CN112852905B - 二肽在提高裸藻中副淀粉含量中的应用 - Google Patents
二肽在提高裸藻中副淀粉含量中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了二肽在提高裸藻中副淀粉含量中的应用,属于裸藻培养技术领域;所述二肽选自Glu‑Ala、Asp‑Gly和Arg‑His中的一种或几种。本发明利用二肽与裸藻培养促进裸藻中副淀粉含量增加,实现裸藻生物量高效产出及可持续培养,进而能够促进目前裸藻培养产能机制的研究进展,解决裸藻大规模培养所面临的瓶颈问题。
Description
技术领域
本发明涉及裸藻培养技术领域,尤其涉及二肽在提高裸藻中副淀粉含量中的应用。
背景技术
纤细裸藻是一种单细胞真核微藻。细胞具有独特的植物和动物特征——在这种有机体中可以观察到叶绿体内的鞭毛运动和光合作用。由于裸藻能生产出有价值的产品,如蜡酯、顺丁香和有机酸,还含有营养上重要的所有必需的维生素和多不饱和脂肪酸(二十二碳六烯酸和二十碳五烯酸)。裸藻可利用多种外部碳源,如葡萄糖、乙醇、谷氨酸、苹果酸、丙酮酸和乳酸等进行营养合成。裸藻细胞能分泌一种不溶性的多糖——副淀粉(Paramylon,Pm),主链为β-1,3连接的葡萄糖。Pm是一种良好的免疫刺激剂和免疫增强剂,在医学上可以作为一种抗肿瘤药物,其抑制肿瘤生长的作用可归因于对淋巴细胞或相关细胞因子的刺激。Pm在光照和好氧条件下积累,在黑暗、厌氧条件下降解。但是目前裸藻养殖中存在裸藻中副淀粉含量低的技术问题。
发明内容
本发明的目的在于提供二肽在提高裸藻中副淀粉含量中的应用。
为了实现上述发明目的,本发明提供以下技术方案:
本发明提供了二肽在提高裸藻中副淀粉含量中的应用;所述二肽选自Glu-Ala、Asp-Gly和Arg-His中的一种或几种。
优选的,二肽通过添加到裸藻培养基中来提高裸藻中副淀粉含量。
优选的,所述应用包括以下步骤:
1)对裸藻进行放大培养,至藻液的OD750值达到1.0~4.5,得到富集藻液,对所述富集藻液进行离心,收集沉淀,采用裸藻专用培养基和所述沉淀混合至混合液的OD750值为1.0~4.5,得到待培养藻液;
2)将二肽、待培养藻液和裸藻专用培养基,进行培养,得到含裸藻的藻液;
所述裸藻专用培养基以裸藻常用培养基为基础培养基,还包括10~80g/L的葡萄糖。
优选的,步骤2)中,每1.5L混合液包括待培养藻液100~800mL、二肽1~3g和余量的裸藻专用培养基。
优选的,步骤2)中所述培养的光照强度为70~200μmol/m2s1。
优选的,步骤1)中所述离心的转速为3000~8000rpm;所述离心的时间为3~20min。
本发明提供了二肽在提高裸藻中副淀粉含量中的应用;所述二肽选自Glu-Ala、Asp-Gly和Arg-His中的一种或几种。本发明利用二肽促进裸藻副淀粉产能增加,实现裸藻副淀粉产能物质的高效产出及可持续培养,进而能够促进目前裸藻培养产能机制的研究进展,解决裸藻大规模培养所面临的瓶颈问题。
附图说明
图1为实施例1和对比例1培养体系中裸藻中副淀粉含量变化情况;
图2为实施例2和对比例2不同培养体系中裸藻中副淀粉含量变化情况。
具体实施方式
本发明提供了二肽在提高裸藻中副淀粉含量中的应用;所述二肽选自Glu-Ala、Asp-Gly和Arg-His中的一种或几种。二肽通过和裸藻培养能够促进裸藻细胞的生命活动,进而提高裸藻中副淀粉含量。
在本发明中,所述Glu-Ala的制备方法包括以下步骤:Glu的α-羧基和Ala的α-氨基脱水缩合,形成的酰胺键,得到Glu-Ala。
在本发明中,所述Asp-Gly的制备方法包括以下步骤:Asp的α-羧基和Gly的α-氨基脱水缩合,形成的酰胺键,得到Glu-Ala。
在本发明中,所述Arg-His的制备方法包括以下步骤:Arg的α-羧基和His的α-氨基脱水缩合,形成的酰胺键,得到Glu-Ala。
在本发明中,所述Glu-Ala、Asp-Gly和Arg-His购自于生物工程(上海)股份有限公司。
在本发明中,所述应用优选的包括以下步骤:
1)对裸藻进行放大培养,至藻液的OD750值达到1.0~4.5,得到富集藻液,对所述富集藻液进行离心,收集沉淀,采用裸藻专用培养基和所述沉淀混合至混合液的OD750值为1.0~4.5,得到待培养藻液;
2)将二肽、待培养藻液和裸藻专用培养基,进行培养,得到含裸藻的藻液;
所述裸藻专用培养基以裸藻常用培养基为基础培养基,还包括10~80g/L的葡萄糖。
本发明首先对裸藻进行放大培养,至藻液的OD750值达到1.0~4.5,得到富集藻液,对所述富集藻液进行离心,收集沉淀,采用裸藻专用培养基和所述沉淀混合至混合液的OD750值为1.0~4.5,得到待培养藻液。
在本发明中,在所述放大培养之前优选的还包括对所述裸藻进行活化培养,得到裸藻活化培养液;所述活化培养采用的培养基优选为裸藻常用培养基;所述活化培养的温度优选为25~30℃,进一步优选为26℃;所述活化培养的时间优选为7~9d,更优选的以将裸藻培养至对数期(OD750=3)为准;所述活化培养过程中,每隔24h取样测OD750值。在所述活化培养过程中,本发明对光照周期没有特殊要求,无光照条件下、光照:黑暗=12h:12h条件或全天光照条件均可。若在有光照的条件下,所述光照的光照强度优选为70~200μmol/m2s1;进一步优选为100~150μmol/m2s1。
在得到裸藻活化培养液后,本发明优选的还包括将所述裸藻活化培养液转接至培养基进行放大培养;所述放大培养采用的培养基优选为裸藻常用培养基;所述放大培养的温度优选为20~30℃,进一步优选为23℃;所述放大培养的光照强度优选为70~200μmol/m2s1,进一步优选为100μmol/m2s1;所述放大培养优选的于光照培养箱中进行;所述放大培养的时间优选的以裸藻达到生长对数期为准;所述扩大培养的次数优选为2次;所述放大培养过程中,优选的每天对培养瓶进行摇动;所述摇动的方式优选为人工摇动;所述摇动的次数优选为2~10次/d,以避免藻体沉底。在本发明中,扩大培养是为了让藻种进行生长繁殖,经过对数期增长,藻种量快速增加。
本发明所述活化培养和光照培养的过程均按照标准的微生物学实验方法,在超净工作台的无菌条件下进行,以避免藻种被污染。
在本发明中,所述离心的转速优选为3000~8000rpm,进一步优选为5000rpm;所述离心的时间优选为3~20min,进一步优选为5min。
在本发明中,所述裸藻专用培养基中葡萄糖的浓度优选为15g/L。在本发明中,所述葡萄糖的作用是提供碳源。
在本发明中,所述裸藻常用培养基的配方如表1所示。
表1裸藻常用培养基配方
所述Microelementa的配方参见表2。
表2 Microelementa的配方
bVitamin B1:准确称量0.05g Vitamin B1,溶于100mL去离子水,过滤除菌,存于4℃冰箱。
cVitamin B12:准确称量0.05g Vitamin B12,溶于1L去离子水,过滤除菌,存于4℃冰箱。
得到待培养藻液后,本发明将二肽、待培养藻液和裸藻专用培养基,进行培养,得到含裸藻的藻液。
在本发明中,每1.5L混合液优选的包括待培养藻液100~800mL、二肽1~30g和余量的裸藻专用培养基,进一步优选的每1.5L混合液包括待培养藻液200mL、二肽2g和余量的裸藻专用培养基。在本发明中,所述培养的光照强度优选为70~200μmol/m2s1,进一步优选为100μmol/m2s1;所述培养过程中优选的保持持续光照;所述培养优选的于光照培养箱中进行;所述培养的时间优选为5~7d,进一步优选为6d;所述培养的温度优选为20~25℃,进一步优选为23℃。
下面将结合本发明中的实施例,对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
实施例1
1、藻种来源
本发明所使用的藻种:裸藻(Euglena.gracilis)CCAP 1224/5Z,购买于CultureCollection of Algae and Protozoa。
2、培养基组成
裸藻常用培养基配方参见表1。Microelementa的配方参见表2。裸藻专用培养基为裸藻常用培养基再加15g/L葡萄糖。
3、藻种培养方法
挑取裸藻保种平板的裸藻放入50mL灭菌裸藻常用培养基的150mL三角锥形瓶进行活化,待其培养至对数期,转移至1L新鲜裸藻常用培养基溶液中继续扩培,放置于光照培养箱,23±1℃培养,光照强度为100±5μmol/m2s1,持续光照。整个操作过程均按照标准的微生物学实验方法,在超净工作台的无菌条件下进行,以避免藻种被污染。培养过程中采用人工摇动,每天摇2~3次,避免藻体沉底。培养直至裸藻生长对数期,再进行转接到3个含有1L新鲜裸藻常用培养液中扩培,待生长至对数期,即可转接出去进行放大培养。
4、裸藻和Glu-Ala培养技术
1)藻液预处理
将培养至饱和期(OD750约为3)的裸藻藻液进行收集,5000rpm离心5min,藻沉淀用裸藻专用培养基洗涤三次后,加入裸藻专用培养基定容至OD750为3,取200mL转移至2L灭菌的锥形瓶中;
2)加入Glu-Ala培养
200mL藻液加入2g Glu-Ala,然后用裸藻专用培养基定容至1.5L,置于光照培养箱中,光照强度为100±5μmol/m2s1,持续光照。第3天与第9天取样检测裸藻的生理指标(副淀粉)。
对比例1
除省略Glu-Ala外,其余内容和实施例1相同。
实施例2
除将对比文件1中Glu-Ala替换为Arg-His外,其余和实施例1相同。
对比例2
除省略Arg-His外,其余和实施例2相同。
测定实施例1、2以及对比例1、2的藻液中的裸藻副淀粉含量
(1)取样藻液置于离心管中,8000rpm离心收藻细胞,弃上清。管口打开置于冷冻干燥机中-45℃干燥24h,干燥好的藻粉于-80℃保存。
(2)副淀粉提取,称量约5mg干燥藻粉于15mL离心管中,加入4mL丙酮后涡旋震荡10s,连续两次,静置1h,再进行转速5000rpm,离心5min,去上清。沉淀加入1mL 1%SDS溶液,重悬后至1.5mL EP管,并在85℃加热30min,2000g离心5min,去上清,60℃烘箱烘干至恒重,得到沉淀为Pm,再加入1mL 0.5M NaOH溶解。
(3)称量标准葡萄糖40mg于1L容量瓶,加水至刻度线,分别吸取0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9及1.0mL至50mL比色管,以蒸馏水补至1.0mL。加现配6%苯酚0.5mL及浓H2SO45 mL,摇匀冷却,静置20min于490nm处测吸光值。以1.0mL蒸馏水为空白对照,横坐标为吸光值,纵坐标为葡萄糖克数,绘制标准曲线。
(4)取50μL“(2)”中的溶液,补蒸馏水至1.0mL,按照“(3)”所述操作,获得吸光值,并通过“(3)”绘制的标准曲线计算Pm含量。
实施例1和对比例1的分析结果参见图1。由图1可以看出,对比例1与加入Glu-Ala的裸藻培养体系(实施例1)随着培养时间的增加,各体系的裸藻副淀粉含量均不断提升,且后者的副淀粉含量远远大于前者。第9天时,加入了Glu-Ala培养的裸藻体系中,副淀粉含量达到了最大值1.33g/L,与对比例1的0.7g/L相比,提升了约90%。
实施例2和对比例2的分析结果参见图2。由图2可以看出,对比例2与加入Arg-His的实施例2的裸藻培养体系随着培养时间的增加,各体系的裸藻副淀粉含量均不断提升,且后者的副淀粉含量远远大于前者。第9天时,加入了Arg-His的实施例2培养的裸藻体系中,副淀粉含量达到了最大值1.11g/L,与对比例2的0.7g/L相比,提升了约58.57%。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (5)
1.二肽在提高裸藻(Euglena)中副淀粉含量中的应用,所述二肽选自Glu-Ala、Asp-Gly和Arg-His中的一种或几种;
所述二肽通过添加到裸藻培养基中来提高裸藻中副淀粉含量。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述应用包括以下步骤:
1)对裸藻进行放大培养,至藻液的OD750值达到1.0~4.5,得到富集藻液,对所述富集藻液进行离心,收集沉淀,采用裸藻专用培养基和所述沉淀混合至混合液的OD750值为1.0~4.5,得到待培养藻液;
2)将二肽、待培养藻液和裸藻专用培养基混合,进行培养,得到含裸藻的藻液;
所述裸藻专用培养基以裸藻常用培养基为基础培养基,还包括10~80g/L的葡萄糖。
3.根据权利要求2所述的应用,其特征在于,步骤2)中,每1.5L混合液包括待培养藻液100~800mL、二肽1~30g和余量的裸藻专用培养基。
4.根据权利要求2所述的应用,其特征在于,步骤2)中所述培养的光照强度为70~200μmol/m2s1。
5.根据权利要求2所述的应用,其特征在于,步骤1)中所述离心的转速为3000~8000rpm;所述离心的时间为3~20min。
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