のＧｌｃＮＡｃ残基の
量が減少し、リゾチームの触媒活性点への吸着が不十分
となり、リゾチームへの受容性が急激に低下するものと
考えられる。したがって、ＤＡＣを利用する場合、脱ア
セチル化度やＧｌｃＮＡｃ残基由来のアセトアミド基の
分子内での分布状態を考慮する必要がある。しかし、従
来より行われている化学的手法では、脱アセチル化度や
アセトアミド基の分布状態を選択的に制御することは難
しく、実用上の問題点となっていた。

【０００６】一方、セルロースは、植物体を構成成分と
し、豊富に存在する多糖であり、グルコースのみを構成
糖とする点でキチンと異なるが、キチンと同様にβ−１
，４結合で結合しているため、セルロースを出発原料と
してグルコース残基の水酸基を化学的に修飾してアセト
アミド基やアミノ基をランダムに導入することは可能で
ある。しかし、これら置換基の導入部位や置換度、置換
基の分子内での分布状態を選択的に制御することは技術
的に困難であった。

【０００７】そこで、本発明者らは、従来の天然物を主
原料とする化学的手法でのムコ多糖類の改変法と異なり
、酵素反応を利用したムコ多糖類の合成法に着目した。 すなわち、酵素反応における基質特異性は必ずしも厳密
でなく、構造的に類似した化合物をも基質として利用し
得る場合があること、また微生物などの細胞をそのまま
酵素源として利用する場合は、与えた基質に適応して新
たな生合成酵素が生産される場合があることから、キチ
ンと同じβ−１，４結合で結合しており、構成成分が類
似しているセルロースに注目した。さらに、生産速度が
速く、かつ大量に供給することが可能であること、菌体
外に生産されるため、容易に高純度の製品が得られるこ
とから、同じセルロースでも微生物の生産するセルロー
スの合成系を利用することとし、鋭意検討を重ねた。そ
の結果、セルロース生産能を有する特定の微生物をＮ−
アセチルグルコサミンを含有する培地で培養することに
より、分子中にＮ−アセチルグルコサミン残基を含む新
規なセルロースが得られることを見出し、本発明を完成
したのである。

【０００８】本発明は、分子中にＮ−アセチルグルコサ
ミン残基を含むセルロースおよびセルロース生産能を有
する酢酸菌をＮ−アセチルグルコサミンを含む培地で培
養することを特徴とする該新規セルロースの製造法を提
供するものである。

【０００９】本発明に使用する微生物は、基本的にはセ
ルロース生産能を有するものであればよいが、アセトバ
クター属，グルコノバクター属などの酢酸菌が好ましく
、特に前者はセルロース生産能が高く、より好適である
。具体的には、アセトバクター・キシリナム（Ａｃｅｔ
ｏｂａｃｔｅｒ　ｘｙｌｉｎｕｍ）　ＡＴＣＣ１０２４
５株，アセトバクター・キシリナムＮＢＩ１０５１株（
ＦＥＲＭ　　Ｐ−１２０００）などが挙げられる。なお
、これら微生物から誘導された変異株も使用することが
できる。さらに、これら微生物をＮ−アセチルグルコサ
ミンを炭素源として含む培地で継代培養することにより
、上記新規セルロースの生産能が高まった菌株は一層好
適である。

【００１０】分子中にＮ−アセチルグルコサミン残基を
含む新規セルロースを生産させる培地としては、炭素源
としてＮ−アセチルグルコサミンを単独で、もしくは他
の炭素源と組み合わせて使用するものであればよく、さ
らに窒素源，無機塩類，その他必要に応じてアミノ酸，
ビタミンや微生物の生育に必要な栄養源を含む。アセト
バクター属に属する微生物を用いる場合には、ヘキソサ
ミンを炭素源として含有させたＳｃｈｒａｍｍ−Ｈｅｓ
ｔｒｉｎ　培地が特に好適である。

【００１１】Ｎ−アセチルグルコサミンの培地への添加
濃度は、微生物の培養に影響がない範囲で適宜決定すれ
ばよく、通常は０．１〜５％の範囲が望ましい。また、
ヘキソサミンの添加濃度や添加方法を変えることにより
、生産物中のグルコース残基に対するヘキソサミン残基
の割合を任意に制御することができる。

【００１２】培養条件については、用いる酢酸菌が生育
し、新規セルロースを生産する条件であればよく、通常
、ｐＨは５〜９が適当であり、温度は２０〜４０℃、時
間は２〜１０日間が適当である。また、培養方法は、通
気かく拌培養でも静置培養でもよい。静置培養の場合は
、目的とするセルロースは培養液表面にゲル状物質とし
て生産され、容易に回収することができるので好ましい
。

【００１３】生産された新規セルロースは、必要に応じ
て除蛋白処理をした後、通常は水洗して使用する。さら
に、所望により水洗後、新規セルロースが分解しない方
法、例えば風乾などの一般的方法で乾燥させてもよい。

【００１４】本発明により製造されたゲル状高分子物質
が、グルコース残基だけでなくＧｌｃＮＡｃ残基も分子
中に含有しているセルロースであることは、例えば静置
培養で生産されたゲル状物質を除蛋白し、さらに培地由
来のＧｌｃＮＡｃを水洗により除去した後、乾燥させた
フィルム状物について塩酸で加水分解し、分解産物のア
ミノ酸分析計での定量結果や未乾燥ゲル状物質をブレン
ダーで離解したものにリゾチームを作用させると分解す
ること等から確認することができる。

【００１５】本発明の新規セルロースは、セルロース分
子中のグルコース残基の一部がＧｌｃＮＡｃ残基に置換
された、グルコース残基とＧｌｃＮＡｃ残基から構成さ
れる化合物であり、グルコース残基のみから構成される
セルロースやＧｌｃＮＡｃ残基のみから構成されるキチ
ンとは構造的に相違しているばかりでなく、キチンのＧ
ｌｃＮＡｃ残基の一部がグルコサミン残基に変換された
ＤＡＣとも異なる新規な化合物である。

【００１６】

【実施例】次に、本発明を実施例により詳しく説明する
。 実施例１ アセトバクター・キシリナムＡＴＣＣ１０２４５をＳｃ
ｈｒａｍｍ−Ｈｅｓｔｒｉｎ　培地（Ｄ−グルコース２
．０ｇ，バクトペプトン（ディフコ社製）０．５ｇ，酵
母エキス（ディフコ社製）０．５ｇ，クエン酸０．１１
５ｇ，リン酸水素二ナトリウム０．２７ｇ，蒸留水１０
０ｍｌ、ｐＨ６．０）１５ｍｌに植菌し、２８℃で２日
間培養して得られた菌液０．５ｍｌを炭素源としてグル
コースとＧｌｃＮＡｃを種々の割合で含むＳｃｈｒａｍ
ｍ−Ｈｅｓｔｒｉｎ　培地１５ｍｌに加え、２８℃で４
日間静置培養した。グルコースを含まないＧｌｃＮＡｃ
のみの培地での培養は、３日毎にＧｌｃＮＡｃのみを含
む培地で継代培養を行い、その後、培養した菌液０．５
ｍｌを炭素源としてグルコースとＧｌｃＮＡｃを種々の
割合で含むＳｃｈｒａｍｍ−Ｈｅｓｔｒｉｎ　培地１５
ｍｌに植え、２８℃で４〜７日間静置培養した。

【００１７】培養終了後、培養液表面に生産されたゲル
状の膜を取り出し、２％ＳＤＳ溶液で煮沸後、１％Ｎａ
ＯＨ水溶液に浸し、超音波で洗浄した。さらに、１％酢
酸水溶液で中和後、水洗してセルロースを得た。このと
きの収量は、培養液１５ｍｌあたり５〜１５ｍｇであっ
た。 また、得られたセルロース膜の引張強度をＧｌｃＮＡｃ
残基を含まないセルロース膜（対照）と比較したところ
、対照より高い弾性率を示した。

【００１８】実施例２ アセトバクター・キシリナムＡＴＣＣ１０２４５を、グ
ルコースの代わりにＧｌｃＮＡｃを炭素源とするＳｃｈ
ｒａｍｍ−Ｈｅｓｔｒｉｎ　培地（ＧｌｃＮＡｃ０．５
ｇ，バクトペプトン（ディフコ社製）０．５ｇ，酵母エ
キス（ディフコ社製）０．５ｇ，クエン酸０．１１５ｇ
，リン酸水素二ナトリウム０．２７ｇ，蒸留水１００ｍ
ｌ、ｐＨ６．０）１５ｍｌに植菌し、２８℃で２日間静
置培養して得られた菌液を蒸留水で１０００倍に希釈し
、２％の寒天を含む上記組成のＧｌｃＮＡｃを炭素源と
するＳｃｈｒａｍｍ−Ｈｅｓｔｒｉｎ寒天培地に塗布し
、２８℃で培養してコロニーを形成させた。

【００１９】形成したコロニーを、炭素源としてグルコ
ースとＧｌｃＮＡｃを種々の割合で含むＳｃｈｒａｍｍ
−Ｈｅｓｔｒｉｎ　培地１５ｍｌに加え、２８℃で７日
間静置培養した。グルコースを含まないＧｌｃＮＡｃの
みの培地での培養は、３日毎にＧｌｃＮＡｃのみを含む
培地で継代培養を行い、その後、培養した菌液０．５ｍ
ｌを炭素源としてグルコースとＧｌｃＮＡｃを種々の割
合で含むＳｃｈｒａｍｍ−Ｈｅｓｔｒｉｎ　培地１５ｍ
ｌに植え、２８℃で４〜７日間静置培養した。

【００２０】培養終了後、培養液表面に生産されたゲル
状の膜を取り出し、２％ＳＤＳ溶液で煮沸後、１％Ｎａ
ＯＨ水溶液に浸し、超音波で洗浄した。さらに、１％酢
酸水溶液で中和後、水洗してセルロースを得た。このと
きの収量は、培養液１５ｍｌあたり４〜５ｍｇであった
。

【００２１】実施例３ 実施例１および実施例２で得られたセルロースをガラス
板上で乾燥させ、８５％リン酸で洗浄後、２Ｎ塩酸にて
減圧下で１００℃，１２時間加水分解し、塩酸を除去後
、アミノ酸分析計で分析し、Ｎ−アセチルグルコサミン
に相当するピークの存在を確認し、グルコサミン塩酸塩
として定量した。使用したアミノ酸分析計は日立製８３
５型で、カラムは日立製♯２６１７（４ｍｍ径×２５０
ｍｍ）を使用した。サンプルをサンプル溶解用バッファ
ー（クエン酸ナトリウム二水和物４．９ｇ，クエン酸一
水和物３５．０ｇ，ＮａＣｌ８．７７ｇ，カプリル酸０
．１０ｍｌ，チオジグリコール５．００ｍｌを蒸留水に
溶解して１リットルに調製する。）に溶解後、適当量を
カラムに注入して分析した。カラムはあらかじめバッフ
ァー１（クエン酸ナトリウム二水和物１４．７１ｇ，ク
エン酸一水和物１０．５０ｇ，ＮａＣｌ２．９２ｇ，チ
オジグリコール５．００ｍｌ，ブリーチ４．００ｍｌ，
カプリル酸０．１０ｍｌを蒸留水に溶解し、１リットル
としたもの。ｐＨは４．３に調整）で平衡化しておき、
サンプル注入後、バッファー２（クエン酸ナトリウム二
水和物２６．６７ｇ，クエン酸一水和物６．１０ｇ，Ｎ
ａＣｌ５４．３５ｇ，ベンジルアルコール５．００ｍｌ
，ブリーチ４．００ｍｌ，カプリル酸０．１０ｍｌを蒸
留水に溶解し、１リットルとしたもの。ｐＨは４．９に
調整）でグラジエントをかけ溶出させた。そのときの溶
出速度は０．２７５ｍｌ／ｍｉｎであった。溶出位置５
１．４ｍｉｎにＮ−アセチルグルコサミンに相当するピ
ークが検出された。

【００２２】実施例１で得た結果を基にして培地中のＧ
ｌｃＮＡｃ量に対して得られたセルロース膜中のＧｌｃ
ＮＡｃ量をプロットすると、図１のようになった。図中
、１はあらかじめＧｌｃＮＡｃを含む培地で継代培養を
行わない場合、２は５回継代培養を行った場合、３は１
０回継代培養を行った場合の結果をそれぞれ示す。図か
ら明らかなように、継代培養を行うと、培養の回数が増
えるに従いセルロース膜中のＧｌｃＮＡｃ量が増大する
。なお、セルロース中のＧｌｃＮＡｃ残基の量は、グル
コース残基の量の１〜２％であった。

【００２３】セルロース膜の収量は、培地のグルコース
とＧｌｃＮＡｃの比率に関係なく、継代培養を５回行っ
た以後は、与えた糖に対してほぼ一定であり、約２％で
あった。なお、１０回の継代培養後に生成されたセルロ
ースは、ＧｌｃＮＡｃを全く含まないＳｃｈｒａｍｍ−
Ｈｅｓｔｒｉｎ　培地においてもＧｌｃＮＡｃ残基を含
んでいたが、これは植え継ぎ時にＧｌｃＮＡｃが種培養
から持ち込まれたために、見かけ上グルコースのみの培
地でも生産される結果となったため、あるいはグルコー
スから直接にＧｌｃＮＡｃ残基を含むセルロースを生産
するように菌株が変異したものと推定される。

【００２４】また、実施例２で得た結果を基にして培地
中のＧｌｃＮＡｃ量に対して得られたセルロース膜中の
ＧｌｃＮＡｃ量をプロットしたところ、図１と同様の結
果が得られた。

【００２５】実施例４ 実施例１で得た未乾燥のＧｌｃＮＡｃ残基を含むセルロ
ースを６７ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．２）に浸し、水
分を該リン酸緩衝液に置換後、ブレンダーで離解し、離
解物を得た。この離解物を含む懸濁液のＯＤ５４０ｎｍ
を１．０になるように調整して３７℃にて１時間プレイ
ンキュベートした。次いで、最終濃度が１〜５μｇ　／
ｍｌになるように卵白リゾチーム溶液を加え、３７℃で
反応させ、濁度の減少度を測定した。

【００２６】一方、対照としてＳｃｈｒａｍｍ−Ｈｅｓ
ｔｒｉｎ　培地で培養したこと以外は実施例１と同様に
して培養して得たセルロースを用いた。その結果、図２
に示す如く、セルロースだけでは分解に伴う濁度の減少
は見られなかった。しかし、ＧｌｃＮＡｃ残基を含むセ
ルロースでは、顕著な濁度の減少が認められた。これは
、本来はリゾチームの基質とならないセルロースの分子
中にリゾチームの作用部位であるＧｌｃＮＡｃ残基が導
入されたことにより、リゾチームの分解作用を受けるよ
うになったためである。図中、実線は実施例１で得たセ
ルロースの測定値であり、点線は対照のセルロースの測
定値である。

【００２７】

【発明の効果】本発明の新規セルロースは、フィルム状
や繊維状に成形することができ、このセルロースはゲル
状のままでも成形物であっても、生体適合性や生体内消
化性にすぐれている。しかも、ＧｌｃＮＡｃ残基の割合
を制御できることから、容易に高純度の製品を得ること
が可能であり、傷口治癒剤，縫合糸，薬物送達システム
担体，化粧品等の素材として利用できる。また、分子中
にアセトアミド基が存在することにより、グルコース残
基だけでは見られない各種物質に対する透過性に選択性
が生じることから、透析膜，気体分離膜，アフィニティ
ー膜，物質選択透過膜等の分離膜素材や固定化担体，光
学分割，アフィニティー分離クロマトの担体などの素材
としても利用できる。

【００２８】

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例１で得たセルロース膜中のＧｌｃＮＡｃ
含有量と継代培養の回数との関係を示すグラフである。

【図２】実施例４において、リゾチーム濃度１μｇ　／
ｍｌのときの実施例１のセルロース膜のリゾチーム消化
性を示すグラフである。Ｇｌｃ　のみからなるセルロー
ス膜は、Ｓｃｈｒａｍｍ−Ｈｅｓｔｒｉｎ　培地で培養
して製造したセルロース膜を示す。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】分子中にＮ−アセチルグルコサミン残基を
   含むセルロース。
2. 【請求項２】セルロース生産能を有する酢酸菌をＮ−ア
   セチルグルコサミンを含む培地で培養することを特徴と
   する分子中にＮ−アセチルグルコサミン残基を含むセル
   ロースの製造法。