CN102702508A

CN102702508A - 一种以工业规模提取聚谷氨酸的方法

Info

Publication number: CN102702508A
Application number: CN2012101626973A
Authority: CN
Inventors: 朱瑞艳; 徐美娜; 王永长; 杜迎辉; 徐志文
Original assignee: LEADING BIO-AGRICULTURAL Co Ltd
Current assignee: LEADING BIO-AGRICULTURAL Co Ltd
Priority date: 2012-05-24
Filing date: 2012-05-24
Publication date: 2012-10-03
Anticipated expiration: 2032-05-24
Also published as: CN102702508B

Abstract

本发明涉及一种以工业规模提取聚谷氨酸的方法。该方法包括乙醇溶液提取、第一次脱水与第二次脱水等步骤。本发明的方法可以非常显著地提高γ-PGA产品的纯度，其纯度高达90%以上，产品颗粒状，分散性好，易于操作，生产设备投资小，无污染，环境友好。

Description

一种以工业规模提取聚谷氨酸的方法

【技术领域】

本发明属于生物化工技术领域。更具体地，本发明涉及一种以工业规模提取聚谷氨酸的方法。

【背景技术】

微生物发酵法合成的γ-PGA（γ-polyglutamic acid,γ-PGA）是一种以α-氨基和γ-羧基经酰胺键缩合而成的高分子化合物，它的分子量是50000-2000000Da，聚合度为500-50000，γ-PGA的结构式如下：

γ-PGA具有优良的水溶性、超强的吸附性和生物可降解性，降解产物为无公害的谷氨酸，是一种优良的环保型高分子材料，可作为保水剂、重金属离子吸附剂、絮凝剂、缓释剂以及药物载体等，在化妆品、环境保护、食品、医药、农业、沙漠治理等产业均有很大的商业价值和社会价值。从γ-PGA的发现至今仅有几十年的历史，对γ-PGA的研究及开发主要集中于产生菌的改良和基因研究，发酵过程研究和提取纯化过程研究，以及衍生物的生产和应用。但是，γ-PGA的开发研究尚处于实验室阶段，目前还没有一套规模化分离、纯化γ-PGA的成熟工艺。目前，γ-PGA的分离纯化主要存在两个技术难点：1）发酵液粘度高，细胞分离困难；2）发酵液成分复杂，提取成本高。从高粘度体系中提取聚谷氨酸是目前聚谷氨酸未能规模化应用的关键之一。在现有技术中，通过调节含有γ-PGA发酵液pH使其粘度下降，从而可以采用离心、微滤的方式进行菌体分离。例如CN 200910020224公开了一种聚谷氨酸提取新工艺，该工艺首先采用稀酸调发酵液pH至3.0-5.0以降低发酵液粘度，然后高速离心发酵液除去菌体，离心清液加酶进一步水解蛋白，高速离心除去不溶物，再调酸用超滤膜透析浓缩除去色素盐类等小分子杂质，随后用乙醇沉淀胶渣，最后用乙醇加盐提取胶体，进行固液分离，固体胶体用真空低温或真空冷冻干燥得到成品聚谷氨酸。CN 201010177020公开了一种γ-聚谷氨酸(γ-PGA)的提取方法，特别是采用稀酸调pH3.0-5.0，过滤除菌，加入蛋白酶、溶菌酶除蛋白后，加入2-3倍体积的乙醇沉淀，经过滤后用蒸馏水溶解，经超滤膜过滤除杂、浓缩，再通过喷雾干燥得到γ-聚谷氨酸成品。

γ-PGA提取纯化多采用有机溶剂沉淀、膜分离法，尤其是需要得到纯度较高的γ-PGA时，需要采用超滤的方法。CN 200910097634公开了一种微生物发酵和膜分离技术耦合生产γ-聚谷氨酸的方法。该发明针对发酵过程中由于产物聚谷氨酸导致发酵液的粘度不断升高，严重影响发酵过程中的菌体生长和溶氧供应等难题，提出发酵与分离相耦合的方法，其步骤包括菌种活化，种子培养，发酵培养，微滤膜过滤，超滤浓缩和补料。采用此方法可以使发酵液黏度维持在较低水平，从而有利于增加发酵罐中的溶氧，降低产物的高黏度对菌体生长的抑制作用，提高γ-PGA的产量和发酵产率，降低了生产成本，并有利于发酵液的后处理和产物的精制。CN200910020221公开了一种聚谷氨酸提取新方法，即在一定PH、温度的发酵液中按比例添加溶菌酶、蛋白酶，作用一定时间除去发酵液中的菌体，然后加入适量的乙醇制成乳浊液并沉淀出胶渣，离心除去胶渣，再加入适量钠盐沉淀胶体同时分离色素、盐类等杂质，胶体再复水溶解，经超滤浓缩进一步脱盐、色素等小分子杂质，超滤浓缩液再加入乙醇析出胶体，多次置换高度乙醇降低胶体粘度，经离心分离乙醇后，真空烘干或冷冻烘干制的产品γ-PGA。

但是，上述γ-PGA提取的方法和工艺均集中于实验室小规模提取过程，尚未放大到以工业规模分离纯化γ-PGA的工艺过程中。为此，本发明人在总结与分析现有技术的基础上经过大量实验研究，终于完成了本发明。

【发明内容】

[要解决的技术问题]

本发明的目的是提供一种以工业规模提取聚谷氨酸的方法。

[技术方案]

本发明是通过下述技术方案实现的。

本发明涉及一种以工业规模提取聚谷氨酸的方法。

该提取聚谷氨酸方法的步骤如下：

A、乙醇溶液提取

按照以千克计发酵液重量与以升计提取溶剂体积的比1:1-4，在持续搅拌下将乙醇水溶液加到含有γ-PGA的发酵液中进行γ-PGA提取；在乙醇水溶液添加结束后，停止搅拌，并静置至料液分层；然后，将上层溶液与沉淀物分离；

B、第一次脱水

按照步骤A)得到的沉淀物与乙醇水溶液的重量比1~3:1，往步骤A）得到的沉淀物中加入乙醇水溶液，并持续搅拌至沉淀物分散成絮状，再停止搅拌，静置至料液分层；然后，将上层溶液与沉淀物分离；

C、第二次脱水

按照步骤B)得到的沉淀物与乙醇水溶液的重量比1~3:1，往步骤B）得到的沉淀物中加入乙醇水溶液，并持续搅拌至沉淀物分散成絮状，再停止搅拌，静置至料液分层；然后，将上层溶液与沉淀物分离；得到的沉淀物经干燥后得到纯度>90%的γ-PGA产品。

所述乙醇水溶液的浓度是以乙醇体积计92%以上。

根据本发明的一种优选实施方式，含有γ-PGA的发酵液是采用微生物发酵方法制备的含有以重量计3.5-4.0%γ-PGA的发酵液。

根据本发明的另一种优选实施方式，在步骤A)，所述的乙醇水溶液全部以流加方式加到含有γ-PGA的发酵液中，或者所述的乙醇水溶液以其总体积的2/3一次性加到含有γ-PGA的发酵液中，余下的1/3再以流加方式加到含有γ-PGA的发酵液中。

根据本发明的另一种优选实施方式，在步骤A)，乙醇水溶液流加流速是每分钟为1-5%所述发酵液重量。

更优选地，在步骤A)，乙醇水溶液流加流速是每分钟为2.5-3.2%所述发酵液重量。

根据本发明的另一种优选实施方式，所述静置的时间是20-60min。

更优选地，所述静置的时间是30-35min。

根据本发明的另一种优选实施方式，所述的干燥是在室温下自然干燥。

下面将更详细地描述本发明。

本发明涉及一种以工业规模提取聚谷氨酸的方法。该提取聚谷氨酸方法的步骤如下：

A、乙醇溶液提取

按照以千克计发酵液重量与以升计乙醇水溶液体积的比1:1-4，在持续搅拌下将乙醇水溶液加到含有γ-PGA的发酵液中进行γ-PGA提取；在乙醇水溶液添加结束后，停止搅拌，并静置至料液分层；然后，将上层溶液与沉淀物分离；

根据本发明，所述的含有γ-PGA的发酵液应该理解是采用微生物发酵方法制备的含有以重量计3.5-4.0%γ-PGA的发酵液，例如按照CN101109010B描述的方法，利用枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）CGMCCNo.2108制备的含有以重量计3.5-4.0%γ-PGA的发酵液。

所述发酵液中γ-PGA含量测定方法如下：将发酵液稀释100倍后离心除菌，取离心除菌后的上清液20μl通过0.22μm细菌过滤器过滤，进样到液相色谱柱测定其含量。测定条件为：

由测定的样品与标准品在相同保留时间下的峰面积之比，计算出发酵液中聚谷氨酸的含量。

根据本发明，如果所述的发酵液中γ-PGA含量小于以重量计3.5％，则会导致酒精使用量增加，工业规模上成本大幅度增加；如果所述的发酵液中γ-PGA含量大于以重量计4.0%，需要提取过程中搅拌功率增加；因此，所述的发酵液中γ-PGA含量为以重量计3.5-4.0%是合适的。

所述发酵液的粘度是使用商品名为NDJ-8S数字式粘度计进行测定的，本发明所使用发酵液的粘度为6500-7000mPa.s。

所述乙醇水溶液的浓度是以乙醇体积计92%以上。

根据本发明，所述的持续搅拌是使用机械搅拌器在30-50rpm条件下不断地进行搅拌。在乙醇水溶液添加结束后，停止其搅拌，并静置至料液分层；然后，采用虹吸方式或其它分离方式将上层溶液抽出，分离其沉淀物。

得到的上层溶液是乙醇溶液，可以采用常规蒸馏方法与设备回收所述上层溶液中的乙醇。

在这个步骤中，所述的乙醇水溶液可以全部以流加方式加到含有γ-PGA的发酵液中。

所述乙醇水溶液的流加流速是每分钟为1-5%所述发酵液重量，即每分钟往所述发酵液中加入乙醇水溶液的量是该发酵液重量的1-5%。如果往所述发酵液中加入乙醇水溶液的量小于1%，则聚谷氨酸收率降低；如果往所述发酵液中加入乙醇水溶液的量大于5%，则导致聚谷氨酸形成块状，不易后续操作；因此，所述乙醇水溶液的流加流速每分钟为1-5%所述发酵液重量是合适的。

优选地，所述乙醇水溶液流加流速是每分钟为2.5-3.2%所述发酵液重量。

或者，可以将一次性方式与流加方式两种不同方式相结合的方式加入所述的乙醇水溶液，例如以其乙醇水溶液总体积的2/3一次性加到含有γ-PGA的发酵液中，余下的1/3再以流加方式加到含有γ-PGA的发酵液中，一次性方式加入量与流加方式加入量之比还可以根据实际情况进行调整或改变。所述的乙醇水溶液以流加方式加入时，其流加流速如前面所述的相同。

根据本发明，所述的静置应该理解是让含有沉淀物的料液在没有任何外力作用下仍其沉淀物自然沉降，从而达到固-液相分离的目的。所述的静置的时间是20-60min。如果所述的静置的时间小于20min，则密度较轻的絮状物不能完全沉降。如果所述的静置的时间大于60min，则会导致部分聚谷氨酸性质发生变化。因此，所述的静置的时间20-60min是合适的。

优选地，所述静置的时间是30-35min。

B、第一次脱水

按照步骤A)得到的沉淀物与乙醇水溶液的重量比1~3:1，往步骤A）得到的沉淀物中加入乙醇水溶液，并持续搅拌至沉淀物分散成絮状，再停止搅拌，静置至料液分层；然后，将上层溶液与沉淀物分离。

该步骤使用的乙醇水溶液、搅拌条件、静置与步骤A)的相同。

C、第二次脱水

按照步骤B)得到的沉淀物与乙醇水溶液的重量比1~3:1，往步骤B）得到的沉淀物中加入乙醇水溶液，并持续搅拌至沉淀物分散成絮状，再停止搅拌，静置至料液分层；然后，将上层溶液与沉淀物分离。

该步骤使用的乙醇水溶液、搅拌条件、静置与步骤B)的相同。

得到的沉淀物经干燥后得到纯度>90%的γ-PGA产品。

所述沉淀物干燥可以采用常规真空干燥或低温干燥方法进行干燥，例如是在室温下自然干燥。

然后，采用凝胶色谱法对干燥产品进行γ-PGA含量测定。

液相色谱法的测定条件如下：

测定结果：采用本发明方法得到的干燥产品的γ-PGA含量以重量计大于90%。

[有益效果]

本发明的有益效果是：本发明的方法可以非常显著地提高γ-PGA产品的纯度，其纯度高达90%以上，产品颗粒状，分散性好，易于操作，生产设备投资小，无污染，环境友好。

【附图说明】

图1是本发明实施例1制备的γ-PGA产品外观图；

图2是本发明对比实施例1制备的γ-PGA产品外观图。

【具体实施方式】

通过下述实施例将更好地理解本发明。

实施例1：使用1吨γ-PGA提取罐提取γ-PGA

其实施步骤如下：

A、乙醇溶液提取

将γ-PGA的微生物发酵液250kg泵入到1吨提取罐内，采用本说明书中描述的方法测定该发酵液中γ-PGA含量为3.9%，该发酵液的pH值为7.2，该发酵液的粘度为6800mPa.s。

提取罐的搅拌转速为30rpm，向提取罐内一次性泵入250L酒精含量为95%的工业酒精，搅拌均匀，然后向提取罐内继续泵入酒精含量为95%的工业酒精，流加速率为10L/min，流加时间为25min；

继续搅拌20min，然后停止搅拌，物料混合液静置30min，料液分层；

将上层清液泵出提取罐，进行酒精蒸馏回收，得到沉淀物。

B、第一次脱水

往步骤A)得到的沉淀物(40kg)中加入40L酒精含量为95%的工业酒精，搅拌30min，静置分层；

将上层清液泵出提取罐，进行酒精蒸馏回收，得到沉淀物。

C、第二次脱水

往步骤B)得到的沉淀物(40kg)加入40L酒精含量为95%的工业酒精，搅拌30min，静置分层；

将上清泵入酒精回收罐内，进行酒精蒸馏，得到沉淀物；

将所述沉淀从提取罐中转出后，铺膜风干，采用常压干燥法测定水含量为13%，即得到γ-PGA制品，采用凝胶色谱测定γ-PGA的纯度为90.5%。

采用本发明方法得到的γ-PGA分散性好，且纯度显著增高，凝胶色谱分析其纯度可达到90.8%，产品分析结果见表1和附图1a。

对比实施例1：采用一次沉淀法提取γ-PGA

一次沉淀法实施步骤如下：

将上述γ-PGA的微生物发酵液250kg泵入到1t提取罐内，采用本说明书中描述的方法测定该发酵液中γ-PGA含量为3.9%，该发酵液的pH值为7.2，该发酵液的粘度为6800mPa.s。

提取罐的搅拌转速为30rpm，向提取罐内泵入500kg酒精含量95%的工业酒精，搅拌均匀。

停止搅拌罐搅拌，静置30min分层，将上层清夜使用真空泵抽出，下层沉淀物为一整体块状物，从提取罐内取出后，由于有较强的弹性和韧性，不易分散和干燥。

采用一次沉淀法制备得到的γ-PGA分散性差（图1b），且纯度较低，采用凝胶色谱测定其产品中γ-PGA纯度仅为46%，产品分析结果见表1。

表1γ-PGA产品质量分析

实施例2：使用1吨γ-PGA提取罐提取γ-PGA

其实施步骤如下：

A、乙醇溶液提取

将γ-PGA的微生物发酵液250kg泵入到1吨提取罐内，采用本说明书中描述的方法测定该发酵液中γ-PGA含量为3.7%，该发酵液的pH值为7.15，该发酵液的粘度为6500mPa.s。

提取罐的搅拌转速为30rpm，向提取罐内泵入500L酒精含量为99%的工业酒精，流加速率为15L/min，流加时间为35min；

将上层清液泵出提取罐，进行酒精蒸馏回收，得到沉淀物。

B、第一次脱水

往步骤A)得到的沉淀物(约40kg)中加入40L酒精含量为99%的工业酒精，搅拌30min，静置分层；

将上层清液泵出提取罐，进行酒精蒸馏回收，得到沉淀物。

C、第二次脱水

往步骤B)得到的沉淀物加入40L酒精含量为99%的工业酒精，搅拌30min，静置分层；

将上清泵入酒精回收罐内，进行酒精蒸馏，得到沉淀物；

将所述沉淀从提取罐中转出后，铺膜风干，采用常压干燥法定水含量为13％，即得到γ-PGA制品，采用凝胶色谱测定γ-PGA的纯度为91.0％。

实施例3：使用1吨γ-PGA提取罐提取γ-PGA

其实施步骤如下：

A、乙醇溶液提取

将γ-PGA的微生物发酵液250kg泵入到1吨提取罐内，采用本说明书中描述的方法测定该发酵液中γ-PGA含量为3.9%，该发酵液的pH值为7.2，该发酵液的粘度为6900mPa.s。

提取罐的搅拌转速为30rpm，向提取罐内一次性泵入500L酒精含量为95%的工业酒精，搅拌均匀，然后向提取罐内继续泵入酒精含量为95%的工业酒精，流加速率为10L/min，流加时间为50min；

将上层清液泵出提取罐，进行酒精蒸馏回收，得到沉淀物。

B、第一次脱水

往步骤A)得到的沉淀物(42kg)中加入14L酒精含量为95%的工业酒精，搅拌30min，静置分层；

将上层清液泵出提取罐，进行酒精蒸馏回收，得到沉淀物。

C、第二次脱水

往步骤B)得到的沉淀物(42kg)加入14L酒精含量为95%的工业酒精，搅拌30min，静置分层；

将上清泵入酒精回收罐内，进行酒精蒸馏，得到沉淀物；

将所述沉淀从提取罐中转出后，铺膜风干，采用常压干燥法测定水含量为13%，即得到γ-PGA制品，采用凝胶色谱测定γ-PGA的纯度为91.5%。

实施例4：使用1吨γ-PGA提取罐提取γ-PGA

其实施步骤如下：

A、乙醇溶液提取

将γ-PGA的微生物发酵液250kg泵入到1吨提取罐内，采用本说明书中描述的方法测定该发酵液中γ-PGA含量为3.9%，该发酵液的pH值为7.2，该发酵液的粘度为7000mPa.s。，。

提取罐的搅拌转速为30rpm，向提取罐内一次性泵入125L酒精含量为95%的工业酒精，搅拌均匀，然后向提取罐内继续泵入酒精含量为95%的工业酒精，流加速率为10L/min，流加时间为12.5min；

将上层清液泵出提取罐，进行酒精蒸馏回收，得到沉淀物。

B、第一次脱水

往步骤A)得到的沉淀物(40kg)中加入20L酒精含量为95%的工业酒精，搅拌30min，静置分层；

将上层清液泵出提取罐，进行酒精蒸馏回收，得到沉淀物。

C、第二次脱水

往步骤B)得到的沉淀物(40kg)加入20L酒精含量为95%的工业酒精，搅拌30min，静置分层；

将上清泵入酒精回收罐内，进行酒精蒸馏，得到沉淀物；

将所述沉淀从提取罐中转出后，铺膜风干，采用常压干燥法方法测定水含量为13%，即得到γ-PGA制品，采用凝胶色谱测定γ-PGA的纯度为90.5%。

Claims

1.一种以工业规模提取聚谷氨酸的方法，其特征在于该方法的步骤如下：

A、乙醇溶液提取

B、第一次脱水

C、第二次脱水

所述乙醇水溶液的浓度是以乙醇体积计92%以上。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于含有γ-PGA的发酵液是采用微生物发酵方法制备的含有以重量计3.5-4.0%γ-PGA的发酵液。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于在步骤A)，所述的乙醇水溶液全部以流加方式加到含有γ-PGA的发酵液中，或者所述的乙醇水溶液以其总体积的2/3一次性加到含有γ-PGA的发酵液中，余下的1/3再以流加方式加到含有γ-PGA的发酵液中。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于在步骤A)，乙醇水溶液流加流速是每分钟为1-5%所述发酵液重量。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于在步骤A)，乙醇水溶液流加流速是每分钟为2.5-3.2%所述发酵液重量。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述静置的时间是20-60min。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述静置的时间是30-35min。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的干燥是在室温下自然干燥。