CN101671632B

CN101671632B - 一种粒毛盘菌及由其液态发酵制备黑色素的方法

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Publication number: CN101671632B
Application number: CN2009101450584A
Authority: CN
Inventors: 叶明�; 许庆平; 陈晓
Original assignee: Hefei University of Technology
Current assignee: Hefei University of Technology
Priority date: 2009-09-24
Filing date: 2009-09-24
Publication date: 2011-09-28
Anticipated expiration: 2029-09-24
Also published as: CN101671632A

Abstract

本发明公开了一种粒毛盘菌及由其液态发酵制备黑色素的方法，特征是将保藏编号为CCTCC No：M 209193的粒毛盘菌菌株活化后摇瓶培养得到的种子液按发酵培养基体积的4～8％接种于发酵培养基进行液态发酵，发酵液用碱性溶液浸提后，用沉淀剂进行沉淀，所得粗提物以盐酸溶液酸解后得到黑色素粗品，重新溶于氨水溶液，依次用石油醚、三氯甲烷和乙酸乙酯萃取，得到黑色素纯品。与采用基础发酵培养基相比，采用本发明的改良发酵培养基并以盐酸甲醇溶液作为沉淀剂，黑色素产量由1.471g/L提高到3.856g/L，发酵周期由12天缩短至8天，且所得黑色素粗提物纯度高，有利于纯化及减少纯化过程对其结构的破坏。

Description

一种粒毛盘菌及由其液态发酵制备黑色素的方法

技术领域

本发明属于由微生物粒毛盘菌(Lachnum)液态发酵制备黑色素技术领域，具体涉及采用盐酸甲醇溶液作为沉淀剂从粒毛盘菌(Lachnum)发酵液中提取黑色素及采用改良的发酵培养基以提高黑色素产量的方法。

背景技术

目前，黑色素既可以通过酪氨酸或其衍生物的氧化进行化学合成，也可以从动植物材料中提取，还可以利用微生物合成。例如中国专利申请号92112247.0和91104469.8分别公开的一种以哺乳类动物毛发为原料和一种以黑芝麻为原料，用氢氧化钠溶液浸提后采用盐酸作为沉淀剂使黑色素沉淀来制备黑色素的方法。但随着人们对以化学原料合成的黑色素安全性问题的认识，现已越来越倾向于对天然黑色素的开发和应用。中国专利申请号01140572.4公开的一种以酪氨酸等一元酚衍生物为底物、以酪氨酸氧化酶酶促合成黑色素，并加入乙酸铅等试剂来制备黑色素的方法。中国《Frontiers of Biology inChina》(《中国生物前沿期刊》)(2007，2(1)：26-29)以及美国《食品化学》(FoodChemistry，1997，1-2：69-73)分别报道了一种从细菌和一种从真菌发酵制备黑色素的方法，它们都是采用氢氧化钠或氢氧化钾溶液浸提后，用盐酸溶液作为沉淀剂获得黑色素粗品，再通过盐酸酸解及萃取后获得黑色素的纯品。由于黑色素是一类高度聚合的阴离子化合物，极易与带电荷的蛋白质结合形成包结而不易分开，采用氢氧化钠或氢氧化钾溶液浸提后采用盐酸作为沉淀剂使黑色素沉淀时，与黑色素结合在一起的蛋白质不能完全水解除去，这会造成得到的黑色素的粗品纯度低，导致在黑色素的纯化阶段需要采用强酸进行较长时间的高温处理；而根据美国《药用研究综述》(Medicinal ResearchReviews，1988，8：525-556.)以及美国的《色素细胞研究》(Pigment Cell Research，2000，13：283-293.)所公开的研究结果表明，采用强酸长时间处理会造成黑色素产物结构的破坏，并产生脱羧基作用，从而改变了黑色素的结构性质。

目前对于微生物来源黑色素的研究主要集中在其代谢途径、生物学活性、提取纯化以及结构等方面，还未见其工业化生产及其产量的报道。粒毛盘菌(Lachnum)，隶属于盘菌纲(Discomycetes)柔膜菌目(Helotiales)晶杯菌科(Hyaloscyphaceae)，目前大多数学者主要集中于分类研究上，而对其代谢产物的研究较少。《中国抗生素杂志》(JournalAntibiot，1995，48(2)：158-161；1996，49(5)：447-452)报道过从粒毛盘菌深层发酵产物中发现具有杀线虫及抗微生物作用的生物活性物质。目前仅见本发明人研究课题组在中国《食品科学》(2007，28(10)：329-322)公开报道过对巴西粒毛盘菌产色素的研究，其菌落形态为：菌丝白色，较短，呈绒毛状，生长速度较慢，在马铃薯葡萄糖培养基(PDA)25℃平板培养7天后，所产色素的颜色较浅；但该巴西粒毛盘菌至今尚未在国家专利局承认的保藏单位保藏。对于真菌来源的黑色素，目前采用的培养基主要是马铃薯葡萄糖液体培养基(PDB)(沈萍，1999.微生物学实验)、沙堡氏葡萄糖肉汤培养基(SDB)和察贝克氏酵母膏培养基(CDYB)等。英国《真菌研究》(Mycological Research，2004，108 (8)：974-978)曾报道采用PDB培养基培养10天获得黑色素，以L-酪氨酸直接参与黑色素的生物合成，经酪氨酸酶(TYR)的催化作用，使L-酪氨酸羟基化形成L-多巴，并氧化成L-多巴醌，L-多巴醌经过一系列的反应最终形成黑色素；Cu²⁺是TYR的活性中心，Cu²⁺的引入能增强TYR的活性并最终决定黑色素生成的速度及产量；但目前采用上述培养基来合成黑色素的方法产量较低，前期的研究结果通常仅为1.2～1.4g/L，且发酵周期一般需12～15天。

发明内容

本发明的目的是提供一种粒毛盘菌(Lachnum sp.)及由其液态发酵制备黑色素的方法，以克服现有技术的上述缺陷，提高黑色素的产量和纯度。

本发明的粒毛盘菌(Lachnum sp.)菌株，其特征在于所述菌株的保藏编号为CCTCCNo：M 209193。

本发明由粒毛盘菌液态发酵制备黑色素的方法，其特征在于：先将保藏编号为CCTCC No：M 209193的粒毛盘菌(Lachnum sp.)菌株活化后，采用马铃薯葡萄糖液体培养基(PDB)摇瓶培养得到种子液，将种子液接种于发酵培养基进行液态发酵，再将所得到的发酵液采用碱性溶液浸提后，用沉淀剂进行沉淀，获得黑色素粗提物；然后将所得到的黑色素粗提物以盐酸溶液酸解，得到黑色素粗品；最后将该黑色素粗品重新溶于氨水溶液后依次用石油醚、三氯甲烷和乙酸乙酯萃取，即得到黑色素纯品；

所述粒毛盘菌菌株的活化为：将马铃薯葡萄糖培养基(PDA)斜面保藏的保藏编号为CCTCC No：M 209193的粒毛盘菌(Lachnum sp.)菌株接种于PDA平板上，在23～25℃恒温培养5～7天，得到活化菌落；

所述摇瓶培养为：沿上述粒毛盘菌活化菌落边缘接种一块菌龄一致的菌块于马铃薯葡萄糖液体发酵培养基中，在23～28℃、以160～200r/min摇床培养3～5天后，得到粒毛盘菌种子液；

所述液态发酵方法为：将上述粒毛盘菌种子液按发酵培养基体积的4～8％接种于发酵培养基，在23～28℃、以160～200r/min摇床培养8～12天。

所述发酵培养基可采用现有的基础发酵培养基，其配方按质量百分比为：马铃薯汁20％、葡萄糖2％、蛋白胨0.5％、pH自然，蒸馏水1000ml；或，可特别采用本发明提出的改良发酵培养基进行液态发酵，该改良发酵培养基的配方质量百分比为：葡萄糖1％～4％、蛋白胨0.5～1.0％、L-酪氨酸0.03～0.1％、K₂HPO₄0.03～0.1％、CuSO₄0.01～0.05％、蒸馏水1000ml，pH 6.0～7.0。

所述碱性溶液可选自氢氧化钠、氢氧化钾或氨水溶液。

所述沉淀剂可选自盐酸溶液或盐酸甲醇溶液。

本发明的粒毛盘菌(Lachnum sp.)菌株，其子实体采自安徽黄山，经分离纯化鉴定后获得。该生物材料样品已于2009年9月3日保藏到中国典型培养物保藏中心，地址：武汉市武昌珞珈山武汉大学生命科学学院(430072)，保藏编号为CCTCC No：M 209193，分类命名为粒毛盘菌(Lachnum sp.)。

利用本发明的保藏编号为CCTCC No：M 209193的粒毛盘菌(Lachnum sp.)菌株进行液态发酵制备黑色素，与中国《食品科学》(2007，28(10)：329-322)曾报道过的以巴西粒毛盘菌来制备得到色素相比，该巴西粒毛盘菌尚未在国家专利局承认的任何保藏单位保藏，其菌落形态为：菌丝白色，较短，呈绒毛状，生长速度较慢，在25℃下，PDA平板培养7天后，所产色素的颜色较浅；而本发明提供的粒毛盘菌已交付中国典型培养物保藏中心保藏，其菌落形态为：菌丝长，呈絮状，菌落边缘菌丝呈白色，中间呈黄绿色，生长速度快，在25℃下，PDA平板培养7天后，所产黑色素颜色深。所以本发明提供的保藏编号为CCTCC No：M 209193的粒毛盘菌(Lachnum sp.)菌株与曾公开报道过的巴西粒毛盘菌应属于粒毛盘菌属的不同种；而且在相同的培养条件下，以本发明的保藏编号为CCTCC No：M 209193的粒毛盘菌(Lachnum sp.)菌株进行液态发酵制备得到黑色素的产量(3.856g/L)明显高于所报道的以巴西粒毛盘菌进行液态发酵制备得到色素的产量(1.276g/L)。

由于黑色素为高度聚合的阴离子化合物，极易与带电荷的蛋白结合形成包结而不易分开。本发明由粒毛盘菌液态发酵制备黑色素的方法中采取了盐酸甲醇溶液作为沉淀剂来使黑色素沉淀，加入甲醇后不仅使黑色素与蛋白质沉淀，还引起蛋白质的变性、结构解体伸展，在沉降的过程中被盐酸水解进一步除去了与之结合的蛋白质，所得到的黑色素粗提物中蛋白质、多肽以及核酸的含量很少，表明黑色素的粗提物纯度较高，有利于纯化以及减少纯化过程对黑色素结构造成的破坏。

本发明提出的改良发酵培养基配方，在现有基础发酵培养基的基础上添加了L-酪氨酸、K₂HPO₄和CuSO₄，去除了马铃薯汁，并将培养基的pH值的范围调节到6～7；由于L-酪氨酸直接参与黑色素的生物合成，经酪氨酸酶(TYR)的催化作用，使L-酪氨酸羟基化形成L-多巴并氧化成L-多巴醌，L-多巴醌经过一系列的反应最终形成黑色素；TYR是一种铜结合金属酶，Cu²⁺的引入能使在黑色素生物合成过程中形成的一种异源二聚体复合物分离释放出活性TYR，而TYR是黑色素生成的限速酶，其表达和活性决定着黑色素合成的速度和产量；另外，加入K₂HPO₄及调节发酵培养基的pH值在6～7之间有利于黑色素的生成；现有培养基配方中采用的马铃薯汁的主要成分为淀粉，与葡萄糖相比不易被菌株的生长所利用，而且其配制过程中要采用煮沸并过滤得到马铃薯汁，操作步骤较繁琐且增加了产品成本。采用本发明的改良发酵培养基配方与采用基础发酵培养基相比，黑色素产量由1.471g/L提高到3.856g/L，且发酵周期可由原来的12天缩短至8天。

附图说明

图1为本发明采用盐酸以及盐酸甲醇作为沉淀剂得到的黑色素的紫外可见光谱图。

具体实施方式

实施例1：

本发明的本发明的保藏编号为CCTCC No：M 209193的粒毛盘菌(Lachnum sp.)菌株，其子实体采自安徽黄山，采用组织分离法对其进行分离纯化：取新鲜的粒毛盘菌子实体，先用75％酒精浸泡10～30s后再用0.1％升汞溶液浸泡5～8min，然后用无菌水清洗2～3次后，将子实体切割成2～4块，接种于PDA培养基，23～25℃恒温培养，待菌丝生长后，沿菌落边缘取菌龄及形态一致的菌块进行纯化培养，重复4～5次，获得粒毛盘菌(Lachnum sp.)纯培养物；

(1)粒毛盘菌液态发酵

将上述保藏编号为CCTCC No：M 209193的粒毛盘菌(Lachnum sp.)菌株纯培养物接种于马铃薯葡萄糖培养基(PDA培养基)平板上活化，25℃恒温培养7天后，用直径6mm的打孔器沿菌落边缘取一块菌龄一致的菌块接种于装有80ml马铃薯葡萄糖液体培基(PDB)的250ml三角瓶中，在25℃、以200r/min的转速，摇床培养4天后，得到粒毛盘菌种子液；将该粒毛盘菌种子液按发酵培养基体积的6％接种于5L自动控制发酵罐，装液量为3.5L，通气量为2L/min，在25℃、以180r/min，在基础发酵培养基以及改良发酵培养基中分别培养12天以及8天后，抽滤2次，滤液即为所需发酵液；

所述马铃薯葡萄糖培养基(PDA)，其配方质量百分比为：马铃薯汁20％、葡萄糖2％、琼脂2％、蒸馏水1000ml，pH自然；所述马铃薯葡萄糖液体培养基(PDB)，其配方质量百分比为：马铃薯汁20％、葡萄糖2％、蒸馏水1000ml，pH自然；所述发酵培养基配方，可选用现有的基础发酵培养基，其配方质量百分比为：马铃薯汁20％、葡萄糖2％、蛋白胨0.5％、蒸馏水1000ml，pH自然；或选用本发明提出的改良发酵培养基，其配方质量百分比为：葡萄糖2％、蛋白胨0.5％、L-酪氨酸0.05％、K₂HPO₄0.05％、CuSO₄0.03％、蒸馏水1000ml，pH 6.5；

(2)黑色素粗提物

分别取上述采用不同发酵培养基的发酵液各1L按体积比为1∶1分别与1L浓度为2mol/L的氢氧化钠溶液混匀，得浸提液，静置12小时；用1mol/L盐酸甲醇溶液调节上述浸提液pH值为2，静置12小时，得到黑色素悬浮液；然后将上述黑色素悬浮置于高速冷冻离心机中，以5000r/min的转速、在4℃离心10min，弃上清液，将所得到的沉淀经去离子水洗涤至pH值为7后采用真空冷冻干燥，从采用基础发酵培养基以及改良发酵培养基的发酵液中分别得到黑色素粗提物1.471g和3.856g；

(3)黑色素粗提物纯化

分别取上述黑色素粗提物，按黑色素粗提物的质量(g)与浓度为6mol/L盐酸溶液的体积(ml)比为1∶40，100℃水浴酸解1小时，用高速冷冻离心机，以5000r/min的转速、在4℃离心10min，弃上清液，沉淀经去离子水洗涤至pH值为7时真空冷冻干燥后，分别得黑色素粗品1.217g和3.016g；按黑色素粗品质量(g)与浓度为0.5mol/L的氨水溶液的体积(ml)比为1∶20，将黑色素粗品溶于浓度为0.5mol/L的氨水溶液中，50℃水浴1小时，旋转蒸发仪蒸去氨气至溶液pH为7，得黑色素粗品溶液；将黑色素粗品溶液先与石油醚按体积比为2∶1，萃取5次，再与氯仿按体积比为2∶1，萃取5次，最后与乙酸乙酯按体积比为2∶1，萃取5次，萃取液用1mol/L盐酸甲醇溶液调pH值为2，用高速冷冻离心机，以5000r/min的转速、在4℃离心10min，弃上清液，所得沉淀用去离子水反复洗涤至pH值为7后，采用真空冷冻干燥，分别得到纯化后黑色素1.063g和2.727g。

采用盐酸以及盐酸甲醇作为沉淀剂处理得到的黑色素粗提物的紫外可见光谱图如图1所示，从图1中可见：用盐酸甲醇作为沉淀剂得到的黑色素粗提物的曲线a，在波长260nm、280nm处吸收峰明显低于现有技术中采用盐酸作为沉淀剂后得到的黑色素粗提物的曲线b，表明黑色素粗提物中蛋白质、多肽以及核酸的含量少；两种方法得到的黑色素粗提物溶液，在相同浓度下，最大吸收波长均在211nm处，而采用盐酸甲醇得到的黑色素粗提物在211nm处的吸光度为3.268，明显大于采用盐酸得到的黑色素粗提物在211nm处的吸光度2.560；根据兰伯比尔定律可知，两种方法得到的黑色素粗提物在相同浓度时，采用盐酸甲醇作为沉淀剂得到的黑色素粗提物纯度相对较高。

实施例2：

粒毛盘菌纯培养物的获得方法同实施例1；

(1)粒毛盘菌液态发酵

将上述粒毛盘菌纯培养物接种于马铃薯葡萄糖培养基平板上活化，23℃恒温培养5天后，用直径6mm的打孔器沿菌落边缘取一块菌龄一致的菌块接种于装有50ml马铃薯葡萄糖液体发酵培养基的250ml三角瓶中，在25℃、以160r/min摇床培养5天后，得到粒毛盘菌种子液。将该粒毛盘菌种子液按发酵培养基体积的4％接种于5L自动控制发酵罐，发酵培养基装液量为3L，通气量为2L/min，在28℃、以180r/min的转速培养10天后，抽滤2次，所得到的滤液即为所需发酵液。所述发酵培养基配方(重量百分比)为：葡萄糖1％、蛋白胨1.0％、L-酪氨酸1.0％、K₂HPO₄0.03％、CuSO₄0.01％、蒸馏水1000ml，pH 6.0；

(2)黑色素粗提物

取上述发酵液1L与浓度为1mol/L的氢氧化钾溶液按体积比为1∶2，混匀后静置12小时得浸提液；用浓度为1.5mol/L的盐酸甲醇溶液调节浸提液pH值为3，静置12小时，得到黑色素悬浮液；然后将上述黑色素悬浮置于高速冷冻离心机中，以5000r/min的转速、在4℃离心10min，弃上清液，沉淀经去离子水洗涤至pH值为7时真空冷冻干燥后得到黑色素粗提物2.115g；

(3)黑色素粗提物纯化

取上述黑色素粗提物2.115g，按黑色素粗提物的质量(g)与浓度为6mol/L盐酸溶液的体积(ml)比为1∶40，80℃水浴酸解4小时，用高速冷冻离心机，以5000r/min的转速、在4℃下离心15min，弃上清液，所得沉淀用去离子水洗涤至pH值为7时进行真空冷冻干燥，得黑色素粗品1.797g。按黑色素粗品质量(g)与浓度为0.5mol/L的氨水溶液的体积(ml)比为1∶40，将黑色素粗品溶于浓度为1mol/L的氨水溶液中，50℃水浴2小时，旋转蒸发仪蒸去氨气至溶液pH为7，得黑色素粗品溶液；将上述黑色素粗品溶液先与石油醚按体积比为4∶1，萃取4次，再与氯仿按体积比为4∶1，萃取4次，最后与乙酸乙酯按体积比为4∶1，萃取4次，萃取液用2mol/L盐酸甲醇溶液调pH值为2，采用高速冷冻离心机，以5000r/min的转速、在4℃下离心10min，弃上清液，所得沉淀经去离子水反复洗涤至pH值为7时进行真空冷冻干燥，得到纯化后黑色素1.649g。

本实施例中用盐酸甲醇作为沉淀剂得到的黑色素粗提物的紫外可见光谱曲线，与实施例1中产物的图1中的曲线a、以及采用盐酸作为沉淀剂后得到的黑色素粗提物的紫外可见光谱曲线b分别重合。证实了在本实施例中采用两种方法所得到的黑色素粗提物在相同浓度时，采用盐酸甲醇作为沉淀剂得到的黑色素粗提物纯度相对较高。

实施例3：

粒毛盘菌纯培养物的获得方法同实施例1；

(1)粒毛盘菌液态发酵

将上述粒毛盘菌纯培养物接种于马铃薯葡萄糖培养基平板上活化，25℃恒温培养6天，用直径6mm的打孔器沿菌落边缘取一块菌龄一致的菌块接种于装有60ml马铃薯葡萄糖液体发酵培养基的250ml三角瓶中，在23℃、以200r/min的转速，摇床培养3天后，得到粒毛盘菌种子液。将该粒毛盘菌种子液按发酵培养基体积8％接种于5L自动控制发酵罐，发酵培养基装液量为3L，通气量为2L/min，在23℃、以200r/min的转速，培养12天后，抽滤2次，滤液即为所需发酵液。所述发酵培养基配方重量百分比为：葡萄糖4％、蛋白胨0.5％、L-酪氨酸0.3％、K₂HPO₄0.05％、CuSO₄0.05％、蒸馏水1000ml，pH 7.0；

(2)黑色素粗提物

取1L上述发酵液与2mol/L氨水溶液按体积比为1∶4，混匀后静置12小时得到浸提液；用浓度为1.0mol/L的盐酸甲醇溶液调节浸提液pH值为2，静置12小时得到黑色素悬浮液；然后将上述黑色素悬浮置于高速冷冻离心机中，以5000r/min的转速、在4℃离心10min，弃上清液，沉淀经去离子水洗涤至pH值为7时真空冷冻干燥后得到黑色素粗提物3.013g；

(3)黑色素粗提物纯化

取上述黑色素粗提物3.013g，按黑色素粗提物的质量(g)与浓度为6mol/L盐酸溶液的体积(ml)比为1∶40，100℃水浴酸解2小时，高速冷冻离心机，5000r/min、4℃离心15min，弃上清液，沉淀经去离子水洗涤至pH值为7时真空冷冻干燥得黑色素粗品2.603g；按黑色素粗品质量(g)与浓度为2mol/L的氨水溶液的体积(ml)比为1∶10，将黑色素粗品溶于浓度为2mol/L的氨水溶液中，60℃水浴1小时，旋转蒸发仪蒸去氨气至溶液pH为7，得黑色素粗品溶液；将上述黑色素粗品溶液先与石油醚按体积比为1∶1，萃取3次，再与氯仿按体积比为1∶1，萃取3次，最后与乙酸乙酯按体积比为1∶1，萃取3次，萃取液用2mol/L盐酸甲醇溶液调pH值为2，高速冷冻离心机，5000r/min、4℃离心10min，弃上清液，所得沉淀经去离子水反复洗涤至pH值为7时真空冷冻干燥后得到纯化后黑色素2.327g。

本实施例中用盐酸甲醇作为沉淀剂得到的黑色素粗提物的紫外可见光谱曲线，也与实施例1中产物的图1中的曲线a、以及采用盐酸作为沉淀剂后得到的黑色素粗提物的紫外可见光谱曲线b分别重合。证实了在本实施例中采用两种方法所得到的黑色素粗提物在相同浓度时，采用盐酸甲醇作为沉淀剂得到的黑色素粗提物纯度相对较高。

由以上本发明实施例的结果与现有技术相比较可以看到：采用本发明的改良培养基配方黑色素的产量由1.471g/L提高到3.856g/L，发酵周期由12d缩短至8d；并且由于采用了盐酸甲醇作为沉淀剂，得到的黑色素粗提物纯度相对较高，避免了后续强酸处理对结构造成更大破坏。

Claims

1.一种粒毛盘菌(Lachnum sp.)菌株，其特征在于所述菌株的保藏编号为CCTCCNo：M 209193。

2.一种由粒毛盘菌液态发酵制备黑色素的方法，其特征在于：先将保藏编号为CCTCC No：M 209193的粒毛盘菌(Lachnum sp.)菌株活化后，采用马铃薯葡萄糖液体培养基摇瓶培养得到种子液，将种子液接种于发酵培养基进行液态发酵，再将所得到的发酵液采用碱性溶液浸提后，用沉淀剂进行沉淀，获得黑色素粗提物；然后将所得到的黑色素粗提物以盐酸溶液酸解，得到黑色素粗品；最后将该黑色素粗品重新溶于氨水溶液后依次用石油醚、三氯甲烷和乙酸乙酯萃取，即得到黑色素纯品；

所述菌株活化为：将马铃薯葡萄糖培养基斜面保藏的保藏编号为CCTCC No：M 209193的粒毛盘菌(Lachnum sp.)菌株接种于PDA平板上，在23～25℃恒温培养5～7天，得到活化菌落；

所述摇瓶培养为：沿活化菌落边缘接种一块菌龄一致的菌块于马铃薯葡萄糖液体发酵培养基中，在23～28℃、以160～200r/min摇床培养3～5天后，得到粒毛盘菌种子液；

所述液态发酵方法为：将粒毛盘菌种子液按发酵培养基体积的4～8％接种于发酵培养基，在23～28℃、以160～200r/min摇床培养8～12天。

3.如权利要求2所述由粒毛盘菌液态发酵制备黑色素的方法，特征在于所述发酵培养基采用基础发酵培养基，其配方按质量百分比为：马铃薯汁20％、葡萄糖2％、蛋白胨0.5％、pH自然，蒸馏水1000ml。

4.如权利要求2所述由粒毛盘菌液态发酵制备黑色素的方法，特征在于所述发酵培养基采用改良发酵培养基，其配方质量百分比为：葡萄糖1％～4％、蛋白胨0.5～1.0％、L-酪氨酸0.03～0.1％、K₂HPO₄0.03～0.1％、CuSO₄0.01～0.05％、蒸馏水1000ml，pH 6.0～7.0。

5.如权利要求2所述由粒毛盘菌液态发酵制备黑色素的方法，特征在于所述碱性溶液选自氢氧化钠、氢氧化钾或氨水溶液。

6.如权利要求2所述由粒毛盘菌液态发酵制备黑色素的方法，特征在于所述沉淀剂选自盐酸溶液或盐酸甲醇溶液。