CN107828675B - 一株可耐受高浓度谷氨酸钠和葡萄糖产γ-聚谷氨酸的贝莱斯芽孢杆菌 - Google Patents

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Abstract

一株可耐受高浓度谷氨酸钠和葡萄糖产γ‑聚谷氨酸的贝莱斯芽孢杆菌，该菌株命名为Bacillus velezensis Z3，该菌株于2017年5月22日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物保藏管理中心，保藏号为CGMCC14180。本发明的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)，其在高浓度底物条件下不影响细胞生长和γ‑PGA的合成，可在发酵合成γ‑PGA时提高初始葡萄糖和谷氨酸钠的浓度，减少在细胞生长旺盛阶段的补料环节，从而避免发酵过程中由于补料造成的染菌。

Description

一株可耐受高浓度谷氨酸钠和葡萄糖产γ-聚谷氨酸的贝莱 斯芽孢杆菌
技术领域 本发明涉及一种微生物。
背景技术
γ-聚谷氨酸(γ-Polyglutamic acid，γ-PGA)，是一种由微生物合成的、由D-谷氨酸和L-谷氨酸通过γ-氨酰键聚合而成的高分子水溶性均聚物，其结构式如下：
Figure GDA0002620542060000011
γ-PGA具有良好的水溶性、吸附性和生物可降解性，可广泛应用于农业、环保、沙漠治理、食品和医药等领域。
目前文献已报道可产生γ-PGA的微生物有枯草芽孢杆菌，巨大芽孢杆菌，解淀粉芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌等，其合成的γ-PGA分子量在10-1000KDa之间，聚合度为500-5000。γ-PGA发酵的碳源多为葡萄糖和蔗糖，氮源多为谷氨酸钠，文献中报道产γ-PGA时的葡萄糖和谷氨酸的浓度分别为20-60g/L和20-80g/L，80g/L的葡萄糖浓度已抑制了细胞的生长和γ-PGA的合成(缪静等碳源对γ-聚谷氨酸发酵的影响，中国酿造，2010(3)216：70-72)，底物浓度过高导致渗透压较高，影响细胞的生长和代谢产物的合成。通常，γ-PGA的发酵采取补料发酵方式，可使得细胞处在最适底物浓度合成γ-PGA；但是补料会带来染菌的风险，造成发酵的失败。
发明内容 本发明的目的是提供一株能够耐受高浓度谷氨酸钠和葡萄糖并在限定的高浓度葡萄糖和谷氨酸浓度下，不影响细胞生长和γ-PGA合成的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)以及B.velezensis在高浓度谷氨酸钠和葡萄糖条件下产γ-PGA的方法。
本发明是通过以下技术方案实现的。
本发明提供的一株B.velezensis，已于2017年5月22日在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号为CGMCC14180。
1、本发明所述的B.velezensis是从黑龙江大兴安林林区土样分离得到的，其分离、鉴定步骤如下：
本发明土样采自黑龙江大兴安岭林区，取土样后由无菌取样袋带回，称取1g土样加入到50ml无菌水中(50ml无菌水中加入15颗直径为的6mm玻璃珠以充分打散土壤团粒释放土壤中的微生物)，180rpm振荡20min。将振荡的样品静置5min后取上清，将上清转移至2ml灭菌离心管中，将离心管置于75℃水浴中热激处理10min，将热激后的溶液逐级梯度稀释至10-7，取100ul涂布于葡萄糖-谷氨酸固体平板上(SGG固体培养基)，SGG固体培养基配方为：葡萄糖20g/L，谷氨酸钠20g/L，酵母浸膏粉1g/L，磷酸氢二钠1g/L，磷酸二氢钠6g/L，硫酸镁0.5g/L，硫酸锰0.01g/L，琼脂粉20g/L，pH6.8，32℃培养48h，选取每个平板上生长50-100个单菌落的稀释梯度的平板，用牙签挑取16个具有粘性的菌落，三段划线纯化菌落。将纯化后的16个菌落接种于葡萄糖-谷氨酸液体培养基中(简称SGG液体培养基)，SGG液体培养基配方为：葡萄糖20g/L，谷氨酸钠20g/L，酵母浸膏粉1g/L，磷酸氢二钠1g/L，磷酸二氢钠6g/L，硫酸镁0.5g/L，硫酸锰0.01g/L，pH6.8，32℃180rpm振荡培养65h，对粘性最大的3#产生的代谢产物采用溴化十六烷三甲基铵(CTAB)方法进行测定。CTAB法测定γ-PGA的产量：准确取2mlγ-PGA标准液(浓度分别为0mg/L，12mg/L，18mg/L,24mg/L，30mg/L，36mg/L)试管中，准确加入2ml10％的溴化十六烷三甲基铵(CTAB)试液，充分振荡后静置3min，然后将反应液倒入石英比色杯中，3min时测定波长在250nm下的吸光度，建立γ-PGA的标准曲线，其回归方程为：Y(γ-PGA含量mg/L)＝44.813x+0.8982(R2＝0.9971，公式中x为γ-PGA标准曲线制作溶液在250nm测定的吸光值)；然后含有γ-PGA的发酵液用蒸馏水稀释200倍，准确量取2ml稀释液于试管中，准确加入2ml10％的溴化十六烷三甲基铵(CTAB)试液，充分振荡后静置3min，然后将反应液倒入石英比色杯中，3min时测定波长在250nm下的吸光度，测得γ-PGA筛选菌株3#在SGG液体培养基中产生的γ-PGA的200倍稀释液的OD250值为0.239，计算得到γ-PGA产量为2.2g/L，初步确定分离的3#菌株为γ-PGA产生菌株。
将该菌株在SGG液体培养基中培养，32℃180rpm，培养24h，10000g离心收集菌体，按照Tiangen细菌DNA提取试剂盒方法提取3#总DNA，并进行PCR扩增16S rDNA，扩增使用的引物分别为：
正向引物27F：AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG；
反向引物1492r：TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T
PCR反应体系：DNA模板1μl、2×MastarMix10μl、27F 1μl、1492R 1μl，超纯水补足至20μl。
PCR扩增程序：
预变性：94℃5min
扩增：94℃1min，55℃1min,72℃10min(共30个循环)
延伸：72℃10min
扩增产物经0.7％琼脂糖凝胶电泳检测其序列约1400bp，如图1所示，将扩增的16SrDNA送至北京三博远志测序；测序结果拼接后在NCBI网站www.ncbi.nlm.nih.gov进行序列比对，并利用MEGA6.0建立该菌株的系统进化树，如图2所示，确定该菌株为贝莱斯芽孢杆菌，并命名为Bacillus velezensis Z3，将该菌株保存至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC14180。
B.velezensis Z3具有以下生物学特征：
1)形态特征
革兰氏染色后采用光学显微镜镜检为革兰氏阳性、短杆状、能产生芽孢，营养体大小为(0.6-1.0)×1-2μm。在LB固体平板培养基上30℃恒温培养20-24h，菌落中等大小，不透明，呈乳白色，表面干燥。
2)生理生化特征
菌株可利用葡萄糖、甘露糖、麦芽糖、淀粉，甲基红、V-P实验呈现阴性，接触酶阳性，氧化酶阳性。
2、B.velezensis Z3的应用，即在高浓度底物浓度下产γ-PGA的方法，具体如下：
1)接种：将B.velezensis Z3接种在LB固体培养基上，32-37℃培养24-30h，其中LB固体培养基配方为：酵母浸膏粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L,琼脂20g/L,pH7.2。
2)种子培养：挑取单菌落接种到100ml SGG液体培养基中，SGG液体培养基配方为：葡萄糖20g/L，谷氨酸钠20g/L，酵母浸膏粉1g/L，磷酸氢二钠1g/L，磷酸二氢钠6g/L，硫酸镁0.5g/L，硫酸锰0.01g/L，pH6.8，接种后32℃180rpm培养20-24h至对数生长期；按照2％接种量将上述对数期培养物转接至100ml SGG液体培养基中，32℃180rpm振荡培养16-20h进行种子的二次活化，得到γ-PGA发酵培养的种子；
3)发酵培养：按照1-3％接种量将二次活化的B.velezensis Z3种子接种到γ-PGA发酵培养基(FGG)中，FGG发酵培养基为：葡萄糖40-120g/L，谷氨酸钠100-250g/L，酵母浸膏粉1g/L，磷酸氢二钠1g/L，磷酸二氢钠6g/L，硫酸镁0.5g/L，硫酸锰0.01g/L，pH6.8-7.5，接种后32-37℃180rpm发酵培养60-65h，得到含有γ-PGA的发酵液。
4)CTAB法测定γ-PGA的产量：准确取2mlγ-PGA标准液或样液于试管中，准确加入2ml 10％的溴化十六烷三甲基铵(CTAB)试液，充分振荡后静置3min，然后将反应液倒入石英比色杯中，3min时测定波长在250nm下的吸光度；CTAB法测定γ-PGA的标准曲线的回归方程为：Y(γ-PGA含量mg/L)＝44.813x+0.8982(R2＝0.9971，公式中x为γ-PGA标准曲线制作溶液在250nm测定的吸光值)；将含有γ-PGA的发酵液稀释200倍后，按照上述过程测定稀释后样品的OD250值，将测定得到的OD250吸光值带入到上述γ-PGA标准曲线计算得到稀释样品中γ-PGA含量，再乘以样品的稀释倍数即为γ-PGA的产量(g/L)。
本发明与现有技术相比具有如下优点：
本发明提供的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)，其在高浓度底物条件下不影响细胞生长和γ-PGA的合成，可在发酵合成γ-PGA时提高初始葡萄糖和谷氨酸钠的浓度，减少在细胞生长旺盛阶段的补料环节，从而避免发酵过程中由于补料造成的染菌。
附图说明
图1是本发明Bacillus velezensis Z3 16S rDNA扩增电泳图。
图2是本发明Bacillus velezensis Z3系统进化树图。
具体实施方式
实施例1
本发明土样采自黑龙江大兴安岭林区，取土样后由无菌取样袋带回，称取1g土样加入到50ml无菌水中(50ml无菌水中加入15颗直径为的6mm玻璃珠以充分打散土壤团粒释放土壤中的微生物)，180rpm振荡20min。将振荡的样品静置5min后取上清，将上清转移至2ml灭菌离心管中，将离心管置于75℃水浴中热激处理10min，将热激后的溶液逐级梯度稀释至10-7，取100ul涂布于葡萄糖-谷氨酸固体平板上(SGG固体培养基)，SGG固体培养基配方为：葡萄糖20g/L，谷氨酸钠20g/L，酵母浸膏粉1g/L，磷酸氢二钠1g/L，磷酸二氢钠6g/L，硫酸镁0.5g/L，硫酸锰0.01g/L，琼脂粉20g/L，pH6.8，32℃培养48h，选取每个平板上生长50-100个单菌落的稀释梯度的平板，用牙签挑取16个具有粘性的菌落，三段划线纯化菌落。将纯化后的16个菌落接种于葡萄糖-谷氨酸液体培养基中(简称SGG液体培养基)，SGG液体培养基配方为：葡萄糖20g/L，谷氨酸钠20g/L，酵母浸膏粉1g/L，磷酸氢二钠1g/L，磷酸二氢钠6g/L，硫酸镁0.5g/L，硫酸锰0.01g/L，pH6.8，32℃180rpm振荡培养65h，对粘性最大的3#产生的代谢产物采用溴化十六烷三甲基铵(CTAB)方法进行测定。CTAB法测定γ-PGA的产量：准确取2mlγ-PGA标准液(浓度分别为0mg/L，12mg/L，18mg/L,24mg/L，30mg/L，36mg/L)试管中，准确加入2ml10％的溴化十六烷三甲基铵(CTAB)试液，充分振荡后静置3min，然后将反应液倒入石英比色杯中，3min时测定波长在250nm下的吸光度，建立γ-PGA的标准曲线，其回归方程为：Y(γ-PGA含量mg/L)＝44.813x+0.8982(R2＝0.9971，公式中x为γ-PGA标准曲线制作溶液在250nm测定的吸光值)；然后含有γ-PGA的发酵液用蒸馏水稀释200倍，准确量取2ml稀释液于试管中，准确加入2ml10％的溴化十六烷三甲基铵(CTAB)试液，充分振荡后静置3min，然后将反应液倒入石英比色杯中，3min时测定波长在250nm下的吸光度，测得γ-PGA筛选菌株3#在SGG液体培养基中产生的γ-PGA的200倍稀释液的OD250值为0.239，计算得到γ-PGA产量为2.2g/L，初步确定分离的3#菌株为γ-PGA产生菌株。将该菌株在SGG液体培养基中培养，32℃180rpm，培养24h，10000g离心收集菌体，按照Tiangen细菌DNA提取试剂盒方法提取3#总DNA，并进行PCR扩增16S rDNA，扩增使用的引物分别为：
正向引物27F：AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG；
反向引物1492r：TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T
PCR反应体系：DNA模板1μl、2×MastarMix10μl、27F 1μl、1492R 1μl，超纯水补足至20μl。
PCR扩增程序：
预变性：94℃5min
扩增：94℃1min，55℃1min,72℃10min(共30个循环)
延伸：72℃10min
扩增产物经0.7％琼脂糖凝胶电泳检测其序列约1400bp，如图1所示，将扩增的16SrDNA送至北京三博远志测序；测序结果拼接后在NCBI网站www.ncbi.nlm.nih.gov进行序列比对，并利用MEGA6.0建立该菌株的系统进化树，如图2所示，确定该菌株为贝莱斯芽孢杆菌，并命名为Bacillus velezensis Z3，将该菌株保存至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC14180。
B.velezensis Z3具有以下生物学特征：
1)形态特征
革兰氏染色后采用光学显微镜镜检为革兰氏阳性、短杆状、能产生芽孢，营养体大小为(0.6-1.0)×1-2μm。在LB固体平板培养基上30℃恒温培养20-24h，菌落中等大小，不透明，呈乳白色，表面干燥。
2)生理生化特征
菌株可利用葡萄糖、甘露糖、麦芽糖、淀粉，甲基红、V-P实验呈现阴性，接触酶阳性，氧化酶阳性。
实施例2
将B.velezensis Z3在LB固体培养基(蛋白胨10g/L，酵母浸膏粉5g/L，氯化钠10g/L,pH7.0)活化，32℃培养30h。挑取单菌落接种至100ml SGG液体培养基中，SGG液体培养基配方为：葡萄糖20g/L，谷氨酸钠20g/L，酵母浸膏粉1g/L，磷酸氢二钠1g/L，磷酸二氢钠6g/L，硫酸镁0.5g/L，硫酸锰0.01g/L，pH6.8，接种后32℃180rpm振荡培养24h至对数生长期。按照2％接种量将上述对数期培养物转接至100ml SGG液体培养基中，32℃180rpm振荡培养16h进行种子的二次活化，得到γ-PGA发酵培养的种子；按照2％接种量将二次活化的B.velezensis Z3种子接种至γ-PGA发酵培养基(FGG培养基)，FGG培养基配方为：葡萄糖40g/L，谷氨酸钠120g/L，酵母浸膏粉1g/L，磷酸氢二钠1g/L，磷酸二氢钠6g/L，硫酸镁0.5g/L，硫酸锰0.01g/L，pH6.8，接种后32℃180rpm振荡培养65h，得到含有γ-PGA的发酵液。
培养结束后，利用722s分光光度计测定细胞生长量，测得OD600为3.19；准确取2mlγ-PGA标准液(浓度分别为0mg/L，12mg/L，18mg/L,24mg/L，30mg/L，36mg/L)于试管中，再准确加入2ml 10％的溴化十六烷三甲基铵(CTAB)试液，充分振荡后静置3min，然后将反应液倒入石英比色杯中，3min时测定波长在250nm下的吸光度，建立γ-PGA的标准曲线，其回归方程为：Y(γ-PGA含量mg/L)＝44.813x+0.8982(R2＝0.9971，公式中x为γ-PGA标准曲线制作溶液在250nm测定的吸光值)；然后将含有γ-PGA的发酵液用蒸馏水稀释200倍，准确量取2ml稀释液于试管中，准确加入2ml 10％的溴化十六烷三甲基铵(CTAB)试液，充分振荡后静置3min，然后将反应液倒入石英比色杯中，3min时测定波长在250nm下的吸光度，测得稀释液的OD250为0.507，通过γ-PGA标准曲线Y(γ-PGA含量mg/L)＝44.813x+0.8982计算Y值为23.29mg/L，再乘以稀释倍数200，得到发酵液中γ-PGA含量为4.66g/L。
实施例3
将B.velezensis Z3在LB固体培养基(蛋白胨10g/L，酵母浸膏粉5g/L，氯化钠10g/L,pH7.0)活化，37℃培养24h。挑取单菌落接种至100ml SGG液体培养基中，SGG液体培养基配方为：葡萄糖20g/L，谷氨酸钠20g/L，酵母浸膏粉1g/L，磷酸氢二钠1g/L，磷酸二氢钠6g/L，硫酸镁0.5g/L，硫酸锰0.01g/L，pH6.8，接种后32℃180rpm振荡培养20h至对数生长期。按照2％接种量将上述对数期培养物转接至100ml SGG液体培养基中，32℃180rpm振荡培养16h进行种子的二次活化，得到γ-PGA发酵培养的种子；按照1％接种量将二次活化的B.velezensis Z3种子接种至γ-PGA发酵培养基(FGG培养基)，FGG培养基配方为：葡萄糖120g/L，谷氨酸钠120g/L，酵母浸膏粉1g/L，磷酸氢二钠1g/L，磷酸二氢钠6g/L，硫酸镁0.5g/L，硫酸锰0.01g/L，pH7.5，接种后37℃180rpm振荡培养60h，得到含有γ-PGA的发酵液。培养结束后，利用722s分光光度计测定细胞生长量，测得OD600为3.77，γ-PGA产量测量和计算与实施例2相同，测得OD250值为0.441，计算得到γ-PGA的产量为4.06g/L。
实施例4
将B.velezensis Z3在LB固体培养基(蛋白胨10g/L，酵母浸膏粉5g/L，氯化钠10g/L,pH7.0)活化，32℃培养24h。挑取单菌落接种至100ml SGG液体培养基中，SGG液体培养基配方为：葡萄糖20g/L，谷氨酸钠20g/L，酵母浸膏粉1g/L，磷酸氢二钠1g/L，磷酸二氢钠6g/L，硫酸镁0.5g/L，硫酸锰0.01g/L，pH6.8，接种后32℃180rpm振荡培养24h至对数生长期。按照2％接种量将上述对数期培养物转接至100ml SGG液体培养基中，32℃180rpm振荡培养20h进行种子的二次活化，得到γ-PGA发酵培养的种子；按照3％接种量将二次活化的B.velezensis Z3种子接种至γ-PGA发酵培养基(FGG培养基)，FGG培养基配方为：葡萄糖40g/L，谷氨酸钠250g/L，酵母浸膏粉1g/L，磷酸氢二钠1g/L，磷酸二氢钠6g/L，硫酸镁0.5g/L，硫酸锰0.01g/L，pH6.8，接种后32℃180rpm振荡培养65h，得到含有γ-PGA的发酵液。培养结束后，利用722s分光光度计测定细胞生长量，测得OD600为3.79，γ-PGA产量测定和计算与实施例2相同，测得OD250值为0.694，计算得到γ-PGA的产量为6.32g/L。
实施例5
将B.velezensis Z3在LB固体培养基(蛋白胨10g/L，酵母浸膏粉5g/L，氯化钠10g/L,pH7.0)活化，32℃培养24h。挑取单菌落接种至100ml SGG液体培养基中，SGG液体培养基配方为：葡萄糖20g/L，谷氨酸钠20g/L，酵母浸膏粉1g/L，磷酸氢二钠1g/L，磷酸二氢钠6g/L，硫酸镁0.5g/L，硫酸锰0.01g/L，pH6.8，接种后32℃、180rpm振荡培养24h至对数生长期。按照2％接种量将上述对数期培养物转接至100ml SGG液体培养基中，32℃180rpm振荡培养16h进行种子的二次活化，得到γ-PGA发酵培养的种子；按照2％接种量将二次活化种子接种至γ-PGA发酵培养基(FGG培养基)，FGG培养基配方为：葡萄糖45g/L，谷氨酸钠200g/L，酵母浸膏粉1g/L，磷酸氢二钠1g/L，磷酸二氢钠6g/L，硫酸镁0.5g/L，硫酸锰0.01g/L，pH6.8，接种后37℃180rpm振荡培养65h，得到含有γ-PGA的发酵液。培养结束后，利用722s分光光度计测定细胞生长量，测得OD600为3.75，γ-PGA产量测定和计算与实施例2相同，测得OD250值为0.470，计算得到γ-PGA的产量为4.33g/L。
实施例6
将B.velezensis Z3在LB固体培养基(蛋白胨10g/L，酵母浸膏粉5g/L，氯化钠10g/L,pH7.0)活化，32℃培养24h。挑取单菌落接种至100ml SGG液体培养基中，SGG液体培养基配方为：葡萄糖20g/L，谷氨酸钠20g/L，酵母浸膏粉1g/L，磷酸氢二钠1g/L，磷酸二氢钠6g/L，硫酸镁0.5g/L，硫酸锰0.01g/L，pH6.8，接种后32℃180rpm振荡培养24h至对数生长期。按照2％接种量将上述对数期培养物转接至100ml SGG液体培养基中，32℃180rpm振荡培养16h进行种子的二次活化，得到γ-PGA发酵培养的种子；按照2％接种量将二次活化种子接种至γ-PGA发酵培养基(FGG培养基)，FGG培养基配方为：葡萄糖56g/L，谷氨酸钠100g/L，酵母浸膏粉1g/L，磷酸氢二钠1g/L，磷酸二氢钠6g/L，硫酸镁0.5g/L，硫酸锰0.01g/L，pH6.8，接种后37℃180rpm振荡培养60h，培养结束后，利用722s分光光度计测定细胞生长量，测得OD600为5.10，γ-PGA产量测定和计算与实施例2相同，测得OD250值为0.407，计算得到γ-PGA的产量为3.78g/L。
Figure IDA0001522422830000011
Figure IDA0001522422830000021

Claims (3)

1.一株可耐受高浓度谷氨酸钠和葡萄糖产γ-聚谷氨酸的贝莱斯芽孢杆菌，其特征在于：该菌株命名为Bacillus velezensis Z3，该菌株于2017年5月22日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物保藏管理中心，保藏号为CGMCC14180。
2.权利要求1的可耐受高浓度谷氨酸钠和葡萄糖产γ-聚谷氨酸的贝莱斯芽孢杆菌在高浓度底物浓度下产γ-PGA的方法，其特征在于：
1)接种：将B.velezensis Z3接种在LB固体培养基上，32-37℃培养24-30h；
2)种子培养：挑取单菌落接种到100ml SGG液体培养基中，SGG液体培养基配方为：葡萄糖20g/L，谷氨酸钠20g/L，酵母浸膏粉1g/L，磷酸氢二钠1g/L，磷酸二氢钠6g/L，硫酸镁0.5g/L，硫酸锰0.01g/L，pH为6.8；接种后32℃180rpm培养20-24h至对数生长期；按照2％接种量将上述对数期培养物转接至100ml SGG液体培养基中，32℃180rpm振荡培养16-20h进行种子的二次活化，得到γ-PGA发酵培养的种子；
3)发酵培养：按照1-3％接种量将二次活化的B.velezensis Z3种子接种到γ-PGA发酵培养基FGG中，FGG发酵培养基为：葡萄糖40-120g/L，谷氨酸钠100-250g/L，酵母浸膏粉1g/L，磷酸氢二钠1g/L，磷酸二氢钠6g/L，硫酸镁0.5g/L，硫酸锰0.01g/L，pH6.8-7.5，接种后32-37℃180rpm发酵培养60-65h，得到含有γ-PGA的发酵液。
3.根据权利要求1所述的可耐受高浓度谷氨酸钠和葡萄糖产γ-聚谷氨酸的贝莱斯芽孢杆菌在高浓度底物浓度下测定γ-PGA的方法，其特征在于：CTAB法测定γ-PGA的产量：准确取2mlγ-PGA标准液于试管中，γ-PGA标准液的浓度分别为0mg/L，12mg/L，18mg/L,24mg/L，30mg/L，36mg/L，准确加入2ml 10％的溴化十六烷三甲基铵试液，溴化十六烷三甲基铵简称为CTAB，充分振荡后静置3min，然后将反应液倒入石英比色杯中，3min时测定波长在250nm下的吸光度；CTAB法测定γ-PGA的标准曲线的回归方程为：Y＝44.813x+0.8982，式中Y表示γ-PGA含量，单位是mg/L，公式中x为γ-PGA标准曲线制作溶液在250nm测定的吸光值，该回归方程的R2为0.9971；将含有γ-PGA的发酵液稀释200倍后，按照上述过程测定稀释后样品的OD250值，将测定得到的OD250吸光值带入到上述γ-PGA标准曲线计算得到稀释样品中γ-PGA含量，再乘以样品的稀释倍数即为γ-PGA的产量，产量单位按g/L计。
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