CN107022580A - 一种利用γ‑聚谷氨酸产生菌制备γ‑聚谷氨酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用γ‑聚谷氨酸产生菌制备γ‑聚谷氨酸的方法，所述γ‑聚谷氨酸产生菌采用地衣芽孢杆菌CICC10099作为出发菌株，通过γ‑聚谷氨酸产生菌种子液；配制发酵培养基；发酵培养基灭菌；菌株接种及药瓶发酵培养等步骤产生γ‑聚谷氨酸，最后经过分离提纯得到γ‑聚谷氨酸产品，该方法生产γ‑聚谷氨酸的过程简单、操作简便，不需要复杂的发酵工具和发酵条件，γ‑聚谷氨酸的浓度最高可达40g/l，产品纯度高、质量好，适宜在实际生产中大面积推广。
Description
技术领域
本发明涉及γ-聚谷氨酸制备生产领域，具体而言，涉及一种利用γ-聚谷氨酸产生菌制备γ-聚谷氨酸的方法。
背景技术
γ-聚谷氨酸(γ-PGA)是一种由微生物生物合成的聚谷氨酸，它由 D-谷氨酸单体或L-谷氨酸单体以羧基和氨基相缩合而成。γ-聚谷氨酸 是一种有极大开发价值和前景的多功能性生物制品，近年来被作为增稠剂，保湿剂，药物载体等而一直被广泛应用于工业领域。它是一种水溶性和可生物降解的新型生物高分子材料，可通过微生物合成。在生产低聚谷氨酸工艺当中，利用微生物发酵法生产聚谷氨酸具有很好的前景。微生物发酵法生产聚谷氨酸通常利用枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌等微生物发酵培养，通过微生物的作用把谷氨酸单体聚合成大分子的γ-聚谷氨酸。
申请号为 CN201310749908.8的中国发明专利申请公开了一种高效生产γ-聚谷氨酸的方法，以高产γ-聚谷氨酸的地衣芽孢杆菌CGMCC：NO.3336为出发菌株，向发酵培养基中添加硝酸钠并通过调控发酵过程中pH值与通风量，在硝酸盐呼吸条件下影响聚谷氨酸合成酶的活性，从而减少发酵液中谷氨酸的剩余，提高谷氨酸的转化率，发酵结束后发酵液中谷氨酸含量为5-15g/L,γ-聚谷氨酸产量45-55g/L。该制备方法能提高谷氨酸单体的转化率，从而提高γ-聚谷氨酸的产生浓度，但是生产过程对生产罐压、空气流通量、培养基流速等条件进行了限制，生产条件复杂、生产操作不易，不适宜在实际生产中大面积推广。
发明内容
本发明的目的是在于提供了一种γ-聚谷氨酸产生菌制备γ-聚谷氨酸的方法，解决现有技术中利用地衣芽孢杆菌制备γ-聚谷氨酸的生产条件复杂、生产操作不简单的问题。
本发明的上述目的通过以下技术方案予以实现：
一种利用γ-聚谷氨酸产生菌制备γ-聚谷氨酸的方法包括以下步骤：
S1. γ-聚谷氨酸产生菌种子液制备；
S2.配制发酵培养基；
S3.发酵培养基灭菌；
S4.将S1所得的种子液接种至含S3所得的发酵培养基的发酵罐中，形成培养液；
S5.将S4所得的培养液摇瓶发酵；
S6.将S5摇瓶发酵后的培养液调酸后离心，分离，并利用有机溶剂提纯，所得提纯的上清液为γ-聚谷氨酸产品；
其中，在所述步骤S1中，采用地衣芽孢杆菌CICC10099作为所述γ-聚谷氨酸产生菌种子液的出发菌株，并通过种子发酵培养制备形成种子液；所述地衣芽孢杆菌的母种从中国工业微生物菌种保藏中心购得。
在所述S2步骤中，发酵培养基含以下质量百分数原料：葡萄糖0.5-0.8%，酵母粉0.1-0.2%，磷酸氢二钾0.05-0.06%，L-谷氨酸6-9%，硫酸镁0.04-0.05%。
在上述发酵培养基的配方中，通过添加限定配方的葡萄糖、酵母粉以及硫酸镁，为γ-聚谷氨酸产生菌株培养分别提供碳源、氮源以及大量元素；添加的L-谷氨酸为γ-聚谷氨酸产生菌制备合成γ-聚谷氨酸提供原料单体，从而生产γ-聚谷氨酸；添加限定配方的磷酸氢二钾，使培养基的PH得到缓冲，使γ-聚谷氨酸产生菌在较稳定的PH保持较高的成活率和增长率，从而制备高浓度的γ-聚谷氨酸产品。
优选地，在所述S2步骤中，发酵培养基含以下质量百分数原料：葡萄糖0.6-0.75%，酵母粉0.12-0.18%，磷酸氢二钾0.05-0.06%，L-谷氨酸7-8%，硫酸镁0.04-0.05%。
更优选地，所述S2步骤中发酵培养基含以下质量百分数原料：葡萄糖0.7%，酵母粉0.15%，磷酸氢二钾0.06%，L-谷氨酸7.5%，硫酸镁0.05%。
优选地，在所述步骤S4中，在所述步骤S4中，所述发酵培养基的装液量与发酵罐的容量之比为5~8:30。
通过调整发酵培养基的装液量，使发酵罐中的气体空间增大，在发酵过程中，更多的气态氧转化为培养液中的溶解氧，为γ-聚谷氨酸产生菌的发酵培养提供充足的溶解氧，从而提高γ-聚谷氨酸的产率。
优选地，在所述步骤S4中，所述菌液分二环斜面接种于发酵培养基中。使用二环斜面接种的方式，将菌液接种于发酵培养基中，使γ-聚谷氨酸产生菌在培养基中均匀分布培养，并控制杂菌进入培养基中，影响γ-聚谷氨酸产生菌的发酵培养，通过该接种方法限定γ-聚谷氨酸产生菌的用量，使菌株在培养基中充分利用营养物质发酵培养，制备出γ-聚谷氨酸产品，菌株在发酵培养过程中保持较稳定的存活率和增长率。
优选地，在所述步骤S5中，所述培养液在37℃的温度下，摇瓶发酵50h；所述摇瓶转速为220rpm，所述培养液的PH保持在5~8。使γ-聚谷氨酸产生菌在适宜的温度、PH值和转速条件下进行摇瓶发酵培养，从而提高γ-聚谷氨酸产品的产率。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
（1）利用本发明技术方案所述的γ-聚谷氨酸产生菌摇瓶发酵制备γ-聚谷氨酸的产率高，生产γ-聚谷氨酸的浓度最高可达40g/l，产品纯度高、质量好。
（2）发酵菌种提取和接种发酵过程简单，操作简便，不需要复杂的发酵条件和发酵工具进行生产，发酵时间短，成本低，适宜在实际生产中大面积推广。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的作进一步的说明。但本发明的实施方式并不因此限定于以下实施例。
实施例1
一种利用γ-聚谷氨酸产生菌制备γ-聚谷氨酸的方法包括以下步骤：
S1. γ-聚谷氨酸产生菌种制备；
S2.配制发酵培养基；
S3.发酵培养基灭菌；
S4.将S1所得的种子液接种至含S3所得的发酵培养基的发酵罐中，形成培养液；
S5.将S4所得的培养液摇瓶发酵；
S6.将S5摇瓶发酵后的培养液调酸后离心，分离，并利用有机溶剂提纯，所得提纯的上清液为γ-聚谷氨酸产品；
其中，在所述步骤S1中，采用地衣芽孢杆菌CICC10099作为所述γ-聚谷氨酸产生菌种子液的出发菌株，并通过种子发酵培养制备形成种子液，所述地衣芽孢杆菌的母种从中国工业微生物菌种保藏中心购得。
所述S2步骤中，发酵培养基含以下质量百分数原料：葡萄糖0.5%，酵母粉0.1%，磷酸氢二钾0.05%，L-谷氨酸6%，硫酸镁0.04%，余量为水。
在上述发酵培养基的配方中，通过添加限定配方的葡萄糖、酵母粉以及硫酸镁，为γ-聚谷氨酸产生菌株培养分别提供碳源、氮源以及大量元素；添加的L-谷氨酸为γ-聚谷氨酸产生菌制备合成γ-聚谷氨酸提供原料单体，从而生产γ-聚谷氨酸；添加限定配方的磷酸氢二钾，使培养基的PH得到缓冲，使γ-聚谷氨酸产生菌在较稳定的PH保持较高的成活率和增长率，从而制备高浓度的γ-聚谷氨酸产品。
在所述步骤S4中，所述发酵罐的容量为300ml，发酵培养基的装液量即体积为50ml。通过调整发酵培养基的装液量，使发酵罐中的气体空间增大，在发酵过程中，更多的气态氧转化为培养液中的溶解氧，为γ-聚谷氨酸产生菌的发酵培养提供充足的溶解氧，从而提高γ-聚谷氨酸的产率。
在所述步骤S4中，所述种子液分二环斜面接种于发酵培养基中。使用二环斜面接种的方式，将菌液接种于发酵培养基中，使γ-聚谷氨酸产生菌在培养基中均匀分布培养，并控制杂菌进入培养基中，影响γ-聚谷氨酸产生菌的发酵培养，通过限定γ-聚谷氨酸产生菌的用量，使菌株在培养基中充分利用营养物质发酵培养，制备出γ-聚谷氨酸产品，菌株在发酵培养过程中保持较稳定的存活率和增长率。
在所述步骤S5中，所述培养液在37℃的温度下，摇瓶发酵50h；所述摇瓶转速为220rpm，所述培养要的PH保持在5~8。使γ-聚谷氨酸产生菌在适宜的温度、合适的PH值以及转速条件下进行摇瓶发酵培养，从而提高γ-聚谷氨酸产品的产率。
通过上述方法制备的γ-聚谷氨酸由HPLC检测仪完成其定量分析，色谱柱Agilent1100，流动相为100m mol/L的 KH2PO4加5.0％甲醇(用磷酸调pH值至2.5)过滤，超声波除气，紫外检测波长为210nm，流速为1mL/min，谷氨酸作为定量的标准物，测定上述制备方法所产生的γ-聚谷氨酸浓度最高可达40g/l。
实施例2
除所述制备发酵培养基的原料质量百分数不同外，其他同实施例1；
所述发酵培养基含以下质量百分数原料：葡萄糖0.8%，酵母粉0.2%，磷酸氢二钾0.06%，L-谷氨酸9%，硫酸镁0.05%，余量为水。
实施例3
除所述制备发酵培养基的原料质量百分数不同外，其他同实施例1；
所述发酵培养基含以下质量百分数原料：葡萄糖0.6%，酵母粉0.12%，磷酸氢二钾0.05%，L-谷氨酸7%，硫酸镁0.04%，余量为水。
实施例4
除所述制备发酵培养基的原料质量百分数不同外，其他同实施例1；
所述发酵培养基含以下质量百分数原料：葡萄糖0.75%，酵母粉0.18%，磷酸氢二钾0.06%，L-谷氨酸8%，硫酸镁0.05%，余量为水。
实施例5
除所述制备发酵培养基的原料质量百分数不同外，其他同实施例1；
所述发酵培养基含以下质量百分数原料：葡萄糖0.7%，酵母粉0.15%，磷酸氢二钾0.6%，L-谷氨酸7.5%，硫酸镁0.05%，余量为水。
实施例6
除发酵罐的容量、发酵培养基的装液量以及γ-聚谷氨酸产生菌菌液的用量不同外，其他同实施例1；
所述发酵罐的容量为300ml，所述发酵培养基的装液量为80ml。
显然，本专利的上述实施例仅仅是为清楚地说明本专利所作的举例，而并非是对本专利的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本专利的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本专利权利要求的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种利用γ-聚谷氨酸产生菌制备γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
S1. γ-聚谷氨酸产生菌种制备；
S2.配制发酵培养基；
S3.发酵培养基灭菌；
S4.将S1所得的菌种接种至含S3所得的发酵培养基的发酵罐中，形成培养液；
S5.将S4所得的培养液摇瓶发酵；
S6.将S5摇瓶发酵后的培养液调酸后离心，分离，并利用有机溶剂提纯，所得提纯的上清液为γ-聚谷氨酸产品；
在所述S1步骤中，采用地衣芽孢杆菌CICC10099作为所述γ-聚谷氨酸产生菌种的出发菌株。
2.根据权利要求1所述的利用γ-聚谷氨酸产生菌制备γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于，在所述S2步骤中，所述发酵培养基由以下质量百分数原料组成：葡萄糖0.5-0.8%，酵母粉0.1-0.2%，磷酸氢二钾0.05-0.06%，L-谷氨酸6-9%，硫酸镁0.04-0.05%，余量为水。
3.根据权利要求2述的利用γ-聚谷氨酸产生菌制备γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于，在所述S2步骤中，所述发酵培养基由以下质量百分数原料组成：葡萄糖0.6-0.75%，酵母粉0.12-0.18%，磷酸氢二钾0.05-0.06%，L-谷氨酸7-8%，硫酸镁0.04-0.05%，余量为水。
4.根据权利要求3述的利用γ-聚谷氨酸产生菌制备γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于，在所述S2步骤中，所述发酵培养基由以下质量百分数原料组成：葡萄糖0.7%，酵母粉0.15%，磷酸氢二钾0.06%，L-谷氨酸7.5%，硫酸镁0.05%，余量为水。
5.根据权利要求1所述的利用γ-聚谷氨酸产生菌制备γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于，在所述步骤S4中，所述发酵培养基的体积与发酵罐的容积之比为5~8:30。
6.根据权利要求1所述的利用γ-聚谷氨酸产生菌制备γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于，在所述步骤S4中，所述种子液分二环斜面接种于发酵培养基中。
7.根据权利要求1所述的利用γ-聚谷氨酸产生菌制备γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于，在所述步骤S5中，所述培养液在37℃的温度下，摇瓶发酵50h；所述摇瓶转速为220rpm。
8.根据权利要求1述的利用γ-聚谷氨酸产生菌制备γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于，在所述S5步骤中，所述培养液的PH为5~8。
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