CN102041240B - 一株短小芽孢杆菌及其在生产2,3-丁二醇中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株产2，3-丁二醇的短小芽孢杆菌，其中所述短小芽孢杆菌定名为短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)SDM，该菌已于2010年11月22日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏号为：CCTCC NO：M 2010307。本发明所述菌株能以可再生资源为碳源，通过溶解氧分段控制策略，得到2，3-丁二醇的浓度达到70g/L，生产强度为1.46g/L.h。且所述菌株具有生物安全性，发酵生产的2，3-丁二醇具有广泛的用途。

Description

一株短小芽孢杆菌及其在生产2,3-丁二醇中的应用

技术领域

本发明涉及一株短小芽孢杆菌及其应用，尤其涉及一株短小芽孢杆菌及其在发酵生产2，3-丁二醇中的应用；属于生物技术领域。

背景技术

2，3-丁二醇广泛应用于化工、食品、燃料及航天航空等多个领域(Syu M J.ApplMicrobiol Biotechnol，2001，55(1)：10-18)。因其热值较高(27,200kJ/kg)，同乙醇(29,100kJ/kg)相当，可用作燃料添加剂；可代替1，4-丁二醇，用于聚酯和聚亚氨酯的合成；其脱水产物甲乙酮是一种低沸点溶剂，广泛应用于涂料、润滑剂、燃料等行业，同时又可作为有机合成香料、抗氧化剂等的中间体；其脱水产物1，3-丁二烯可用来合成橡胶单体，是一种重要的石油化工基础有机原料；同甲乙酮缩合加氢形成辛烷，可用于生产高级航空用油；其高值衍生物3-羟基丁酮和丁二酮广泛应用于食品、化妆品、香料等行业。

目前2，3-丁二醇的生产方法主要有化学合成法和微生物发酵法。化学法主要以石油裂解时产生的丁烯为原料，经过HClO的氧化及NaOH的作用后，在高温高压下水解得到几种不同种类的丁二醇，再通过减压分馏分离获得。相比于化学法，微生物发酵法具有可利用生物质可再生资源、环境友好、工艺简单等特点，符合低碳经济的发展策略。自然界中具有2，3-丁二醇生产能力的细菌主要包括：克雷伯氏菌属(Klebsiella)、芽孢杆菌属(Bacillus)、沙雷氏菌属(Serratia)和肠杆菌属(Enterobacter)等(Afschar A S，Vaz RossellC E，Jonas R，et al.J Biotechnol，1993，27(3)：317-329)。目前，国内外发酵生产2，3-丁二醇的研究常用菌株多为克雷伯氏菌、粘质沙雷氏菌，其潜在的致病性，限制了在食品工业中的应用。芽孢杆菌具有食品安全性，现有多粘芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌生产2，3-丁二醇的专利报道(中国专利200910026807.1，201010167019.7)，但其产物生产强度较低。

经检索，目前未见有使用短小芽孢杆菌发酵生产2，3-丁二醇的报道。

发明内容

针对现有2，3-丁二醇生产方法中存在的不足，本发明的目的在于提供一株新分离的短小芽孢杆菌及其在发酵生产2，3-丁二醇中的应用，即通过分段溶解氧控制策略，以短小芽孢杆菌发酵生产2，3-丁二醇。

本发明短小芽孢杆菌定名为短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)SDM，该菌已于2010年11月22日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，湖北省武汉市武昌珞珈山)，其保藏号为：CCTCC NO：M 2010307。

上述短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)SDM CCTCC NO：M 2010307菌株形态为棒杆状，菌落颜色为黄色或白色，产芽孢，VP反应成阳性，长2.0～3.0μm，直径0.6～0.7μm，能利用葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、甘露醇、果糖产酸，能水解酪蛋白、明胶、吐温80，可在45℃条件下生长。

上述短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)SDM CCTCC NO：M 2010307菌株的16SrDNA序列如SEQ ID No.1所示，序列长度为1513bp，所述序列与其他短小芽孢杆菌的16S rDNA序列有99％～100％的相似性。

上述小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)SDM CCTCC NO：M 2010307菌株可以在高糖LB培养基中生长；其中所述高糖LB培养基配方为：1L蒸馏水中含：150g葡萄糖，10g蛋白胨，5g酵母粉，10gNaCl，121℃条件下灭菌15min。固体高糖LB培养基是在上述配方的基础上加入20g/L的琼脂粉。

本发明所述短小芽孢杆菌在发酵生产2，3-丁二醇中的应用，其中所述应用涉及的方法是：

制备细胞液体培养物：挑取固体高糖LB培养基斜面培养的短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)SDM CCTCC NO：M 2010307菌株1～2环，接种在装有灭菌的100mL高糖LB培养基的500mL锥形瓶中，置于摇床上，在37℃条件下，以180±10rpm的转速培养24±2h，得所述菌株的细胞液体培养物；其中所述高糖LB培养基配方为：1L蒸馏水中含：150g葡萄糖，10g蛋白胨，5g酵母粉，10g NaCl；所述固体高糖LB培养基是在上述配方的基础上加入20g/L的琼脂粉；

以葡萄糖培养基或蔗糖培养基发酵生产2，3-丁二醇：所述发酵罐发酵条件为：将上述制得的细胞液体培养物以50mL/L的接种量接种在装有灭菌的4L发酵培养基的5L发酵罐中，发酵温度为30～40℃；发酵前期从开始至14～24h搅拌转速控制为400～600rpm，通气量为0.8～1.2vvm；发酵后期即从15～25h开始搅拌转速控制为200～350rpm，通气量为0.3～0.7vvm，发酵40～60h后发酵结束，得含2，3-丁二醇发酵液；

分离提纯2，3-丁二醇：收集含2，3-丁二醇发酵液，8,000～10，000rpm离心5～10分钟，取上清液采用常规的萃取方法得天然的2，3-丁二醇产品；

其中：上述葡萄糖培养基配方为：1L蒸馏水中含：150g葡萄糖，5～15g玉米浆干粉，3～8g酵母粉，2～10g K₂HPO₄，0.05～0.4g MgSO₄·7H₂O，0.05～0.4g CaCl₂，0.5～2g乙酸钠；上述蔗糖培养基配方为：1L蒸馏水中含：120g蔗糖，5～15g玉米浆干粉，3～8g酵母粉，2～10g K₂HPO₄，0.05～0.4g MgSO₄·7H₂O，0.05～0.4g CaCl₂，0.5～2g乙酸钠。115℃条件下灭菌20min。

上述短小芽孢杆菌在发酵生产2，3-丁二醇中的应用中：所述以葡萄糖培养基或蔗糖培养基发酵生产2，3-丁二醇的发酵温度优选为37℃。

上述短小芽孢杆菌在发酵生产2，3-丁二醇中的应用中：所述以葡萄糖培养基发酵生产2，3-丁二醇的发酵条件优选为：发酵前期24h搅拌转速为400rpm，通气量为1.0vvm；发酵后期24h搅拌转速为230rpm，通气量为0.4vvm；发酵48h后发酵结束。

上述短小芽孢杆菌在发酵生产2，3-丁二醇中的应用中：所述以蔗糖培养基发酵生产2，3-丁二醇的发酵条件优选为：发酵前期20h搅拌转速为500rpm，通气量为1vvm；发酵后期28h搅拌转速为200rpm，通气量为0.5vvm；发酵48h后发酵结束。

本发明提供的2，3-丁二醇生产菌株短小芽孢杆菌，即短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)SDM CCTCC NO：M 2010307菌株，能以可再生资源为碳源，通过溶解氧分段控制策略，得到了较高的2，3-丁二醇产量，2，3-丁二醇的浓度达到70g/L，生产强度为1.46g/L.h。本发明提供的产2，3-丁二醇菌株具有生物安全性，发酵生产的2，3-丁二醇具有广泛的用途。

具体实施方式

下面通过实施例进一步阐明本发明，但不仅限于此。

一般性说明：

葡萄糖的测定方法为：发酵液稀释后离心，采用生物传感分析仪SBA-40C(山东省科学院生物研究所)测定。测定原理为利用固定化葡萄糖脱氢酶膜专一性测定葡萄糖含量。

蔗糖的测定方法为：Agilent 1100高效液相色谱仪，G1311A四元泵，示差折光分析检测器，进样量10μL。Agilent HPLC 2D色谱工作站。色谱柱为ZORBAX碳水化合物分析柱(4.6×150mm)，柱温30～50℃，流动相为乙腈∶水＝80∶20(v/v)，流速1.2mL/min。以保留时间定性，外标法定量。

2，3-丁二醇的测定方法为：VARIAN CP-3380气相色谱仪检测。乙酸丁酯为萃取剂，体积比1∶1萃取，取上层有机相检测。具体测定的条件是：火焰离子监测器(FID)温度为280℃，进样器温度为220℃，而毛细管柱温是从50℃升温到180℃，升温速度20℃/min，载气为氮气。利用2，3-丁二醇标准品(德国Sigma-Aldrich公司，货号：361461)做出标准曲线，再根据标准曲线计算出发酵液中2，3-丁二醇的含量。

实施例1：耐高糖并且产2，3-丁二醇菌株的筛选

从果园等地取得土样，用高糖LB培养基浸泡24h，在500mL锥形瓶中装收集的浸泡液100mL，在37℃条件下，置于摇床上以180rpm的转速培养48小时。将培养液以10^-2、10^-3两个稀释度涂布在固体高糖LB培养基的培养皿中，37℃培养24h。挑单菌落，扩大培养，通过VP反应进行初筛。根据反应时间和颜色变化筛选出阳性菌株。筛选原理是2，3-丁二醇在碱性条件下氧化为双乙酰，与肌酸或胍类衍生物合成红色物质，加入α-萘酚、肌酸可以促进反应。然后测定初筛的阳性细菌的2，3-丁二醇产量，得到耐高糖并且产2，3-丁二醇的菌株，用于下一步离子束诱变。

实施例2：离子束诱变

挑取固体高糖LB培养基斜面培养的由实施例1得到的耐高糖并且产2，3-丁二醇的菌株，接种在装有灭菌的100mL高糖LB培养基的500mL锥形瓶中，在37℃条件下，置于摇床上以180rpm的转速培养24h，即制得耐高糖并且产2，3-丁二醇菌株的细胞液体培养物。

将制得的上述细胞液体培养物离心，去上清，用生理盐水洗涤后悬浮，制成菌悬液。吸取100μL涂布于装有固体高糖LB培养基的培养皿中，无菌风吹干制成菌膜后进行离子注入，离子能量为30keV，注入剂量分别为0，5×10¹⁴ions/cm²，20×10¹⁴ions/cm²，100×10¹⁴ions/cm²。离子注入后的培养皿用1mL生理盐水洗脱。各不同注入剂量分别吸取100μL，稀释1000倍，分别涂布于装有高糖LB培养基的培养皿中，在37℃条件下，静置培养36h，挑出单菌落，扩大培养，检测2，3-丁二醇产量，挑选其中最高产量的菌株。其中得到的产量最高的菌株为短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)SDM。

上述发明菌株形态为为棒杆状，菌落颜色为黄色或白色，产芽孢，VP反应成阳性，长2.0～3.0μm，直径0.6～0.7μm，能利用葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、甘露醇、果糖产酸，能水解酪蛋白、明胶、吐温80，可在45℃条件下生长。其16S rDNA序列与其他短小芽孢杆菌的16S rDNA序列(序列表中的序列1)有99％～100％的相似性。

本发明菌株定名为短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)SDM，该菌已于2010年11月22日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，湖北省武汉市武昌珞珈山)，其保藏号为：CCTCC NO：M 2010307。

实施例3：制备短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)SDM CCTCC NO：M 2010307菌株的细胞液体培养物

挑取固体高糖LB培养基斜面培养的短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)SDM CCTCCNO：M 2010307菌株一环，接种在装有灭菌的100mL高糖LB培养基的500mL锥形瓶中，置于摇床上，在37℃条件下，以180rpm的转速培养24h，得短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)SDM CCTCC NO：M 2010307菌株的细胞液体培养物。

实施例4：利用短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)SDM CCTCC NO：M 2010307菌株以葡萄糖为碳源，在5L发酵罐中生产2，3-丁二醇

将通过实施例3的方法获得的短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)SDM CCTCC NO：M2010307菌株的细胞液体培养物以50mL/L的接种量接种在装有灭菌的4L发酵培养基的5L发酵罐中，在37℃条件下，发酵前期24h搅拌转速为400rpm，通气量为1.0vvm；发酵后期24h搅拌转速为230rpm，通气量为0.4vvm。第48h 2，3-丁二醇的浓度达到70.0g/L。

上述发酵培养基配方为：1L蒸馏水中含：150g葡萄糖，7g玉米浆干粉，8g酵母粉，5g K₂HPO₄，0.3g MgSO₄·7H₂O，0.3g CaCl₂，1g乙酸钠，115℃条件下灭菌20min。

实施例5：利用短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)SDM CCTCC NO：M 2010307菌株以葡萄糖为碳源，在5L发酵罐中生产2，3-丁二醇

将通过实施例3的方法获得的短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)SDM CCTCC NO：M2010307菌株的细胞液体培养物以50mL/L的接种量接种在装有灭菌的4L发酵培养基的5L发酵罐中，在40℃条件下，发酵前期14h搅拌转速为600rpm，通气量为1.0vvm；发酵后期28h搅拌转速为350rpm，通气量为0.7vvm。第42h 2，3-丁二醇的浓度达到50.6g/L。

上述发酵培养基配方为：1L蒸馏水中含：150g葡萄糖，7g玉米浆干粉，8g酵母粉，5g K₂HPO₄，0.3g MgSO₄·7H₂O，0.3g CaCl₂，1g乙酸钠，115℃条件下灭菌20min。

实施例6：利用短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)SDM CCTCC NO：M 2010307菌株以蔗糖为碳源，在5L发酵罐中生产2，3-丁二醇

将通过实施例3的方法获得的短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)SDM CCTCC NO：M2010307菌株的细胞液体培养物以50mL/L的接种量接种在装有灭菌的4L发酵培养基的5L发酵罐中，在37℃条件下，发酵前期20h搅拌转速为500rpm，通气量为1vvm；发酵后期28h搅拌转速为200rpm，通气量为0.5vvm。第48h 2，3-丁二醇的浓度达到65.0g/L。

上述发酵培养基配方为：1L蒸馏水中含：120g蔗糖，15g玉米浆干粉，5g酵母粉，8g K₂HPO₄，0.4g MgSO₄·7H₂O，0.4g CaCl₂，2g乙酸钠，115℃条件下灭菌20min。

序  列  表

 

<110> 山东大学

<120> 一株短小芽孢杆菌及其在生产2,3-丁二醇中的应用

<141> 2010-11-29

<160> 1

<210> 1

<211> 1513

<212> DNA

<213> 短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）

<221> 短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）SDM CCTCC NO: M 2010307 16S rDNA

<222>（1）…（1513）

 

<400> 1

 

agagtttgat cctggctcag gacgaacgct ggcggcgtgc ctaatacatg caagtcgagc       60

ggacagaagg gagcttgctc ccggatgtta gcggcggacg ggtgagtaac acgtgggtaa      120

cctgcctgta agactgggat aactccggga aaccggagct aataccggat agttccttga      180

accgcatggt tcaaggatga aagacggttt cggctgtcac ttacagatgg acccgcggcg      240

cattagctag ttggtgaggt aacggctcac caaggcgacg atgcgtagcc gacctgagag      300

ggtgatcggc cacactggga ctgagacacg gcccagactc ctacgggagg cagcagtagg      360

gaatcttccg caatggacga aagtctgacg gagcaacgcc gcgtgagtga tgaaggtttt      420

cggatcgtaa agctctgttg ttagggaaga acaagtgcaa gagtaactgc ttgcaccttg      480

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aagaggagag tggaattcca cgtgtagcgg tgaaatgcgt agagatgtgg aggaacacca      720

gtggcgaagg cgactctctg gtctgtaact gacgctgagg agcgaaagcg tggggagcga      780

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ttccgcccct tagtgctgca gctaacgcat taagcactcc gcctggggag tacggtcgca      900

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tcgaagcaac gcgaagaacc ttaccaggtc ttgacatcct ctgacaaccc tagagatagg     1020

gctttccctt cggggacaga gtgacaggtg gtgcatggtt gtcgtcagct cgtgtcgtga     1080

gatgttgggt taagtcccgc aacgagcgca acccttgatc ttagttgcca gcattcagtt     1140

gggcactcta aggtgactgc cggtgacaaa ccggaggaag gtggggatga cgtcaaatca     1200

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gaccgcaagg tttagccaat cccacaaatc tgttctcagt tcggatcgca gtctgcaact     1320

cgactgcgtg aagctggaat cgctagtaat cgcggatcag catgccgcgg tgaatacgtt     1380

cccgggcctt gtacacaccg cccgtcacac cacgagagtt tgcaacaccc gaagtcggtg     1440

aggtaacctt tatggagcca gccgccgaag gtggggcaga tgattggggt gaagtcgtaa     1500

caaggtagcc gta                                                        1513

 

Claims (5)

1.一株产2，3-丁二醇的短小芽孢杆菌，其特征在于，所述短小芽孢杆菌定名为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)SDM，该菌已于2010年11月22日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏号为：CCTCC NO：M 2010307。

2.权利要求1所述短小芽孢杆菌在发酵生产2，3-丁二醇中的应用，其特征在于：所述应用涉及的方法是：

制备细胞液体培养物：挑取固体高糖LB培养基斜面培养的短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)SDM CCTCC NO：M 2010307菌株1～2环，接种在装有灭菌的100mL高糖LB培养基的500mL锥形瓶中，置于摇床上，在37℃条件下，以180±10rpm的转速培养24±2h，得所述菌株的细胞液体培养物；其中所述高糖LB培养基配方为：1L蒸馏水中含：150g葡萄糖，10g蛋白胨，5g酵母粉，10g NaCl；所述固体高糖LB培养基是在上述配方的基础上加入20g/L的琼脂粉；

以葡萄糖培养基或蔗糖培养基发酵生产2，3-丁二醇：所述发酵条件为：将上述制得的细胞液体培养物以50mL/L的接种量接种在装有灭菌的4L发酵培养基的5L发酵罐中，发酵温度为30～40℃；发酵从开始至14～24h搅拌转速控制为400～600rpm，通气量为0.8～1.2vvm；之后将搅拌转速控制为200～350rpm，通气量为0.3～0.7vvm，发酵40～60h后发酵结束，得含2，3-丁二醇发酵液；

分离提纯2，3-丁二醇：收集含2，3-丁二醇发酵液，8,000～10,000rpm离心5～10分钟，取上清液采用常规的萃取方法得天然的2，3-丁二醇产品；

其中：上述葡萄糖培养基配方为：1L蒸馏水中含：150g葡萄糖，5～15g玉米浆干粉，3～8g酵母粉，2～10g K₂HPO₄，0.05～0.4g MgSO₄·7H₂O，0.05～0.4g CaCl₂，0.5～2g乙酸钠；上述蔗糖培养基配方为：1L蒸馏水中含：120g蔗糖，5～15g玉米浆干粉，3～8g酵母粉，2～10g K₂HPO₄，0.05～0.4g MgSO₄·7H₂O，0.05～0.4g CaCl₂，0.5～2g乙酸钠。

3.如权利要求2所述短小芽孢杆菌在发酵生产2，3-丁二醇中的应用，其特征在于：所述以葡萄糖培养基或蔗糖培养基发酵生产2，3-丁二醇的发酵温度为37℃。

4.如权利要求2所述短小芽孢杆菌在发酵生产2，3-丁二醇中的应用，其特征在于：所述以葡萄糖培养基发酵生产2，3-丁二醇的发酵条件为：发酵从开始至24h搅拌转速为400rpm，通气量为1.0vvm；之后调节搅拌转速为230rpm，通气量为0.4vvm；发酵48h后发酵结束。

5.如权利要求2所述短小芽孢杆菌在发酵生产2，3-丁二醇中的应用，其特征在于：所述以蔗糖培养基发酵生产2，3-丁二醇的发酵条件为：发酵从开始至20h搅拌转速为500rpm，通气量为1vvm；之后调节搅拌转速为200rpm，通气量为0.5vvm；发酵48h后发酵结束。