CN105039216B - 气单胞菌yq及在酶法制备l-瓜氨酸中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种气单胞菌YQ及在酶法制备L‑瓜氨酸中的应用，气单胞菌(Aeromonas sp.)YQ，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC No：M 2015271，保藏日期：2015年5月3日，地址：中国，武汉，武汉大学，邮编430072；本发明筛选得到一株具有转化底物L‑精氨酸生产L‑瓜氨酸能力的菌株Aeromonas sp.YQ，该菌全细胞可在30℃～37℃，180r/min，pH＝6的醋酸缓冲液中，作用3d，可将100g/L的底物L‑精氨酸转化生成75g/L的L‑瓜氨酸，产品纯度约为47.8％，整个工艺产品总收率为40％，为酶法生产L‑瓜氨酸工业化奠定基础。
Description
(一)技术领域
本发明涉及一株产L-瓜氨酸菌种--气单胞菌(Aeromonas sp.YQ)以及采用该菌株转化底物L-精氨酸生产L-瓜氨酸的工艺方法。
(二)背景技术
L-瓜氨酸(L-citrulline)是人体尿素循环中的一种重要代谢产物，能够吸收并清除有害的自由基从而起到抗氧化的作用。瓜氨酸可以使人的血管获得松弛，用于增强男性性功能，以及治疗性功能障碍。维护建康的肺功能，提高脑力清晰度，有帮助脑神经细胞具贮藏与调回讯息的功能。L-瓜氨酸可由L-精氨酸在精氨酸脱亚胺酶作用下，脱去亚氨基生成。目前，生产L-瓜氨酸的方法主要有：发酵法、化学合成法、提取法和酶转化法。发酵法生产的缺点是L-瓜氨酸产率低。化学合成法生产的产品中含有L-瓜氨酸的旋光对映体D-瓜氨酸。提取法的生产工艺相对困难，产品很难纯化，因此成本比较高。酶转化法优点是生产条件温和，产品中无D-型旋光对映体产生。酶转化法生产L-瓜氨酸是一种效率高，成本低的生产方法，将在瓜氨酸生产中起到重要作用。转化能力较强的菌株将在未来瓜氨酸生产中扮演重要角色。
迄今尚没有气单胞菌(Aeromonas sp.)酶转化法生产L-瓜氨酸的报道。
(三)发明内容
本发明目的是提供一株可转化底物L-精氨酸生产L-瓜氨酸的新菌株--气单胞菌(Aeromonas sp.)YQ，及其酶法生产L-瓜氨酸的工艺方法。
本发明采用的技术方案是：
气单胞菌(Aeromonas sp.)YQ，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCCNo：M 2015271，保藏日期：2015年5月3日，地址：中国，武汉，武汉大学，邮编430072。
本发明菌株的获得：从浙江省杭州市勾庄西瓜大棚中采集的土壤样品，通过初筛，复筛，获得具有转化底物L-精氨酸生产L-瓜氨酸能力的纯培养物。对该纯培养物进行了形态和生理生化鉴定，将其鉴定为气单胞菌(Aeromonas sp.)，命名为气单胞菌YQ(Aeromonassp.YQ)。
本发明还涉及所述的气单胞菌YQ在酶法制备L-瓜氨酸中的应用，具体所述的应用为：以气单胞菌YQ经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，以L-精氨酸为底物，以pH＝6醋酸缓冲液为反应介质，在30℃～37℃，180r/min条件下进行转化反应，反应结束后，获得含L-瓜氨酸的混合液，将混合液分离纯化，获得L-瓜氨酸。
进一步，所述湿菌体的用量以缓冲液体积计为10.35g/L，所述底物的终浓度以缓冲液体积计为100g/L。
进一步，所述混合液分离纯化的方法为：将混合液用截留分子量为6000的超滤膜过滤，透过液调整pH值至2后进行阳离子交换树脂柱层析(装填25mL湿732型树脂的内径13mm、高250mm的玻璃吸附柱进行动态吸附，上柱温度为室温)，以质量浓度1％的氨水作为洗脱液，以1.2BV/h的流速进行洗脱，洗脱液用量为6倍树脂体积，将收集的洗脱液用NKA-II树脂脱色，随后减压浓缩，再在浓缩液中加入无水乙醇进行结晶，晶体干燥，获得L-瓜氨酸。
本发明的有益效果主要体现在：本发明筛选得到一株具有转化底物L-精氨酸生产L-瓜氨酸能力的菌株Aeromonas sp.YQ，该菌全细胞可在30℃～37℃，180r/min，pH＝6的醋酸缓冲液中，作用3d，可将100g/L的底物L-精氨酸转化生成75g/L的L-瓜氨酸，产品纯度约为47.8％，整个工艺产品总收率为40％，为酶法生产L-瓜氨酸工业化奠定基础。
(四)附图说明
图1为菌株YQ在牛肉膏蛋白胨琼脂上的菌落形态图片；
图2为菌株YQ的透射电镜图片；
图3为菌株YQ的革兰氏染色镜检图片(球状的菌株为阳性对照，杆状为菌株YQ)；
图4为菌株YQ的系统进化发育树；
图5为L-瓜氨酸标准品高效液相色谱检测图谱(A)及L-瓜氨酸浓度计算的标准曲线(B)；
图6为Aeromonas sp.YQ不同天数的转化液高效液相色谱检测图谱(A)1d，(B)2d，(C)3d及转化液中L-瓜氨酸浓度的变化趋势(D)。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：酶转化法生产L-瓜氨酸菌株的筛选
(1)菌株筛选
采集浙江省杭州市勾庄西瓜大棚中采集的土壤样品，用生理盐水制成悬液，并用生理盐水梯度稀释，涂布于筛选培养基平板，置于培养箱中，37℃培养24h，产生红色变色圈较大的菌株即为初步筛选对象。将上述菌株接种于100ml发酵培养中，37℃，180r/min培养24h，离心收集菌体转入60ml含终浓度100g/L L-精氨酸的pH为6的醋酸缓冲溶液中，置于37℃摇床，180r/min转化1d。通过HPLC测定转化液中L-瓜氨酸的浓度，比较菌体转化底物L-精氨酸生产L-瓜氨酸的能力。瓜氨酸出峰面积越大，表明菌株转化底物L-精氨酸能力越强，L-瓜氨酸产量越高。其中YQ菌株L-瓜氨酸峰面积最大为4403，转化液中瓜氨酸浓度达27g/L。保藏YQ菌株用于进一步试验。
筛选培养基：蛋白胨1g/L，NaCl 5g/L，KH2PO4 0.3g/L，L-精氨酸10g/L，酚红0.01，琼脂20g/L，溶剂为去离子水，pH 6.7。
发酵培养基组成：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，L-精氨酸2g/L，溶剂为去离子水，pH＝7.4。
(2)菌株的鉴定
菌株YQ在牛肉膏蛋白胨琼脂平板上形成的菌落(如图1所示)为圆形，微白色半透明，表明光滑边缘整齐，中间凸起。通过透射电镜观察(如图2所示)，菌株YQ呈短杆状，两端钝圆，有一根极生鞭毛。菌体的大小为(0.2～0.4)μm×(1～2)μm，革兰氏染色阴性(图3所示)，不产芽孢。菌株生理生化特性测定结果为：甲基红实验，V-P实验，运动性实验，产硫化氢实验，明胶水解实验，接触酶实验阳性阳性。吲哚实验阴性。
对该菌株YQ的DNA进行PCR扩增，以细菌16S rDNA通用引物，扩增到1439bp的DNA片段，GenBank中登录号为(KR612330)，通过NCBI数据库进行BLAST比对，结果显示该菌株与气单胞菌属(Aeromonas)的序列同源性最高，采用MEGA5.05软件将该菌株的16S rDNA序列与Genbank中的若干个相关种的16S rDNA序列进行分析比对，以Plesiomonas shigelloides(NR_044827)为外群构建系统发育树，结果如图4所示，该菌株与Aeromonas veronii B565strain B565(NR_102789)位于同一个系统发育的分支。根据该菌株形态特征、生理生化特征及16S rDNA序列分析，并参考《常见细菌鉴定手册》，该菌株与Aeromonas属特征相符，故将该菌株命名为气单胞菌YQ(Aeromonas sp.YQ)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC No：M 2015271，保藏日期：2015年5月3日，地址：中国，武汉，武汉大学，邮编430072。
实施例2菌株的活化与发酵
将气单胞菌YQ接种至斜面培养基，37℃培养24小时，获得斜面菌体。将斜面菌体接种一环于装有50mL种子培养基的250mL锥形瓶中，37℃，180rpm下培养24小时，获得种子液。再以体积浓度4％的接种量将种子液接种于100ml发酵培养基中，37℃，180r/min培养24h，将发酵液于6000rpm离心10min，收集菌体用灭菌生理盐水洗涤1～2次，获得湿菌体。
斜面培养基组成：蛋白胨10g/L，牛肉膏5g/L，NaCl 3g/L，KH2PO4 2g/L，溶剂为去离子水，琼脂20g/L，pH＝7.4。
种子培养基组成：蛋白胨10g/L，牛肉膏5g/L，NaCl 3g/L，KH2PO4 2g/L，溶剂为去离子水，pH＝7.4。
发酵培养基组成：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，L-精氨酸2g/L，溶剂为去离子水，pH＝7.4。
实施例3：气单胞菌YQ转化液的制备及L-瓜氨酸衍生化
将实施例2制备的湿菌体0.621g加入60ml含终浓度100g/L L-精氨酸的pH＝6醋酸缓冲液中，反复吹打均匀，装液量60mL，置于37℃，180r/min开始转化反应。转化反应3d后，每24h取转化液10000r/min离心5min，上清用蒸馏水稀释30倍，取1mL放入10mL的棕色容量瓶中(因为衍生物见光易分解)，加入配制好的pH值为9的Na2CO3-NaHCO3缓冲液1mL，再加入1mL的体积浓度1.5％的2,4-二硝基氟苯乙腈溶液后摇匀，60℃水浴加热1h后，用pH值为7的K2HPO4-KH2PO4缓冲液定容。衍生化后的样品(定容后的溶液)10000r/min离心5min，取0.6mL入棕色液相瓶中，采用HPLC测L-瓜氨酸浓度。气单胞菌YQ转化L-精氨酸1d、2d、3d后，HPLC检测得L-瓜氨酸峰面积依次为4403.15479、10034.5、11550.1，L-瓜氨酸浓度依次为27.37g/L，65.31g/L，75.52g/L。
将混合液用截留分子量为6000的超滤膜过滤，透过液调整pH值至2后进行阳离子交换树脂柱层析(732型树脂)，以质量浓度1％的氨水作为洗脱液，以1.2BV/h的流速进行洗脱，洗脱液用量为6倍树脂体积，将收集的洗脱液用NKA-II树脂脱色，随后减压浓缩，再在浓缩液中加入无水乙醇进行结晶，晶体干燥，获得L-瓜氨酸。产品纯度约为47.8％，整个工艺产品总收率为40％。
使用Agilent XDB-C18色谱柱(250mmX4.6mm)。流动相A为含1％N，N-二甲基甲酰胺的0.05mol/LNaAc和HAc缓冲溶液，流动相B为乙腈-水(3:1)。实验采用梯度洗脱，流动相A和B的体积比为：初始A与B的体积比为75％：25％；10min后A与B的体积比为40％：60％；13min时A与B的体积比增至5％：95％；17min时A与B的体积比还原为75％：25％；20min洗脱结束。流速1.0mL/min，进样量5μL，二极管阵列(DAD)检测器，检测波长360nm。
同样条件下制备L-瓜氨酸标准品(购自Sigma公司)的衍生化样品，L-瓜氨酸衍生化样品中L-瓜氨酸的浓度为0.2g/L，分别进样2μL，4μL，6μL，8μL，10μL，平行进样五次，确定L-瓜氨酸的出峰时间(如图5中A所示瓜氨酸的出峰时间为5.211min)，并以L-瓜氨酸标准品衍生化样品进样量为横坐标，以峰面积为纵坐标制作绘制进样量与峰面积的线性关系图(图5中B)。标准曲线的回归方程为y＝8905x+340.25，R2＝0.997。检测样品瓜氨酸浓度的计算方法为：经HPLC检测得样本瓜氨酸的峰面积y值，带入标准曲线换算出进样量x值，除以进样体积，乘以转化液的稀释倍数即为样品转化液中的瓜氨酸浓度。
实施例4气单胞菌YQ转化底物L-精氨酸及产物L-瓜氨酸的检测
(1)气单胞菌YQ转化底物L-精氨酸
将实施例2制备的湿菌体0.621g加入60ml含终浓度100g/L精氨酸的pH＝6醋酸缓冲液中，反复吹打均匀，装液量60mL，置于37℃，180r/min开始转化，分别于1d，2d，3d时取样1mL。L-瓜氨酸浓度检测方法同实施例3，结果如图6所示。图6中A、B、C分别为转化1d，2d，3d后转化液中L-瓜氨酸的HPLC检测图谱，5.1min为瓜氨酸的出峰时间，所得的峰面积根据绘制的标准曲线换算，1d，2d，3d的瓜氨酸浓度分别为27.37g/L，65.31g/L，75.52g/L。图6中D为转化3d转化液中瓜氨酸浓度的变化趋势。由图可知，转化1d，2d两个时间点之间的斜率最陡，瓜氨酸产生速率最大。这可能是由于第0天转入的菌体在高浓度底物L-精氨酸的刺激下持续表达精氨酸脱亚胺酶，经过1d的转化反应在胞内累积了大量的精氨酸脱亚胺酶，酶量的增加加速了酶促反应，使得瓜氨酸的产生速率加快。而后由于酶的稳定性，产物等因素反馈抑制了瓜氨酸的进一步产生，使得瓜氨酸产生速率大幅度降低，3d后瓜氨酸浓度趋于稳定。
Claims (4)
1.一种气单胞菌(Aeromonas sp.)YQ在酶法生产L-瓜氨酸中的应用，其特征在于所述的应用为：以气单胞菌YQ经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，以L-精氨酸为底物，以pH＝6醋酸缓冲液为反应介质，在30℃～37℃，180r/min条件下进行转化反应，反应结束后，获得含L-瓜氨酸的混合液，将混合液分离纯化，获得L-瓜氨酸；气单胞菌(Aeromonas sp.)YQ，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC No：M 2015271，保藏日期：2015年5月3日，地址：中国，武汉，武汉大学，邮编430072。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述湿菌体的用量以缓冲液体积计为10.35g/L，所述底物的终浓度以缓冲液体积计为100g/L。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述湿菌体的制备方法为：将气单胞菌YQ接种至斜面培养基，37℃培养24小时，获得斜面菌体；将斜面菌体接种一环于装有50mL种子培养基的250mL锥形瓶中，37℃，180rpm下培养24小时，获得种子液；再以体积浓度4％的接种量将种子液接种于100ml发酵培养基中，37℃，180r/min培养24h，将发酵液于6000rpm离心10min，收集菌体用灭菌生理盐水洗涤1～2次，获得湿菌体；
斜面培养基组成：蛋白胨10g/L，牛肉膏5g/L，NaCl 3g/L，KH2PO4 2g/L，溶剂为去离子水，琼脂20g/L，pH＝7.4；
种子培养基组成：蛋白胨10g/L，牛肉膏5g/L，NaCl 3g/L，KH2PO4 2g/L，溶剂为去离子水，pH＝7.4；
发酵培养基组成：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，L-精氨酸2g/L，溶剂为去离子水，pH＝7.4。
4.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述混合液分离纯化的方法为：将混合液用截留分子量为6000的超滤膜过滤，透过液调整pH值至2后进行阳离子交换树脂柱层析，以质量浓度1％的氨水作为洗脱液，以1.2BV/h的流速进行洗脱，洗脱液用量为6倍树脂体积，将收集的洗脱液用NKA-II树脂脱色，随后减压浓缩，再在浓缩液中加入无水乙醇进行结晶，晶体干燥，获得L-瓜氨酸。
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