CN102154395A - 一种无机盐、有机溶剂共沉作用提取γ-聚谷氨酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种提取γ-聚谷氨酸的方法。本发明通过下述方案予以实现：将发酵液抽滤除菌体。发酵上清液添加有机溶剂，加入氯化钠、氯化钾或硫酸铵，放置过夜，获得的沉淀为γ-聚谷氨酸粗品。将此γ-聚谷氨酸粗品溶于蒸馏水中，离心除去小分子不溶物，上清液加入氯化钠、氯化钾或硫酸铵，再加入有机溶剂，搅拌获得γ-聚谷氨酸沉淀，按照1∶5～10(m：v)溶于蒸馏水中，超滤膜过滤除去杂质。超滤透出液冷冻干燥得到白色γ-聚谷氨酸粉末。本发明方法可有效提高了产品提取收率，减少有机溶剂的使用量，降低生产成本，避免了提取中使用大量有机溶剂而造成的环境问题，减少环境污染。

Description

一种无机盐、有机溶剂共沉作用提取γ-聚谷氨酸的方法

技术领域

本发明的技术方案属于生物法合成生物可降解高分子材料研究领域。

背景技术

γ-聚谷氨酸[γ-ployglutamic acid，简称为γ-PGA]是以谷氨酸为唯一单体的共聚高分子聚合物。γ-PGA最早发现于1937年。研究人员在炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)与糖化菌(Bacillus mesentericus)的细胞荚膜中发现γ-PGA，是某些微生物荚膜的主要成分之一。后期日本研究者在枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和纳豆杆菌(Bacillus natto)中也发现γ-PGA。迄今为止，以味之素株式会社、明治制果公司和广崎大学为代表的国外单位对γ-PGA的性能，合成和应用做了较深入地研究，γ型聚谷氨酸已有商业产品，我国在这方面研究的相对较少，直到近几年才有学者对聚谷氨酸的合成与性能做了基础性的研究。因此加强聚谷氨酸的研究，特别是对下游加工提取过程系统研究，构建可降解生物高分子的一个研究的平台，具有重要的理论价值和应用价值。

采用酸碱滴定法测定游离型γ-PGA的pKa值，得到γ-PGA的pKa＝2.23，该值与谷氨酸的α-羧基的pKa值大体一致。利用TGA和DSC进行热性质的分析，得出其热分解温度为235.9℃，熔点为223.5℃。从溶解度角度研究γ-PGA的功能，研究人员对γ-PGA的可溶性溶剂的研究结果表明：1.0gγ-PGA可溶于100mL二甲基亚矾、热的N，N-二甲基甲酰胺、N-甲基-2-吡咯烷酮。γ-PGA酸水解后用GITC做衍生化试剂，HPLC测得γ-PGA中D-谷氨酸和L-谷氨酸的比值稳定在D∶L＝3∶2。生物发酵法测得的γ-PGA为一个平均值，一般而言，由芽孢杆菌产生的γ-PGA的平均分子量(Mw)在10⁵～8×10⁶之间，而多分散性在2～5之间。

聚谷氨酸属于聚酯类聚合物，是一种新型的完全生物降解性高分子材料。生物降解性材料是指通过自然界微生物(细菌、真菌等)作用而发生降解的高分子物质。该种材料降解的产物无毒无害，不会对环境产生二次污染，近年来这种高分子材料的开发研究得到了飞速发展。γ-PGA由L-或/和D-谷氨酸通过γ-谷氨酰键连接而成，不同的微生物合成的立体化学结构和分子量不同，已经发现的主要有三种立体化学结构：D-谷氨酸组成的均聚物(γ-D-PGA)，L-谷氨酸组成的均聚物(γ-L-PGA)，D-型和L-型谷氨酸组成的共聚物(γ-DL-PGA)。

作为一种水溶性脂肪族聚酯，聚谷氨酸分子中有大量的游离的亲水性羧基，因此γ-PGA具有高度的水溶性、生物相容性、生物可降解性、生物可吸收性、无免疫原性和可化学衍生性，γ-PGA可在酸性水溶液中(如胃酸环境下)自发或在酶的促进下降解为小分子谷氨酸，而谷氨酸单体可参与三羧酸循环被人体吸收，并无任何毒副作用。聚谷氨酸分解或燃烧后，最终产物是二氧化碳和水，可被植物吸收，对环境无毒无害。γ-PGA在体内环境下受生物酶的作用，会降解生成无毒的短肽、小分子或氨基酸单体，在自然环境中，会受到微生物的作用而降解；在生理功能方面可防止细胞脱水、保护细胞免受蛋白酶的降解；在放射线照射下，γ-PGA会发生分子间的结合，提高吸水性能，由此可开发出一种强吸水性的生物树脂。此外，由于γ-PGA易在冷水中分散，可制成水凝胶，γ-PGA水凝胶有良好的粘弹性，并在一定范围内具有耐高温，耐酸、碱、盐，耐渗透压，抗冻融等优良特性。

聚谷氨酸的生产方法主要有化学合成法、提取法和微生物发酵法三种方法。化学合成方法包括传统的肽合成法和二聚体缩聚法。两种化学合成法都只能合成相对分子质量为5000～20000的小分子聚谷氨酸甲基酷，经碱性水解变成小分子γ-PGA。化学合成法难度很大，后续分离提纯成本高，没有工业应用价值。提取法来制取聚谷氨酸起源与日本纳豆产业。早期，日本生产γ-聚谷氨酸大多采用提取法，用乙醇将纳豆中的PGA分离提取出来。由于纳豆中所含的γ-聚谷氨酸浓度甚微，且有波动，因此，提取工艺十分复杂，生产成本甚高，同样难以大规模生产。微生物发酵制取聚谷氨酸是现在最有可能实现大规模工业生产的方法。聚谷氨酸微生物发酵制取聚谷氨酸生产方法主要有分批发酵法、连续发酵法、液体两相发酵法、搅拌罐反应器自循环发酵法、固体发酵法和固定化酶法等6种方法，分批发酵法简单方便，容易操作和控制，在工业小试阶段容易得到较纯的样品。分批发酵制取聚谷氨酸工艺，菌种方面现主要发现地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)和枯草芽孢杆菌(B.subtilis)具有较高的聚谷氨酸合成能力。生物发酵合成γ-PGA具有突出的优点，通过芽孢杆菌发酵，产物均为γ-PGA型、产物分子量高、生产条件温和、生成产物纯度较高，微生物发酵得到的γ-PGA分子量可达100KD～1000KD，相比于化学合成法制取成本也大大减少，是唯一适合工业化大规模生产聚谷氨酸的方法。但微生物发酵生产γ-PGA产量不高，内含大量杂蛋白和多糖，分离纯化困难，特别是在采用地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)发酵生产γ-聚谷氨酸的过程中，高粘度的发酵液除菌体一直是不容忽视的重要问题，也是造成γ-PGA生产成本巨大的重要原因。γ-PGA是一种胞外产物，其发酵液很黏，用一般的离心法去除菌体很难，且不适用于工业大规模应用。为了降低去除菌体的能量消耗和节省用于沉淀的有机溶剂用量，DO.J.H等对原工艺进行优化，提出了一种高效分离γ-PGA的方法。该方法由两步组成：首先调PH至3.0使粘度降为原发酵液的1/6，再离心除菌体，这样使得离心能量降为原来的17％；然后对去菌液回调至PH5.0，用中空纤维膜进行超滤，使得发酵液由原来的20g/L，浓缩至60g/L，提取所需的乙醇用量减少为原来的1/4，减低的提取γ-PGA的成本。但是这种方法，对纤维膜的要求极高，而且工业生产难以放大生产。因此，发酵液粘度的降低，同时后续分离中如何高效提取聚谷氨酸一直是困扰地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)发酵制备γ-PGA的主要问题之一，需高度重视。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：提供一种利用地衣芽孢杆菌(B.licheniformis CGMCC3336)发酵生产聚谷氨酸利用无机盐、有机溶剂共沉作用提取γ-聚谷氨酸的方法，实现高粘发酵液快速、高效提取和纯化，提高γ-聚谷氨酸产率，减少生产成本。

本发明解决该技术问题所采用的技术方案是：

第一步培养基的配制

(1)菌种活化培养基：LB培养基：酵母粉5g/L，胰蛋白胨10g/L，Nacl 10g/L，琼脂20g/L，pH 7.0，121℃高压蒸汽灭菌15min；

(2)种子培养基：K₂HPO₄0.5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，葡萄糖30g/L，酵母粉5g/L，胰蛋白胨10g/L，PH 7.0；121℃高压蒸汽灭菌15min；

(3)发酵培养基：葡萄糖80g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，酵母膏20g/L，Nacl 10g/L，Cacl₂1g/L，谷氨酸钠80g/L(单独灭菌)，pH7.0，121℃高压蒸汽灭菌15min；

第二步菌种活化

将斜面菌种——地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)转接LB斜面培养基，37℃活化培养12h；

第三步种子培养将第二步活化的斜面菌种接种于装有50mL第一步制得的种子培养基的500mL三角瓶中，在37℃，180～250r/m下培养16h；

第四步发酵培养

将第三步制得的种子培养液以10％接种量接种于发酵培养基中，在37℃，220r/m下培养72h；

第五步分离提取

(1)抽滤除菌体：在第四步发酵结束后取发酵液，发酵液pH调节至pH 3～pH 5，静置60min～90min，发酵液粘度大大下降，将此发酵液抽滤除菌体。

(2)γ-聚谷氨酸的初步提取：将第五步(1)中的发酵液冷却至室温，缓慢搅拌，分别添加无水乙醇、甲醇或丙酮使其在溶液中的终浓度达到70％～80％(v/v)，同时分别添加1％～3％(m/v)的氯化钠、氯化钾或硫酸铵，在30℃～60℃下，混合液于室温下缓慢搅拌放置过夜，获得的沉淀为γ-聚谷氨酸，倾去上清液获得聚谷氨酸沉淀，按1∶5～10(m∶v)溶于蒸馏水中，再次离心除去小分子不溶物，上清液直接冷冻干燥，得γ-聚谷氨酸粗品。

(3)γ-聚谷氨酸的精制：将第五步(2)得到的γ-聚谷氨酸粗品按1∶5～10(m∶v)溶于蒸馏水中，加入1％～10％(m/v)氯化钠、氯化钾或硫酸铵，加入无水乙醇、甲醇或丙酮使其在溶液中的终浓度达到40％～50％(v/v)，缓慢搅拌获得γ-聚谷氨酸沉淀，按照1∶5～10(m∶v)溶于蒸馏水中，通过超滤膜(MW3500～10000)过滤除去小分子杂质。超滤透出液直接冷冻干燥得到白色γ-聚谷氨酸粉末。

本发明与现有技术相比，有益效果是：第一，使用该方法可有效降低原始发酵液粘度，利于后续除去菌体；第二，利用无机盐、有机溶剂共沉精制γ-聚谷氨酸，既提高了产品提取收率，减少有机溶剂的使用量，降低γ-聚谷氨酸的生产成本，又避免了提取操作过程中由于使用大量有机溶剂而造成的环境问题，减少环境污染。

具体实施方式

实施例一

提取γ-聚谷氨酸：

第一步培养基的配制

(1)菌种活化培养基：LB培养基：酵母粉5g/L，胰蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，琼脂20g/L，pH 7.0，121℃高压蒸汽灭菌15min；

(2)种子培养基：K₂HPO₄0.5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，葡萄糖30g/L，酵母粉5g/L，胰蛋白胨10g/L，pH 7.0；121℃高压蒸汽灭菌15min

(3)发酵培养基：葡萄糖80g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，酵母膏20g/L，NaCl 10g/L，CaCl₂1g/L，谷氨酸钠8g/L(单独灭菌)，pH7.0，121℃高压蒸汽灭菌15min；

第二步菌种活化

将斜面菌种——地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)转接LB斜面培养基，37℃活化培养12h；

第三步种子培养将第二步活化的斜面菌种接种于装有50mL第一步制得的种子培养基的500mL三角瓶中，在37℃，250r/m下培养16h；

第四步发酵培养

将第三步制得的种子培养液以10％接种量接种于发酵培养基中，在37℃，220r/m下培养72h；

第五步聚谷氨酸分离提取

(1)盐析法除菌体：在第四步发酵结束后取发酵液，发酵液pH调节至pH＝3，静置60min，发酵液粘度大大下降，将此发酵液抽滤除菌体。

(2)γ-聚谷氨酸的初步提取：将第五步(1)中的发酵液冷却至室温，缓慢搅拌，加入四倍体积无水乙醇使其在溶液中的终浓度达到80％(v/v)，同时分别添加1％(m/v)的氯化钠，在40℃下，混合液于室温下缓慢搅拌放置过夜，获得的沉淀为γ-聚谷氨酸，倾去上清液获得聚谷氨酸沉淀，按1∶10(m∶v)溶于蒸馏水中，再次离心除去小分子不溶物，上清液经过冷冻干燥，得γ-聚谷氨酸粗品。

(3)γ-聚谷氨酸的精制：将第五步(2)得到的γ-聚谷氨酸粗品按1∶10(m∶v)溶于蒸馏水中，加入1％(m/v)氯化钠，再加入无水乙醇使其在溶液中的终浓度为50％(v/v)，缓慢搅拌获得γ-聚谷氨酸沉淀，按照1∶10(m∶v)溶于蒸馏水中，通过超滤膜(MW10000)过滤除去小分子杂质。超滤透出液经过冷冻干燥得到白色γ-聚谷氨酸粉末。

实施例二

在本实施例中，按照实施例一的方法在第五步(2)发酵过滤液添加三倍体积无水乙醇使其终浓度在溶液中达到75％(v/v)，2％(m/v)的氯化钠，在40℃下，缓慢搅拌放置过夜，获得的沉淀为γ-聚谷氨酸，倾去上清液获得聚谷氨酸沉淀，按1∶5(m∶v)溶于蒸馏水中，再次离心除去小分子不溶物，上清液经过冷冻干燥，得γ-聚谷氨酸粗品。将第五步(2)得到的γ-聚谷氨酸粗品按1∶5(m∶v)溶于蒸馏水中，加入2％(m/v)氯化钠，再加入无水乙醇使其在溶液中终浓度达到30％(v/v)，缓慢搅拌获得γ-聚谷氨酸沉淀，按照1∶5(m∶v)溶于蒸馏水中，通过超滤膜(MW3500)过滤除去小分子杂质。超滤透出液经过冷冻干燥得到白色γ-聚谷氨酸粉末。其它同实施例1。

实施例三

在本实施例中，按照实施例一的方法在第五步(2)发酵过滤液，添加无水乙醇使其在上清液中终浓度达到80％(v/v)，1％(m/v)的氯化钾，在30℃下，缓慢搅拌放置过夜，获得的沉淀为γ-聚谷氨酸，倾去上清液获得聚谷氨酸沉淀，按1∶10(m∶v)溶于蒸馏水中，再次离心除去小分子不溶物，上清液经过冷冻干燥，得γ-聚谷氨酸粗品。将第五步(2)得到的γ-聚谷氨酸粗品按1∶10(m∶v)溶于蒸馏水中，加入1％(m/v)氯化钾，再加入无水乙醇使其在溶液中终浓度达到30％(v/v)，缓慢搅拌获得γ-聚谷氨酸沉淀，按照1∶10(m∶v)溶于蒸馏水中，通过超滤膜(MW5000)过滤除去小分子杂质。超滤透出液经过冷冻干燥得到白色γ-聚谷氨酸粉末。其它同实施例1。

实施例四

在本实施例中，按照实施例一的方法在第五步(2)发酵过滤液添加分析纯甲醇使其在上清液中终浓度达到80％(v/v)，1％(m/v)的氯化钠，在30℃下，缓慢搅拌，放置过夜，获得的沉淀为γ-聚谷氨酸，倾去上清液获得聚谷氨酸沉淀，按1∶10(m∶v)溶于蒸馏水中，再次离心除去小分子不溶物，上清液经过冷冻干燥，得γ-聚谷氨酸粗品。将第五步(2)得到的γ-聚谷氨酸粗品按1∶10(m∶v)溶于蒸馏水中，加入1％(m/v)氯化钠，再加入分析纯甲醇使其在溶液中终浓度达到30％(v/v)，缓慢搅拌获得γ-聚谷氨酸沉淀，按照1∶10(m∶v)溶于蒸馏水中，通过超滤膜(MW3500)过滤除去小分子杂质。超滤透出液经过冷冻干燥得到白色γ-聚谷氨酸粉末。其它同实施例1。

实施例五

在本实施例中，按照实施例一的方法在第五步(2)发酵过滤液添加分析纯丙酮使其在上清液的终浓度达到70％(v/v)，1％(m/v)的硫酸铵，在30℃下，缓慢搅拌，放置过夜，获得的沉淀为γ-聚谷氨酸，倾去上清液获得聚谷氨酸沉淀，按1∶10(m∶v)溶于蒸馏水中，再次离心除去小分子不溶物，上清液经过冷冻干燥，得γ-聚谷氨酸粗品。将第五步(2)得到的γ-聚谷氨酸粗品按1∶10(m∶v)溶于蒸馏水中，加入1％(m/v)硫酸铵，再加入分析纯丙酮使其在溶液中终浓度达到30％(v/v)，缓慢搅拌获得γ-聚谷氨酸沉淀，按照1∶10(m∶v)溶于蒸馏水中，通过超滤膜(MW3500)过滤除去小分子杂质。超滤透出液经过冷冻干燥得到白色γ-聚谷氨酸粉末。其它同实施例1。

Claims (5)

1.一种无机盐、有机溶剂共沉作用提取γ-聚谷氨酸的方法，包括以下步骤：

第一步培养基的配制

(1)菌种活化培养基：LB培养基：酵母粉5g/L，胰蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，琼脂20g/L，pH 7.0，121℃高压蒸汽灭菌15min；

(2)种子培养基：K₂HPO₄0.5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，葡萄糖30g/L，酵母粉5g/L，胰蛋白胨10g/L，pH 7.0；121℃高压蒸汽灭菌15min；

(3)发酵培养基：葡萄糖80g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，酵母膏20g/L，NaCl 10g/L，CaCl₂1g/L，谷氨酸钠8g/L(单独灭菌)，pH7.0，121℃高压蒸汽灭菌15min；

第二步菌种活化

将斜面菌种——地衣芽孢杆菌(B.licheniformis CGMCC3336)转接LB斜面培养基，37℃活化培养12h；

第三步种子培养将第二步活化的斜面菌种接种于装有50mL第一步制得的种子培养基的500mL三角瓶中，在37℃，180～250r/m下培养16h；

第四步发酵培养

将第三步制得的种子培养液以10％接种量接种于发酵培养基中，在37℃，220r/m下培养72h；

第五步分离提取

(1)抽滤除菌体：在第四步发酵结束后取发酵液，发酵液pH调节至pH 3～pH 5，静置60min～90min，发酵液粘度大大下降，将此发酵液抽滤除菌体。

(2)γ-聚谷氨酸的初步提取：将第五步(1)中的发酵液冷却至室温，缓慢搅拌，分别添加无水乙醇、甲醇或丙酮使其在溶液中的终浓度达到70％～80％(v/v)，同时分别添加1％～3％(m/v)的氯化钠、氯化钾或硫酸铵，在30℃～60℃下，混合液于室温下缓慢搅拌放置过夜，获得的沉淀为γ-聚谷氨酸，倾去上清液获得聚谷氨酸沉淀，按1∶5～10(m∶v)溶于蒸馏水中，再次离心除去小分子不溶物，上清液经过冷冻干燥，得γ-聚谷氨酸粗品。

(3)γ-聚谷氨酸的精制：将第五步(2)得到的γ-聚谷氨酸粗品按1∶5～10(m∶v)溶于蒸馏水中，加入1％～10％(m/v)氯化钠、氯化钾或硫酸铵，加入无水乙醇、甲醇或丙酮使其在溶液中的终浓度达到40％～50％(v/v)，缓慢搅拌获得γ-聚谷氨酸沉淀，按照1∶5～10(m∶v)溶于蒸馏水中，通过超滤膜(MW3500～10000)过滤除去小分子杂质。超滤透出液经冷冻干燥得到白色γ-聚谷氨酸粉末。

2.根据权利要求1所述的共沉作用提取γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于，抽滤后的发酵上清液加入的有机溶剂为无水乙醇、分析纯甲醇或丙酮。

3.根据权利要求1所述的共沉作用提取γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于，抽滤后的发酵上清液加入的有机溶剂为无水乙醇、分析纯甲醇或丙酮，使有机溶剂在溶液中的终浓度达到70％～80％(v/v)。

4.根据权利要求1所述的共沉作用提取γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于，抽滤后的发酵上清液加入的无机盐为氯化钠、氯化钾或硫酸铵。

5.根据权利要求1所述的共沉作用提取γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于，抽滤后的发酵上清液加入的无机盐为氯化钠、氯化钾或硫酸铵，无机盐的添加量为1％～3％(m/v)。