CN103103225A - 一种制备高纯度β-聚苹果酸的方法 - Google Patents
一种制备高纯度β-聚苹果酸的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种制备高纯度β-聚苹果酸的方法，属于高分子聚合物制备领域，涉及一种制备β-聚苹果酸的方法，特别是一种高纯度β-聚苹果酸的方法。本发明所述制备高纯度β-聚苹果酸的方法，主要步骤包括菌种活化、种子培养、发酵培养及分离纯化，其特征在于，所述分离纯化方法如下：普兰多糖的去除，聚苹果酸粗品的提取，样品中难分离多糖的去除，离心收集沉淀物，冷冻干燥。本发明与现有发明相比，有益效果是：①应用较为简单的方法即可得到较高纯度样品，设备投入较少，生产成本较低；②得到的样品纯度很高，可为后续的应用打下一定的基础。
Description
技术领域
本发明属于高分子聚合物制备领域，本发明涉及一种制备β-聚苹果酸的方法，特别是涉及一种制备高纯度β-聚苹果酸的方法。
背景技术
β-聚苹果酸（β-PMLA）是一种以苹果酸为单体的高分子聚合物，因其具有良好的水溶性、可化学衍生性、可降解性、可再生性、生物安全性等特点而受到研究者的重视。可期待在化妆品、药物、包装材料等领域广泛应用。
聚苹果酸的生产主要有化学合成法和微生物发酵法两种，化学合成的方法较多，主要分为直接聚合法、交酯开环法和内酯开环法，可分别得到γ型、α型和β型，由于在生物体内天然存在的是β型PMLA,故开发β型PMLA的合成方法便成为研究的热点。而化学法合成β－PMLA，只有内酯开环法一种，该方法形成内酯的步骤较多、产率低、反应温度高、中间产物分离提纯繁琐，制约了该方法的发展。
1969年，Shimada等发现一种由苹果酸组成的高分子化合物能够抑制圆弧青霉的酸性蛋白，后来被证实为聚苹果酸。到目前为止，国内外专家已经对聚苹果酸的生物发酵法进行了深入的研究，并获得了高产量的菌株及其生产工艺。但对生物发酵生产聚苹果酸的提取工艺的研究尚不是太多，国内外的论文和专利也很少，大多数专利和论文着重介绍的都是聚苹果酸菌株的培养方法，及简单的提取方法，例如：1995年公开的日本专利“生产苹果酸聚合微生物的培养方法（JP7308188A2）”、1992年公开的日本专利“微生物合成L-苹果酸聚合物（JP42111385A2）”。中国专利“同时获得副产物普鲁兰多糖的β-聚苹果酸的制备方法（公开号为CN101100687A）”中，介绍的方法是同时获得聚苹果酸和普鲁兰多糖两种产物，并除去里面的黑色素，但没有具体提到通过这种方法得到的聚苹果酸达到多少纯度。“β-聚苹果酸及其盐的制备方法（公开号为CN101487034A）”中介绍了在发酵的同时，通过膜技术回流发酵液以分离高分子量的聚苹果酸，并将低分子量的苹果酸回流到发酵液中继续发酵，并采用膜分离的方法对样品做进一步的纯化，通过这种方法可以得到高分子量的聚苹果酸，但没有说得到的聚苹果酸的纯度，而且医用的聚苹果酸并不需要太高的分子量。而且这种方法操作复杂，可行性比较差，而且成本较高。
发明内容
本发明解决的技术问题是：
采用醇沉的方法将发酵液中的大部分普鲁兰多糖除去，使β-聚苹果酸提升到一定浓度。采用普鲁兰酶将存在于样品中的一些很难除去的多糖去除，采用离子交换的方法将β-聚苹果酸盐转变为β-聚苹果酸。冻干得到纯度达80%以上的β-聚苹果酸。
本发明解决技术问题时所采用的技术方案如下：
1、菌种活化
将甘油管保存的出芽短梗霉接种到活化培养基上，在23-25℃培养2-3d。
2、种子培养
将培养好的斜面种子，采用洗菌的方法接种到种子培养基中，25-28℃，150-200r/min条件下振荡培养3d，制得种子液。
3、发酵培养
将2中得到的种子培养物以5%-10%的接种量，接种于发酵培养基中，25-28℃，150-200r/min条件下振荡培养7-10d。
4、分离纯化
a、普兰多糖的去除：在发酵培养后，离心除去菌体，边搅拌边加入甲醇或乙醇，加入量占加入后总液体体积的25%，用玻璃棒搅拌，玻璃棒上缠绕的絮状物即为普鲁兰多糖，将其移除；
b、聚苹果酸粗品的提取：向a得到的液体中边搅拌边继续添加甲醇，使甲醇的总含量达到总液体体积的60%，将上清液移除，向沉淀中再加入甲醇洗涤沉淀1-3次；离心后将沉淀收集，冷冻干燥得白色样品；
c、样品中难分离多糖的去除：将b中得到的白色样品再次溶解，加入2-10%（v/v）的普鲁兰酶，60℃反应30-60min，冷却，加入甲醇，使甲醇的总含量达到总液体体积的60%，进行醇沉；离心收集沉淀物，冷冻干燥，即可得到纯度为80%以上的β-聚苹果酸盐白色粉末；
d、将c中得到的白色粉末再次溶到水中，以2Bv/h过强酸性阳离子交换树脂，得到含有β-聚苹果酸的溶液，将其冻干即得到纯度为80%以上的β-聚苹果酸。
5、本发明技术方案中所用到的培养基为：
（1）活化培养基：即马铃薯葡萄糖培养基（PDA）：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L，pH6.0，121℃高压蒸汽灭菌20min；
（2）种子培养基：葡萄糖80g/L，丁二酸铵3g/L，丁二酸2g/L，K2CO30.4g/L，KH2PO41g/L，MgSO4·7H2O1g/L，ZnSO4·7H2O5ppm，玉米浸出液10g/L，CaCO320g/L，pH4.0-5.0，121℃高压蒸汽灭菌20min；
（3）发酵培养基：葡萄糖100g/L，硝酸钠20g/L，KH2PO41g/L，MgSO4·7H2O0.5g/L，蛋白胨20g/L，pH4.0-4.5，121℃高压蒸汽灭菌20min，CaCO320g/L，单独灭菌，121℃高压蒸汽灭菌20min。
本发明中使用菌种为常见产生β-聚苹果酸的出芽短梗霉及出芽短梗霉(Aureobasidiumpullulans)TKPM00006，CGMCC3337，见天津科技大学申请专利，申请号为CN200910071018，发明名称为一种大量产生β-聚苹果酸的诱变菌株出芽短梗霉TKPM00006及其培养方法，公开日期是2011.02.23。该专利中公开了本发明用出芽短梗霉(Aureobasidiumpullulans)TKPM00006，CGMCC3337，2009年10.14日保藏，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
有益效果
本发明与现有发明相比，有益效果是：①得到较高纯度样品的方法较为简单，设备投入较少，生产成本较低；②得到纯度较高的样品，为后续的应用打下了一定的基础。
具体实施方式
下面通过具体的实施方案叙述本发明中β-聚苹果酸的生产方法。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。
实施例1
按如下步骤制备β-聚苹果酸：
1、培养基的制备
（1）活化培养基：即马铃薯葡萄糖培养基（PDA）：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L，pH6.0，121℃高压蒸汽灭菌20min。
（2）种子培养基：葡萄糖80g/L，丁二酸铵3g/L，丁二酸2g/L，K2CO30.4g/L，KH2PO41g/L，MgSO4·7H2O1g/L，ZnSO4·7H2O5ppm，玉米浸出液10g/L，CaCO320g/L，pH4.0-5.0，121℃高压蒸汽灭菌20min。
（3）发酵培养基：葡萄糖100g/L，硝酸钠20g/L，KH2PO41g/L，MgSO4·7H2O0.5g/L，蛋白胨20g/L，pH4.0-4.5，121℃高压蒸汽灭菌20min，CaCO320g/L，单独灭菌，121℃高压蒸汽灭菌20min。
2、菌种活化
将甘油管保存的出芽短梗霉TKPM00006接种到活化培养基上，在25℃培养2d。
3、种子培养
将培养好的斜面种子，采用洗菌的方法接种到种子培养基中，25℃，200r/min振荡培养3d。
4、接种发酵
将3中得到的种子培养物以5%的接种量，接种于发酵培养基中，25℃，200r/min振荡培养10d。
5、分离纯化
a、普兰多糖的去除：在第四步发酵后，离心除去菌体。边搅拌边加入甲醇，使甲醇加入后，甲醇占总液体体积的25%。用玻璃棒搅拌，可发现玻璃棒上缠绕很多絮状物即为普鲁兰多糖，将其移除。
b、聚苹果酸粗品的提取：向a得到的液体中边搅拌边继续添加甲醇，使甲醇的总含量达到60%，这时会有大量白色的物质沉淀出来。将上清移除，再加入两倍体积的甲醇洗涤沉淀3次。离心将沉淀收集，冷冻干燥。
c、样品中难分离多糖的去除：将b中得到的白色样品再次溶解，加入5%的普鲁兰酶，60℃反应60min，冷却，加入甲醇，使甲醇总含量达到总液体体积的60%，进行醇沉。离心收集沉淀物，冷冻干燥。即可得到纯度为80%以上的聚苹果酸盐白色粉末。
d、将c中得到的白色粉末再次溶到水中，以2Bv/h的流速过001*7树脂，得到含有β-聚苹果酸的溶液，将其冻干即可得到纯度为80%以上的β-聚苹果酸。
实施例2
按如下步骤制备β-聚苹果酸
1、培养基的制备
（1）活化培养基：即马铃薯葡萄糖培养基（PDA）：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L，pH6.0，121℃高压蒸汽灭菌20min。
（2）种子培养基：葡萄糖80g/L，丁二酸铵3g/L，丁二酸2g/L，K2CO30.4g/L，KH2PO41g/L，MgSO4·7H2O1g/L，ZnSO4·7H2O5ppm，玉米浸出液10g/L，CaCO320g/L，pH4.0-5.0，121℃高压蒸汽灭菌20min。
（3）发酵培养基：葡萄糖100g/L，硝酸钠20g/L，KH2PO41g/L，MgSO4·7H2O0.5g/L，蛋白胨20g/L，pH4.0-4.5，121℃高压蒸汽灭菌20min，CaCO320g/L，单独灭菌，121℃高压蒸汽灭菌20min。
2、菌种活化
将甘油管保存的出芽短梗霉TKPM00006接种到活化培养基上，在23℃培养3d。
3、种子培养
将培养好的斜面种子，采用洗菌的方法接种到种子培养基中，28℃，150r/min振荡培养3d。
4、接种发酵
将第三步得到的种子培养物以10%的接种量，接种于发酵培养基中，28℃，150r/min振荡培养7d。
5、分离纯化
a、普兰多糖的去除：在第四步发酵后，离心除去菌体。边搅拌边加入甲醇，使甲醇加入后，甲醇占总液体体积的25%。用玻璃棒搅拌，可发现玻璃棒上缠绕很多絮状物即为普鲁兰多糖，将其移除。
b、聚苹果酸粗品的提取：向a得到的液体中边搅拌边继续添加甲醇，使甲醇的总含量达到60%，这时会有大量白色的物质沉淀出来。将上清移除，再加入3倍体积的甲醇洗涤沉淀1次。离心将沉淀收集，冷冻干燥。
c、样品中难分离多糖的去除：将b中得到的白色样品再次溶解，加入2.5%(v/v)的普鲁兰酶，60℃反应40min，冷却，加入甲醇，使甲醇总含量达到总液体体积的60%，进行醇沉。离心收集沉淀物，冷冻干燥。即可得到纯度为80%以上的聚苹果酸盐白色粉末。
d、将c中得到的白色粉末再次溶到水中，以2Bv/h的流速过001*1树脂，得到含有β-聚苹果酸的溶液，将其冻干即可得到纯度为80%以上的β-聚苹果酸。
实施例3
按如下步骤制备β-聚苹果酸：
1、培养基的制备
（1）活化培养基：即马铃薯葡萄糖培养基（PDA）：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L，pH6.0，121℃高压蒸汽灭菌20min。
（2）种子培养基：葡萄糖80g/L，丁二酸铵3g/L，丁二酸2g/L，K2CO30.4g/L，KH2PO41g/L，MgSO4·7H2O1g/L，ZnSO4·7H2O5ppm，玉米浸出液10g/L，CaCO320g/L，pH4.0-5.0，121℃高压蒸汽灭菌20min。
（3）发酵培养基：葡萄糖100g/L，硝酸钠20g/L，KH2PO41g/L，MgSO4·7H2O0.5g/L，蛋白胨20g/L，pH4.0-4.5，121℃高压蒸汽灭菌20min，CaCO320g/L，单独灭菌，121℃高压蒸汽灭菌20min。
2、菌种活化
将甘油管保存的出芽短梗霉TKPM00006接种到活化培养基上，在25℃培养2d。
3、种子培养
将培养好的斜面种子，采用洗菌的方法接种到种子培养基中，25℃，200r/min振荡培养2d。
4、接种发酵
将第三步得到的种子培养物以8%的接种量，接种于发酵培养基中，25℃，200r/min振荡培养10d。
5、分离纯化
a、普兰多糖的去除：在第四步发酵后，离心除去菌体。边搅拌边加入甲醇，使乙醇加入后，乙醇占总液体体积的25%。用玻璃棒搅拌，可发现玻璃棒上缠绕很多絮状物即为普鲁兰多糖，将其移除。
b、聚苹果酸粗品的提取：向a得到的液体中边搅拌边继续添加甲醇，使甲醇的总含量达到60%，这时会有大量白色的物质沉淀出来。将上清移除，再加入2倍体积的甲醇洗涤沉淀2次。离心将沉淀收集，冷冻干燥。
c、样品中难分离多糖的去除：将b中得到的白色样品再次溶解，加入10%的普鲁兰酶，60℃反应40min，冷却，加入甲醇，使甲醇总含量达到总液体体积的60%，进行醇沉。离心收集沉淀物，冷冻干燥。即可得到纯度为80%以上的聚苹果酸盐白色粉末。
d、将c中得到的白色粉末再次溶到水中，以2Bv/h的流速过001*7树脂，得到含有β-聚苹果酸的溶液，将其冻干即可得到纯度为80%以上的β-聚苹果酸。
实施例4
按如下步骤制备β-聚苹果酸
1、培养基的制备
（1）活化培养基：即马铃薯葡萄糖培养基（PDA）：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L，pH6.0，121℃高压蒸汽灭菌20min。
（2）种子培养基：葡萄糖80g/L，丁二酸铵3g/L，丁二酸2g/L，K2CO30.4g/L，KH2PO41g/L，MgSO4·7H2O1g/L，ZnSO4·7H2O5ppm，玉米浸出液10g/L，CaCO320g/L，pH4.0-5.0，121℃高压蒸汽灭菌20min。
（3）发酵培养基：葡萄糖100g/L，硝酸钠20g/L，KH2PO41g/L，MgSO4·7H2O0.5g/L，蛋白胨20g/L，pH4.0-4.5，121℃高压蒸汽灭菌20min，CaCO320g/L，单独灭菌，121℃高压蒸汽灭菌20min。
2、菌种活化
将甘油管保存的出芽短梗霉TKPM00006接种到活化培养基上，在23℃培养3d。
3、种子培养
将培养好的斜面种子，采用洗菌的方法接种到种子培养基中，28℃，150r/min振荡培养3d。
4、接种发酵
将第三步得到的种子培养物以10%的接种量，接种于发酵培养基中，28℃，150r/min振荡培养7d。
5、分离纯化
a、普兰多糖的去除：在第四步发酵后，离心除去菌体。边搅拌边加入乙醇，使乙醇加入后，乙醇占总液体体积的25%。用玻璃棒搅拌，可发现玻璃棒上缠绕很多絮状物即为普鲁兰多糖，将其移除。
b、聚苹果酸粗品的提取：向a得到的液体中边搅拌边继续添加甲醇，使甲醇的总含量达到60%，这时会有大量白色的物质沉淀出来。将上清移除，再加入3倍体积的甲醇洗涤沉淀1次。离心将沉淀收集，冷冻干燥。
c、样品中难分离多糖的去除：将b中得到的白色样品再次溶解，加入10%的普鲁兰酶，60℃反应40min，冷却，加入甲醇，使甲醇总含量达到总液体体积的60%，进行醇沉。离心收集沉淀物，冷冻干燥。即可得到纯度为80%以上的聚苹果酸盐白色粉末。
d、将c中得到的白色粉末再次溶到水中，以2Bv/h的流速过001*1树脂，得到含有β-聚苹果酸的溶液，将其冻干即可得到纯度为80%以上的β-聚苹果酸。
Claims (3)
1.一种制备高纯度β-聚苹果酸的方法，包括菌种活化、种子培养、发酵培养及分离纯化，其特征在于，所述分离纯化方法如下：
a、普兰多糖的去除：将出芽短梗霉发酵培养后，离心除去菌体，加入甲醇或乙醇，加入量占加入后总液体体积的25％，用玻璃棒搅拌，玻璃棒上缠绕的絮状物即为普鲁兰多糖，将其移除；
b、聚苹果酸粗品的提取：向a得到的液体中继续添加甲醇，使甲醇的总含量达到总液体体积的60％，将上清液移除，向沉淀中再加入甲醇，洗涤沉淀，离心后将沉淀物收集，冷冻干燥得白色样品；
c、样品中难分离多糖的去除：将b中得到的白色样品加水溶解，加入2-10％(v/v)的普鲁兰酶，60℃反应30-60min，冷却，加入甲醇，使甲醇的总含量达到总液体体积的60％，进行醇沉；离心收集沉淀物，冷冻干燥，即可得到纯度为80％以上的β-聚苹果酸盐白色粉末；
d、将c中得到的白色粉末再次溶到水中，以2Bv/h的流速过强酸性阳离子交换树脂，得到含有β-聚苹果酸的溶液，将其冻干即得到纯度为80％以上的β-聚苹果酸。
2.根据权利要求1所述的一种制备高纯度β-聚苹果酸的方法，其特征在于，洗涤沉淀时所述甲醇的加入量为沉淀体积的2～3倍，洗涤次数为1～3次。
3.根据权利要求1所述的一种制备高纯度β-聚苹果酸的方法，其特征在于，所述分离纯化方法如下：
a、普兰多糖的去除：将出芽短梗霉TKPM00006发酵培养后，离心除去菌体，加入甲醇，加入量占总液体体积的25%，用玻璃棒搅拌，玻璃棒上缠绕的絮状物即为普鲁兰多糖，将其移除；
b、聚苹果酸粗品的提取：向a得到的液体中继续添加甲醇，使甲醇的总含量达到总液体体积的60%，将上清液移除，向沉淀中再加入2倍体积的甲醇洗涤沉淀3次，离心收集沉淀，冷冻干燥得白色样品；
c、样品中难分离多糖的去除：将b中得到的白色样品加水溶解，加入5%的普鲁兰酶，60℃反应60min，冷却，加入甲醇，使甲醇总含量达到总液体体积的60%，进行醇沉；离心收集沉淀物，冷冻干燥，即可得到纯度为80%以上的β-聚苹果酸盐白色粉末；
d、将c中得到的白色粉末再次溶到水中，以2Bv/h的流速过001*7树脂，得到含有β-聚苹果酸的溶液，将其冻干即可得到纯度为80%以上的β-聚苹果酸。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
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