CN105441498A

CN105441498A - γ-聚谷氨酸的发酵制备方法

Info

Publication number: CN105441498A
Application number: CN201510801416.8A
Authority: CN
Inventors: 周骅; 徐佳; 陈维; 齐宗献
Original assignee: Hui Baokang Source Wuhan Medical Research LLC
Current assignee: Hui Baokang Source Wuhan Medical Research LLC
Priority date: 2014-05-21
Filing date: 2014-11-20
Publication date: 2016-03-30
Also published as: CN105385718A; CN104694590A; CN104694590B

Abstract

本发明提供了γ-聚谷氨酸的发酵方法，其包括将产γ-聚谷氨酸的枯草芽孢杆菌（如，HBY-PBS-ZY55）接种入添加了正己烷、吐温-80和/或甜菜碱的发酵培养基中进行发酵培养，并任选在步骤（1）的发酵培养期间进一步添加正己烷。另外，本发明还提供了获得高产γ-聚谷氨酸的枯草芽孢杆菌的方法和由该方法获得的菌株及其应用等。

Description

γ-聚谷氨酸的发酵制备方法

技术领域

本发明属于微生物发酵领域，具体而言，本发明涉及利用微生物发酵生产γ-聚谷氨酸的方法，另外本发明还涉及用于该方法中的优选的菌株等。

背景技术

γ-聚谷氨酸(简称为γ-PGA或PGA)是谷氨酸单体以γ-位上的酰胺键聚合而形成的同质多肽。它具有水溶性，可生物降解，不含毒性，可广泛应用于食品工业、化妆品、保健、水处理、废水处理、卫生用品、医疗等领域，例如可以用作为增稠剂、冷冻保护剂、缓释剂、药物载体、生物粘合剂、保湿剂、生物可降解纤维、高吸水性树脂、生物絮凝剂和重金属离子吸收剂等。

γ-聚谷氨酸的主要制备方法有：化学合成法，提取法，酶转化法和微生物发酵法。由于前三种方法产量低，成本较高，污染大，目前主要利用微生物发酵法来制备γ-聚谷氨酸。

现有技术对利用微生物发酵生产γ-聚谷氨酸的关注点主要在于微生物生产菌种和菌株上，例如，中国专利申请第02151746号公开了枯草芽孢杆菌NX-2及利用其来制备γ-聚谷氨酸的方法；

中国专利申请第200410010509号公开了枯草芽孢杆菌zju-7及利用其来制备γ-聚谷氨酸的方法；

中国专利申请第200610155278号公开了利用枯草芽孢杆菌和谷氨酸棒杆菌混和制备γ-聚谷氨酸的方法；

中国专利申请第200710130248号公开了枯草芽孢杆菌CGMCCNo.2108及利用其来制备γ-聚谷氨酸的方法，最高产量可达34.1g/L；

中国专利申请第200810027184号公开了枯草芽孢杆菌PGA-7及利用其来制备γ-聚谷氨酸的方法，最高产量可达27.3g/L；

中国专利申请第200810150830号公开了枯草芽孢杆菌XN01及利用其来制备γ-聚谷氨酸的方法；

中国专利申请第201010271196号公开了枯草芽孢杆菌PGS-1及利用其来制备γ-聚谷氨酸的方法；

中国专利申请第201210018185号公开了利用枯草芽孢杆菌SY-ND和巨大芽孢杆菌SY-Z5混和制备γ-聚谷氨酸的方法，进而用于生产微生物絮凝剂；

中国专利申请第201210371764和201210371783号公开了枯草芽孢杆菌GXA-28及利用其来制备γ-聚谷氨酸的方法，产量可达20-30g/L；

中国专利申请第201210555304号公开了基因工程重组VHb基因的枯草芽孢杆菌FRD518及利用其来制备γ-聚谷氨酸的方法，最高产量可达65g/L。

本发明人发现，上述现有技术最为严重的一个缺陷是发酵时间都较长，要达到较高或最高产量，发酵时间需要长达48-96小时，非常不利于工业化生产。而本发明人没有受到上述现有技术关注方向的限制，令人意外地发现，正己烷、吐温-80和/或甜菜碱的加入，能够提升γ-聚谷氨酸的产量，尤其是提高短期发酵的产量，增幅最高可达20％以上；另外，根据本发明人筛选得到的枯草芽孢杆菌HBY-PBS-ZY55的使用以及针对其的补料发酵的优化，在不超过36小时(甚至28小时)的短期内的γ-聚谷氨酸产量可稳定达到36g/L以上。其中，枯草芽孢杆菌HBY-PBS-ZY55是没有转化过VHb基因的非基因工程菌，因此还有进一步基因改造提升产量的前景。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供新的γ-聚谷氨酸发酵方面的方法、应用和菌株等，尤其能够使其在短期内通过发酵培养即取得高产。

具体而言，在第一方面，本发明提供了γ-聚谷氨酸的发酵方法，其包括：

(1)将产γ-聚谷氨酸的枯草芽孢杆菌(如，HBY-PBS-ZY55)接种入添加了正己烷、吐温-80和/或甜菜碱的发酵培养基中进行发酵培养；

(2)任选在步骤(1)的发酵培养期间进一步添加正己烷；

(3)收集发酵培养物中的γ-聚谷氨酸。

相应地，在第二方面，本发明也提供了提高γ-聚谷氨酸发酵产量的方法，其包括：

(2)任选在步骤(1)的发酵培养期间进一步添加正己烷；

(3)收集发酵培养物中的γ-聚谷氨酸。

本发明第二方面的方法能比相应的不添加正己烷、吐温-80和/或甜菜碱的方法获得更多γ-聚谷氨酸，在本发明的具体实施方式中，γ-聚谷氨酸发酵产量可提高20％以上。

在本文中，产γ-聚谷氨酸的枯草芽孢杆菌为本领域技术人员所知晓，例如本发明背景技术部分所提及的，本发明优选采用的枯草芽孢杆菌将在下文中更详细地描述；枯草芽孢杆菌的发酵温度为本领域技术人员所知晓，为34-38℃，本发明优选采用36℃或36.5℃等。

在本文中，术语“和/或”具有一般理解的意义，即并列关系是“和”或者是“或”的关系。例如，添加了正己烷、吐温-80和/或甜菜碱，可以是仅仅添加了正己烷，可以是仅仅添加了吐温-80，可以是仅仅添加了甜菜碱，可以是仅仅添加了正己烷和吐温-80，可以是仅仅添加了正己烷和甜菜碱，可以是仅仅添加了吐温-80和甜菜碱，也可以是添加了正己烷、吐温-80和甜菜碱。

在本文中，如未特别指出培养基中的添加物，培养基仅仅是未添加相应添加物的培养基。例如，在本发明中，发酵培养的发酵培养基优选可以是如下配方(g/L)：葡萄糖60-80，果糖5-10，谷氨酸钠20-40，氯化钙1-1.5，K₂HPO₄1.3-1.8，MgSO₄·7H₂O0.4-0.6，玉米浆干粉5-15，酵母粉5-10，柠檬酸钠10-20，氯化铵10-30,硫酸锰0.05-0.2，硫酸亚铁0.015-0.025，NaCl3-8，pH7.1-7.6；更优选可以是如下配方(g/L)：葡萄糖70，果糖8，谷氨酸钠30，氯化钙1.2，K₂HPO₄1.5，MgSO₄·7H₂O0.5，玉米浆干粉10，酵母粉8，柠檬酸钠15，氯化铵20，硫酸锰0.1，硫酸亚铁0.02，NaCl5，pH7.4。

在本发明中，优选产γ-聚谷氨酸的枯草芽孢杆菌是在种子培养基中活化培养而获得的。也优选其中，种子培养基可以是如下配方(g/L)：葡萄糖10-30，酵母提取物5-10，蛋白胨5-15，氯化铵2-5，KH₂PO₄1-5，MgSO₄7H₂O0.2-1，氯化钙0.5-1，NaCl3-8，pH7.1-7.6；更优选可以是如下配方(g/L)：葡萄糖20，酵母提取物8，蛋白胨10，氯化铵3，KH₂PO₄3，MgSO₄7H₂O0.5，氯化钙0.8，NaCl5，pH7.4。

在本发明中，优选发酵或发酵培养是短期的。本发明人通过各种方面的研究，在菌株、培养基添加物和发酵步骤等多方面均出人意料地发现了能够提高短期发酵产量的因素。在本发明中，优选发酵培养的时间不超过36小时，更优选为26-36小时，如26-28小时或32-36小时等。

优选在本发明第一或第二方面的方法中，正己烷的添加量为5-50ml/L，优选为8-30ml/L，更优选为10-20ml/L；吐温-80的添加量为0.1-1ml/L，优选为0.2-0.8ml/L，更优选为0.45-0.55ml/L；和/或，甜菜碱的添加量为0.05-0.5g/L，优选为0.1-0.3g/L，更优选为0.15-0.25g/L。本发明人研究发现，添加物的量效关系并非呈正相关关系，例如过多的正己烷并不能带来更多的产量提高。在本文中，添加是本领域技术人员所能理解并实施的，例如5ml/L的添加量就是向1L培养基或培养物中添加5ml相应添加物。

更令人意外的是，在本发明中，由于减少了发酵周期，本发明人发现发酵液的色度也降低了，使得γ-聚谷氨酸的收集(提取)工艺中的脱色难度大为降低，因此本发明第一或第二方面的方法中步骤(3)的收集优选可以通过加入乙醇沉淀来收集而无需或者减少额外的脱色步骤。

在第三方面，本发明提供了获得高产γ-聚谷氨酸的枯草芽孢杆菌的方法，其包括：

(1)将待诱变的产γ-聚谷氨酸的枯草芽孢杆菌液体培养，然后稀释；

(2)将步骤(1)获得的稀释菌液在黑暗条件下进行紫外照射；

(3)将步骤(2)获得的经照射的菌液在平板筛选培养基上避光培养；

(4)将步骤(3)培养获得的单菌落分别进行发酵培养(优选短期发酵培养)；和，

(5)测量步骤(4)发酵产生的γ-聚谷氨酸的产量，选择出高产(优选是短期发酵高产)γ-聚谷氨酸的枯草芽孢杆菌。

优选在本发明第三方面的方法中，高产γ-聚谷氨酸的枯草芽孢杆菌是短期发酵高产γ-聚谷氨酸的枯草芽孢杆菌。其中，高产指的是在相同的发酵条件下比相应的待诱变的产γ-聚谷氨酸的枯草芽孢杆菌的γ-聚谷氨酸的产量高；如无相反指示，短期具有前文所定义的意义，优选不超过36小时，更优选为26-36小时，如26-28小时或32-36小时等。

优选在本发明第三方面的方法中，各步骤地实施可以优选本发明具体实时方式所记载的步骤和/或其中的培养基。例如，在步骤(1)中，培养优选是培养至OD₆₀₀为10-12，和/或，稀释优选是稀释10⁶倍。又如，在步骤(2)中，紫外照射优选是在30W紫外灯下30cm处照射180秒。还如，在步骤(3)中，平板筛选培养基含有1％(W/W)氯化锂。

在第四方面，本发明提供了本发明第三方面的方法获得的高产γ-聚谷氨酸的枯草芽孢杆菌，尤其优选提供本发明第三方面的方法获得的短期发酵高产γ-聚谷氨酸的枯草芽孢杆菌。其中，如无相反指示，高产和短期具有前文所定义的意义。

优选本发明第四方面的枯草芽孢杆菌是于2014年5月20日以保藏编号CCTCCNO：M2014213保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)HBY-PBS-ZY55，保藏地址为：中国，武汉，武汉大学。

在第五方面，本发明提供了本发明第四方面的枯草芽孢杆菌在γ-聚谷氨酸的发酵中的应用，尤其优选提供本发明第四方面的枯草芽孢杆菌在γ-聚谷氨酸的短期发酵中的应用。其中，如无相反指示，短期具有前文所定义的意义。

优选在本发明第五方面的应用中，γ-聚谷氨酸的发酵的方法包括在发酵中维持溶氧量≥10％，例如通过发酵罐装液量、通气量和/或搅拌速度等的调整来维持；和/或，γ-聚谷氨酸的发酵的方法包括维持糖(如，葡萄糖)含量为10-15g/L，例如通过补料添加来维持。本发明人发现，维持溶氧量和维持糖含量都能显著提高γ-聚谷氨酸的产量，尤其是后者还能显著缩短发酵周期，使得更容易实现短期发酵。

优选在本发明中，发酵的发酵培养基优选可以是如下配方(g/L)：葡萄糖20-40，果糖5-10，谷氨酸钠20-40，氯化钙1-1.5，K₂HPO₄1.3-1.8，MgSO₄·7H₂O0.3-0.8，玉米浆干粉5-15，酵母粉5-15，柠檬酸钠10-20，氯化铵10-30，硫酸锰0.05-0.2，硫酸亚铁0.01-0.03，NaCl3-8，pH7.1-7.6，另外添加消泡剂0.1-1ml/3L；更优选可以是如下配方(g/L)：葡萄糖30，谷氨酸钠30，氯化钙1.2，K₂HPO₄1.5，MgSO₄·7H₂O0.5，果糖8，玉米浆干粉10，酵母粉5，柠檬酸钠15，氯化铵20，硫酸锰0.1，硫酸亚铁0.02，NaCl5，pH7.4，另外添加消泡剂0.5ml/3L。

也优选在本发明中，发酵补料的补料培养基可以是如下配方(g/L)：葡萄糖500-1000，MgSO₄·7H₂O2-5，氯化钙2-5，玉米浆干粉15-30；更优选可以是如下配方(g/L)：葡萄糖750，MgSO₄·7H₂O3，氯化钙3，玉米浆干粉25。

本发明人还研究出了更加复杂的发酵培养基和补料培养基，能够取得更好的效果，记载于本发明的具体实施方式中，但是上述发酵培养基和补料培养基是特别优选的。

另外也优选在本发明第五方面的应用中，γ-聚谷氨酸的发酵的方法是本发明第一方面的方法。

在其他方面，本发明还提供了本说明书(尤其是以下实施例)中记载的方法或培养基等技术方案，就好像本发明说明书(尤其是以下实施例)中记载的方法或培养基等技术方案在此和在权利要求书中又重复记载了一样。

例如，本发明提供了发酵培养基，其可以是如下配方(g/L)：葡萄糖10-30，果糖5-10，谷氨酸钠5-15，氯化钙1-1.5，K₂HPO₄1.5，MgSO₄·7H₂O0.3-0.8，玉米浆干粉5-15，酵母粉5-15，柠檬酸钠10-20，氯化铵10-30，硫酸锰0.05-0.2，硫酸亚铁0.02，NaCl3-8，pH7.1-7.6，另外添加消泡剂0.1-1ml/3L；更优选可以是如下配方(g/L)：葡萄糖25，谷氨酸钠10，氯化钙1.2，K₂HPO₄1.5，MgSO₄·7H₂O0.5，果糖8，玉米浆干粉10，酵母粉5，柠檬酸钠15，氯化铵20，硫酸锰0.1，硫酸亚铁0.02，NaCl5，pH7.4，另外添加消泡剂0.5ml/3L。

又如，本发明提供了补料培养基其可以是如下配方(g/L)：葡萄糖300-1000，MgSO₄·7H₂O2-5，氯化钙2-5，玉米浆干粉15-30,柠檬酸钠10-20，氯化铵10-20,K₂HPO₄1-2；更优选可以是如下配方(g/L)：葡萄糖650，MgSO₄·7H₂O3，氯化钙3，玉米浆干粉25，柠檬酸钠15，氯化铵15，K₂HPO₄1.5。

本发明的有益效果在于：提供的方法和枯草芽孢杆菌提高了γ-聚谷氨酸产量，降低了发酵周期，提高了设备利用率，降低了生产成本和发酵液的色度，适合产业化生产；另外提供的枯草芽孢杆菌遗传稳定性强，可重复传代。

为了便于理解，以下将通过具体的实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。依据本说明书的论述，本发明的许多变化、改变对所属领域技术人员来说都是显而易见的。另外，本发明引用了公开文献，这些文献是为了更清楚地描述本发明，它们的全文内容均纳入本文进行参考，就好像它们的全文已经在本文中重复叙述过一样。

具体实施方式：

下面结合实例对本发明进行具体说明，其中所用试剂均可通过商业渠道购买获得，另外其中枯草芽孢杆菌HBY-PBS-ZY55按照微生物的专利保藏程序保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCCNO：M2014213，保藏日为2014年5月20日)。

实施例1枯草芽孢杆菌HBY-PBS-ZY55的获得

以本申请人保存的枯草芽孢杆菌HBY-PBS-3L为出发菌株，采用紫外-氯化锂复合诱变方法，通过多重筛选得到了稳定高产的突变株HBY-PBS-ZY55。

具体而言，将在斜面培养基(配方(g/L)：蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl5，琼脂20，pH7.0)上分离出的出发菌株HBY-PBS-3L接种到液体种子培养基(配方(g/L)：葡萄糖20，酵母提取物8，蛋白胨10，氯化铵3，KH₂PO₄3，MgSO₄7H₂O0.5，氯化钙0.8，NaCl5，pH7.4)中，以36℃和摇床转速220r/min，震荡培养8h，在600n波长下测定其OD值，测得OD₆₀₀为10-12，然后用种子培养基稀释至10^-6，制备成菌悬液。

然后在黑暗条件下进行紫外诱变(紫外灯功率30W)，即取5ml上述菌悬液加入到放置在磁力搅拌器上的无菌培养皿中，紫外灯下30cm处，照射120s,150s,180s,210s后，分别涂布于含有0.5％、1％、1.5％(W/W)氯化锂的平板筛选培养基(配方(g/L)：葡萄糖10，酵母提取物5，蛋白胨10，谷氨酸钠10，琼脂20，中性红0.1，pH7.0)上，36℃避光培养16h，计算致死率，得到得出最佳诱变条件：紫外照射180s，平板筛选培养基中氯化锂添加量为1％。以此最佳诱变条件获得存活的单菌落。

将上述诱变获得的单菌落分别接种于种子培养基中，以36℃和摇床转速220r/min，震荡培养8h，然后以5％(V/V)的接种量，接种于摇瓶发酵培养基(配方(g/L)：葡萄糖70，谷氨酸钠30，氯化钙1.2，K₂HPO₄1.5，MgSO₄·7H₂O1.2，甘蔗糖蜜8，玉米浆干粉10，酵母粉10，柠檬酸钠15，氯化铵20，硫酸锰0.1，硫酸亚铁0.02，NaCl5，pH7.4)中，以36℃和摇床转速220r/min，震荡培养30-36h。

取一定体积发酵液静置去除气泡，待气泡完全去除后，加水稀释为原体积的4倍；9000r/min离心15min，除去菌体，取一定体积的上清液加入3倍体积的无水乙醇，不断搅拌后，4℃静置过夜，9000r/min离心10min，去除上清液，将得到沉淀经冷冻干燥称重，计算γ-聚谷氨酸的产量，并根据产量判断各菌株的优劣。从中筛选得到了高产菌株HBY-PBS-ZY55，其保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCCNO：M2014213，保藏日为2014年5月20日)。

该高产菌株、其传代十代后的菌株以及其出发菌株和中国专利申请第200810027184号的枯草芽孢杆菌PGA-7分别如上进行摇瓶发酵培养，在培养32h和36h时取样测定γ-聚谷氨酸的产量。结果如表1所示，本发明的高产菌株，即使经过传代，在短期发酵的32小时时，不但能达到高产的发酵产量，而且已经达到高点，继续发酵的产量提升不大；而作为对比的出发菌株和现有的PGA-7在短期发酵内的产量均不如本发明的高产菌株，而且需要更长的发酵时间才能进一步提升产量。所以，无论从γ-聚谷氨酸的发酵产量，还是发酵效率上来说，本发明的高产菌株更加具有实践应用的意义。

表1各菌株的γ-聚谷氨酸短期发酵水平比对

实施例2提高γ-聚谷氨酸发酵产量的方法研究

使用本发明的高产菌株HBY-PBS-ZY55和现有的枯草芽孢杆菌PGA-7分别使用不同的方法进行对比发酵，其中发酵方法1的过程如下：

将在斜面培养基(配方(g/L)：蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl5，琼脂20，pH7.0)上分离出的菌株接种到液体种子培养基(配方(g/L)：葡萄糖20，酵母提取物8，蛋白胨10，氯化铵3，KH₂PO₄3，MgSO₄7H₂O0.5，氯化钙0.8，NaCl5，pH7.4)中，以36℃和摇床转速220r/min，震荡培养8h。然后将获得的种子培养物以5％(V/V)的接种量，接种于摇瓶发酵培养基(配方(g/L)：葡萄糖70，果糖8，谷氨酸钠30，氯化钙1.2，K₂HPO₄1.5，MgSO₄·7H₂O0.5，玉米浆干粉10，酵母粉10，柠檬酸钠15，氯化铵20，硫酸锰0.1，硫酸亚铁0.02，NaCl5，pH7.4)中，以36℃和摇床转速220r/min，震荡培养30h。最后测定并计算摇瓶发酵培养物中的γ-聚谷氨酸的产量。

发酵方法2的过程基本相同于发酵方法1的过程，所不同的是在摇瓶发酵培养基中还含有0.5ml/L吐温-80；

发酵方法3的过程基本相同于发酵方法1的过程，所不同的是在摇瓶发酵培养基中还含有0.2g/L甜菜碱；

发酵方法4、5、6的过程基本相同于发酵方法1的过程，所不同的是在摇瓶发酵培养基中还分别含有10ml/L、20mL/L、30mL/L正己烷；

发酵方法7的过程基本相同于发酵方法1的过程，所不同的是在摇瓶发酵培养进行到第18h时向摇瓶发酵培养物中加入30ml/L正己烷；

发酵方法8的过程基本相同于发酵方法1的过程，所不同的是在摇瓶发酵培养进行到第0(即在摇瓶发酵培养基中)、16h和24h时向摇瓶发酵培养物中分别加入10ml/L、20ml/L和10ml/L正己烷；

发酵方法9的过程基本相同于发酵方法1的过程，所不同的是在摇瓶发酵培养基中还含有0.5ml/L吐温-80、0.2g/L甜菜碱和10ml/L正己烷，然后在摇瓶发酵培养进行到第16h和24h时向摇瓶发酵培养物中分别加入20ml/L和10ml/L正己烷。

结果如表2所示，HBY-PBS-ZY55较之PGA-7在短期发酵中的产量优势明显；吐温-80、甜菜碱和正己烷的添加都能提高各菌株的发酵产量，其中在初始发酵时即添加正己烷的量过多反而会使得产量提高钝化，而在发酵进行过程中添加少量正己烷是非常有益的。

表2各菌株使用不同方法获得的γ-聚谷氨酸的产量

实施例3枯草芽孢杆菌HBY-PBS-ZY55短期发酵的条件优化研究

使用枯草芽孢杆菌HBY-PBS-ZY55进行发酵。

发酵方法1和2基本参照实施例2的发酵方法1进行，所不同的是摇瓶发酵培养基的配方，其中，摇瓶发酵培养基的配方1(g/L)：葡萄糖65，谷氨酸钠30，氯化钙1.2，K₂HPO₄1.5，MgSO₄·7H₂O1.2，甘蔗糖蜜8，玉米浆15，豆粕水解液10，柠檬酸钠15，氯化铵20，硫酸锰0.05，硫酸亚铁0.02，NaCl5，pH7.4，在发酵32h时产量水平即达到高点，为23.2g/L；

摇瓶发酵培养基的配方2(g/L)：葡萄糖65，谷氨酸钠30，氯化钙1.2，K₂HPO₄1.5，MgSO₄·7H₂O1.2，果糖8，玉米浆干粉15，酵母粉10，柠檬酸钠15，氯化铵20，硫酸锰0.1，硫酸亚铁0.02，NaCl5，pH7.4，在发酵32h时产量水平即达到高点，为24.7g/L。

发酵方法3和4基本参照实施例2的发酵方法1进行，所不同的是摇瓶发酵培养基的配方以及将摇瓶发酵改为发酵罐发酵，其中，摇瓶发酵培养基(即发酵罐发酵培养基)的配方3(g/L)：葡萄糖65，谷氨酸钠30，氯化钙1.2，K₂HPO₄1.5，MgSO₄·7H₂O1.2，甘蔗糖蜜8，玉米浆15，豆粕水解液10，柠檬酸钠15，氯化铵20，硫酸锰0.05，硫酸亚铁0.02，NaCl5，pH7.4；发酵罐发酵条件：发酵罐的体积5L，装液量50％，搅拌转速200-800r/min并且通气量1-2.5VVM从而维持溶氧量≥10％，温度36.5℃，在发酵32h时产量水平即达到高点，为30.2g/L；

摇瓶发酵培养基(即发酵罐发酵培养基)的配方4(g/L)：葡萄糖65，谷氨酸钠30，氯化钙1.2，K₂HPO₄1.5，MgSO₄·7H₂O1.2，果糖8，玉米浆干粉15，酵母粉10，柠檬酸钠15，氯化铵20，硫酸锰0.1，硫酸亚铁0.02，NaCl5，pH7.4；发酵罐发酵条件：发酵罐的体积5L，装液量60％，搅拌转速200-800r/min并且通气量1-2.5VVM从而维持溶氧量≥10％，温度36.5℃，在发酵30h时产量水平即达到高点，为31.8g/L。

发酵方法5和6基本参照实施例2的发酵方法1进行，所不同的是摇瓶发酵培养基的配方以及将摇瓶发酵改为发酵罐补料发酵，其中，摇瓶发酵培养基(即初始的发酵罐发酵培养基)的配方5(g/L)：葡萄糖30，谷氨酸钠30，氯化钙1.2，K₂HPO₄1.5，MgSO₄·7H₂O0.5，果糖8，玉米浆干粉10，酵母粉10，柠檬酸钠15，氯化铵20，硫酸锰0.1，硫酸亚铁0.02，NaCl5，pH7.4，另外每罐添加THIF-298消泡剂0.5ml(可购自烟台恒鑫化工科技有限公司)；补料培养基的配方5(g/L)：葡萄糖750，MgSO₄·7H₂O3，氯化钙3，玉米浆干粉25；发酵罐发酵条件：发酵罐的体积5L，装液量60％，搅拌转速200-800r/min并且通气量1-2.5VVM从而维持溶氧量≥10％，温度36.5℃，取样测定发酵罐内培养物中葡萄糖含量，当低于15g/L时(最初出现于发酵第10-12h时)，添加补料培养基，使得在发酵罐内培养物中葡萄糖含量维持在15g/L，补料到发酵第24h时停止，在26h时产量水平即达到高点，为36.8g/L；

摇瓶发酵培养基(即初始的发酵罐发酵培养基)的配方6(g/L)：葡萄糖25，谷氨酸钠10，氯化钙1.2，K₂HPO₄1.5，MgSO₄·7H₂O0.5，果糖8，玉米浆干粉10，酵母粉10，柠檬酸钠15，氯化铵20，硫酸锰0.1，硫酸亚铁0.02，NaCl5，pH7.4，另外每罐添加另外每罐添加THIF-298消泡剂0.5ml(可购自烟台恒鑫化工科技有限公司)；补料培养基的配方6A(g/L)：葡萄糖650，MgSO₄·7H₂O3，氯化钙3，玉米浆干粉25,柠檬酸钠15，氯化铵15，K₂HPO₄1.5；补料培养基的配方6B(g/L)：谷氨酸钠400；发酵罐发酵条件：发酵罐的体积5L，装液量60％，搅拌转速200-800r/min并且通气量1-2.5VVM从而维持溶氧量≥10％，温度36.5℃，取样测定发酵罐内培养物中葡萄糖含量和谷氨酸含量，当葡萄糖含量低于10g/L时和/或谷氨酸含量低于10g/L时(最初出现于培养到第12-13h时)，添加补料培养基A和/或B，使得在发酵罐内培养物中葡萄糖含量维持在10-15g/L(即高于15g/L时停止补料培养基A)并且谷氨酸含量维持在10g/L，同时在开始添加补料培养基后，也开始加入1mol/L的氢氧化钠或盐酸使得pH控制在6.8±0.1，补料到发酵第24h时停止，在28h时产量水平即达到高点，为37.6g/L。

由上述发酵结果可见，对于枯草芽孢杆菌HBY-PBS-ZY55，培养基的微调，甚至补料培养基更加严格的调整，对发酵产量的提高和发酵时间的缩短影响不大，而控制溶氧量水平能够大幅提高发酵产量；通过补料，尤其是维持糖含量，能够进一步大幅提高发酵产量，而且还能够大幅缩短发酵时间。

Claims

1.γ-聚谷氨酸的发酵方法，其包括：

(1)将产γ-聚谷氨酸的枯草芽孢杆菌接种入添加了正己烷、吐温-80和/或甜菜碱的发酵培养基中进行发酵培养；

(2)任选在步骤(1)的发酵培养期间进一步添加正己烷；

(3)收集发酵培养物中的γ-聚谷氨酸。

2.权利要求1所述的方法，其中，正己烷的添加量为5-50ml/L，优选为8-30ml/L，更优选为10-20ml/L；吐温-80的添加量为0.1-1ml/L，优选为0.2-0.8ml/L，更优选为0.45-0.55ml/L；和/或，甜菜碱的添加量为0.05-0.5g/L，优选为0.1-0.3g/L，更优选为0.15-0.25g/L。

3.权利要求1所述的方法，其中，发酵培养是短期的，优选发酵培养的时间不超过36小时，更优选为26-36小时，如26-28小时或32-36小时。

4.权利要求1所述的方法，其中，发酵的温度为34-38℃，优选36℃或36.5℃。

5.权利要求1所述的方法，其中，发酵培养基的组成选自如下配方之一：

(1)葡萄糖60-80g/L，果糖5-10g/L，谷氨酸钠20-40g/L，氯化钙1-1.5g/L，K₂HPO₄1.3-1.8g/L，MgSO₄·7H₂O0.4-0.6g/L，玉米浆干粉5-15g/L，酵母粉5-10g/L，柠檬酸钠10-20g/L，氯化铵10-30g/L，硫酸锰0.05-0.2g/L，硫酸亚铁0.015-0.025g/L，NaCl3-8g/L，pH7.1-7.6；

(2)葡萄糖20-40g/L，果糖5-10g/L，谷氨酸钠20-40g/L，氯化钙1-1.5g/L，K₂HPO₄1.3-1.8g/L，MgSO₄·7H₂O0.3-0.8g/L，玉米浆干粉5-15g/L，酵母粉5-15g/L，柠檬酸钠10-20g/L，氯化铵10-30g/L，硫酸锰0.05-0.2g/L，硫酸亚铁0.01-0.03g/L，NaCl3-8g/L，消泡剂0.1-1ml/3L，pH7.1-7.6；

(3)葡萄糖10-30g/L，果糖5-10g/L，谷氨酸钠5-15g/L，氯化钙1-1.5g/L，K₂HPO₄1.5g/L，MgSO₄·7H₂O0.3-0.8g/L，玉米浆干粉5-15g/L，酵母粉5-15g/L，柠檬酸钠10-20g/L，氯化铵10-30g/L，硫酸锰0.05-0.2g/L，硫酸亚铁0.02g/L，NaCl3-8g/L，消泡剂0.1-1ml/3L，pH7.1-7.6。

6.权利要求1所述的方法，其中，步骤(1)中的产γ-聚谷氨酸的枯草芽孢杆菌是在种子培养基中活化培养而获得的。

7.权利要求6所述的方法，其中，种子培养基的组成是如下配方：

葡萄糖10-30g/L，酵母提取物5-10g/L，蛋白胨5-15g/L，氯化铵2-5g/L，KH₂PO₄1-5g/L，MgSO₄7H₂O0.2-1g/L，氯化钙0.5-1g/L，NaCl3-8g/L，pH7.1-7.6。

8.权利要求1所述的方法，其中，发酵培养中维持溶氧量≥10％和/或维持糖(如，葡萄糖)含量为10-15g/L。

9.权利要求8所述的方法，其中，发酵培养中补加补料培养基，优选所述补料培养基的组成选自如下配方之一：

(1)葡萄糖500-1000g/L，MgSO₄·7H₂O2-5g/L，氯化钙2-5g/L，玉米浆干粉15-30g/L；

(2)葡萄糖300-1000g/L，MgSO₄·7H₂O2-5g/L，氯化钙2-5g/L，玉米浆干粉15-30g/L,柠檬酸钠10-20g/L，氯化铵10-20g/L,K₂HPO₄1-2g/L。

10.权利要求1所述的方法，其中产γ-聚谷氨酸的枯草芽孢杆菌是于2014年5月20日以保藏编号CCTCCNO：M2014213保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)HBY-PBS-ZY55。