CN103757063A - 一种添加维生素大量提高β-聚苹果酸产量的发酵培养基 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种添加维生素大量提高β-聚苹果酸产量的发酵培养基，属于微生物发酵领域。所述的发酵培养基组成如下（g/L）：蔗糖120，NaNO32，KH2PO40.1，KCl0.5，MnSO40.05，MgSO4·7H2O0.3，CaCO320，NH4NO314.5，天门冬氨酸0.336，亮氨酸0.581，苏氨酸0.236，缬氨酸0.501，组氨酸0.361，胞嘧啶0.0015，腺嘌呤0.001，胆碱0.16，维生素B10.001～0.01，维生素B90.0001～0.001，维生素B120.001～0.01。本发明通过在已优化好的合成培养基中添加不同种类、不同浓度的维生素作为生长因子，从而有利于协助多种胺基酸之间的转换，提高菌体对环境的适应能力，刺激菌体生长代谢，促进发酵液中的β-聚苹果酸产量的提高，从而提供一种高效制备β-聚苹果酸的方法；通过本发明的培养基可使发酵液中β-聚苹果酸含量达到45g/L。
Description
技术领域
本发明属于微生物发酵领域，具体涉及一种发酵过程中添加不同种类、不同浓度的维生素有效提高聚苹果酸产量的发酵培养基。
背景技术
现在，大部分合成高分子聚合物是石油化工产品，对环境产生了深远的影响。而随着人们对环境保护知识的积累，对传统的不可降解高分子的认识发生了改变。目前，人们关注的重点是环境友好型的生物可降解高分子，这些高分子聚合物的生产有利于节约能源和资源，从而减缓温室效应，协调生态发展的工艺过程和产品。
聚苹果酸（聚羟基丁二酸酯，Poly malic acid或Poly malate,简称为PMLA）是以苹果酸为唯一单体合成的均聚高分子聚合物。苹果酸是一种含有羟基的二羧酸，它是一种很好的食品添加剂，其水溶解性很强,在体内主要参与三羧酸(TCA)循环。聚合时通过其羟基和羧基酯化连接而成为高分子化合物。苹果酸含有两个羧基和一个羟基，其相互酯化的产物主要有三种，即α型、β型、γ型PMLA，唯一存在于人体内的只有β型PMLA（结构如下式）。
式2聚L-β–苹果酸的立体结构
聚苹果酸（聚羟基丁二酸酯）属于聚酯类聚合物，是完全生物降解高分子。生物降解性材料是指通过自然界微生物（细菌、真菌等）作用而发生降解的高分子物质。该种材料降解的产物无毒无害,不会对环境产生二次污染,近年来这种高分子材料的开发研究得到了飞速发展。在国外，有关聚苹果酸的研究开始于上世纪60年代，对于其性质、用途、合成方法都有一定的研究和报道，聚苹果酸主要应用于药物载体和微胶囊材料，其合成方法主要集中于化学合成，β型聚苹果酸已有商业产品。而国内还刚刚起步，对聚苹果酸的研究非常少，几乎为空白。因此加强聚苹果酸的研究，构建可降解生物高分子的一个研究的平台，具有重要的理论价值和应用价值。
目前国际上有关利用微生物发酵生产聚苹果酸的专利非常少，我国有关聚苹果酸 的专利中，公告号为CN102154389A的专利申请中公开了一种通过流加碳源和无机盐实现聚苹果酸的高产的方法；公告号为CN101979499A的专利申请中公开了多组复合诱变技术选育出的高产β-聚苹果酸的诱变菌株，然后对发酵培养基进行优化发酵生产β-聚苹果酸的方法；公告号为CN101560528的专利申请公开了一种利用普鲁兰酶有效降解去除出芽短梗霉发酵液中普鲁兰多糖，以利于提取获得β-聚苹果酸的方法；还有公告号为CN103045662A的专利申请公开了一种提高发酵法生产β-聚苹果酸产量和纯度的发酵培养基，虽然培养基中添加了氨基酸，但只是用来替代原半合成培养基中的蛋白胨。
在利用微生物发酵生产β-聚苹果酸的方法中，大多需要加入部分有机氮源（如蛋白胨）以保证菌体的正常生长和β-聚苹果酸的合成。但利用有机氮源则存在原料成本较高，后期提取困难，得到的β-聚苹果酸纯度不高等问题。因此，寻求更廉价、更简单的培养基以成为有效提高β-聚苹果酸产量的必然之路。
发明内容：
本发明的目的是提供一种发酵过程中添加不同种类、不同浓度的维生素有效提高聚苹果酸的方法。该方法通过氨基酸、嘌呤、嘧啶的科学复配取代半合成培养基中的蛋白胨，解决发酵过程中原料成本高和提取过程中脱色困难的问题，显著提高β-聚苹果酸的产量和纯度，降低生产成本。
为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
所述的发酵培养基组成如下（g/L）：蔗糖120，NaNO32，KH2PO40.1，KCl0.5，MnSO40.05，MgSO4·7H2O0.3，CaCO320，NH4NO314.5，天门冬氨酸0.336，亮氨酸0.581，苏氨酸0.236，缬氨酸0.501，组氨酸0.361，胞嘧啶0.0015，腺嘌呤0.001，胆碱0.16，维生素B10.001～0.01，维生素B90.0001～0.001，维生素B120.001～0.01。
所述发酵培养基组成较优的为（g/L）：蔗糖120，NaNO32，KH2PO40.1，KCl0.5，MnSO40.05，MgSO4·7H2O0.3，CaCO320，NH4NO314.5，天门冬氨酸0.336，亮氨酸0.581，苏氨酸0.236，缬氨酸0.501，组氨酸0.361，胞嘧啶0.0015，腺嘌呤0.001，胆碱0.16，维生素B10.001，维生素B90.001，维生素B120.001。
所述发酵培养基组成较优的为（g/L）：蔗糖120，NaNO32，KH2PO40.1，KCl0.5，MnSO40.05，MgSO4·7H2O0.3，CaCO320，NH4NO314.5，天门冬氨酸0.336，亮氨酸0.581，苏氨酸0.236，缬氨酸0.501，组氨酸0.361，胞嘧啶0.0015，腺嘌呤0.001，胆碱0.16，维生素B10.003，维生素B90.0009，维生素B120.003。
所述发酵培养基组成较优的为（g/L）：蔗糖120，NaNO32，KH2PO40.1，KCl0.5，MnSO40.05，MgSO4·7H2O0.3，CaCO320，NH4NO314.5，天门冬氨酸0.336，亮氨酸0.581，苏氨酸0.236，缬氨酸0.501，组氨酸0.361，胞嘧啶0.0015，腺嘌呤0.001，胆碱0.16，维生素B10.005，维生素B90.0005，维生素B120.005。
所述发酵培养基组成较优的为（g/L）：蔗糖120，NaNO32，KH2PO40.1，KCl0.5，MnSO40.05，MgSO4·7H2O0.3，CaCO320，NH4NO314.5，天门冬氨酸0.336，亮氨酸0.581，苏氨酸0.236，缬氨酸0.501，组氨酸0.361，胞嘧啶0.0015，腺嘌呤0.001，胆碱0.16，维生素B10.007，维生素B90.0003，维生素B120.007。
所述发酵培养基组成较优的为（g/L）：蔗糖120，NaNO32，KH2PO40.1，KCl0.5，MnSO40.05，MgSO4·7H2O0.3，CaCO320，NH4NO314.5，天门冬氨酸0.336，亮氨酸0.581，苏氨酸0.236，缬氨酸0.501，组氨酸0.361，胞嘧啶0.0015，腺嘌呤0.001，胆碱0.16，维生素B10.009，维生素B90.0007，维生素B120.009。
所述发酵培养基组成较优的为（g/L）：蔗糖120，NaNO32，KH2PO40.1，KCl0.5，MnSO40.05，MgSO4·7H2O0.3，CaCO320，NH4NO314.5，天门冬氨酸0.336，亮氨酸0.581，苏氨酸0.236，缬氨酸0.501，组氨酸0.361，胞嘧啶0.0015，腺嘌呤0.001，胆碱0.16，维生素B10.01，维生素B90.0001，维生素B120.01。
本发明所用菌种来源：天津北洋百川生物技术有限公司申请专利名称为一种惰性载体吸附固态发酵法生产β-聚苹果酸的方法，申请号：200910071171.2。.该专利中公开了本发明所用菌种为出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans），已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种编号CGMCC3337。
有益效果：
本发明利用出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans）发酵生产β-聚苹果酸，可以有效降低发酵原料成本和提取过程中脱色难度，提高最终获得β-聚苹果酸的纯度，本发明利用氨基酸、胆碱和嘌呤嘧啶的复配，取代原半合成培养基中的蛋白胨所得到一种全新的合成培养基，在已优化好的合成培养基中添加不同种类、不同浓度的维生素作为生长因子，从而有利于合成嘌呤和胸腺嘧啶，协助多种胺基酸之间的转换，促进蛋白质的合成和细胞的成熟，提高菌体对环境的适应能力，刺激菌体生长代谢，促进发酵液中的β-聚苹果酸产量的提高，从而提供一种高效制备β-聚苹果酸的方法；通过本发明的培养基可使发酵液中β-聚苹果酸含量达到45g/L。
具体实施方法：
下面通过具体的实施方案叙述本发明中聚苹果酸的生产方法。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。
实施例1
1培养基的制备
(1)活化培养基为：土豆葡萄糖琼脂培养基（PDA）：土豆200g/L,葡萄糖20g/L,琼脂20g/L,pH自然，121℃高压蒸汽灭菌20min；
（2）种子培养基为：蔗糖140g/L、酵母膏3g/L、硫酸铵1g/L、丁二酸2g/L、玉米浆1g/L、K2CO30.4g/L、MgSO4·7H2O0.1g/L、KH2PO40.1g/L、ZnSO4·7H2O0.005g/L，CaCO320g/L(单独灭菌)，121℃高压蒸汽灭菌20min。
2.CGMCC3336菌种活化：菌种转接到PDA斜面培养基上，25℃活化培养3～5d；
3.种子液制备：选取生长良好的斜面种子用无菌生理盐水洗下孢子，制备孢子浓度约106个/ml的孢子悬浮液，按10%（v/v）接种量接种装有100ml液体种子培养基的500ml三角瓶中，25℃，200rpm条件下培养2～3d，制得种子液。
4.发酵罐发酵：
（1）发酵培养基（g/L）：蔗糖120，NaNO32，KH2PO40.1，KCl0.5，MnSO40.05，MgSO4·7H2O0.3，CaCO320，NH4NO314.5，天门冬氨酸0.336，亮氨酸0.581，苏氨酸0.236，缬氨酸0.501，组氨酸0.361，胞嘧啶0.0015，腺嘌呤0.001，胆碱0.16，维生素B10.001，维生素B90.001，维生素B120.001。
（2）发酵条件：30L发酵罐装液量为15L，按上述发酵培养基所示的配方配制发酵培养基，种子液的接种量为10%，发酵温度25℃，发酵时间120小时，通风量1.0vvm，转速400rpm；发酵结束后，发酵液经甲醇醇沉、水解后，并稀释相当倍数，使用C18柱采用高效液相色谱法检测β-聚苹果酸的产量为35g/L。
实施例2
菌种的活化和种子液的制备同实施例1
4.发酵罐发酵：
（1）发酵培养基（g/L）：蔗糖120，NaNO32，KH2PO40.1，KCl0.5，MnSO40.05，MgSO4·7H2O0.3，CaCO320，NH4NO314.5，天门冬氨酸0.336，亮氨酸0.581，苏氨酸0.236，缬氨酸0.501，组氨酸0.361，胞嘧啶0.0015，腺嘌呤0.001，胆碱0.16， 维生素B10.003，维生素B90.0009，维生素B120.003。
（2）发酵条件：30L发酵罐装液量为15L，按上述发酵培养基所示的配方配制发酵培养基，种子液的接种量为10%，发酵温度25℃，发酵时间120小时，通风量1.0vvm，转速400rpm；发酵结束后，发酵液经甲醇醇沉、水解后，并稀释相当倍数，使用C18柱采用高效液相色谱法检测β-聚苹果酸的产量为39g/L。
实施例3
菌种的活化和种子液的制备同实施例1
4.发酵罐发酵：
（1）发酵培养基（g/L）：蔗糖120，NaNO32，KH2PO40.1，KCl0.5，MnSO40.05，MgSO4·7H2O0.3，CaCO320，NH4NO314.5，天门冬氨酸0.336，亮氨酸0.581，苏氨酸0.236，缬氨酸0.501，组氨酸0.361，胞嘧啶0.0015，腺嘌呤0.001，胆碱0.16，维生素B10.005，维生素B90.0005，维生素B120.005。
（2）发酵条件：30L发酵罐装液量为15L，按上述发酵培养基所示的配方配制发酵培养基，种子液的接种量为10%，发酵温度25℃，发酵时间120小时，通风量1.0vvm，转速400rpm；发酵结束后，发酵液经甲醇醇沉、水解后，并稀释相当倍数，使用C18柱采用高效液相色谱法检测β-聚苹果酸的产量为45g/L。
实施例4
菌种的活化和种子液的制备同实施例1
4.发酵罐发酵：
（1）发酵培养基（g/L）：蔗糖120，NaNO32，KH2PO40.1，KCl0.5，MnSO40.05，MgSO4·7H2O0.3，CaCO320，NH4NO314.5，天门冬氨酸0.336，亮氨酸0.581，苏氨酸0.236，缬氨酸0.501，组氨酸0.361，胞嘧啶0.0015，腺嘌呤0.001，胆碱0.16，维生素B10.007，维生素B90.0003，维生素B120.007。
（2）发酵条件：30L发酵罐装液量为15L，按上述发酵培养基所示的配方配制发酵培养基，种子液的接种量为10%，发酵温度25℃，发酵时间120小时，通风量1.0vvm，转速400rpm；发酵结束后，发酵液经甲醇醇沉、水解后，并稀释相当倍数，使用C18柱采用高效液相色谱法检测β-聚苹果酸的产量为42g/L。
实施例5
菌种的活化和种子液的制备同实施例1
4.发酵罐发酵：
（1）发酵培养基（g/L）：蔗糖120，NaNO32，KH2PO40.1，KCl0.5，MnSO40.05， MgSO4·7H2O0.3，CaCO320，NH4NO314.5，天门冬氨酸0.336，亮氨酸0.581，苏氨酸0.236，缬氨酸0.501，组氨酸0.361，胞嘧啶0.0015，腺嘌呤0.001，胆碱0.16，维生素B10.009，维生素B90.0007，维生素B120.009。
（2）发酵条件：30L发酵罐装液量为15L，按上述发酵培养基所示的配方配制发酵培养基，种子液的接种量为10%，发酵温度25℃，发酵时间120小时，通风量1.0vvm，转速400rpm；发酵结束后，发酵液经甲醇醇沉、水解后，并稀释相当倍数，使用C18柱采用高效液相色谱法检测β-聚苹果酸的产量为36g/L。
实施例6
菌种的活化和种子液的制备同实施例1
4.发酵罐发酵：
（1）发酵培养基（g/L）：蔗糖120，NaNO32，KH2PO40.1，KCl0.5，MnSO40.05，MgSO4·7H2O0.3，CaCO320，NH4NO314.5，天门冬氨酸0.336，亮氨酸0.581，苏氨酸0.236，缬氨酸0.501，组氨酸0.361，胞嘧啶0.0015，腺嘌呤0.001，胆碱0.16，维生素B10.01，维生素B90.0001，维生素B120.01。
（2）发酵条件：30L发酵罐装液量为15L，按上述发酵培养基所示的配方配制发酵培养基，种子液的接种量为10%，发酵温度25℃，发酵时间120小时，通风量1.0vvm，转速400rpm；发酵结束后，发酵液经甲醇醇沉、水解后，并稀释相当倍数，使用C18柱采用高效液相色谱法检测β-聚苹果酸的产量为32g/L。
Claims (7)
1.一种添加维生素大量提高β-聚苹果酸产量的发酵培养基，组成如下（g/L）：蔗糖120，NaNO32，KH2PO40.1，KCl0.5，MnSO40.05，MgSO4·7H2O0.3，CaCO320，NH4NO314.5，天门冬氨酸0.336，亮氨酸0.581，苏氨酸0.236，缬氨酸0.501，组氨酸0.361，胞嘧啶0.0015，腺嘌呤0.001，胆碱0.16，维生素B10.001～0.01，维生素B90.0001～0.001，维生素B120.001～0.01。
2.如权利要求1所述的添加维生素大量提高β-聚苹果酸产量的发酵培养基，其特征在于，组成如下（g/L）：蔗糖120，NaNO32，KH2PO40.1，KCl0.5，MnSO40.05，MgSO4·7H2O0.3，CaCO320，NH4NO314.5，天门冬氨酸0.336，亮氨酸0.581，苏氨酸0.236，缬氨酸0.501，组氨酸0.361，胞嘧啶0.0015，腺嘌呤0.001，胆碱0.16，维生素B10.001，维生素B90.001，维生素B120.001。
3.如权利要求1所述的添加维生素大量提高β-聚苹果酸产量的发酵培养基，其特征在于，组成如下（g/L）：蔗糖120，NaNO32，KH2PO40.1，KCl0.5，MnSO40.05，MgSO4·7H2O0.3，CaCO320，NH4NO314.5，天门冬氨酸0.336，亮氨酸0.581，苏氨酸0.236，缬氨酸0.501，组氨酸0.361，胞嘧啶0.0015，腺嘌呤0.001，胆碱0.16，维生素B10.003，维生素B90.0009，维生素B120.003。
4.如权利要求1所述的添加维生素大量提高β-聚苹果酸产量的发酵培养基，其特征在于，组成如下（g/L）：蔗糖120，NaNO32，KH2PO40.1，KCl0.5，MnSO40.05，MgSO4·7H2O0.3，CaCO320，NH4NO314.5，天门冬氨酸0.336，亮氨酸0.581，苏氨酸0.236，缬氨酸0.501，组氨酸0.361，胞嘧啶0.0015，腺嘌呤0.001，胆碱0.16，维生素B10.005，维生素B90.0005，维生素B120.005。
5.如权利要求1所述的添加维生素大量提高β-聚苹果酸产量的发酵培养基，其特征在于，组成如下（g/L）：蔗糖120，NaNO32，KH2PO40.1，KCl0.5，MnSO40.05，MgSO4·7H2O0.3，CaCO320，NH4NO314.5，天门冬氨酸0.336，亮氨酸0.581，苏氨酸0.236，缬氨酸0.501，组氨酸0.361，胞嘧啶0.0015，腺嘌呤0.001，胆碱0.16，维生素B10.007，维生素B90.0003，维生素B120.007。
6.如权利要求1所述的添加维生素大量提高β-聚苹果酸产量的发酵培养基，其特征在于，组成如下（g/L）：蔗糖120，NaNO32，KH2PO40.1，KCl0.5，MnSO40.05，MgSO4·7H2O0.3，CaCO320，NH4NO314.5，天门冬氨酸0.336，亮氨酸0.581，苏氨酸0.236，缬氨酸0.501，组氨酸0.361，胞嘧啶0.0015，腺嘌呤0.001，胆碱0.16，维生素B10.009，维生素B90.0007，维生素B120.009。
7.如权利要求1所述的添加维生素大量提高β-聚苹果酸产量的发酵培养基，其特征在于，组成如下（g/L）：蔗糖120，NaNO32，KH2PO40.1，KCl0.5，MnSO40.05，MgSO4·7H2O0.3，CaCO320，NH4NO314.5，天门冬氨酸0.336，亮氨酸0.581，苏氨酸0.236，缬氨酸0.501，组氨酸0.361，胞嘧啶0.0015，腺嘌呤0.001，胆碱0.16，维生素B10.01，维生素B90.0001，维生素B120.01。
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| 安超等: "出芽短梗霉发酵生产普鲁兰多糖研究进展", 《陕西农业科学》 * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104561143A (zh) * | 2014-12-29 | 2015-04-29 | 天津北洋百川生物技术有限公司 | 一种补料发酵提高β-聚苹果酸产量的方法 |
| CN107723318A (zh) * | 2017-11-28 | 2018-02-23 | 申国庆 | 聚苹果酸的高产量培养基 |
| CN112813015A (zh) * | 2021-02-05 | 2021-05-18 | 深圳大学 | 一种提高裸藻干重的促进剂、裸藻培养基及其应用 |
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20140430 |
|
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |