CN107058395A

CN107058395A - 一种通过发酵制备桦褐孔菌黑色素的方法

Info

Publication number: CN107058395A
Application number: CN201710297413.4A
Authority: CN
Inventors: 傅俊生; 戚梦; 李佳欢; 胡开辉; 林文雄
Original assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Current assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Priority date: 2017-04-28
Filing date: 2017-04-28
Publication date: 2017-08-18

Abstract

本发明提供一种通过发酵制备桦褐孔菌黑色素的方法，将桦褐孔菌的发酵液除去菌丝体后，用强酸破坏发酵液中的蛋白质，在将黑色素通过碱性溶液沉淀出来，收集沉淀得到黑色素粗提物，在进行纯化。黑色素具有延缓衰老、乌发润肤、舒气止胀、清热解毒、壮阳补肾、软化血管、下淤血、消浮肿、抗肥胖、制风热、添精神等功效，还可防治各种中老年疾病，如高血压、心脏病、糖尿病、肾炎、血管硬化、癌症及肝脏等疾病。传统的黑色素合成主要釆用酶法和化学法，但是由于原料以及酪氨酸酶价格昂贵，合成流程复杂，成本较高，不利于大规模工厂化生产。本发明所采用的培养基配方简单,原料来源广,价格低廉,循环利用,适合推广及应用。

Description

一种通过发酵制备桦褐孔菌黑色素的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体是一种通过发酵制备桦褐孔菌黑色素的方法。

背景技术

桦褐孔菌属于真菌门，担子菌亚门，层菌纲，非褐菌目，锈革孔菌科，褐卧孔菌属，桦褐孔菌中含有多糖、桦褐孔素、类固醇、黑色素等物质。黑色素是桦褐孔菌中的一种重要的活性物质，黑色素是目前应用最多最广的生物天然色素之一，是一类由酚和（或）吲哚化合物聚合氧化而成的高分子聚合物，其广泛存在于动物、植物中，从乌贼、核桃皮等中提得的黑色素均被报道具有较强的抗氧化、清除自由基等功效且具有延缓衰老、乌发润肤、舒气止胀、清热解毒、壮阳补肾、软化血管、下淤血、消浮肿、抗肥胖、制风热、添精神等功效，还可防治各种中老年疾病，如高血压、心脏病、糖尿病、肾炎、血管硬化、癌症及肝脏疾病等。传统的黑色素合成主要釆用酶法和化学法，但是由于原料以及酪氨酸酶价格昂贵，合成流程复杂，成本较高，不利于大规模工厂化生产。如今已有许多学者利用细菌、霉菌或者真菌生产黑色素，考虑到菌种安全性，大多数菌株（如：大肠杆菌、苏云金芽孢杆菌等）生产的黑色素难以在食品加工中使用，桦褐孔菌作为一种珍稀药用真菌，在适宜的营养和培养条件下，桦褐孔菌的菌丝可通过液体发酵产生大量的黑色素，但鲜见对桦褐孔菌黑色素提取的研究。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种通过发酵制备桦褐孔菌黑色素的方法，以降低黑色素提取成本，同时其发酵所用的原料为银耳菌糠汁，同时解决银耳菌糠的资源循环利用问题。

本发明采用的技术方案是：

一种通过发酵制备桦褐孔菌黑色素的的方法，将桦褐孔菌发酵液除去菌丝体后，用强酸破坏发酵液中的蛋白质，再将黑色素通过碱性溶液沉淀出来，收集沉淀得到黑色素粗提物，再进行纯化。

所述桦褐孔菌发酵液是将菌种在28℃培养5~8天后接入液体培养基中，于30℃培养15天；液体培养基中含银耳菌糠40-50wt.%、磷酸二氢钾0.1-0.2 wt.%、MgSO₄ 0.1-0.2wt.%、Vb₁0.01~0.015 wt.%、酪氨酸0.1-0.2 wt.%，其余为水。

除去发酵液中菌丝体，取发酵液10毫升加入250ml、4mol/L盐酸中。在60~70摄氏度水浴1.5小时后6000r/min离心15分钟，留沉淀，使发酵液中的蛋白脂质等生物大分子被除去。

向上述所得沉淀中加入250ml、2mol/L NaOH 超声提取2小时后再通过6000r/min离心15分钟，弃沉淀留上清。用5mol/L盐酸调节上清液pH至1.5~2.0。将上清液放入70℃水浴锅中14小时。之后再通过6000r/min离心15分钟，弃上清。最后将沉淀用粗离子水洗涤3~5次。得到纯的黑色素。

本发明的优点在于：通过从桦褐孔菌发酵液中提取黑色素方法，提高桦褐孔菌深层发酵经济效益，实现其综合利用。且从所提取得黑色素可能与桦褐孔菌抗胃癌、心脏病等一些疾病有关。采用才用发酵法制备黑色素，可提高黑色素产量，缩短黑色素提取时间成本较低，适用于大规模工厂化生产，并可促进桦褐孔菌生理学以及人工栽培的研究。

传统的黑色素合成主要釆用酶法和化学法，但是由于原料以及酪氨酸酶价格昂贵，合成流程复杂，成本较高，不利于大规模工厂化生产。本发明所采用的培养基配方简单,原料来源广,价格低廉,循环利用,适合推广及应用。

附图说明

图1 桦褐孔菌黑色素红外光谱图。

具体实施方式

实施例1

所述的桦褐孔菌发酵液是将菌种在28℃培养7天后接入含有银耳菌糠45wt.%、磷酸二氢钾0.1 wt.%、MgSO₄ 0.2 wt.%、Vb₁0.015 wt.%、酪氨酸0.2 wt.%组成的液体培养基中，于30℃培养15天。

除去发酵液中菌丝体，取发酵液10毫升加入250ml、4mol/L盐酸中。在65摄氏度水浴1.5小时后6000r/min离心15分钟，留沉淀，使发酵液中的蛋白脂质等生物大分子被除去。

向上述所得沉淀中加入250ml、2mol/L NaOH 超声提取2小时后再通过6000r/min离心15分钟，弃沉淀留上清。用5mol/L盐酸调节上清液pH至2.0。将上清液放入70℃水浴锅中14小时。之后再通过6000r/min离心15分钟，弃上清。最后将沉淀用粗离子水洗涤4次。得到较纯的黑色素，得率为4.0%。

实施例2

所述桦褐孔菌发酵液是将菌种在28℃培养5天后接入液体培养基中，于30℃培养15天；液体培养基中含银耳菌糠40wt.%、磷酸二氢钾0.1wt.%、MgSO₄ 0.1wt.%、Vb₁0.01wt.%、酪氨酸0.1wt.%，其余为水。

除去发酵液中菌丝体，取发酵液10毫升加入250ml、4mol/L盐酸中。在60摄氏度水浴1.5小时后6000r/min离心15分钟，留沉淀，使发酵液中的蛋白脂质等生物大分子被除去。

向上述所得沉淀中加入250ml、2mol/L NaOH 超声提取2小时后再通过6000r/min离心15分钟，弃沉淀留上清。用5mol/L盐酸调节上清液pH至1.5。将上清液放入70℃水浴锅中14小时。之后再通过6000r/min离心15分钟，弃上清。最后将沉淀用粗离子水洗涤3次。得到较纯的黑色素，得率为3.8%。

对提取到的黑色素进行红外光谱分析发现：1 ) 在波数3442.48cm-1 处都有较宽而强的吸收峰，说明存在－ NH 结构；1460.48 cm-1 处的吸收峰是自由羧基基团－ COOH引起的振动；1632.02cm-1 处吸收峰是C=O 的非对称振动及N－H变角振动形成，说明可能存在－COOH；1330.33cm-1 处吸收峰是C － CH3 的弯曲和骨架振动吸收参与形成；600～700cm-1 范围的吸收带很弱，表明苯环被取代，形成共轭体系。2)桦褐孔菌黑色素都在波数2933.48cm-1 左右处有吸收峰可能是由于C －H 伸缩振动形成，即为－ CH 和－ CH2 的共振吸收峰。

Claims

1.一种通过发酵制备桦褐孔菌黑色素的的方法，其特征在于：将桦褐孔菌发酵液除去菌丝体后，用强酸破坏发酵液中的蛋白质，再将黑色素通过碱性溶液沉淀出来，收集沉淀得到黑色素粗提物，再进行纯化。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述桦褐孔菌发酵液是将菌种在28℃培养5~8天后接入液体培养基中，于30℃培养15天；液体培养基中含银耳菌糠40-50wt.%、磷酸二氢钾0.1-0.2 wt.%、MgSO₄ 0.1-0.2 wt.%、Vb₁0.01~0.015 wt.%、酪氨酸0.1-0.2 wt.%，其余为水。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：取发酵液10毫升加入250ml、4mol/L盐酸中，在60~70℃水浴1.5小时后6000r/min离心15分钟，留沉淀，使发酵液中的蛋白脂质生物大分子被除去。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：向所得沉淀中加入250ml、2mol/L NaOH 超声提取2小时后再通过6000r/min离心15分钟，弃沉淀留上清，用5mol/L盐酸调节上清液pH至1.5~2.0；将上清液放入70℃水浴锅中14小时；之后再通过6000r/min离心15分钟，弃上清；最后将沉淀用粗离子水洗涤3~5次；得到纯的黑色素。