CN112813015A - 一种提高裸藻干重的促进剂、裸藻培养基及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种提高裸藻干重的促进剂、裸藻培养基及其应用，属于裸藻培养技术领域，所述促进剂选自胆碱、四氢嘧啶、维生素B1和磺胺嘧啶中的一种或几种。本发明通过在裸藻培养的培养基中添加所述促进剂促进裸藻干重增加，实现裸藻生物量高效产出及可持续培养，进而能够促进目前裸藻培养产能机制的研究进展，解决裸藻大规模培养所面临的瓶颈问题。

Description

一种提高裸藻干重的促进剂、裸藻培养基及其应用
技术领域
本发明涉及裸藻培养技术领域，尤其涉及一种提高裸藻干重的促进剂、裸藻培养基及其应用。
背景技术
裸藻(Euglena gracilis)也叫“眼虫”，细胞通常因含多个卵圆形的叶绿体而呈绿色。有鞭毛2条，1条自胞口伸出，生活时常打动。淡水产，春夏季节常在有机质较多的静态水体内大量繁殖，使水质成绿色。如绿眼虫可作为有机物污染环境的生物指标。裸藻细胞具有动物和植物的特点。裸藻具有与多细胞生物相当的极其复杂的代谢能力，为代谢工程生产增值生物分子提供了广阔的机会。在发现裸藻的高蛋白含量和氨基酸谱后，人们认识到了其商业潜力。此外，裸藻细胞还含有营养上重要的脂肪酸：二十二碳六烯酸(DHA)、二十碳五烯酸(EPA)和维生素，这表明裸藻作为一种有价值的资源具有工业潜力。独特的系统发育地位的特点使裸藻成为一种适合生理生化研究的真核生物。但是目前裸藻养殖中存在裸藻干重产量不理想的技术问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种提高裸藻干重促进剂、裸藻培养基及其应用，所述促进剂或裸藻培养基能够有效提高裸藻干重产量。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种提高裸藻干重的促进剂，所述促进剂选自胆碱、四氢嘧啶、维生素B1和磺胺嘧啶中的一种或几种。
优选的，当所述促进剂包括胆碱和四氢嘧啶时，所述胆碱和四氢嘧啶的质量比为(0.5～6.5)：(0.5～6.5)。
本发明还提供了一种裸藻培养基，所述裸藻培养基中包含上述方案所述促进剂。
优选的，所述裸藻培养基中促进剂的浓度为1～60g/1.5L。
本发明还提供了上述方案所述的促进剂或者所述裸藻培养基在提高裸藻干重中的应用。
优选的，所述应用包括以下步骤：
1)对裸藻进行放大培养，至藻液的OD750值达到1.0～4.5，得到富集藻液，对所述富集藻液进行离心，收集沉淀，采用裸藻专用培养基和所述沉淀混合至混合液的OD750值为1.0～4.5，得到待培养藻液；
2)在所述待培养藻液中加入所述促进剂和裸藻专用培养基，得到混合液，进行培养，得到含裸藻的藻液；
所述裸藻专用培养基以裸藻常用培养基为基础培养基，还包括10～80g/L的葡萄糖。
优选的，步骤2)中，每1.5L混合液包括待培养藻液100～800mL、促进剂1～60g和余量的裸藻专用培养基。
优选的，步骤2)中所述培养的光照强度为70～200μmol/m2s1。
优选的，步骤1)中所述离心的转速为3000～8000rpm；所述离心的时间为3～20min。
本发明提供了一种提高裸藻干重的促进剂，所述促进剂包括胆碱和/或四氢嘧啶。对比例1(未加入胆碱和四氢嘧啶)、仅加入胆碱(实施例1)、仅加入四氢嘧啶(实施例2)和同时加入胆碱和四氢嘧啶配伍(实施例3)的裸藻培养体系随着培养时间的增加，各体系的干重含量均不断提升，且加入胆碱和/或四氢嘧啶的裸藻养殖体系中的裸藻干重含量明显大于对比例1。第9天时，同时加入胆碱和四氢嘧啶配伍的裸藻体系中，干重含量达到了最大值2.16g/L，较对比例1提高了80％。单独添加胆碱的培养体系中，裸藻干重增加了50％，单独添加四氢嘧啶的培养体系中，裸藻干重增加了58.3％；本发明利用胆碱和/或四氢嘧啶与裸藻培养促进裸藻干重增加，实现裸藻生物量高效产出及可持续培养，进而能够促进目前裸藻培养产能机制的研究进展，解决裸藻大规模培养所面临的瓶颈问题。
附图说明
图1为实施例1～3和对比例1的裸藻干重含量变化情况对比分析结果；
图2为实施例4和对比例2的裸藻干重含量变化情况对比分析结果。
具体实施方式
本发明提供了一种提高裸藻干重的促进剂，所述促进剂选自胆碱(Choline)、四氢嘧啶(Ectoine)、维生素B1和磺胺嘧啶中的一种或几种。在本发明中，所述促进剂的分子结构中含有两个氮原子的六元杂环；本发明中，四氢嘧啶能够诱导裸藻细胞中负责调控ABC转运蛋白表达的其中一个基因-ehuB基因表达量的上调，裸藻为摄取四氢嘧啶从而提高了相关ABC转运蛋白的合成量，进一步加强裸藻对膜外物质的摄取能力，促进甘油三酸酯的酶催化合成，进而促进裸藻的生长及干重的增加。在本发明中，胆碱能够促进螺藻生长和有机物质合成和累积。
在本发明中，所述胆碱、四氢嘧啶、维生素B1和磺胺嘧啶来源于常规市售，优选的购自于生物工程(上海)股份有限公司。
在本发明中，所述胆碱的化学式如式I所示；
Figure BDA0002936420860000031
在本发明中，所述四氢嘧啶的化学式如式II所示；
Figure BDA0002936420860000032
在本发明中，所述磺胺嘧啶的化学结构式如式III所示；
Figure BDA0002936420860000033
在本发明中，当所述促进剂包括胆碱和四氢嘧啶时，所述胆碱和四氢嘧啶的质量比优选为(0.5～6.5)：(0.5～6.5)，进一步优选为1：1。
本发明还提供了上述方案所述的促进剂或者所述的培养基在提高裸藻干重中的应用。
在本发明中，所述促进剂优选的通过添加到裸藻培养基中来提高裸藻干重。
在本发明中，所述应用优选的包括以下步骤：
1)对裸藻进行放大培养，至藻液的OD750值达到1.0～4.5，得到富集藻液，对所述富集藻液进行离心，收集沉淀，采用裸藻专用培养基和所述沉淀混合至混合液的OD750值为1.0～4.5，得到待培养藻液；
2)在所述待培养藻液中加入所述促进剂和裸藻专用培养基，得到混合液，进行培养，得到含裸藻的藻液；
所述裸藻专用培养基以裸藻常用培养基为基础培养基，还包括10～80g/L的葡萄糖。
本发明首先对裸藻进行放大培养，至藻液的OD750值达到1.0～4.5，得到富集藻液，对所述富集藻液进行离心，收集沉淀，采用裸藻专用培养基和所述沉淀混合至混合液的OD750值为1.0～4.5，得到待培养藻液。
在本发明中，在所述放大培养之前优选的还包括对所述裸藻进行活化培养，得到裸藻活化培养液；所述活化培养采用的培养基优选为裸藻常用培养基；所述活化培养的温度优选为25～30℃，进一步优选为26℃；在所述活化培养过程中，本发明对光照周期没有特殊要求，无光照条件下、光照：黑暗＝12h:12h条件或全天光照条件均可。若在有光照的条件下，所述光照的光照强度优选为70～200μmol/m2s1；进一步优选为100～150μmol/m2s1。
在得到裸藻活化培养液后，本发明优选的还包括将所述裸藻活化培养液转接至培养基进行放大培养；所述放大培养采用的培养基优选为裸藻常用培养基；所述放大培养的温度优选为20～30℃，进一步优选为23℃；所述放大培养的光照强度优选为70～200μmol/m2s1，进一步优选为100μmol/m2s1；所述放大培养优选的于光照培养箱中进行；所述放大培养的时间优选的以裸藻达到生长对数期为准；所述扩大培养的次数优选为2次；所述放大培养过程中，优选的每天对培养瓶进行摇动；所述摇动的方式优选为人工摇动；所述摇动的次数优选为2～10次/d，以避免藻体沉底。在本发明中，扩大培养是为了让藻种进行生长繁殖，经过对数期增长，藻种量快速增加。
本发明所述活化培养和光照培养的过程均按照标准的微生物学实验方法，在超净工作台的无菌条件下进行，以避免藻种被污染。
在本发明中，所述离心的转速优选为3000～8000rpm，进一步优选为5000rpm；所述离心的时间优选为3～20min，进一步优选为5min。
在本发明中，所述裸藻专用培养基中葡萄糖的浓度优选为15g/L。在本发明中，所述葡萄糖的作用是提供碳源。
在本发明中，所述裸藻常用培养基的配方如表1所示。
表1裸藻常用培养基配方
Figure BDA0002936420860000051
所述Microelementa的配方参见表2。
表2 Microelementa的配方
Figure BDA0002936420860000052
Figure BDA0002936420860000061
bVitamin B1：准确称量0.05g Vitamin B1，溶于100mL去离子水，过滤除菌，存于4℃冰箱。
cVitamin B12：准确称量0.05g Vitamin B12，溶于1L去离子水，过滤除菌，存于4℃冰箱。
得到待培养藻液后，本发明在所述待培养藻液中加入所述促进剂和裸藻专用培养基，得到混合液，进行培养，得到含裸藻的藻液。
在本发明中，每1.5L混合液优选的包括待培养藻液100～800mL、促进剂1～30g和余量的裸藻专用培养基，进一步优选的每1.5L混合液包括待培养藻液200mL、促进剂2g和余量的裸藻专用培养基。在本发明中，所述培养的光照强度优选为70～200μmol/m2s1，进一步优选为100μmol/m2s1；所述培养过程中优选的保持持续光照；所述培养优选的于光照培养箱中进行；所述培养的时间优选为5～7d，进一步优选为6d；所述培养的温度优选为20～25℃，进一步优选为23℃。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
1、藻种来源
本发明所使用的藻种：裸藻(Euglena.gracilis)CCAP 1224/5Z，购买于CultureCollection ofAlgae andProtozoa。
2、培养基组成
裸藻常用培养基配方参见表1。Microelementa的配方参见表2。裸藻专用培养基为裸藻常用培养基再加15g/L葡萄糖。
3、藻种培养方法
挑取裸藻保种平板的裸藻放入50mL灭菌裸藻常用培养基的150mL三角锥形瓶进行活化，待其培养至对数期，转移至1L新鲜裸藻常用培养基溶液中继续扩培，放置于光照培养箱，23±1℃培养，光照强度为100±5μmol/m2s1，持续光照。整个操作过程均按照标准的微生物学实验方法，在超净工作台的无菌条件下进行，以避免藻种被污染。培养过程中采用人工摇动，每天摇2～3次，避免藻体沉底。培养直至裸藻生长对数期，再进行转接到3个含有1L新鲜裸藻常用培养液中扩培，待生长至对数期，即可转接出去进行放大培养。
4、裸藻和胆碱培养技术
1)藻液预处理
将培养至饱和期(OD750约为3)的裸藻藻液进行收集，5000rpm离心5min，藻沉淀用裸藻专用培养基洗涤三次后，加入裸藻专用培养基定容至OD750为3，取200mL转移至2L灭菌的锥形瓶中；
2)加入胆碱培养
200mL藻液加入2g胆碱，然后用裸藻专用培养基定容至1.5L，置于光照培养箱中，光照强度为100±5μmol/m2s1，持续光照。第3天与第9天取样检测裸藻的生理指标(干重)，每组三个生物学平行实验。
实施例2
将实施例1中的2g胆碱替换为2g四氢嘧啶，其余内容和实施例1相同。
实施例3
将实施例1中的2g胆碱替换为1g胆碱和1g四氢嘧啶，其余内容和实施例1相同。
对比例1
除省略胆碱的使用外，其余内容和实施例1相同。
实施例4
将实施例1中的2g胆碱替换为2g磺胺嘧啶，其余内容和实施例1相同。
对比例2
除省略磺胺嘧啶的使用外，其余内容和实施例4相同。
对实施例1～4以及对比例1和2的藻液中的裸藻进行生理生化分析。
1、裸藻干重的测定
(1)将称量瓶打开，在65℃鼓风干燥箱中烘干称重。重复该步骤直至恒重，称量瓶的重量记为m1。
(2)量取一定体积(一般为30mL，记为V)藻液置于离心管中，8000r/min离心10min，弃上清，然后以蒸馏水将湿藻泥冲洗到称量瓶中，65℃下干燥至恒重，记称量瓶和微藻的重量之和为m2。
(3)单位体积藻细胞干重为前后质量只差除以体积。
实施例1～3和对比例1的比较分析结果参见图1。由图1可以看出，对比例1(未加入胆碱和四氢嘧啶)、仅加入胆碱(实施例1)、仅加入四氢嘧啶(实施例2)和同时加入胆碱和四氢嘧啶配伍(实施例3)的裸藻培养体系随着培养时间的增加，各体系的干重含量均不断提升，且加入胆碱和/或四氢嘧啶的裸藻养殖体系中的裸藻干重含量明显大于对比例1。第9天时，同时加入胆碱和四氢嘧啶配伍的裸藻体系中，干重含量达到了最大值2.16g/L，较对比例1提高了80％。本发明利用胆碱和/或四氢嘧啶与裸藻培养促进裸藻干重增加，实现裸藻生物量高效产出及可持续培养。
实施例4和对比例2的对比分析结果参见图2。由图2可以看出，对比例2、实施例4的裸藻培养体系随着培养时间的增加，各体系的干重含量均不断提升，且加入磺胺嘧啶培养后的实施例4的干重含量远大于对照组培养体系。第9天时，加入磺胺嘧啶的实施例4的裸藻体系中，干重含量达到了最大值1.89g/L，较对比例2提高了58.82％。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种提高裸藻干重的促进剂，所述促进剂选自胆碱、四氢嘧啶、维生素B1和磺胺嘧啶中的一种或几种。
2.根据权利要求1所述的促进剂，其特征在于，当所述促进剂包括胆碱和四氢嘧啶时，所述胆碱和四氢嘧啶的质量比为(0.5～6.5)：(0.5～6.5)。
3.一种裸藻培养基，所述裸藻培养基中包含权利要求1或2所述促进剂。
4.根据权利要求3所述的裸藻培养基，其特征在于，所述裸藻培养基中促进剂的浓度为1～60g/1.5L。
5.权利要求1或2所述的促进剂或者权利要求3或4所述裸藻培养基在提高裸藻干重中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述应用包括以下步骤：
1)对裸藻进行放大培养，至藻液的OD750值达到1.0～4.5，得到富集藻液，对所述富集藻液进行离心，收集沉淀，采用裸藻专用培养基和所述沉淀混合至混合液的OD750值为1.0～4.5，得到待培养藻液；
2)在所述待培养藻液中加入所述促进剂和裸藻专用培养基，进行培养，得到含裸藻的藻液；
所述裸藻专用培养基以裸藻常用培养基为基础培养基，还包括10～80g/L的葡萄糖。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤2)中，每1.5L混合液包括待培养藻液100～800mL、促进剂1～60g和余量的裸藻专用培养基。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤2)中所述培养的光照强度为70～200μmol/m2s1。
9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤1)中所述离心的转速为3000～8000rpm；所述离心的时间为3～20min。
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