CN103614299A - 一种卷枝毛霉、制备降粘酶的方法及其应用 - Google Patents

一种卷枝毛霉、制备降粘酶的方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种卷枝毛霉、制备降粘酶的方法及其在甘薯发酵降粘中的应用，属于微生物及微生物发酵领域。针对现有技术中降低甘薯发酵醪液粘度存在的缺陷，本发明提供了一种能够生产降粘酶的菌种。卷枝毛霉CBS131818已保藏于荷兰皇家艺术与科学学院荷兰微生物菌种保藏中心，保藏日期2012年1月27日。卷枝毛霉CBS131818采集自酸处理水稻秸秆处理液，可应用于制备降粘酶。所产降粘酶活性高，并可进一步应用于甘薯燃料乙醇发酵醪液降粘工艺，可有效降低甘薯块茎发酵醪液粘度，且用量少、作用时间短，能够简化甘薯燃料乙醇发酵工艺，降低生产成本。

Description

一种卷枝毛霉、制备降粘酶的方法及其应用
技术领域
本发明涉及一种卷枝毛霉、利用该菌种制备降粘酶的方法及其应用，特别是涉及一种可应用于甘薯块茎发酵降粘的普通镰刀菌及其应用，属于微生物及微生物发酵领域。
背景技术
生物质燃料乙醇即采用植物等生物质原料发酵生产无水乙醇，再加入体积比5%左右的变性剂（一般为无铅汽油或无铅的烃类）使之成为含水量小于0.8%且不可食用的变性无水乙醇。燃料乙醇是一种良好的汽油增氧剂和辛烷值调和组分，能有效降低汽车尾气中的一氧化碳含量，从而真正实现节能减排。生物质燃料乙醇作为一种可再生能源，因其能缓解能源危机，稳定粮食生产，增加就业机会和农民收入，减少环境污染而备受关注并成为各国竞相研发的重要课题之一。2007年，我国正式宣布停止一切以粮食为原料生产燃料乙醇的项目，鼓励发展甘薯、甘蔗、甜高粱等非粮食原料生产燃料乙醇。甘薯燃料乙醇发酵醪液是一种典型的非牛顿流体（一般的发酵液粘度小于0.1Pa.S），具有粘度大的特点（大于100Pa.S），对发酵过程中传质传热等产生影响，从而降低了发酵效率、延长发酵时间、减少最终乙醇浓度，并且容易堵塞管路、增加能耗。因而醪液粘度高是甘薯高浓度发酵生产燃料乙醇的瓶颈之一。
现有技术中，降低甘薯发酵醪液基本有两种方法，一是添加发酵用水降低粘度，二是添加木聚糖酶、纤维素酶、果胶酶等商品酶或者其混合物，促进α-淀粉酶与淀粉颗粒接触，提高淀粉颗粒利用效率。这两种方法均存在各自的技术缺陷：前者不仅增加了发酵用水量，还降低了酒精成产产量，不能解决实际问题；后者使用商品酶作为一种快速预处理方法，增加了生产成本，不利于燃料乙醇规模化生产。
发明内容
本发明的目的就是针对现有技术的不足，提供一种能够生产降粘酶的菌种，及其制备降粘酶以及到甘薯发酵降粘中的应用。
为实现上述目的，本发明首先提供一种卷枝毛霉：
卷枝毛霉S-1，保藏于CBS-KNAW，保藏号为CBS131818，保藏日期为2012年1月27日。
卷枝毛霉CBS131818属卷枝毛霉（Mucor circinelloides），已保藏于荷兰皇家艺术与科学学院荷兰微生物菌种保藏中心（Royal NetherlandsAcademy of Arts and Sciences,The CentraalbureauvoorSchimmelcultures，CBS-KNAW)，保藏日期2012年1月27日，保藏编号CBS131818。CBS-KNAW机构地址：8Uppsalalaan，3584CT，荷兰乌得勒支（Uppsalalaan8,3584CT Utrechtthe Netherlands）。
卷枝毛霉CBS131818采集自酸处理水稻秸秆后的处理液。筛选的技术方案如下：一种筛选卷枝毛霉CBS131818的方法：其特征在于：
步骤S1、制备酸处理秸秆材料后的处理液
秸秆材料于60℃烘干至恒重后粉碎，过35目筛；取筛选后的粉末10g置于250ml的三角瓶中，加入100ml浓度为0.5%～4%（v/v）的稀硫酸，升温至121℃保持60min得处理液；处理液室温放置1～2个月，液面有霉菌生长；
上述秸秆材料可以是玉米芯、玉米秸秆、小麦秸秆、水稻秸秆等。
步骤S2、筛选过程
按照经典的涂布稀释平板法，挑取步骤S1处理液中菌落按经梯度稀释后；分别取100μL10-5，10-6，10-7浓度的菌悬液涂布于筛选培养基上，30℃培养3d；挑取平板上生长较大的单菌落到PDA培养基上，30℃培养7d；用刚果红染液染色，挑选出黄色透明圈大且明显的菌株；所述筛选培养基的组成为（g/L）：羧甲基纤维素钠（CMC）10，酵母膏4.5，(NH4)2SO44.5，NaCl5.0，K2HPO42.0，MgSO4·7H2O0.4，琼脂15，pH6.0。
上述筛选方法中，刚果红染液染色为常规操作，具体是：菌落挑取后，利用1%刚果红染液染色10min，倒掉染色液然后用1mol/L NaCl溶液润洗3次，每次10min。
本发明菌落质地疏松，一般高度在1cm以内，棕褐色，顶生孢子囊，孢子囊成球形，成熟时孢子囊壁消解，孢囊孢子椭圆形或拟椭圆形。经鉴定属卷枝毛霉（Mucorcircinelloides）。
卷枝毛霉CBS131818可应用于降粘酶制备。
本发明还提供一种降粘酶制备方法，其技术方案如下：
一种降粘酶制备方法，其特征在于：将卷枝毛霉CBS131818接种于发酵培养基，30℃、130rpm下培养5d，制得降粘酶粗酶液；所述发酵培养基组分是（g/L）：风干玉米芯20、蛋白胨3.0、酵母膏0.5、KH2PO42.0、(NH4)2SO41.5、MgSO4·7H2O0.15、CaCl20.3、FeSO4·7H2O0.0005、ZnSO4·7H2O0.0014、MnSO4·H2O0.0016、COCl2·6H2O0.0016、Tween-803.3，pH5.0。
在优选条件下，发酵培养基的组成是（g/L）：风干玉米芯4.4、木聚糖10.7、L-山梨醇4.9、KH2PO42.0、(NH4)2SO41.5、MgSO4·7H2O0.15、CaCl20.3、FeSO4·7H2O0.0005、ZnSO4·7H2O0.0014、MnSO4·H2O0.0016、COCl2·6H2O0.0016、Tween-803.3，pH3.48。
以上述方法制得的降粘酶粗酶液，是多种酶的混合液，经Pedersen etal.(2009)报道的AZCL分析方法分析显示，降粘酶粗酶液组成为：内切-1,4-β-D-甘露聚糖酶24（蓝色水解环直径/mm，下同），内切-1,4-β-D-木聚糖酶11，β-葡聚糖酶24，内切-1,3-β-D-葡聚糖酶18。基于此，本发明提供一种降粘酶组合物，其技术方案如下：
一种降粘酶组合物，其特征在于：制备方法为：将卷枝毛霉CBS131818接种于发酵培养基，30℃、130rpm下培养5d，制得降粘酶组合物；所述发酵培养基是如下二者之一：
发酵培养基一（g/L）：风干玉米芯20、蛋白胨3.0、酵母膏0.5、KH2PO42.0、(NH4)2SO41.5、MgSO4·7H2O0.15、CaCl20.3、FeSO4·7H2O0.0005、ZnSO4·7H2O0.0014、MnSO4·H2O0.0016、COCl2·6H2O0.0016、Tween-803.3，pH5.0；
发酵培养基二（g/L）：风干玉米芯4.4、木聚糖10.7、L-山梨醇4.9、KH2PO42.0、(NH4)2SO41.5、MgSO4·7H2O0.15、CaCl20.3、FeSO4·7H2O0.0005、ZnSO4·7H2O0.0014、MnSO4·H2O0.0016、COCl2·6H2O0.0016、Tween-803.3，pH3.48。
上述降粘酶组合物是粗酶液，在优化条件下，可经离心，取上清液经0.22μm过滤器过滤制得纯化后的降粘酶组合物。
利用上述降粘酶组合物，本发明进一步提供一种甘薯块茎发酵降粘的方法，其技术方案如下：
一种利用上述降粘酶组合物实施的甘薯块茎发酵降粘的方法，其特征在于：30℃条件下向甘薯块茎浆中添加反应酶液，50℃、180rpm条件下反应2h；所述反应酶液是降粘酶粗酶液。
在优选条件下，上述方法的反应酶液是降粘酶粗酶液经离心，取上清液经0.22μm过滤器过滤制得。
在优选条件下，上述方法的甘薯块茎浆制备方法是：步骤S1、甘薯块茎原料洗净、打浆制得甘薯块茎原浆；步骤S2、按照90～150KNU/kg淀粉在甘薯块茎原浆中添加α-淀粉酶，80℃～90℃反应至碘反应为红棕色，冷却至室温后按甘薯块茎原浆料水重量比3:1加水；115℃条件下灭菌20min，制得甘薯块茎浆。
上述甘薯块茎发酵降粘的方法可以应用于甘薯燃料乙醇发酵工艺中。具体是应用于鲜甘薯类燃料乙醇发酵工艺的前期降粘预处理中。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：（1）提供了新的卷枝毛霉CBS131818（卷枝毛霉S-1）；（2）卷枝毛霉CBS131818可应用于制备降粘酶，卷枝毛霉CBS131818所产降粘酶活性高、用量少、作用时间短、降粘效果好；（3）卷枝毛霉CBS131818可应用于甘薯块茎发酵降粘；（4）利用卷枝毛霉CBS131818实施的甘薯块茎发酵降粘方法可应用于甘薯燃料乙醇发酵工艺中。
具体实施方式
下面结合优选实施例、对照例对本发明技术方案作进一步的描述。
实施例一
本实施例记载卷枝毛霉CBS131818的筛选方法。
水稻秸秆于60℃烘干至恒重后粉碎，过35目筛；取筛选后的粉末10g置于250ml的三角瓶中，加入100ml浓度为0.5%（v/v）的稀硫酸，升温至121℃保持60min得处理液；处理液室温放置1～2个月，液面有霉菌生长。
筛选过程为：按照经典的涂布稀释平板法，将上述处理液经10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7的浓度稀释后，分别取100μL10-5，10-6，10-7浓度的菌悬液涂布于筛选培养基上，30℃培养3d，挑取平板上生长较大的单菌落到PDA斜面培养基上，30℃培养7d，然后用刚果红染液染色，挑选出黄色透明圈大且明显的菌株。
筛选培养基的组成为（g/L）：羧甲基纤维素钠（CMC）10，酵母膏4.5，(NH4)2SO44.5，NaCl5.0，K2HPO42.0，MgSO4·7H2O0.4，琼脂15，pH6.0。
刚果红染液染色步骤为：菌落挑取后，利用1%刚果红染液染色10min，倒掉染色液然后用1mol/LNaCl溶液润洗3次，每次10min。
本实施例筛选得到的菌落质地疏松，一般高度在1cm以内，棕褐色，顶生孢子囊，孢子囊成球形，成熟时孢子囊壁消解，孢囊孢子椭圆形或拟椭圆形。经鉴定属卷枝毛霉（Mucorcircinelloides），命名为S-1。
实施例二
本实施例记载卷枝毛霉CBS131818的筛选方法，其与实施例一相同之处不再重复，不同之处在于，所述稀硫酸浓度为4%（v/v）。
实施例三
本实施例记载卷枝毛霉CBS131818的筛选方法，其与实施例一相同之处不再重复，不同之处在于，所述稀硫酸浓度为2%（v/v）。
实施例四
本实施例记载卷枝毛霉CBS131818制备降粘酶的方法。
发酵培养基：风干玉米芯20、蛋白胨3.0、酵母膏0.5、KH2PO42.0、(NH4)2SO41.5、MgSO4·7H2O0.15、CaCl20.3、FeSO4·7H2O0.0005、ZnSO4·7H2O0.0014、MnSO4·H2O0.0016、COCl2·6H2O0.0016、Tween-803.3，pH5.0。
制备操作：将卷枝毛霉CBS131818接种于50mL发酵培养基，30℃、130rpm下培养4d，制得降粘酶粗酶液。
实施例五
本实施例记载卷枝毛霉CBS131818制备降粘酶的方法，其与实施例二相同之处不再重复，其不同之处在于，将卷枝毛霉CBS131818接种于发酵培养基，30℃、130rpm下培养5d，制得降粘酶粗酶液。
实施例六
本实施例记载卷枝毛霉CBS131818制备降粘酶的方法。
优选发酵培养基：风干玉米芯4.4、木聚糖10.7、L-山梨醇4.9、KH2PO42.0、(NH4)2SO41.5、MgSO4·7H2O0.15、CaCl20.3、FeSO4·7H2O0.0005、ZnSO4·7H2O0.0014、MnSO4·H2O0.0016、COCl2·6H2O0.0016、Tween-803.3，pH3.48。
制备操作：将卷枝毛霉CBS131818接种于50mL发酵培养基，30℃、130rpm下培养4d，制得降粘酶粗酶液。
实施例七
本实施例记载卷枝毛霉CBS131818制备降粘酶的方法，其与实施例四相同之处不再重复，其不同之处在于：将卷枝毛霉CBS131818接种于50mL发酵培养基，30℃、130rpm下培养5d，制得降粘酶粗酶液。
实施例八
本实施例记载卷枝毛霉CBS131818制备降粘酶的方法，其与实施例五相同之处不再重复，其不同之处在于：将卷枝毛霉CBS131818接种于200mL发酵培养基（其中卷枝毛霉CBS131818接种量与发酵培养基用量放大相同倍数），30℃、130rpm下培养5d，制得降粘酶粗酶液。
实施例九
本实施例记载甘薯块茎发酵降粘的方法。
粘度测定仪器：上海尼润智能科技有限公司生产的RDV-2+PRO型数字式旋转粘度计。
α-淀粉酶标准酶活力为90KNU/g，酶活定义为在37℃，pH5.6时，每h水解5.26g淀粉的酶量为1个KNU。
步骤S1、甘薯块茎原料洗净、打浆制得甘薯块茎原浆。
步骤S2、按照90～150KNU/kg淀粉在甘薯块茎原浆中添加α-淀粉酶，80℃～90℃反应至碘反应为红棕色，冷却至室温后按甘薯块茎原浆料水重量比3:1加水；115℃条件下灭菌20min，制得甘薯块茎浆。
步骤S3、降粘酶粗酶液经离心，取上清液经0.22μm过滤器过滤制得反应酶液。
步骤S4、步骤S2所得甘薯块茎浆升温至30℃，添加反应酶液，50℃、180rpm条件下反应2h，测量粘度值；降粘酶粗酶液来源、加入量及降粘效果如下表1所示。
对照处理：50g或100g步骤S2所得甘薯块茎浆，加入2mL或4mL无菌水，50℃作用2h后，测定粘度值为19686mPa.s～23042.5mPa.s。
表1反应酶液及粘度测定值
NO. 降粘酶粗酶液来源 反应酶液加入量 粘度下降率
1 实施例二 2mL/50g甘薯块茎浆 71.40%
2 实施例三 2mL/50g甘薯块茎浆 72.78%
3 实施例四 2mL/50g甘薯块茎浆 73.85%
4 实施例五 2mL/50g甘薯块茎浆 75.41%
5 实施例六 4mL/100g甘薯块茎浆 73.52%
测试例一
本测试例记载对实施例四、五、六所得降粘酶粗酶液组分的测定。
采用Pedersen et al.(2009)经报道的AZCL分析方法测定降粘酶粗酶液组成及活性，结果显示降粘酶清液的组成为：
内切-1,4-β-D-甘露聚糖酶24（蓝色水解环直径/mm，下同），内切-1,4-β-D-木聚糖酶11，β-葡聚糖酶24，内切-1,3-β-D-葡聚糖酶18。
参考文献：Pedersen M,Hollensted M,Lange L,Andersen B.Screeningfor cellulose and hemicellulose degrading enzymes from the fungal genusUlocladium.Inter Biodeter Biodegr2009;63:484-9.
对照例一
本对照例记载现有技术采用果胶酶降粘的试验。
甘明哲等(2009)通过优化，获得的鲜甘薯最佳预处理条件为：料水比2:l、126℃、pH2.5条件下预处理5min，液化，糖化时加入果胶酶40U/g醪液，纤维素酶0.5U/g醪液。糖化2h后，粘度4.5×104mPa.s。(果胶酶：购自广州中凯生物制品公司，7万单位/g;维素酶：购自上海博奥生物科技有限公司，1.万单位/g)，而采用传统糖化工艺，糖化2h后，粘度大于1.0×105mPa.s。
参考文献：甘明哲等.适合鲜甘薯原料乙醇发酵的低粘度快速糖化预处理.应用与环境生物学报,2009年02期。

Claims (9)

1.卷枝毛霉CBS131818，保藏于CBS-KNAW，保藏号为CBS131818，保藏日期为2012年1月27日。
2.根据权利要求1所述的卷枝毛霉CBS131818在制备降粘酶中的应用。
3.一种降粘酶制备方法，其特征在于：将卷枝毛霉CBS131818接种于发酵培养基，30℃、130rpm下培养4d～5d，制得降粘酶粗酶液；所述发酵培养基组分是如下二种之一：
发酵培养基一（g/L）：风干玉米芯20、蛋白胨3.0、酵母膏0.5、KH2PO42.0、(NH4)2SO41.5、MgSO4·7H2O0.15、CaCl20.3、FeSO4·7H2O0.0005、ZnSO4·7H2O0.0014、MnSO4·H2O0.0016、COCl2·6H2O0.0016、Tween-803.3，pH5.0；
发酵培养基二（g/L）：风干玉米芯4.4、木聚糖10.7、L-山梨醇4.9、KH2PO42.0、(NH4)2SO41.5、MgSO4·7H2O0.15、CaCl20.3、FeSO4·7H2O0.0005、ZnSO4·7H2O0.0014、MnSO4·H2O0.0016、COCl2·6H2O0.0016、Tween-803.3，pH3.48。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述发酵培养天数为5d。
5.一种降粘酶组合物，其特征在于：制备方法为：将卷枝毛霉CBS131818接种于发酵培养基，30℃、130rpm下培养4d～5d，制得降粘酶组合物；所述发酵培养基是如下二者之一：
发酵培养基一（g/L）：风干玉米芯20、蛋白胨3.0、酵母膏0.5、KH2PO42.0、(NH4)2SO41.5、MgSO4·7H2O0.15、CaCl20.3、FeSO4·7H2O0.0005、ZnSO4·7H2O0.0014、MnSO4·H2O0.0016、COCl2·6H2O0.0016、Tween-803.3，pH5.0；
发酵培养基二（g/L）：风干玉米芯4.4、木聚糖10.7、L-山梨醇4.9、KH2PO42.0、(NH4)2SO41.5、MgSO4·7H2O0.15、CaCl20.3、FeSO4·7H2O0.0005、ZnSO4·7H2O0.0014、MnSO4·H2O0.0016、COCl2·6H2O0.0016、Tween-803.3，pH3.48。
6.根据权利要求5所述的降粘酶组合物，其特征在于：所得降粘酶组合物经离心，取上清液经0.22μm过滤器过滤提纯。
7.一种利用权利要求5或6所述的降粘酶组合物实施的甘薯块茎发酵降粘的方法，其特征在于：30℃条件下向甘薯块茎浆中添加反应酶液，50℃、180rpm条件下反应2h；所述反应酶液是降粘酶组合物。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述甘薯块茎浆的制备方法是：
步骤S1、甘薯块茎原料洗净、打浆制得甘薯块茎原浆；
步骤S2、按照90～150KNU/kg淀粉在甘薯块茎原浆中添加α-淀粉酶，80℃～90℃反应至碘反应为红棕色，冷却至室温后按甘薯块茎原浆料水重量比3:1加水；115℃条件下灭菌20min，制得甘薯块茎浆。
9.根据权利要求7所述的甘薯块茎发酵降粘的方法在甘薯燃料乙醇发酵中的应用。
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