CN101289680B - 一种以菊芋为原料发酵生产2,3-丁二醇的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种以菊芋为原料发酵生产2，3-丁二醇的方法，属于生物化工技术领域。其特征是以菊芋块茎为原料，将其制备成菊芋汁或菊芋浆，向菊芋汁、浆中添加菊糖酶，可得到菊糖水解液。分别以菊芋汁、浆或菊糖水解液为碳源，与灭菌后的无机盐营养成分混合，接入产2，3-丁二醇的菌种，通过分步糖化发酵或同步糖化发酵两种工艺，可得到较高的2，3-丁二醇浓度。本发明的效果和益处是可降低微生物发酵生产2，3-丁二醇的原料成本，提高生产效率，可得到2，3-BD的最终浓度为49-105g/L；2，3-BD与乙偶姻的最终浓度之和为60-115g/L。
Description
技术领域
本发明属于生物化工技术领域，涉及一种发酵生产2，3-丁二醇的方法，特别涉及到一种以菊芋为原料经微生物发酵生产2，3-丁二醇的方法。
背景技术
2，3-丁二醇(英文名：2，3-Butanediol，以下简称2，3-BD)是一种极其重要的化工原料，具有广泛的应用领域。它是极具价值的液体燃料；并且易于脱水得到重要的工业有机溶剂或燃料添加剂甲乙酮以及合成塑料和人造橡胶的单体-2-丁烯和1，3-丁二烯；同时2，3-BD也很容易催化脱氢获得乙偶姻和二乙酰化合物，用来制作高价值香料和食品添加剂；酯化形式的2，3-BD是合成聚亚胺的前体，可应用于药物、化妆品、洗涤液等；2，3-BD自身也可以作为单体用来合成高分子化合物；左旋形式的2，3-BD由于其较低的凝固点可用作抗冻剂；此外，2，3-BD还在染料、炸药、香水、药物载体等领域显示出潜在的应用价值(ApplMicrobiol Biotechnol，2001，55(1)：10-18；精细与化工专用品，2006，14(15)：15-18)。2，3-BD虽然具有如此广泛的应用潜力，但偏高的价格却一直影响并限制了其大规模生产和广泛的应用。
2，3-BD的生产方法主要有化学法和生物转化法。由于化学法合成比较困难，至今尚未实现工业化生产；生物转化法是以可再生资源为原料，通过微生物代谢将单糖转化为目标产物。由于生物转化法具有安全、环保、反应条件温和等特点，越来越成为国内外研究开发的热点。目前对生物转化法生产2，3-BD的报道较多，且多是利用葡萄糖为碳源(Appl Microbiol Biotechnol，1991，34(4)：463-468；Chin J Chem Eng，2006，14(1)：132-136)，而利用葡萄糖为碳源又存在其价格较高且与人争粮、与粮争地等问题。同时也有报道利用糖蜜、淀粉或甘蔗汁为碳源发酵生产2，3-BD(Z.Naturforsch，2001，56：787-791；中国专利申请公开号：CN1710086A)，还有少量报道是以纤维素为碳源(Appl MicrobiolBiotechnol，2001，55：10-18；Enzyme Microb Technol，1991，13：110-115；中国专利申请公开号：CN101153291A)，但最终产物2，3-BD的浓度都不高，因此寻找一种既廉价又有效的非粮原料来替代粮食作物是推进发酵生产2，3-BD的必经之路。由于用于生产2，3-BD的菌株具有较宽的底物食谱，己糖、戊糖、特定的二糖、糖醛酸等都可以作为底物，因此利用种植广泛的、不与粮食争地的非粮廉价原料菊芋作为发酵底物，是加快2，3-BD实现大规模生产的必然选择。
菊芋(又名洋姜、鬼子姜)作为一种可再生资源，在我国分布广泛。菊芋适应性和抗病能力都很强，不用施肥，但长势旺盛，尤其适合在废弃土地上种植，如沙漠、盐碱地等。菊芋非常容易栽培，通常一年种植后可每年收获，可以连收4-5年。菊芋含有一种贮存性多糖--菊粉，约占菊芋肥大块茎干重的70％以上。菊粉又叫菊糖，主要成分是各种果聚糖，经菊糖酶水解得到以果糖为主并含有部分葡萄糖的水解液，可用来作为发酵生产2，3-BD的底物。另外菊粉中还含有一定数量的蛋白质、果胶、纤维素及微量元素等其它营养成分对发酵可能存在促进作用(四川师范大学学报(自然科学版)，1999，22(6)：747-751；北京工商大学学报(自然科学版)，2004，22(16)：8-17)。Jacques Fages等人也曾尝试过用菊芋为原料采用批式发酵的方式来生产2，3-BD(Appl Microbiol Biotechnol，1986，25(3)：197-202)，但在最佳培养条件下得到的2，3-BD浓度仅为44g/L。目前已有不少文献报道利用菊芋为原料发酵生产燃料乙醇以及微生物油脂(FoodTechnol Biotechnol，2005，43(3)：241-246；中国专利申请公开号：CN101108997A；中国专利申请公开号：CN1952163A)，都取得了较好的结果。因此利用非粮可再生资源菊芋为原料，采用分步糖化发酵或同步糖化发酵工艺获得较高浓度的2，3-BD，可以在一定程度上降低生产成本，提高生产效率，还能为山区资源的开发利用开辟一条很好的途径。
发明内容
本发明的目的是提供一种使用非粮的廉价原料菊芋来代替葡萄糖发酵生产2，3-BD的技术方法，解决目前主要利用葡萄糖为底物发酵生产2，3-BD存在成本较高的问题。
为实现上述目的，本发明的技术方案具体步骤如下：
(1)原料制备和处理：以菊芋块茎为原料，将其制备成菊芋汁或菊芋浆。向菊芋汁、菊芋浆中添加菊糖酶，加酶量为10-100U/g菊芋干重，在37-60℃，pH4.0-7.0条件下，水解2-20小时，制成菊糖水解液，其中还原糖浓度范围：80-400g/L。
(2)培养基：
种子培养基是将(1)中菊糖水解液与无机盐营养成分分别在115-121℃条件下灭菌15-20min，冷却后混合得到；种子培养基中无机盐成分包括：(NH4)2HPO4 6.0g/L；KCl 1.8g/L；EDTA 0.51g/L；MgSO4·7H2O 0.6g/L；柠檬酸0.21g/L；柠檬酸钠0.294g/L；
发酵培养基是将(1)中的菊芋汁、浆或菊糖水解液与无机盐营养成分分别在115-121℃条件下灭菌15-20min，冷却后混合得到；发酵培养基中无机盐成分包括：KH2PO4 1.36g/L；(NH4)2SO4 6.61g/L；MgCl2·6H2O 0.26g/L；酵母粉1g/L；柠檬酸0.428g/L。
(3)菌种：采用的菌种通常为克雷伯氏菌属、多粘芽孢杆菌属或产气肠杆菌属。
(4)发酵培养：经活化后(3)中的菌种接种到种子培养基中，在35-38℃，200rpm条件下培养20-24小时；将上述种子按照2-10％的接种量接种到发酵培养基中，在pH 5.0-7.0、35-38℃、200-300rpm、0.02-0.5vvm通空气条件下，通过分步糖化发酵或同步糖化发酵两种工艺进行发酵。
所述的分步糖化发酵工艺是先将菊芋汁或菊芋浆经菊糖酶糖化制成菊糖水解液，其中菊糖酶的添加量为10-100U/g菊芋干重，然后以菊糖水解液为底物，进行批式发酵或批式流加发酵。
所述的同步糖化发酵工艺是以菊芋汁或浆为底物，在发酵接种的同时加入菊糖酶，其中菊糖酶的添加量为10-100U/g菊芋干重，进行批式发酵或批式流加发酵。
采用这两种发酵工艺，可得到2，3-BD的最终浓度为49-105g/L；2，3-BD与乙偶姻的最终浓度之和为60-115g/L。
本发明的效果和益处是：本发明所用原料种植范围广泛，且不与粮食争地、价格低廉，可显著地降低微生物发酵生产2，3-BD的成本；采用批式流加的发酵方式，可以提高目标产物的浓度；采用同步糖化发酵工艺，可以减轻高浓度底物的抑制作用、节省发酵时间、提高生产效率，并容易形成规模化生产，是一种资源高值化利用的新技术。
具体实施方式
以下结合技术方案详细叙述本发明的具体实施例。
本实施例中所用菌种为克雷伯氏杆菌(Klebsiella pneumoniae)，中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)保藏，保藏号CICC No.10011。具体实例如下：
实施例1：
以菊芋汁为原料采用分步糖化发酵工艺：
将菊芋块茎清洗、压榨、浓缩调浆得到菊芋汁，将菊芋浓汁在55℃、pH 6.0条件下，加入30U/g菊芋干重的菊糖酶，水解12个小时，得到还原糖浓度为254.2g/L的菊糖水解液；将1L菊糖水解液在115℃单独灭菌15min，冷却后与500mL灭菌的发酵培养基中无机盐成分混合；将培养22小时的种子按照5％的接种量接入，发酵培养在37℃、300rpm、pH6.0、通气量为0.1vvm条件下进行；培养方式采用批式流加发酵的方式，当残留还原糖浓度低于50g/L时，补加还原糖浓度为368g/L的菊糖水解液200ml，发酵共进行72小时，发酵液中2，3-BD的最终浓度为68.06g/L；2，3-BD与乙偶姻的最终浓度之和为87.08g/L。
实施例2：
以菊芋粉为原料采用分步糖化发酵工艺：
为方便储存，将菊芋块茎清洗、干燥、粉碎制成菊芋粉，使用前加水调成浆；将400g菊芋粉加水调制成浆定容到1L，在55℃、pH6.0条件下，加入30U/g菊芋干重的菊糖酶，水解12个小时，得到还原糖浓度为246.50g/L的菊糖水解液；将其在115℃条件下单独灭菌15min，冷却后与500mL灭菌的发酵培养基中无机盐成分混合；将培养22小时的种子按5％的接种量接入，发酵培养在37℃、300rpm、pH6.0、通气量为0.1vvm条件下进行；培养方式采用批式发酵的方式，发酵共进行56小时，发酵液中2，3-BD的最终浓度为49.68g/L；2，3-BD与乙偶姻的最终浓度之和为62.25g/L，生产强度为1.11g/(L·h)。
实施例3：
以菊芋粉为原料采用同步糖化发酵工艺：
将400g菊芋粉加水调制成浆定容到1L，将其在115℃条件下单独灭菌15min，冷却后与500mL灭菌的发酵培养基中无机盐成分混合；将培养22小时的种子按5％的接种量接入，与此同时接入经过膜除菌的糖化酶，糖化酶的添加量为30U/g菊芋干重；发酵培养在37℃、300rpm、pH6.0、通气量为0.1vvm条件下进行；培养方式采用批式发酵的方式；在发酵24h时，发酵液中2，3-BD的浓度为48.95g/L，2，3-BD与乙偶姻的浓度之和就已经达到了53.91g/L，发酵40h时2，3-BD的浓度为70.11g/L，2，3-BD与乙偶姻的浓度之和高达81.59g/L，生产强度为2.04g/(L·h)。整个发酵过程中，还原糖的浓度维持在16-38g/L。与实施例二相比，菌体生长状况更好，发酵时间明显缩短，2，3-BD和乙偶姻的生产强度有很大的提高。
Claims (2)
1.一种以菊芋为原料发酵生产2，3-丁二醇的方法，是分别以菊芋汁、浆或菊糖水解液为原料，与灭菌后的无机盐成分混合，接入产2，3-丁二醇的菌种，通过分步糖化发酵或同步糖化发酵两种工艺，得到较高的2，3-丁二醇浓度，其特征在于如下步骤：
(1)原料制备和处理：以菊芋块茎为原料，将其制备成菊芋汁或菊芋浆，向菊芋汁、浆中添加菊糖酶，加酶量为10-100U/g菊芋干重，在55-60℃，pH6.0条件下，水解2-20小时，制成菊糖水解液，其中还原糖浓度范围：120-400g/L；
(2)培养基：
种子培养基是将(1)中菊糖水解液与无机盐营养成分分别在115-121℃条件下灭菌15-20min，冷却后混合得到；
发酵培养基是将(1)中的菊芋汁、浆或菊糖水解液与无机盐营养成分分别在115-121℃条件下灭菌15-20min，冷却后混合得到；
(3)菌种：采用的菌种为克雷伯氏菌属(Klebsiella pneumoniae)，CICC No.10011；
(4)发酵培养：经活化后(3)中的菌种接种到种子培养基中，在35-38℃，200rpm条件下培养20-24小时；将上述种子按照2-10％的接种量接种到发酵培养基中，在pH 6.0、35-38℃、200-300rpm、0.1-0.5vvm通空气条件下进行发酵。
2.根据权利要求1所述的一种以菊芋为原料发酵生产2，3-丁二醇的方法，其特征在于所述的发酵培养采用分步糖化发酵工艺或同步糖化发酵工艺：分步糖化发酵工艺是先将菊芋汁或菊芋浆经菊糖酶糖化制成菊糖水解液，然后以菊糖水解液为底物，进行批式发酵或批式流加发酵；同步糖化发酵工艺是以菊芋汁或浆为底物，在发酵接种的同时加入菊糖酶，进行批式发酵或批式流加发酵。
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