CN101487034A - β-聚苹果酸及其盐的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种制备β－聚苹果酸及其盐与同时获得副产物普鲁兰多糖的方法。通过下述方案予以实现：发酵过程中利用膜技术回流菌体和截留、浓缩高分子量β－聚苹果酸，使低分子量β－聚苹果酸、普鲁兰多糖及其它成份循环回发酵体系；采用弱碱性阴离子交换树脂，吸附β－聚苹果酸且使普鲁兰多糖溶液透过，采用碱性溶液洗脱树脂上吸附的β－聚苹果酸，洗脱液经提纯、干燥得β－聚苹果酸盐产品；所得渗透液经浓缩，采用氯仿/丁酮混合液去除蛋白，乙醇醇析使普鲁兰多糖沉淀，丙酮、乙醚依次洗涤，P2O5干燥得普鲁兰多糖粉末状产品；采用强酸性阳离子交换树脂吸附β－聚苹果酸盐溶液中的盐离子，脱盐溶液经膜脱除多余的酸，浓缩、干燥得β－聚苹果酸产品。
Description
技术领域
本发明的技术方案属于发酵工程技术领域，具体涉及采用膜技术回流菌体、截留浓缩β-聚苹果酸和控制β-聚苹果酸聚合度，及采用树脂制备β-聚苹果酸盐、β-聚苹果酸和普鲁兰多糖的方法。
背景技术
1969年，研究圆弧青霉菌(Pencillium cyclopium)的微生物学家Shimada和Matsushima等推测该菌中可能存在含苹果酸结构单元的聚合物，该聚合物能够抑制圆弧青霉菌的酸性蛋白酶活性，最终证实该聚合物为聚苹果酸。1979年，Vert等首次合成了水溶性脂肪族聚酯——聚苹果酸，它以聚苹果酸为唯一单体。1989年，Fisher等从黏菌(Physarum Polycephalum)细胞中分离出聚苹果酸，并发现它是DNA聚合酶α的抑制剂。迄今为止，以Vert、Cammas、Kajiyama等为代表的国外学者已对聚苹果酸性能和应用做了较深入的研究，目前国内外有关利用微生物发酵生产聚苹果酸的专利非常少，已有的发酵生产或人工合成聚苹果酸(苹果酸聚合物)的专利有：1995年公开的日本专利“生产苹果酸聚合微生物的培养方法(JP7308188A2)”、1991年公开的日本专利“酶法生产L-苹果酸聚合物(JP4341189A2)”和1992年公开的日本专利“微生物合成L-苹果酸聚合物(JP4211385A2)”，这些专利着重描述了产聚苹果酸菌株的培养方法，及醇析获得聚苹果酸的方法；美国专利US4320753，主要是合成聚苹果酸和相应β-内酯的衍生物；中国专利CN101100687，公开了采用不同乙醇浓度醇析，同时获得普鲁兰和聚苹果酸的方法。而关于聚苹果酸应用的专利较多，如：US05811032、US05324519、US5702716等多达90余项。
聚苹果酸是一种特殊的脂肪族聚酯，以苹果酸为唯一单体、相互通过酯键联接而成。它是天然多聚物中新近开发的一种生物多聚物。与许多其它天然多聚物不同，聚苹果酸分子中有许多自由羧基和非对称碳原子，这些自由羧基赋予了它许多特别的性质，它除了具有良好的水溶性、可生物降解性、生物相容性和生物可吸收性之外，还具有两个显著的优点：(1)易代谢性。由于L-苹果酸是生物体内克雷伯氏三羧酸循环的中间体，β-聚苹果酸容易在生物体内通过正常的三羧酸循环代谢途径除去；(2)易修饰性。聚苹果酸具有悬挂羧基，容易与其它官能团反应而制得聚苹果酸衍生物，或引入功能基团或小分子药物，从而制得许多具有特殊功能的产物。因此，聚苹果酸及其衍生物可作为手术缝合线、组织工程支架材料、药物载体或原生药物、药物控制释放体系、食品包装材料、化妆品等，在生物医药、食品、化妆品等领域获得重要的应用。
聚苹果酸可以通过化学的或生物的方法合成，目前两种方法都在研究中。通过化学合成可以得到3种聚苹果酸，即α、β、γ3种类型；而从微生物细胞中分离的聚苹果酸仅有β型一种。同化学合成相比，生物合成产品的分子量较高，可达200～760kDa，而化学合成的聚苹果酸分子量最多为174kDa。另外，生物合成所需的原料简单易得，反应条件温和，具有较大的开发应用前景。
出芽短梗霉生产聚苹果酸过程中的主要副产物是普鲁兰多糖，其易溶于水，不溶于乙醇。它是一种具有极好的成膜、成纤、阻气、粘结、无毒性生物高分子，已广泛应用于生物医药和食品等领域。
到目前为止，发酵法生产β-聚苹果酸没有大规模的应用，其主要原因是：发酵周期过长，产率低，生产成本过高，生产的β-聚苹果酸为多种聚合度的复合物。
发明内容
本发明所解决的技术问题是：发酵过程中利用膜技术回流菌体和截留、浓缩高分子量β-聚苹果酸，使低分子量β-聚苹果酸、苹果酸及其它成份回流于发酵过程，降低末端产物β-聚苹果酸对β-聚苹果酸合成过程的抑制作用，提高发酵过程的菌体密度，控制发酵过程β-聚苹果酸的聚合度，缩短发酵周期。采用弱碱性阴离子交换树脂，吸附β-聚苹果酸且使普鲁兰多糖溶液透过，采用碱性溶液洗脱树脂上吸附的β-聚苹果酸，得到β-聚苹果酸盐。采用强酸性阳离子交换树脂吸附β-聚苹果酸盐溶液中的盐离子，经膜浓缩得游离态的β-聚苹果酸。
本发明解决该技术问题所采用的技术方案是：
1.β-聚苹果酸及其盐的制备方法包括如下步骤：
(1)接种发酵
将出芽短梗霉经活化和种子培养后接种于发酵培养基中，pH4.0～4.5，温度20-28℃，通气量0.5-2.5vvm，培养72-96h，启动泵1及2使菌体经膜组件A(见附图，膜孔径0.22-0.8μm)回流至发酵罐中，压差0.05-0.1mpa，渗透液1经膜组件B(见附图，截留分子量10-100KDa)浓缩，浓缩液回流至储罐1，渗透液2返回发酵罐中。控制发酵罐中β-聚苹果酸含量<1.5g/L，当发酵罐中β-聚苹果酸浓度<0.5g/L时，调节泵1及2的转速，降低发酵液引出的速率；当发酵罐中β-聚苹果酸浓度>1g/L时，调节泵1及2的转速，提高发酵液引出的速率；当储罐A中β-聚苹果酸含量>30g/L，将其转入储罐2中。当葡萄糖浓度<10g/L时，流加300-800g/L葡萄糖、15-40g/L NaNO3的溶液，维持发酵液中葡萄糖浓度在10g/L左右。当菌体有部分自溶，耗糖速率下降，停止流加糖液，当糖浓度下降至0.5g/L时，停止发酵，调节泵1与2的流速，增大膜组件A的压差，将发酵罐中所有料液泵出，收集渗漏液2，留待下批实验配制流加糖及NaNO3使用；
(2)β-聚苹果酸及副产物普鲁兰多糖的制备
①将第(1)步获得的β-聚苹果酸浓缩液经弱碱性阴离子交换树脂吸附，收集渗透液，用去离子水冲洗树脂，洗水与渗透液合并得溶液C。用碱溶液洗脱吸附在树脂上的β-聚苹果酸，洗脱液经脱色得溶液D，将溶液D分别经浓缩、有机溶剂沉淀、冷冻干燥或喷雾干燥步骤制得白色β-聚苹果酸盐产品；
②将①所得的溶液D或β-聚苹果酸盐产品溶液，经强酸性阳离子交换树脂吸附，去除β-聚苹果酸盐中的盐离子，渗透液经膜浓缩去除多余的酸根离子，经有机溶剂沉淀、冷冻干燥或喷雾干燥步骤制得白色β-聚苹果酸产品；
③将①所得溶液C用膜浓缩，浓缩液中加入氯仿/丁酮混合液(体积比4：1)，充分振荡使蛋白析出，离心或过滤除去沉淀。除蛋白的剩余溶液加入2倍体积无水乙醇，充分搅拌，放置12-24h，使普鲁兰多糖沉淀，分离所得沉淀经丙酮、乙醚依次洗涤，P2O5干燥，得普鲁兰多糖粉末状产品；
说明：
(1)第1步所采用的活化培养基：马铃薯葡萄糖培养基，121℃灭菌15min；
(2)第1步所采用的发酵培养基(w/v)：10％ glucose，0.2％ NaNO3，0.01％ KH2PO4，0.02％ MgSO4·7H2O，0.05％ KCl，pH4.0～4.5，121℃灭菌15min；
(3)第1步菌种活化方法
将出芽短梗霉菌株(Aureobasidium pullulans ipe-1)采用活化培养基在20-28℃进行活化培养48-96小时；
(4)第1步采用的种子培养方法
将斜面上活化的种子培养物接种于发酵培养基中，在20-28℃，200r/min条件下振荡培养48-96h小时。
2.根据步骤1所述的制备苹果酸盐、苹果酸及普鲁兰多糖的方法，其特征在于：采用膜组件A回流菌体，渗透液1经膜组件B浓缩后，浓缩液回流至储罐1，渗透液2返回发酵罐。
3.根据步骤1所述的制备苹果酸盐、苹果酸及普鲁兰多糖的方法，其特征在于：采用膜组件B截留高分子量β-聚苹果酸及普鲁兰多糖，低分子量β-聚苹果酸、普鲁兰多糖及培养基成份回流至发酵过程，降低末端产物反馈抑制作用并充分消耗培养基成份和让菌体将低分子量β-聚苹果酸、普鲁兰多糖分别进一步聚合。
4.根据步骤1所述的制备苹果酸盐、苹果酸及普鲁兰多糖的方法，其特征在于：采用的膜组件A为微滤膜，膜孔径0.22-0.8μm有机或无机膜；采用的膜组件B为超滤膜，截留分子量为10-100kDa的有机或无机膜。
5.根据4所述，其特征在于：采用的膜组件A和膜组件B的型式为平板式或中空式。
6.根据4所述，其特征在于：采用的膜组件A和膜组件B中的膜材料为：聚砜、聚醚砜、聚偏氟乙烯、聚四氟乙烯、聚丙烯腈等有机膜或氧化铝质、氧化钴质、氧化硅质、硅酸铝质、碳化硅质等陶瓷膜或Ag膜、Ni膜、Ti膜及不锈钢膜等金属膜或金属与陶瓷复合型无机膜。
7.根据步骤1所述的制备苹果酸盐、苹果酸及普鲁兰多糖的方法，其特征在于：由膜组件B分离获得的浓缩液经阴离子交换树脂吸附，用碱溶液洗脱吸附在树脂上的β-聚苹果酸，洗脱液经膜浓缩去除多余的碱，浓缩液经脱色、进一步浓缩，有机溶剂沉淀、冷冻干燥或喷雾干燥制得白色β-聚苹果酸盐产品；采用β-聚苹果酸盐产品溶液或权利要求1中的溶液D，经强酸性阳离子交换树脂吸附，渗透液经膜浓缩去除多余的酸，进一步浓缩，采用有机溶剂沉淀、冷冻干燥或喷雾干燥制得白色β-聚苹果酸产品。
8.根据步骤1所述的制备苹果酸盐、苹果酸及普鲁兰多糖的方法，其特征在于：采用弱碱性的阴离子交换树脂吸附β-聚苹果酸而使中性的普鲁兰多糖穿过，渗透液经浓缩、提纯、干燥制得普鲁兰多糖。
9.根据7所述的制备苹果酸盐、苹果酸及普鲁兰多糖的方法，其特征在于：所用的碱溶液为βH8-9的氨水或铵盐、0.1mol/L NaOH等。
10.根据7所述的制备苹果酸盐、苹果酸及普鲁兰多糖的方法，其特征在于：所用的有机溶剂为乙醇、丙酮等。
11.根据7所述的制备苹果酸盐、苹果酸及普鲁兰多糖的方法，其特征在于，采用的膜为有机膜或无机膜，膜组件型式为平板式或中空式；膜材料为聚砜、聚醚砜、聚偏氟乙烯、聚四氟乙烯、聚丙烯腈等有机膜或氧化铝质、氧化钴质、氧化硅质、硅酸铝质、碳化硅质等陶瓷膜或Ag膜、Ni膜、Ti膜及不锈钢膜等金属膜或金属与陶瓷复合型无机膜。
12.根据步骤1所述的制备苹果酸盐、苹果酸及普鲁兰多糖的方法，其特征在于：所述的阴离子交换树脂为已处理的碳酸型、氢氧根型和氯型的弱碱性的阴离子交换树脂。
13.根据步骤1所述的制备苹果酸盐、苹果酸及普鲁兰多糖的方法，其特征在于：所述的阳离子交换树脂为强酸性阳离子交换树脂。
14.根据步骤1所述的制备苹果酸盐、苹果酸及普鲁兰多糖的方法，其特征在于：当葡萄糖浓度<10g/L时，流加300-800g/L葡萄糖、15-40g/L NaNO3溶液，维持发酵液中葡萄糖浓度在10g/L左右。
本发明与现有技术相比，有益效果是：第一，采用膜技术使β-聚苹果酸发酵过程的β-聚苹果酸聚合度得到一定控制，缩短发酵周期；第二，同时获得β-聚苹果酸盐、β-聚苹果酸及普鲁兰多糖三种产品，并可根据β-聚苹果酸的应用特性进一步切割β-聚苹果酸产品的聚合度；第三，因发酵过程中的高分子量β-聚苹果酸及普鲁兰多糖被截留排出发酵过程，降低了末端产物的反馈抑制作用，提高了β-聚苹果酸及普鲁兰多糖的产率。第四，实现了细胞的循环使用，提高了发酵罐中菌体密度。
附图说明
图1.β-苹果酸盐与获得副产物普鲁兰多糖的的工艺流程示意图
附图标记
1.发酵罐 2.泵1 3.膜组件A 4.渗漏液1 5.泵4 6.泵3 7.储罐1
8.储罐2 9.泵2 10.膜组件B 11.浓缩液 12.渗透液2 13.菌体
14.阴离子交换柱 15.洗脱液 16.储罐3 17.泵6 18.渗透液
19.储罐4 20.泵5
图2.β-苹果酸的制备方法
附图标记
1.泵1 2.储罐2 3.阳离子交换柱 4.渗透液 5.储罐2 6.泵2
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明，本发明所涉及的主题保护范围并非仅限于这些实施例。
实施例1
按如下步骤制备β-聚苹果酸、β-聚苹果酸盐和普鲁兰多糖：
第一步，培养基配制
①活化培养基：马铃薯葡萄糖培养基，121℃灭菌15min；
②发酵培养基的配制(w/v)：10％ glucose，0.2％ NaNO3，0.01％ KH2PO4，0.02％ MgSO4·7H2O，0.05％ KCl，pH4.0～4.5，121℃灭菌15min。
第二步，菌种活化
将4℃保存的出芽短梗霉菌株(Aureobasidium pullulans ipe-1)，转接于活化培养基斜面上，在25℃进行活化培养48小时。
第三步，种子培养
将斜面上活化的种子培养物接种于装100ml发酵培养基的500ml三角瓶中，在25℃，200r/min条件下振荡培养48小时。
第四步，接种发酵
将第三步制得的培养物以5％的接种量接种于装100ml发酵培养基的500ml三角瓶中，初始pH4.0～4.5，温度25℃，转速200r/min，培养7天。最后得发酵液中β-聚苹果酸含量为1.6g/L。
第五步β-聚苹果酸及副产物普鲁兰多糖的制备
①将第四步获得的β-聚苹果酸发酵液经离心，上清液经弱碱性阴离子交换树脂吸附，收集渗透液，用3倍树脂体积的去离子水冲洗树脂，洗水与渗透液合并。用pH8-9的氨水或铵盐、或0.1mol/L NaOH溶液等碱溶液洗脱吸附在树脂上的β-聚苹果酸，洗脱液经脱色、浓缩，有机溶剂沉淀、冷冻干燥或喷雾干燥制得白色β-聚苹果酸产品，此产品为β-聚苹果酸盐；
②将①所得的洗脱液脱色后溶液或产品溶液，经强酸性阳离子交换树脂吸附，去除β-聚苹果酸盐中的盐离子，渗透液经膜浓缩去除多余的酸根离子，有机溶剂沉淀、冷冻干燥或喷雾干燥制得白色β-聚苹果酸产品；
③将①所得渗透液用截留分子量100kDa膜组件浓缩，进一步浓缩，浓缩液中加入氯仿/丁酮混合液(体积比4：1)，充分振荡使蛋白析出，离心或过滤除去沉淀。除蛋白溶液加入2倍体积无水乙醇，充分搅拌，放置12-24h，使普鲁兰多糖沉淀，分离所得沉淀经丙酮、乙醚依次洗涤，P2O5干燥，得普鲁兰多糖粉末状产品。
实施例2
按如下步骤制备β-聚苹果酸、β-聚苹果酸盐和普鲁兰多糖：
第一步，培养基配制
同实施例1
第二步，菌种活化
同实施例1
第三步，种子培养
同实施例1
第四步，接种发酵
将第三步制得的培养物以10％的接种量接种于装4L发酵培养基的7L发酵罐中，初始pH4.0～4.5，温度25℃，通气量0.5-2.5vvm，转速600-700r/min，培养7天，此时菌体有部分自溶，耗糖速率下降。最后得发酵液中β-聚苹果酸含量为8.7g/L，分子量范围广5KDa-1000kDa。
第五步β-聚苹果酸及副产物普鲁兰多糖的制备
①将第四步获得的β-聚苹果酸发酵液经离心，上清液经截留分子量100kDa的膜组件浓缩，浓缩液经弱碱性阴离子交换树脂吸附，收集渗透液，用3倍树脂体积的去离子水冲洗树脂，洗水与渗透液合并。用pH8-9的氨水或铵盐、或0.1mol/L NaOH溶液等碱溶液洗脱吸附在树脂上的β-聚苹果酸，洗脱液经脱色、浓缩，有机溶剂沉淀、冷冻干燥或喷雾干燥制得白色β-聚苹果酸产品，此产品为β-聚苹果酸盐；
②将①所得的洗脱液脱色后溶液或产品溶液，经强酸性阳离子交换树脂吸附，去除β-聚苹果酸盐中的盐离子，渗透液经膜浓缩去除多余的酸根离子，有机溶剂沉淀、冷冻干燥或喷雾干燥制得白色β-聚苹果酸产品；
③将①所得渗透液用截留分子量100kDa膜组件浓缩，浓缩液中加入氯仿/丁酮混合液(体积比4：1)，充分振荡使蛋白析出，离心或过滤除去沉淀。除蛋白溶液加入2倍体积无水乙醇，充分搅拌，放置12-24h，使普鲁兰多糖沉淀，分离所得沉淀经丙酮、乙醚依次洗涤，P2O5干燥，得普鲁兰多糖粉末状产品。
实施例3
按如下步骤制备β-聚苹果酸、β-聚苹果酸盐和普鲁兰多糖：
第一步，培养基配制
同实施例1
第二步，菌种活化
同实施例1
第三步，种子培养
同实施例1
第四步，接种发酵
将第三步制得的培养物接种于发酵培养基中，pH4.0～4.5，温度25℃，通气量0.5-2.5vvm，转速600-700r/min，培养72h，启动泵1使菌体经膜组件A(见附图，膜孔径0.8μm)回流至发酵罐中，压差0.05-0.1mpa，渗透液1经膜组件B(见附图，截留分子量100KDa)浓缩，浓缩液回流至储罐1，渗透液2返回发酵罐中。控制发酵罐中β-聚苹果酸含量<1.5g/L，当发酵罐中β-聚苹果酸浓度<0.5g/L时，调节泵1及2的转速，降低发酵液引出的速率；当发酵罐中β-聚苹果酸浓度>1g/L时，调节泵1及2的转速，提高发酵液引出的速率；当储罐1中β-聚苹果酸含量>30g/L，将其转入储罐2中。发酵6.5天，产酸10.9g/L，菌体耗糖速率较高，显微镜下观察菌体形态良好。
第五步β-聚苹果酸及副产物普鲁兰多糖的制备
①将第四步获得的β-聚苹果酸发酵液经离心，上清液经截留分子量100kDa的膜组件浓缩，浓缩液经弱碱性阴离子交换树脂吸附，收集渗透液，用3倍树脂体积的去离子水冲洗树脂，洗水与渗透液合并。用pH8-9的氨水或铵盐、或0.1mol/L NaOH溶液等碱溶液洗脱吸附在树脂上的β-聚苹果酸，洗脱液经脱色、浓缩，有机溶剂沉淀、冷冻干燥或喷雾干燥制得白色β-聚苹果酸产品，此产品为β-聚苹果酸盐；
②将①所得的洗脱液脱色后溶液或产品溶液，经强酸性阳离子交换树脂吸附，去除β-聚苹果酸盐中的盐离子，渗透液经膜浓缩去除多余的酸根离子，有机溶剂沉淀、冷冻干燥或喷雾干燥制得白色β-聚苹果酸产品；
③将①所得渗透液用截留分子量100kDa膜组件浓缩，进一步浓缩，浓缩液中加入氯仿/丁酮混合液(体积比4： 1)，充分振荡使蛋白析出，离心或过滤除去沉淀。除蛋白溶液加入2倍体积无水乙醇，充分搅拌，放置12-24h，使普鲁兰多糖沉淀，分离所得沉淀经丙酮、乙醚依次洗涤，P2O5干燥，得普鲁兰多糖粉末状产品。
实施例4
按如下步骤制备β-聚苹果酸、β-聚苹果酸盐和普鲁兰多糖：
第一步，培养基配制
同实施例1
第二步，菌种活化
同实施例1
第三步，种子培养
同实施例1
第四步，接种发酵
将第三步制得的培养物接种于发酵培养基中，pH4.0～4.5，温度25℃，通气量0.5-2.5vvm，转速600-700r/min，培养72h，启动泵1使菌体经膜组件A(见附图，膜孔径0.22μm)回流至发酵罐中，压差0.05-0.1mpa，渗透液1经膜组件B(见附图，截留分子量10KDa)浓缩，浓缩液回流至储罐1，渗透液2返回发酵罐中。控制发酵罐中β-聚苹果酸含量<1.5g/L，当发酵罐中β-聚苹果酸浓度<0.5g/L时，调节泵1及2的转速，降低发酵液引出的速率；当发酵罐中β-聚苹果酸浓度>1g/L时，调节泵1及2的转速，提高发酵液引出的速率；当储罐1中β-聚苹果酸含量>30g/L，将其转入储罐2中。发酵6.5天，产酸12.1g/L，菌体耗糖速率较高，显微镜下观察菌体形态良好。
第五步β-聚苹果酸及副产物普鲁兰多糖的制备
①将第四步获得的β-聚苹果酸发酵液经离心，上清液经截留分子量10kDa的膜组件浓缩，浓缩液经弱碱性阴离子交换树脂吸附，收集渗透液，用3倍树脂体积的去离子水冲洗树脂，洗水与渗透液合并。用pH8-9的氨水或铵盐、或0.1mol/L NaOH溶液等碱溶液洗脱吸附在树脂上的β-聚苹果酸，洗脱液经脱色、浓缩，有机溶剂沉淀、冷冻干燥或喷雾干燥制得白色β-聚苹果酸产品，此产品为β-聚苹果酸盐；
②将①所得的洗脱液脱色后溶液或产品溶液，经强酸性阳离子交换树脂吸附，去除β-聚苹果酸盐中的盐离子，渗透液经膜浓缩去除多余的酸根离子，有机溶剂沉淀、冷冻干燥或喷雾干燥制得白色β-聚苹果酸产品；
③将①所得渗透液用截留分子量100kDa膜组件浓缩，进一步浓缩，浓缩液中加入氯仿/丁酮混合液(体积比4：1)，充分振荡使蛋白析出，离心或过滤除去沉淀。除蛋白溶液加入2倍体积无水乙醇，充分搅拌，放置12-24h，使普鲁兰多糖沉淀，分离所得沉淀经丙酮、乙醚依次洗涤，P2O5干燥，得普鲁兰多糖粉末状产品。
实施例5
按如下步骤制备β-聚苹果酸、β-聚苹果酸盐和普鲁兰多糖：
第一步，培养基配制
同实施例1
第二步，菌种活化
同实施例1
第三步，种子培养
同实施例1
第四步，接种发酵
将第三步制得的培养物以10％接种量接种于发酵培养基中，pH4.0～4.5，温度25℃，通气量0.5-2.5vvm，培养72h，启动泵使菌体经膜组件A(见附图，膜孔径0.8μm)回流至发酵罐中，压差0.05-0.1mpa，渗透液1经膜组件B(见附图，截留分子量100KDa)浓缩，浓缩液回流至储罐1，渗透液B返回发酵罐中。控制发酵罐中β-聚苹果酸含量<1.5g/L，当发酵罐中β-聚苹果酸浓度<0.5g/L时，调节泵1及2的转速，降低发酵液引出的速率；当发酵罐中β-聚苹果酸浓度>1g/L时，调节泵1及2的转速，提高发酵液引出的速率；当储罐A中β-聚苹果酸含量>30g/L，将其转入储罐2中。当葡萄糖浓度<10g/L时，流加每升含500g葡萄糖、25g NaNO3的溶液，维持发酵液中葡萄糖浓度在10g/L左右。当菌体有部分自溶，耗糖速率下降，停止流加糖液，当糖浓度下降至0.5g/L时，停止发酵，调节泵1与2的流速，增大膜组件A的压差，将发酵罐中所有料液泵出，收集渗漏液2，留待下批实验配置流加糖及NaNO3使用。发酵进行12天，产酸18.2g/L。
第五步β-聚苹果酸及副产物普鲁兰多糖的制备
①将第四步获得的β-聚苹果酸浓缩液经弱碱性阴离子交换树脂吸附，收集渗透液，用3倍树脂体积的去离子水冲洗树脂，洗水与渗透液合并。用pH8-9的氨水或铵盐、或0.1mol/L NaOH溶液等碱溶液洗脱吸附在树脂上的β-聚苹果酸，洗脱液经脱色、浓缩，有机溶剂沉淀、冷冻干燥或喷雾干燥制得白色β-聚苹果酸产品，此产品为β-聚苹果酸盐；
②将①所得的洗脱液脱色后溶液或产品溶液，经强酸性阳离子交换树脂吸附，去除β-聚苹果酸盐中的盐离子，渗透液经膜浓缩去除多余的酸根离子，有机溶剂沉淀、冷冻干燥或喷雾干燥制得白色β-聚苹果酸产品；
③将①所得渗透液用截留分子量100kDa膜组件浓缩，进一步浓缩，浓缩液中加入氯仿/丁酮混合液(体积比4：1)，充分振荡使蛋白析出，离心或过滤除去沉淀。除蛋白溶液加入2倍体积无水乙醇，充分搅拌，放置12-24h，使普鲁兰多糖沉淀，分离所得沉淀经丙酮、乙醚依次洗涤，P2O5干燥，得普鲁兰多糖粉末状产品。
实施例6
按如下步骤制备β-聚苹果酸、β-聚苹果酸盐和普鲁兰多糖：
第一步，培养基配制
同实施例1
第二步，菌种活化
同实施例1
第三步，种子培养
同实施例1
第四步，接种发酵
将第三步制得的培养物以10％接种量接种于发酵培养基中，pH4.0～4.5，温度25℃，通气量0.5-2.5vvm，培养72h，启动泵使菌体经膜组件A(见附图，膜孔径0.22μm)回流至发酵罐中，压差0.05-0.1mpa，渗透液1经膜组件B(见附图，截留分子量10KDa)浓缩，浓缩液回流至储罐1，渗透液2返回发酵罐中。控制发酵罐中β-聚苹果酸含量<1.5g/L，当发酵罐中β-聚苹果酸浓度<0.5g/L时，调节泵1及2的转速，降低发酵液引出的速率；当发酵罐中β-聚苹果酸浓度>1g/L时，调节泵1及2的转速，提高发酵液引出的速率；当储罐A中β-聚苹果酸含量>30g/L，将其转入储罐2中。当葡萄糖浓度<10g/L时，流加每升含500g葡萄糖、25g NaNO3的溶液，维持发酵液中葡萄糖浓度在10g/L左右。当菌体有部分自溶，耗糖速率下降，停止流加糖液，当糖浓度下降至0.5g/L时，停止发酵，调节泵1与2的流速，增大膜组件A的压差，将发酵罐中所有料液泵出，收集渗漏液2，留待下批实验配置流加糖及NaNO3使用。发酵进行13天，产酸22.5g/L。
第五步β-聚苹果酸及副产物普鲁兰多糖的制备
①将第四步获得的β-聚苹果酸浓缩液经弱碱性阴离子交换树脂吸附，收集渗透液，用3倍树脂体积的去离子水冲洗树脂，洗水与渗透液合并。用pH8-9的氨水或铵盐、或0.1mol/L NaOH溶液等碱溶液洗脱吸附在树脂上的β-聚苹果酸，洗脱液经脱色、浓缩，有机溶剂沉淀、冷冻干燥或喷雾干燥制得白色β-聚苹果酸产品，此产品为β-聚苹果酸盐；
②将①所得的洗脱液脱色后溶液或产品溶液，经强酸性阳离子交换树脂吸附，去除β-聚苹果酸盐中的盐离子，渗透液经膜浓缩去除多余的酸根离子，有机溶剂沉淀、冷冻干燥或喷雾干燥制得白色β-聚苹果酸产品；
③将①所得渗透液用截留分子量10kDa膜组件浓缩，进一步浓缩，浓缩液中加入氯仿/丁酮混合液(体积比4：1)，充分振荡使蛋白析出，离心或过滤除去沉淀。除蛋白溶液加入2倍体积无水乙醇，充分搅拌，放置12-24h，使普鲁兰多糖沉淀，分离所得沉淀经丙酮、乙醚依次洗涤，P2O5干燥，得普鲁兰多糖粉末状产品。
Claims (14)
1.β-聚苹果酸及其盐和普鲁兰多糖的制备方法包括如下步骤：
1)接种发酵
将出芽短梗霉经活化和种子培养后接种于发酵培养基中，pH4.0～4.5，温度20-28℃，通气量0.5-2.5vvm，培养72-96h，启动泵循环菌体、膜浓缩高分量的β-聚苹果酸及普鲁兰多糖；
2)β-聚苹果酸及其盐和普鲁兰多糖的制备
(1)将第1)步获得的β-聚苹果酸浓缩液经弱碱性阴离子交换树脂吸附，收集渗透液，用去离子水冲洗树脂，洗水与渗透液合并得溶液C，用碱溶液洗脱吸附在树脂上的β-聚苹果酸，洗脱液经脱色得溶液D，将溶液D浓缩，经有机溶剂沉淀、冷冻干燥或喷雾干燥步骤制得白色β-聚苹果酸盐产品；
(2)将(1)所得的溶液D或β-聚苹果酸盐产品溶液，经强酸性阳离子交换树脂吸附，去除β-聚苹果酸盐中的盐离子，渗透液经膜浓缩去除多余的酸根离子，经有机溶剂沉淀、冷冻干燥或喷雾干燥制得白色β-聚苹果酸产品；
(3)将(1)所得溶液C用膜浓缩，浓缩液中加入氯仿/丁酮混合液(体积比4：1)，充分振荡使蛋白析出，离心或过滤除去沉淀。除蛋白的剩余溶液加入2倍体积无水乙醇，充分搅拌，放置12-24h，使普鲁兰多糖沉淀，分离所得沉淀经丙酮、乙醚依次洗涤，P2O5干燥，得普鲁兰多糖粉末状产品。
2.根据权利要求1所述的制备聚苹果酸盐、聚苹果酸及普鲁兰多糖的方法，其特征在于：采用膜组件A回流菌体，渗透液1经膜组件B浓缩后，浓缩液回流至储罐1，渗透液2返回发酵罐。
3.根据权利要求1所述的制备β-聚苹果酸盐、β-聚苹果酸及普鲁兰多糖的方法，其特征在于：采用膜组件B截留高分子量β-聚苹果酸及普鲁兰多糖，低分子量β-聚苹果酸、普鲁兰多糖及培养基成份回流至发酵过程，降低末端产物反馈抑制作用并充分消耗培养基成份和让菌体将低分子量β-聚苹果酸、普鲁兰多糖分别进一步聚合。
4.根据权利要求1所述的制备β-聚苹果酸盐、β-聚苹果酸及普鲁兰多糖的方法，其特征在于：采用的膜组件A为微滤膜，膜孔径0.22-0.8μm有机或无机膜；采用的膜组件B为超滤膜，截留分子量为10-100kDa的有机或无机膜。
5.根据权利要求4所述，其特征在于：采用的膜组件A和膜组件B的型式为平板式或中空式。
6.根据权利要求4所述，其特征在于：采用的膜组件A和膜组件B中的膜材料为：聚砜、聚醚砜、聚偏氟乙烯、聚四氟乙烯、聚丙烯腈等有机膜或氧化铝质、氧化钴质、氧化硅质、硅酸铝质、碳化硅质等陶瓷膜或Ag膜、Ni膜、Ti膜及不锈钢膜等金属膜或金属与陶瓷复合型无机膜。
7.根据权利要求1所述的制备β-聚苹果酸盐、β-聚苹果酸及普鲁兰多糖的方法，其特征在于：由膜组件B分离获得的浓缩液经阴离子交换树脂吸附，用碱溶液洗脱吸附在树脂上的β-聚苹果酸，洗脱液经膜浓缩去除多余的碱，浓缩液经脱色、进一步浓缩，有机溶剂沉淀、冷冻干燥或喷雾干燥制得白色β-聚苹果酸盐产品；采用β-聚苹果酸盐产品溶液或权利要求1中的溶液D，经强酸性阳离子交换树脂吸附，渗透液经膜浓缩去除多余的酸，进一步浓缩，采用有机溶剂沉淀、冷冻干燥或喷雾干燥制得白色β-聚苹果酸产品。
8.根据权利要求1所述的制备β-聚苹果酸盐、β-聚苹果酸及普鲁兰多糖的方法，其特征在于：采用弱碱性的阴离子交换树脂吸附β-聚苹果酸而使中性的普鲁兰多糖穿过，渗透液经浓缩、提纯、干燥制得普鲁兰多糖。
9.根据权利要求7所述的制备β-聚苹果酸盐、β-聚苹果酸及普鲁兰多糖的方法，其特征在于：所用的碱溶液为pH8-9的氨水或铵盐、0.1mol/L NaOH等。
10.根据权利要求7所述的制备β-聚苹果酸盐、β-聚苹果酸及普鲁兰多糖的方法，其特征在于：所用的有机溶剂为乙醇、丙酮等。
11.根据权利要求7所述的制备β-聚苹果酸盐、β-聚苹果酸及普鲁兰多糖的方法，其特征在于：采用的膜为有机膜或无机膜，膜组件型式为平板式或中空式；膜材料为聚砜、聚醚砜、聚偏氟乙烯、聚四氟乙烯、聚丙烯腈等有机膜或氧化铝质、氧化钴质、氧化硅质、硅酸铝质、碳化硅质等陶瓷膜或Ag膜、Ni膜、Ti膜及不锈钢膜等金属膜或金属与陶瓷复合型无机膜。
12.根据权利要求1所述的制备β-聚苹果酸盐、β-聚苹果酸及普鲁兰多糖的方法，其特征在于：所述的阴离子交换树脂为已处理的碳酸型、氢氧根型和氯型的弱碱性的阴离子交换树脂。
13.根据权利要求1所述的制备β-聚苹果酸盐、β-聚苹果酸及普鲁兰多糖的方法，其特征在于：所述的阳离子交换树脂为强酸性阳离子交换树脂。
14.根据权利要求1所述的制备β-聚苹果酸盐、β-聚苹果酸及普鲁兰多糖的方法，其特征在于：当葡萄糖浓度<10g/L时，流加300-800g/L葡萄糖、15-40g/L NaNO3溶液，维持发酵液中葡萄糖浓度在10g/L左右。
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