CN104694437A - 一株地衣芽孢杆菌及其在生产γ-聚谷氨酸中的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一株地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)LW及其在生产γ-聚谷氨酸中的用途。γ-聚谷氨酸生产方法包括活化培养、种子培养、发酵培养、提取与纯化等步骤。本发明通过简单改变发酵碳源可以合成得到两种不同分子量的γ-PGA，且不需要严格控制其他发酵条件，例如通气量和搅拌速率等。本发明制备方法简单，条件易于控制。
Description
【技术领域】
本发明属于微生物技术领域，更具体地，本发明涉及一株地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)LW，还涉及所述地衣芽孢杆菌在生产γ-聚谷氨酸中的用途。
【背景技术】
γ-聚谷氨酸(γ-Polyglutamic acid，γ-PGA)，是一种可由微生物合成的氨基酸聚合物，它由D-谷氨酸和L-谷氨酸通过γ-氨酰键聚合而成，具有如下化学结构式，它的相对分子量一般是10～1000KDa。
γ-PGA是一种水溶性的高分子聚合物，具有良好的水溶性、超强吸附性和生物可降解性，是一种优质的环保型高分子材料，可作为保水剂、重金属离子吸附剂、絮凝剂、缓释剂及药物载体，在农业、环保、沙漠治理、食品和医药等领域具有广泛的应用前景。
目前文献报道的γ-PGA产生菌大多为芽孢杆菌，例如枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、炭疽芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌等，合成的γ-PGA分子量是10～1000KDa。不同分量的γ-PGA可应用于不同的领域，作为用于缓释药物载体的γ-PGA，要求γ-PGA分子量范围为4～8×104Da；作为用于食品抗冻剂和风味剂的γ-PGA，要求γ-PGA分子量低于2×104Da，而作为用于絮凝剂、吸水材料和增稠剂的γ-PGA，要求γ-PGA分子量较高，为8～10×106Da。曾报道(Goto，Biosynthesis and hydrolysis of poly-glutamic acidfrom Bacillus subtilis IFO3355，1992)，Bacillus subtilis IFO3335在利用甘油和柠檬酸为碳源时合成得到分子量为1.5×106Da的γ-PGA分子，如果改变其发酵条件，合成的γ-PGA分子量及立体异构体没有变化。还曾报道(Jeong,The statistically optimized production of polyglutamic acid bybatch fermentation of a newly isolated Bacillus subtilis RKY3,2010)，B.subtilis RKY3利用甘油为碳源时能够合成分子量为6.2×104Da的γ-PGA，还曾报道(Ito,Glutamic acid independent production of poly-glutamic acidby Bacillus subtilis TAM-4,1996)，B.subtilis TAM-4利用葡萄糖作为碳源时合成的γ-PGA分子量随培养时间而变化；刘常金等(纳豆芽孢杆菌液体发酵生产聚谷氨酸，2009)对纳豆芽孢杆菌产生γ-PGA的研究表明，该菌株利用葡萄糖为碳源合成多分子量混合体，需要将γ-PGA降解到一定分子量范围内能够满足不同的应用需求。许多研究表明一种微生物合成的γ-PGA常为多分子混合体或分子量随发酵时间变化而变化，因此，通常需要严格控制发酵时间或其它条件才能够获得具有一定分子量的γ-PGA。
本发明人研究发现，在利用地衣芽孢杆菌合成γ-PGA时，使用一种碳源可以获得一种分子量的γ-PGA，因此，通过简单改变发酵碳源可以合成得到不同分子量的γ-PGA，且不需要严格控制其他发酵条件，例如通气量、搅拌速率和发酵时间。
【发明内容】
[要解决的技术问题]
本发明的目的是提供一株地衣芽孢杆菌。
本发明的另一个目的是提供所述株地衣芽孢杆菌的用途。
[技术方案]
本发明是通过下述技术方案实现的。
本发明涉及一株地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis，B.licheniformis)LW，该菌株已于2014年2月17日在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号为CGMCC No.8821。
本发明还涉及所述的地衣芽孢杆菌LW在生产γ-聚谷氨酸中的用途。
所述γ-聚谷氨酸生产方法的步骤如下：
A、活化培养
将冷冻保存的地衣芽孢杆菌LW菌株挑取一环接种到LB固体培养基上，然后在温度30～37℃的条件下恒温培养至菌落直径2-2.5mm，得到所述菌株活化培养物；
B、种子培养
将步骤A得到的活化培养物挑取一环接种到液体种子培养基中，然后在温度30～37℃的条件下恒温震荡培养至该菌株对数生长期，得到产γ-PGA的地衣芽孢杆菌LW种子液；
C、发酵培养
按照以发酵培养基体积计1％～5％接种量，将步骤B得到的地衣芽孢杆菌LW种子液接种到发酵培养基中，然后在温度30～37℃与通气量0.5～1.0vvm的条件下培养20～48h，得到含有γ-PGA的发酵液；
所述发酵培养基制备方法如下：制备含有40～80g/L葡萄糖碳源、3～6g/L一种或多种选自蛋白胨、酵母浸粉或牛肉膏的有机氮源、2～4g/L硫酸铵或氯化铵无机氮源、30～50g/L味精、5～10g/L磷酸氢二钾、1～2g/L磷酸二氢钾、0.5g/L硫酸镁与0.03g/L硫酸锰的混合物水溶液，将其水溶液的pH调节至6.5～7.5，再在温度121℃下灭菌15-20min，得到所述的发酵培养基；
D、提取与纯化
将步骤C得到的含有γ-PGA的发酵液调节至pH 2～4，在转速12000rpm的条件下离心分离10min，分离得到上清液，将其pH调节至5.0～7.5，并加入为上清液体积2.5～4.0倍的以体积计95％乙醇水溶液，搅拌静置，收集沉淀，接着用蒸馏水溶解，在室温条件下使用截留分子量50000的透析袋透析处理40～48h，再往得到的透析液中加入所述透析液体积的2.5～4.0倍的95％乙醇水溶液进行沉淀，分离的沉淀物于烘箱中在温度55℃下烘干至恒重，测定得到粘均分子量为1.9×105Da的γ-PGA。
根据本发明的一种优选实施方式，在步骤A中，所述LB固体培养基制备方法如下：首先制备含有10g/L蛋白胨、5g/L酵母浸膏粉、10g/L氯化钠与20g/L琼脂的混合物水溶液，再在温度121℃下灭菌15-20min，得到所述的培养基。
根据本发明的另一种优选实施方式，在步骤B中，所述液体种子培养基制备方法如下：首先制备含有18～22g/L葡萄糖、2～4g/L蛋白胨、2～4g/L酵母浸膏粉、2～4g/L硫酸铵或氯化铵、8～12g/L磷酸氢二钾、0.8～1.2g/L磷酸二氢钾、0.4～0.6g/L硫酸镁、0.02～0.04g/L硫酸锰与8～12g/L味精的混合物水溶液，将其水溶液的pH调节至6.5～7.5，再在温度121℃下灭菌15-20min，得到所述的种子培养基。
根据本发明的另一种优选实施方式，在步骤C中，所述的发酵培养基用糖蜜代替葡萄糖作为碳源时，得到粘均分子量为5.4×105Da的γ-PGA固体产物。
根据本发明的另一种优选实施方式，所述水溶液的pH是使用1～3mol/L硫酸、盐酸、氢氧化钠或氢氧化钾水溶液调节的。
根据本发明的另一种优选实施方式，在步骤D中，含有γ-PGA的发酵液的pH是使用浓度为1～3mol/L盐酸水溶液调节的。
根据本发明的另一种优选实施方式，在步骤D中，离心分离上清液是使用浓度为5～10mol/L氢氧化钠水溶液调节的。
根据本发明的另一种优选实施方式，采用CTAB法检测γ-PGA产量为38～45g/L。
下面将更详细地描述本发明。
本发明涉及一株地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis，B.licheniformis)LW，该菌株已于2014年2月17日在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号为CGMCC No.8821。
本发明的菌株是从制糖厂附近土壤中分离得到的，其步骤如下：
1、将采集的土壤加无菌水溶解后在温度75～80℃下进行热激处理，收集的热激处理溶液进行梯度稀释，并将其涂布到含有葡萄糖的GG固体培养基上，所述的培养基含有20g/L葡萄糖、10g/L味精、3g/L酵母浸粉、0.1g/L氯化钙、3g/L磷酸二氢钾与20g/L琼脂，pH6.8～7.0，在温度30℃下培养至菌落2mm，用灭菌牙签挑取仅具有粘性的菌落，稀释于1ml无菌水中，并通过稀释涂布的方式进行菌株的纯化，待长出单菌落后，将具有粘性的单菌落接种于种子培养基中，所述的培养基含有20g/L葡萄糖、3g/L蛋白胨、3g/L酵母浸粉、3g/L硫酸铵、10g/L磷酸氢二钾、1g/L磷酸二氢钾、0.5g/L硫酸镁、0.03g/L硫酸锰与10g/L味精，pH6.5～7.5，在温度30～37℃与180rpm的条件下震荡培养至对数生长期作为发酵所需要的种子。
2、发酵：按照以发酵培养基体积计1％的接种量将前面得到的发酵种子液接种至50L发酵罐中，在温度30～37℃、转速400～600rpm与通气量0.5～1.0vvm的条件下发酵培养20～48h。所述发酵培养基含有40～80g/L碳源、3～6g/L有机氮源、30～50g/L味精、6～12g/L磷酸盐、0.5g/L硫酸镁与0.03g/L硫酸锰，pH6.5～7.5；
3、γ-PGA提取：将前面得到的发酵液的pH调节至2～4，然后在转速12000rpm的条件下离心10min，将得到的上清液的pH调节至5.0～7.5，再使用为上清液体积2.5～4.0倍的95体积％乙醇水溶液进行沉淀，收集沉淀，用蒸馏水溶解，在室温条件下使用截留分子量50000的透析袋透析处理40～48h，再次使用为透析液体积2.5～4.0倍的95体积％乙醇水溶液进行沉淀，得到的沉淀于烘箱中在温度55℃下烘干至恒重，并对烘干的产物进行氨基酸组成鉴定分析，该产物用6mol/L HCl在温度110℃与氮气保护的条件下水解22h，然后使用氨基酸分析仪进行检测确定，进样量为20μl，附图1中VIS1为烘干至恒重的产物水解后氨基酸分析仪测定的曲线，VIS2为谷氨酸标准品测定曲线，水解后进样测定的物质与标准品谷氨酸的保留时间一致，且水解后测定的物质无其他氨基酸成分，表明烘干至恒重的物质的组成仅单一的谷氨酸(附图1)，该分离的菌株产生的代谢产物为γ-PGA。
4、菌株鉴定：分离纯化得到的可产生γ-PGA的菌株进行生物学鉴定。在革兰氏染色后采用光学显微镜镜检为革兰氏阳性、杆状、能产生芽孢，营养体大小为(0.6～1.0)×1.2～2.5μm；并将该菌株接种于LB培养基(含有10g/L蛋白胨、5g/L酵母浸膏粉与10g/L氯化钠)中，在温度30～37℃下收集菌体，采用常规细菌DNA方法提取总DNA，并进行PCR扩增16srDNA。
PCR引物如下：
正向引物27F：AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG；
反向引物1492r：TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T
PCR反应体系：20μl反应体系，反应液组成：1μl DNA模板、10μl2×MastarMix、0.4μl 27F、0.4μl 1492R，超纯水补足至20μl。
PCR扩增程序：在温度94℃下2min；30个循环(在温度94℃时1min，在温度52℃时1min，在温度65℃时8min)；在温度65℃时18min。
扩增产物经0.7％琼脂糖凝胶电泳检测正确后测序，测序结果利用blast软件，进行同源性比对，该菌株与地衣芽孢杆菌的同源性为99％(16srDNA序列见附录)，结合菌落特征、菌体形态特征及分子生物学特性，从而鉴定该菌为地衣芽孢杆菌，并命名为B.licheniformis LW。该菌株已于2014年2月17日在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号为CGMCC No.8821。
地衣芽孢杆菌LW具有下述生物学特征：
1、形态特征
革兰氏染色后采用光学显微镜镜检为革兰氏阳性、杆状、能产生芽孢，营养体大小为(0.6～1.0)×1.2～2.5μm。
2、生理生化特征
可利用葡萄糖，并能在葡萄糖为碳源的复杂培养基中进行厌氧生长，精氨酸双水解酶为阳性。
本发明涉及所述的地衣芽孢杆菌LW在生产γ-聚谷氨酸中的用途。
使用所述地衣芽孢杆菌LW生产γ-聚谷氨酸的方法步骤如下：
A、活化培养
将冷冻保存的地衣芽孢杆菌LW菌株挑取一环接种到LB固体培养基上，然后在温度30～37℃的条件下恒温培养24～48h，待单菌落生长至2-2.5mm时，得到所述菌株活化培养物。
所述地衣芽孢杆菌LW保存方法与条件如下：取600μl已在LB液体培养基中培养至对数期的地衣芽孢杆菌LW，并与灭菌的20-50％(v/v)等体积混合后，保存于-80℃低温冰箱中。
所述的LB固体培养基制备方法如下：首先制备含有10g/L蛋白胨、5g/L酵母浸膏粉、10g/L氯化钠与20g/L琼脂的混合物水溶液，再在温度121℃下灭菌15-20min，得到所述的培养基。
在制备LB固体培养基时使用的蛋白胨例如是由北京奥博星生物技术有限公司生产的商品名为胰蛋白胨产品；酵母浸膏粉例如是由北京奥博星生物技术有限公司生产的商品名为酵母浸粉的产品；琼脂例如是由北京奥博星生物技术有限公司生产的商品名为琼脂粉的产品。
在这个步骤中，使用的活化培养设备都是目前市场上销售的产品，例如由上海实验仪器厂有限公司生产的恒温培养箱；灭菌所使用的设备是目前市场上销售的产品，例如由江阴滨江医疗设备有限公司生产的手提式压力蒸汽灭菌器或西安常仪仪器设备有限公司的高压灭菌锅产品。
B、种子培养
将步骤A得到的活化培养物挑取一环接种到液体种子培养基中，然后在温度30～37℃的条件下恒温震荡培养至该菌株对数生长期，得到产γ-PGA的地衣芽孢杆菌LW种子液。
所述液体种子培养基制备方法如下：首先制备含有18～22g/L葡萄糖、2～4g/L蛋白胨、2～4g/L酵母浸膏粉、2～4g/L硫酸铵或氯化铵、8～12g/L磷酸氢二钾、0.8～1.2g/L磷酸二氢钾、0.4～0.6g/L硫酸镁、0.02～0.04g/L硫酸锰与8～12g/L味精的混合物水溶液，将其水溶液的pH调节至6.5～7.5，再在温度121℃下灭菌15-20min，得到所述的种子培养基。
在制备LB固体培养基时使用的蛋白胨、酵母浸膏粉、琼脂是如前面所述公司的产品。硫酸铵、氯化铵、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、硫酸镁、硫酸锰与味精都是目前市场上广泛销售的产品。
在这个步骤中，使用无机酸或无机碱调节所述水溶液的pH，例如无机碱是1-3mol/L氢氧化钠或碳酸钠水溶液，无机酸是1-3mol/L硫酸或盐酸水溶液。
在这个步骤中，恒温培养和灭菌所使用的设备是如前面所描述产品。在这个步骤中，在恒温震荡种子培至该菌株对数生长期，振荡培养设备如江苏省太仓市华美生化仪器厂生产的全温度振荡培养箱；检测设备如上海优尼科仪器有限公司的紫外可见分光光度计等，所述种子液含有OD600＝2-3的地衣芽孢杆菌LW。
C、发酵培养
按照以发酵培养基体积计1％～5％接种量，将步骤B得到的地衣芽孢杆菌LW种子液接种到发酵培养基中，然后在温度30～37℃与通气量0.5～1.0vvm的条件下培养20～48h，得到含有γ-PGA的发酵液。
所述发酵培养基制备方法如下：制备含有40～80g/L葡萄糖碳源、3～6g/L一种或多种选自蛋白胨、酵母浸粉或牛肉膏的有机氮源、2～4g/L硫酸铵或氯化铵无机氮源、30～50g/L味精、5～10g/L磷酸氢二钾、1～2g/L磷酸二氢钾、0.5g/L硫酸镁与0.03g/L硫酸锰的混合物水溶液，将其水溶液的pH调节至6.5～7.5，再在温度121℃下灭菌30min，得到所述的发酵培养基；
在制备发酵培养基时使用的蛋白胨、酵母浸膏粉等是如前面所述公司的产品。葡萄糖、硫酸铵、氯化铵、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、硫酸镁、硫酸锰与味精等都是目前市场上广泛销售的产品。
在这个步骤中，使用无机酸或无机碱调节所述水溶液的pH，例如无机酸是1-3mol/L氢氧化钠或碳酸钠水溶液，无机碱是1-3mol/硫酸或盐酸水溶液。
在这个步骤中，灭菌所使用的设备是如前面所描述产品。
在这个步骤中，使用的培养设备都是目前市场上销售的产品，例如由上海国强生化装备有限公司或镇江格瑞生物工程有限公司等销售的自动控制搅拌式发酵罐。
在这个步骤中，在发酵培养20～48h时，采用CTAB方法与使用由尤尼柯(上海)仪器有限公司的紫外可见分光光度计测定发酵液中含有聚谷氨酸含量趋于稳定产量不再增加。
D、提取与纯化
将步骤C得到的含有γ-PGA的发酵液调节至pH 2～4，在转速12000rpm的条件下离心分离10min，分离得到上清液，将其pH调节至5.0～7.5，并加入为上清液体积2.5～4.0倍的以体积计95％乙醇水溶液，搅拌静置，收集沉淀，接着用蒸馏水溶解，在室温条件下使用截留分子量50000的透析袋透析处理40～48h，再往得到的透析液中加入所述透析液体积的2.5～4.0倍的95％乙醇水溶液进行沉淀，分离的沉淀物于烘箱中在温度55℃下烘干至恒重，得到粘均分子量为1.9×105Da的γ-PGA固体产物。
在这个步骤中，含有γ-PGA的发酵液的pH是使用浓度为1～3mol/L盐酸水溶液调节的。离心分离上清液是使用浓度为5～10mol/L氢氧化钠水溶液调节的。
在这个步骤中，使用的离心分离设备都是目前市场上销售的产品，例如由Sigma公司台式冷冻离心机等常规高速离心机。
透析需要使用半透膜即可完成。通常是将半透膜制成袋状，将生物大分子样品溶液置入袋内，将此透析袋浸入水或缓冲液中，样品溶液中的大分子量生物大分子被截留在袋内，而盐和小分子物质不断扩散透析到袋外，直到袋内外两边的浓度达到平衡为止。保留在透析袋内未透析的样品溶液称为“保留液”，袋(膜)外的溶液称为“渗出液”或“透析液”。
本发明使用的透析袋是目前市场上销售的产品，例如由上海宝曼生物科技有限公司或Spectrumlabs的透析袋。
粘均分子量是采用粘度法测定得到的聚合物分子量。在所有的聚合物分子量的测定方法中，粘度法使用的仪器设备简单，操作便利，分子量适用范围大，实验精确度好，是一种最常用的实验技术。
在本发明中，粘度法使用的仪器是目前市场上销售的产品，例如由上海密通机电科技有限公司或上海笛柏实验设备有限公司的乌氏粘度计。
通过上述分析方法确定，所述的液体种子培养基用糖蜜作为碳源时，采用本发明方法制备产物含有的γ-PGA的粘均分子量为5.4×105Da。
在本发明中，按照与前面描述的相同方法进行实施，只是在步骤C中，所述的液体种子培养基用糖蜜代替葡萄糖作为碳源时，制备产物含有的γ-PGA的粘均分子量为5.4×105Da。
在这个步骤中，采用CTAB法对γ-PGA固体产物测定了γ-PGA含量：
称取2gγ-PGA固体粉末溶解于40ml水中，取1ml该溶液放于10ml离心管中，再加入0.2ml 6mol/L盐酸溶液，摇匀，在转速12000rpm的条件下离心10min。将离心上清转移至另一个离心管中，使用1mol/L氢氧化钠水溶液将该上清液的pH调节至中性，然后加入以上清液体积计3倍无水乙醇，搅拌5-10min，静置2min，在转速12000rpm的条件下离心10min，得到的沉淀物在烘箱中在温度60℃的条件下烘干至恒重，烘干固体以蒸馏水溶解，再定容至50ml，接着稀释25-30倍得到的稀释溶液。
准确移取2ml所述稀释溶液放于试管中，加入2ml CTAB(十六烷 基三甲基溴化铵)溶液，在室温条件下振荡2-3min，静置3min，然后倒入石英比色杯中，使用由优尼科(上海)仪器有限公司紫外可见风光光度计在250nm处测定分光光度值。
另外，分别配置12、18、24、30、36mg/L的聚谷氨酸标准溶液，取2ml标准溶液于试管中，加入2ml CTAB溶液，在室温条件下振荡2-3min，静置3min，然后倒入石英比色杯中，在与前面描述的条件下测定分光光度值，得到聚谷氨酸浓度的标准曲线，曲线方程为y＝44.813+0.8982x(其中y为聚谷氨酸浓度，x为250nm的吸光值)。
根据测定得到的吸光值与聚谷氨酸浓度标准曲线可计算得到聚谷氨酸的产量。
根据粘度法测定采用本发明方法制备固体产物γ-PGA的特性粘度，再根据下述Mark-Houwink方程计算该γ-PGA的分子量：
[η]＝K Mη α
式中：
η是特性粘度；
K与α是马克-霍温克参数，K＝1.84×10-6，α＝1.16。
[有益效果]
本发明的有益效果是：本发明提供了一株地衣芽孢杆菌LW，通过简单改变发酵碳源可以合成得到两种不同分子量的γ-PGA，且不需要严格控制其他发酵条件，例如通气量、搅拌速率和发酵时间。本发明制备方法简单，条件易于控制。
地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis，B.licheniformis)LW已于2014年2月17日在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号为CGMCC No.8821。
【附图说明】
图1是使用本发明地衣芽孢杆菌LW发酵获得产物γ-PGA的氨基酸水解鉴定图；
图2是在使用不同碳源与培养时间的情况下获得产物γ-PGA的电泳图：
泳道1为糖蜜碳源，培养时间24h；泳道2为糖蜜碳源，培养时间48h；
泳道3为葡萄糖碳源，培养时间24h；泳道4为葡萄糖碳源，培养时间48h。
【具体实施方式】
通过下述实施例将能够更好地理解本发明。
实施例1：生产粘均分子量为1.9×105Da的γ-PGA
该实施例的实施步骤如下：
A、活化培养
制备LB固体培养基：首先制备含有10g/L蛋白胨、5g/L酵母浸膏粉、10g/L氯化钠与20g/L琼脂的混合物水溶液，再在温度121℃下灭菌15min，得到所述的培养基。
使用上海实验设备厂有限公司销售的恒温培养箱，将温度-80℃冷冻保存的地衣芽孢杆菌LW菌株挑取一环接种到LB固体培养基上，然后在温度32℃的条件下恒温培养至菌落直径培养直2-2.5mm备用；
B、种子培养
制备液体种子培养基：首先制备含有22g/L葡萄糖、2g/L蛋白胨、3g/L酵母浸膏粉、4g/L硫酸铵、8g/L磷酸氢二钾、1g/L磷酸二氢钾、0.6g/L硫酸镁、0.04g/L硫酸锰与8g/L味精的混合物水溶液，使用浓盐酸或氢氧化钠水溶液将其混合物水溶液的pH调节至6.8，再在温度121℃下灭菌15min，得到所述的种子培养基。
使用由江苏太仓市华美生化仪器厂的全温度振荡培养箱，将步骤A得到的活化培养物挑取一环接种到所述的液体种子培养基中，然后在温度37℃的条件下恒温震荡培养至该菌株对数生长期，得到产γ-PGA的地衣芽孢杆菌LW种子液，按照与前面描述的同样方式检测，所述的种子液含有OD600＝2.6的地衣芽孢杆菌；
C、发酵培养
制备发酵培养基：首先制备含有68g/L葡萄糖碳源、5g/L蛋白胨有机氮源、2g/L硫酸铵无机氮源、50g/L味精、10g/L磷酸氢二钾、2g/L磷酸二氢钾、0.5g/L硫酸镁与0.03g/L硫酸锰的混合物水溶液，使用盐酸或氢氧化钾水溶液将其水溶液的pH调节至7.5，装入50L自动控制发酵罐，装料系数60％，再在温度121℃下灭菌20min，得到所述的发酵培养基。
按照以发酵培养基体积计1％接种量，将步骤B得到的地衣芽孢杆菌LW种子液接种到发酵培养基中，然后在温度32℃与通气量0.8vvm的条件下培养20h，得到含有γ-PGA的发酵液，按照与前面描述的同样方式检测，所述的发酵液含有聚谷氨酸；
D、提取与纯化
使用浓度为1mol/L盐酸水溶液将步骤C得到的含有γ-PGA的发酵液调节至pH 3.3，使用由Sigma公司台式高速离心机在转速12000rpm的条件下离心分离10min，分离得到上清液，使用浓度为8mol/L氢氧化钠水溶液将其上清液pH调节至5.0，并加入为上清液体积3.0倍的以体积计95％乙醇水溶液，搅拌静置，收集沉淀，接着用蒸馏水溶解，在室温条件下使用截留分子量50000的透析袋透析处理46h，再往得到的透析液中加入所述透析液体积的4.0倍的95％乙醇水溶液进行沉淀，分离的沉淀物于烘箱中在温度55℃下烘干至恒重，得到γ-PGA固体产物。
采用在本说明书前面描述的方法测定本实施例γ‐PGA产量41g/L,该γ‐PGA的粘均分子量是1.9×105Da。
实施例2：生产粘均分子量为1.9×105Da的γ-PGA
该实施例的实施步骤如下：
A、活化培养
制备LB固体培养基：首先制备含有10g/L蛋白胨、5g/L酵母浸膏粉、10g/L氯化钠与20g/L琼脂的混合物水溶液，再在温度121℃下灭菌15min，得到所述的培养基。
将在-80℃低温冰箱中冷冻保存的地衣芽孢杆菌LW菌株挑取一环接种到LB固体培养基上，然后在温度32℃的条件下恒温至菌落直径2mm备用；
B、种子培养
制备液体种子培养基：首先制备含有18g/L葡萄糖、3g/L蛋白胨、4g/L酵母浸膏粉、2g/L氯化铵、10g/L磷酸氢二钾、1g/L磷酸二氢钾、0.5g/L硫酸镁、0.03g/L硫酸锰与10g/L味精的混合物水溶液，使用盐酸或氢氧化钠水溶液将其混合物水溶液的pH调节至7.5，再在温度121℃下灭菌15min。
将步骤A得到的活化培养物挑取一环接种到所述的液体种子培养基中，然后在温度32℃的条件下恒温震荡培养该菌株对数生长期，得到产γ-PGA的地衣芽孢杆菌LW种子液，按照与前面描述的同样方式检测，所述的种子液含有OD600＝2.6的地衣芽孢杆菌；
C、发酵培养
制备发酵培养基：首先制备含有40g/L葡萄糖碳源、4g/L酵母浸粉有机氮源、3g/L氯化铵无机氮源、60g/L味精、5g/L磷酸氢二钾、1g/L磷酸二氢钾、0.5g/L硫酸镁与0.03g/L硫酸锰的混合物水溶液，使用盐酸氢氧化钾水溶液将其水溶液的pH调节至7.0，装入50L自动控制发酵罐，装料系数65％，再在温度121℃下灭菌20min。
按照以发酵培养基体积计3％接种量，将步骤B得到的地衣芽孢杆菌LW种子液接种到装有发酵培养基的50L自动发酵罐中，然后在温度32℃与通气量0.8vvm的条件下培养48h，得到含有γ-PGA的发酵液，按照与前面描述的同样方式检测，所述的发酵液含有地衣芽孢杆菌LW所合成的γ-PGA；
D、提取与纯化
使用盐酸水溶液将步骤C得到的含有γ-PGA的发酵液调节至pH 4，使用由Sigma公司台式高速离心机在转速12000rpm的条件下离心分离10min，分离得到上清液，使用浓度为5mol/L氢氧化钠水溶液将其上清液pH调节至6，并加入为上清液体积3.5倍的以体积计95％乙醇水溶液，搅拌静置，收集沉淀，接着用蒸馏水溶解，在室温条件下使用截留分子量50000的透析袋透析处理48h，再往得到的透析液中加入所述透析液体积的4.0倍的95％乙醇水溶液进行沉淀，分离的沉淀物于烘箱中在温度55℃下烘干至恒重，得到γ-PGA固体产物。
按照与实施例1描述的相同方法测定本实施例制备的γ‐PGA产量为44g/L；该γ‐PGA的粘均分子量是1.9×105Da。
实施例3：生产粘均分子量为1.9×105Da的γ-PGA
该实施例的实施步骤如下：
A、活化培养
制备LB固体培养基：首先制备含有10g/L蛋白胨、5g/L酵母浸膏粉、10g/L氯化钠与20g/L琼脂的混合物水溶液，再在温度121℃下灭菌15min，得到所述的培养基。
将在-80℃低温冰箱中冷冻保存的地衣芽孢杆菌LW菌株挑取一环接种到LB固体培养基上，然后在温度32℃的条件下恒温至菌落直径2mm备用；
B、种子培养
制备液体种子培养基：首先制备含有18g/L葡萄糖、3g/L蛋白胨、4g/L酵母浸膏粉、2g/L氯化铵、10g/L磷酸氢二钾、1g/L磷酸二氢钾、0.5g/L硫酸镁、0.03g/L硫酸锰与10g/L味精的混合物水溶液，使用盐酸或氢氧化钠水溶液将其混合物水溶液的pH调节至7.5，再在温度121℃下灭菌20min。
将步骤A得到的活化培养物挑取一环接种到所述的液体种子培养基中，然后在温度32℃的条件下恒温震荡培养该菌株对数生长期，得到产γ-PGA的地衣芽孢杆菌LW种子液，按照与前面描述的同样方式检测，所述的种子液含有OD600＝3.0的地衣芽孢杆菌；
C、发酵培养
制备发酵培养基：首先制备含有68g/L葡萄糖碳源、5g/L牛肉膏的有机氮源、2g/L氯化铵无机氮源、48g/L味精、10g/L磷酸氢二钾、2g/L磷酸二氢钾、0.5g/L硫酸镁与0.03g/L硫酸锰的混合物水溶液，使用2mol/L硫酸或氢氧化钾水溶液将其水溶液的pH调节至6.8，装入50L自动控制发酵罐，装料系数65％，再在温度121℃下灭菌20min，得到所述的发酵培养基。
按照以发酵培养基体积计5％接种量，将步骤B得到的地衣芽孢杆菌LW种子液接种到发酵培养基中，然后在温度34℃与通气量0.8vvm的条件下培养38h，得到含有γ-PGA的发酵液，按照与前面描述的同样方式检测，所述的发酵液含有38g/L聚谷氨酸；
D、提取与纯化
使用浓度为3mol/L盐酸水溶液将步骤C得到的含有γ-PGA的发酵液调节至pH 2，使用Sigma台式高速离心机在转速12000rpm的条件下离心分离10min，分离得到上清液，使用浓度为8mol/L氢氧化钠水溶液将其上清液pH调节至6.8，并加入为上清液体积4.0倍的以体积计95％乙醇水溶液，搅拌静置，收集沉淀，接着用蒸馏水溶解，在室温条件下使用截留分子量50000的透析袋透析处理40h，再往得到的透析液中加入所述透析液体积的2.5倍的95％乙醇水溶液进行沉淀，分离的沉淀物于烘箱中在温度55℃下烘干至恒重，得到γ-PGA固体产物。
按照与实施例1描述的相同方法测定本实施例制备的γ‐PGA的粘均分子量是1.9×105Da。
实施例4：生产粘均分子量为1.9×105Da的γ-PGA
该实施例的实施步骤如下：
A、活化培养
制备LB固体培养基：首先制备含有10g/L蛋白胨、5g/L酵母浸膏粉、10g/L氯化钠与20g/L琼脂的混合物水溶液，再在温度121℃下灭菌15min。
将-80℃冷冻保存的地衣芽孢杆菌LW菌株挑取一环接种到LB固体培养基上，然后在温度37℃的条件下恒温培养至菌落2mm备用。
B、种子培养
制备液体种子培养基：首先制备含有20g/L葡萄糖、3g/L蛋白胨、4g/L酵母浸膏粉、3g/L硫酸铵、9g/L磷酸氢二钾、1g/L磷酸二氢钾、0.5g/L硫酸镁、0.03g/L硫酸锰与9.5g/L味精的混合物水溶液，调节pH至7.5，再在温度121℃下灭菌15min。
将步骤A得到的活化培养物挑取一环接种到所述的液体种子培养基中，然后在温度32℃的条件下恒温震荡培养至对数生长期，得到产γ-PGA的地衣芽孢杆菌LW种子液，按照与前面描述的同样方式检测，所述的种子液OD600＝2.9；
C、发酵培养
制备发酵培养基：首先制备含有80g/L葡萄糖碳源、3g/L蛋白胨有机氮源、2.6g/L硫酸铵无机氮源、60g/L味精、8g/L磷酸氢二钾、1g/L磷酸二氢钾、0.5g/L硫酸镁与0.03g/L硫酸锰的混合物水溶液，调剂pH调节7.5，装入50L自动控制发酵罐中，装料系数60％，再在温度121℃下灭菌30min。
按照以发酵培养基体积计4％接种量，将步骤B得到的地衣芽孢杆菌LW种子液接种到发酵培养基中，然后在温度30℃与通气量1.0vvm的条件下培养48h，得到含有γ-PGA的发酵液，按照与前面描述的同样方式检测，所述的发酵液中γ-PGA含量为43g/L；
D、提取与纯化
使用浓度为2mol/L盐酸水溶液将步骤C得到的含有γ-PGA的发酵液调节至pH 2.6，使用Sigma台式高速离心机在转速12000rpm的条件下离心分离10min，分离得到上清液，使用浓度为10mol/L氢氧化钠水溶液将其上清液pH调节至7.5，并加入为上清液体积2.5倍的以体积计95％乙醇水溶液，搅拌静置，收集沉淀，接着用蒸馏水溶解，在室温条件下使用截留分子量50000的透析袋透析处理46h，再往得到的透析液中加入所述透析液体积的4.0倍的95％乙醇水溶液进行沉淀，分离的沉淀物于烘箱中在温度55℃下烘干至恒重，得到γ-PGA固体产物。
按照与实施例1描述的相同方法测定本实施例制备的γ‐PGA的粘均分子量是1.9×105Da。
实施例5：生产粘均分子量为5.4×105Da的γ-PGA
该实施例的实施步骤如下：
A、活化培养
制备LB固体培养基：首先制备含有10g/L蛋白胨、5g/L酵母浸膏粉、10g/L氯化钠与20g/L琼脂的混合物水溶液，再在温度121℃下灭菌15min。将于-80℃冷冻保存的地衣芽孢杆菌LW菌株挑取一环接种到LB固体培养基上，然后在温度37℃的条件下恒温培养至菌落直径2mm备用；
B、种子培养
制备液体种子培养基：首先制备含有18g/L葡萄糖、3g/L蛋白胨、4g/L酵母浸膏粉、3g/L硫酸铵、8g/L磷酸氢二钾、1g/L磷酸二氢钾、0.5g/L硫酸镁、0.03g/L硫酸锰与10g/L味精的混合物水溶液，调节pH至7.5，再在温度121℃下灭菌20min，得到所述的种子培养基。
将步骤A得到的活化培养物挑取一环接种到所述的液体种子培养基中，然后在温度30℃的条件下恒温震荡培养至对数生长期，得到产γ-PGA的地衣芽孢杆菌LW种子液，按照与前面描述的同样方式检测，所述的种子液OD600＝2.5；
C、发酵培养
制备发酵培养基：首先制备含有60g/L糖蜜碳源、3g/L蛋白胨有机氮源、2.6g/L硫酸铵无机氮源、50g/L味精、10g/L磷酸氢二钾、2g/L磷酸二氢钾、0.5g/L硫酸镁与0.03g/L硫酸锰的混合物水溶液，pH调节至7.5，并装入50L自动控制发酵罐中，装料系数为65％，再在温度121℃下灭菌30min，得到所述的发酵培养基。
按照以发酵培养基体积计4％接种量，将步骤B得到的地衣芽孢杆菌LW种子液接种到发酵培养基中，然后在温度30℃与通气量0.8vvm的条件下培养38h，得到的发酵液中含有39g/Lγ-PGA；
D、提取与纯化
使用浓度为2mol/L盐酸水溶液将步骤C得到的含有γ-PGA的发酵液调节至pH 2.6，使用Sigm台式高速离心机在转速12000rpm的条件下离心分离10min，分离得到上清液，使用浓度为8mol/L氢氧化钠水溶液将其上清液pH调节至6.8，并加入为上清液体积2.5倍的以体积计95％乙醇水溶液，搅拌静置，收集沉淀，接着用蒸馏水溶解，在室温条件下使用截留分子量50000的透析袋透析处理48h，再往得到的透析液中加入所述透析液体积的4.0倍的95％乙醇水溶液进行沉淀，分离的沉淀物于烘箱中在温度55℃下烘干至恒重，得到γ-PGA固体产物。
按照与实施例1描述的相同方法测定本实施例制备的γ‐PGA的粘均分子量是5.4×105Da。
实施例6：生产粘均分子量为5.4×105Da的γ-PGA
该实施例的实施步骤如下：
A、活化培养
制备LB固体培养基：首先制备含有10g/L蛋白胨、5g/L酵母浸膏粉、·0g/L氯化钠与20g/L琼脂的混合物水溶液，再在温度121℃下灭菌15min。
将-80℃冷冻保存的地衣芽孢杆菌LW菌株挑取一环接种到LB固体培养基上，然后在温度30℃的条件下恒温培养至菌落直径2mm备用。
B、种子培养
制备液体种子培养基：首先制备含有22g/L葡萄糖、3g/L蛋白胨、2g/L酵母浸膏粉、2g/L氯化铵、12g/L磷酸氢二钾、1g/L磷酸二氢钾、0.4g/L硫酸镁、0.02g/L硫酸锰与12g/L味精的混合物水溶液，pH调节至6.5，再在温度121℃下灭菌20min，得到所述的种子培养基。
将步骤A得到的活化培养物挑取一环接种到所述的液体种子培养基中，然后在温度34℃的条件下恒温震荡培养至对数生长期，得到产γ-PGA的地衣芽孢杆菌LW种子液，按照与前面描述的同样方式检测，所述的种子液OD600＝2.5；
C、发酵培养
制备发酵培养基：首先制备含有54g/L糖蜜碳源、5g/L酵母浸粉有机氮源、3g/L氯化铵无机氮源、55g/L味精、8g/L磷酸氢二钾、2g/L磷酸二氢钾、0.5g/L硫酸镁与0.03g/L硫酸锰的混合物水溶液，pH调节至6.5，并装入50L自动控制发酵罐中，装料系数为60％，再在温度121℃下灭菌30min，得到所述的发酵培养基。
按照以发酵培养基体积计5％接种量，将步骤B得到的地衣芽孢杆菌LW种子液接种到发酵培养基中，然后在温度32℃与通气量0.5vvm的条件下培养30h，得到的发酵液含有40g/Lγ-PGA；
D、提取与纯化
使用盐酸水溶液将步骤C得到的含有γ-PGA的发酵液调节至pH3.3，使用Sigma台式高速离心机在转速12000rpm的条件下离心分离10min，分离得到上清液，使用浓度为5mol/L氢氧化钠水溶液将其上清液pH调节至5.8，并加入为上清液体积4.0倍的以体积计95％乙醇水溶液，搅拌静置，收集沉淀，接着用蒸馏水溶解，在室温条件下使用截留分子量50000的透析袋透析处理48h，再往得到的透析液中加入所述透析液体积的2.5倍的95％乙醇水溶液进行沉淀，分离的沉淀物于烘箱中在温度55℃下烘干至恒重，得到γ-PGA固体产物。
按照与实施例1描述的相同方法测定本实施例制备的γ‐PGA的粘均分子量是5.4×105Da。
实施例7：生产粘均分子量为5.4×105Da的γ-PGA
该实施例的实施步骤如下：
A、活化培养
制备LB固体培养基：首先制备含有10g/L蛋白胨、5g/L酵母浸膏粉、10g/L氯化钠与20g/L琼脂的混合物水溶液，再在温度121℃下灭菌15min，得到所述的培养基。
将-80℃冷冻保存的地衣芽孢杆菌LW菌株挑取一环接种到LB固体培养基上，然后在温度30℃的条件下恒温培养至菌落2mm备用；
B、种子培养
制备液体种子培养基：首先制备含有20g/L葡萄糖、2.6g/L蛋白胨、2g/L酵母浸膏粉、4g/L硫酸铵、10g/L磷酸氢二钾、1g/L磷酸二氢钾、0.4g/L硫酸镁、0.04g/L硫酸锰与10g/L味精的混合物水溶液，pH调节至6.5，再在温度121℃下灭菌20min，得到所述的种子培养基。
将步骤A得到的活化培养物挑取一环接种到所述的液体种子培养基中，然后在温度37℃的条件下恒温震荡培养至对数生长期，得到产γ-PGA的地衣芽孢杆菌LW种子液，按照与前面描述的同样方式检测，所述的种子液含有OD600＝2.9；
C、发酵培养
制备发酵培养基：首先制备含有40g/L糖蜜碳源、5g/L牛肉膏有机氮源、2.6g/L氯化铵无机氮源、48g/L味精、5g/L磷酸氢二钾、2g/L磷酸二氢钾、0.5g/L硫酸镁与0.03g/L硫酸锰的混合物水溶液，pH调节至6.8，装入50L自动控制发酵罐中，装料系数60％，再在温度121℃下灭菌30min，得到所述的发酵培养基。
按照以发酵培养基体积计3％接种量，将步骤B得到的地衣芽孢杆菌LW种子液接种到发酵培养基中，然后在温度30℃与通气量0.5vvm的条件下培养48h，得到的发酵液含有38g/Lγ-PGA；
D、提取与纯化
使用浓度为2mol/L盐酸水溶液将步骤C得到的含有γ-PGA的发酵液调节至pH 2.6，使用Sigma台式高速离心机在转速12000rpm的条件下离心分离10min，分离得到上清液，使用浓度为5mol/L氢氧化钠水溶液将其上清液pH调节至7.5，并加入为上清液体积3.5倍的以体积计95％乙醇水溶液，搅拌静置，收集沉淀，接着用蒸馏水溶解，在室温条件下使用截留分子量50000的透析袋透析处理45h，再往得到的透析液中加入所述透析液体积的2.5倍的95％乙醇水溶液进行沉淀，分离的沉淀物于烘箱中在温度55℃下烘干至恒重，得到γ-PGA固体产物。
按照与实施例1描述的相同方法测定本实施例制备的γ‐PGA的粘均分子量是5.4×105Da。
实施例8：生产粘均分子量为5.4×105Da的γ-PGA
该实施例的实施步骤如下：
A、活化培养
制备LB固体培养基：首先制备含有10g/L蛋白胨、5g/L酵母浸膏粉、10g/L氯化钠与20g/L琼脂的混合物水溶液，再在温度121℃下灭菌158min，得到所述的培养基。
将-80℃冷冻保存的地衣芽孢杆菌LW菌株挑取一环接种到LB固体培养基上，然后在温度32℃的条件下恒温培养至菌落直径2.5mm备用；
B、种子培养
制备液体种子培养基：首先制备含有22g/L葡萄糖、4g/L蛋白胨、2.6g/L酵母浸膏粉、2g/L氯化铵、12g/L磷酸氢二钾、1g/L磷酸二氢钾、0.5g/L硫酸镁、0.03g/L硫酸锰与12g/L味精的混合物水溶液，pH调节至7.2，再在温度121℃下灭菌15min，得到所述的种子培养基。
将步骤A得到的活化培养物挑取一环接种到所述的液体种子培养基中，然后在温度30℃的条件下恒温震荡培养对数生长期，得到产γ-PGA的地衣芽孢杆菌LW种子液，按照与前面描述的同样方式检测，所述的种子液OD600＝2.2；
C、发酵培养
制备发酵培养基：首先制备含有80g/L糖蜜碳源、6g/L蛋白胨有机氮源、2.6g/L硫酸铵无机氮源、60g/L味精、8g/L磷酸氢二钾、1.6g/L磷酸二氢钾、0.5g/L硫酸镁与0.03g/L硫酸锰的混合物水溶液，pH调节至7.2，装入50L自动控制发酵罐中，装料系数60％，再在温度121℃下灭菌30min，得到所述的发酵培养基。
按照以发酵培养基体积计4％接种量，将步骤B得到的地衣芽孢杆菌LW种子液接种到发酵培养基中，然后在温度37℃与通气量1.0vvm的条件下培养30h，得到的发酵液含有44g/L的γ-PGA的发酵液；
D、提取与纯化
使用盐酸水溶液将步骤C得到的含有γ-PGA的发酵液调节至pH 3，使用Sigma台式高速离心机在转速12000rpm的条件下离心分离10min，分离得到上清液，使用氢氧化钠水溶将上清液pH调节至6.0，并加入为上清液体积2.5倍的以体积计95％乙醇水溶液，搅拌静置，收集沉淀，接着用蒸馏水溶解，在室温条件下使用截留分子量50000的透析袋透析处理48h，再往得到的透析液中加入所述透析液体积的3.5倍的95％乙醇水溶液进行沉淀，分离的沉淀物于烘箱中在温度55℃下烘干至恒重，得到γ-PGA固体产物。
按照与实施例1描述的相同方法测定本实施例制备的γ‐PGA的粘均分子量是5.4×105Da。
Claims (9)
1.一株地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)LW，该菌株已于2014年2月17日在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号为CGMCC No.8821。
2.根据权利要求1所述的地衣芽孢杆菌LW在生产γ-聚谷氨酸中的用途。
3.根据权利要求2所述的γ-聚谷氨酸生产方法，其特征在于该生产方法的步骤如下：
A、活化培养
将冷冻保存的地衣芽孢杆菌LW菌株挑取一环接种到LB固体培养基上，然后在温度30～37℃的条件下恒温培养至菌落2-2.5mm，得到所述菌株活化培养物；
B、种子培养
将步骤A得到的活化培养物挑取一环接种到液体种子培养基中，然后在温度30～37℃的条件下恒温震荡培养至对数生长期，得到产γ-PGA的地衣芽孢杆菌LW种子液；
C、发酵培养
按照以发酵培养基体积计1％～5％接种量，将步骤B得到的地衣芽孢杆菌LW种子液接种到发酵培养基中，然后在温度30～37℃与通气量0.5～1.0vvm的条件下培养20～48h，得到含有γ-PGA的发酵液；
所述发酵培养基制备方法如下：制备含有40～80g/L葡萄糖碳源、3～6g/L一种或多种选自蛋白胨、酵母浸粉或牛肉膏的有机氮源、2～4g/L硫酸铵或氯化铵无机氮源、30～50g/L味精、5～10g/L磷酸氢二钾、1～2g/L磷酸二氢钾、0.5g/L硫酸镁与0.03g/L硫酸锰的混合物水溶液，将其水溶液的pH调节至6.5～7.5，装入自动控制发酵罐，装料系数60-70％，再在温度121℃下灭菌30min，得到所述的发酵培养基；
D、提取与纯化
将步骤C得到的含有γ-PGA的发酵液调节至pH 2～4，在12000rpm的条件下离心分离10min，分离得到上清液，将其pH调节至5.0～7.5，并加入为上清液体积2.5～4.0倍的以体积计95％乙醇水溶液，搅拌静置，收集沉淀，接着用蒸馏水溶解，在室温条件下使用截留分子量50000的透析袋透析处理40～48h，再往得到的透析液中加入所述透析液体积的2.5～4.0倍的以体积计95％乙醇水溶液进行沉淀，分离的沉淀物于烘箱中在温度55℃下烘干至恒重，得到粘均分子量为1.9×105Da的γ-PGA固体产物。
4.根据权利要求3所述的生产方法，其特征在于在步骤B中，所述液体种子培养基制备方法如下：首先制备含有18～22g/L葡萄糖、2～4g/L蛋白胨、2～4g/L酵母浸膏粉、2～4g/L硫酸铵或氯化铵、8～12g/L磷酸氢二钾、0.8～1.2g/L磷酸二氢钾、0.4～0.6g/L硫酸镁、0.02～0.04g/L硫酸锰与8～12g/L味精的混合物水溶液，将其水溶液的pH调节至6.5～7.5，再在温度121℃下灭菌15～20min，得到所述的种子培养基。
5.根据权利要求3-4中任一项权利要求所述的生产方法，其特征在于在步骤C中，所述的发酵培养基用糖蜜代替葡萄糖作为碳源时，得到粘均分子量为5.4×105Da的γ-PGA。
6.根据权利要求3或5所述的生产方法，其特征在于所述水溶液的pH是使用1～3mol/L硫酸、盐酸、氢氧化钠或氢氧化钾水溶液调节的。
7.根据权利要求3所述的生产方法，其特征在于在步骤E中，含有γ-PGA的发酵液的pH是使用浓度为1～3mol/L盐酸水溶液调节的。
8.根据权利要求3所述的生产方法，其特征在于在步骤E中，离心分离上清液是使用浓度为5～10mol/L氢氧化钠水溶液调节的。
9.根据权利要求3所述的生产方法，其特征在于采用CTAB法检测，所述发酵液中γ-PGA产量为38～45g/L。
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