CN107354186A - 一种同步糖化制备细菌纤维素的方法 - Google Patents

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CN107354186A CN201710622257.4A CN201710622257A CN107354186A CN 107354186 A CN107354186 A CN 107354186A CN 201710622257 A CN201710622257 A CN 201710622257A CN 107354186 A CN107354186 A CN 107354186A
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邹小周
陈根强
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Abstract

本发明涉及一种同步糖化制备细菌纤维素的方法，包括：将菊芋清洗去泥后直接机械粉碎，匀浆；或将清洗干净的菊芋进行蒸煮，匀浆；或将清洗干净的菊芋进行蒸煮，将蒸煮后的菊芋与回收的蒸煮液混合，匀浆，得到菊芋匀浆液；向菊芋匀浆液或菊粉溶解于水中得到菊粉溶液中，补加氮源，调节pH为4～6，灭菌得到培养基体系，同时加入水解酶和产纤维素微生物，进行同步糖化培养发酵，经碱煮‑水煮纯化，去除杂质，得到细菌纤维素纯净物。本发明采用菊芋同步糖化发酵法制备细菌纤维素，简化工艺流程，降低设备投入，提高生产效率；实现边水解边发酵的过程，且该生产工艺原料来源广泛，成本低，细菌纤维素产量高，在细菌纤维素的生产领域具有应用前景。

Description

一种同步糖化制备细菌纤维素的方法
技术领域
本发明属于细菌纤维素的技术领域，特别涉及一种同步糖化制备细菌纤维素的方法。
背景技术
细菌纤维素(Bacterial Nanocellulose，简称BNC)是由微生物生产的多糖类高分子。细菌纤维素具有独特纳米纤维网状结构、高结晶度、高聚合度、高持水率、良好的生物相容性等优良特性，在医学材料、食品、造纸材料、复合材料、环境保护等各领域具有广阔应用前景。然而细菌纤维素工业大规模生产的主要困难是成本高、产率低。利用价格低廉、来源广泛的可再生性农林产品生产细菌纤维素，并改良生产工艺可以有效降低生产成本。
传统制备细菌纤维素的方法为先酸解或酶解原料，再发酵生产细菌纤维素的两步法，该方法制备过程繁杂、消耗原料多、加工成本高，不利于维持较高的生产强度。同步糖化发酵法是指原料的水解与发酵共同进行的工艺。国内外并没有报道过同步糖化生产细菌纤维素的消息。
菊芋在我国资源丰富，种植广泛，存储方便且价格低廉，可用于为发酵提供碳源。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种菊芋同步糖化制备细菌纤维素的方法，本发明采用同步糖化发酵法水解糖化过程与细菌纤维素发酵生产过程耦合在一起，在同一装置内同步进行，水解产物果糖不断被菌体利用，消除了底物反馈抑制作用，简化了流程和设备，提高了生产效率，降低了设备投资，而且整体降低了过程成本，可操作性强，有利于维持较高的生产强度，从而具有良好的工业化应用前景。
本发明的一种同步糖化制备细菌纤维素的方法，包括：
(1)将菊芋清洗去泥后直接机械粉碎，匀浆，得到菊芋匀浆液；
或将清洗干净的菊芋直接加入蒸煮用水中，进行蒸煮、灭酶，匀浆，得到菊芋匀浆液，其中菊芋与蒸煮用水的质量体积比为5～10kg：10～20L；
或将清洗干净的菊芋直接加入蒸煮用水中，进行蒸煮、灭酶，回收蒸煮用水作为蒸煮液，将蒸煮后的菊芋与回收的蒸煮液混合，匀浆，得到菊芋匀浆液，其中菊芋与蒸煮用水的质量体积比为5～10kg：10～20L；蒸煮后的菊芋与蒸煮液的质量体积比为1g：1～10mL；
(2)将步骤(1)中的菊芋匀浆液，补加氮源，调节pH为4～6，灭菌备用；
或将菊粉溶解于水中得到菊粉溶液，其中菊粉溶液的浓度小于200g/L，补加氮源，调节pH为4～6，灭菌备用；
(3)将水解酶和产纤维素微生物同时加入步骤(2)得到的溶液体系中，进行同步糖化培养发酵，经碱煮-水煮纯化，去除杂质，得到细菌纤维素纯净物，其中水解酶的用量为200～5500U/L；产纤维素微生物的用量为5～15v/v％接种量。
所述步骤(1)中蒸煮的工艺参数为：蒸煮温度为80～130℃，蒸煮时间为15～60min。
所述步骤(2)中调节pH值采用缓冲溶液或酸。
所述缓冲溶液为柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液；所述酸选自醋酸或硫酸。
所述步骤(2)中的氮源为0.1～1wt％的酵母提取物和0.1～1wt％的胰蛋白胨；或为0.1-2wt％的硫酸铵、玉米浆或麦芽汁。
所述步骤(3)中的水解酶为菊粉酶、果聚糖酶、葡聚糖酶、纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、糖化酶、糊精酶或淀粉酶中的一种或几种。
所述步骤(3)中的产纤维素微生物为醋酸菌属(Acetobacter sp.)、葡萄糖酸杆菌属(Gluconobacter sp.)、葡糖酸醋杆菌属(Gluconacetobacter sp.)、葡萄糖氧化杆菌(Gluconobacter oxydans)、根瘤菌属(Rhizobium sp.)、八叠球菌属(Sarcina sp.)、假单胞菌属(Pseudomounas sp.)、无色杆菌属(Achromobacter sp.)、产碱菌属(Alcaligenessp.)、气杆菌属(Aerobacter sp.)、固氮菌属(Azotobacter sp.)、土壤杆菌属(Agrobacterium sp.)、洋葱假单胞菌(Seudomonas cepacia)、空肠弯曲菌(Campylobacterjejuni)、木葡糖酸醋杆菌(Gluconacetobacter xylinus)或红茶菌(kombucha)的一种或几种。
所述细菌纤维素生产菌株静态培养7天的含有大量活菌的细菌纤维素膜备用。在无菌操作下，用剪刀、镊子从活菌膜上剪取约1cm3膜，用剪刀剪碎，接种在种子培养基中。将接有菌种的种子培养基放入恒温震荡摇床内，在30℃，160rpm的条件下培养24～48h。直至种子液中有少量的絮状纤维生成，说明种子已经进入对数生长的后期，可以作为发酵实验的菌种使用。
所述步骤(3)中的培养的工艺参数为：培养周期为7～14天，培养温度为25～35℃，先进行动态培养，然后进行静态培养，其中动态培养恒温震荡摇瓶转速为80～170rpm。
所述步骤(3)中的碱煮-水煮纯化的工艺为：在浓度为0.5～1.5％的NaOH溶液70～90℃水浴条件下碱煮1～3h，再水煮1～3h，依次交替，循环3～5次，直至细菌纤维素膜呈现干净白色或透明状，且水煮溶液的pH为中性。
同步糖化菊芋/菊粉发酵生产细菌纤维素实现了边水解边发酵的一步制备过程，利用菊粉酶作用于底物，产生供发酵用的碳源，在细菌纤维素生产菌的作用下，产生高附加值的产品--细菌纤维素。选择合适的微生物菌种，对于利用同步糖化产细菌纤维素十分必要。一个适当的菌种可能更适合于同步糖化工艺，具有更高的细菌纤维素产率。
有益效果
(1)本发明采用同步糖化制备细菌纤维素，做出了极为有效的工艺简化，主要表现在以下两个方面：
其一，菊芋蒸煮过程即起到了灭酶的作用又有对菊芋中的菊糖进行浸提的效果，在该工艺步骤中，蒸煮所用的去离子水可作为菊糖浸提液进行回收，并在匀浆阶段配入干物质使用，有效提高糖的得率；
其二，水解糖化和发酵过程同时进行，简化了工艺步骤，节约人力物力。实验数据表明，在同等条件下，采用同步糖化工艺生产的细菌纤维素产量高于对照组。
(2)本发明的同步糖化制备细菌纤维素方法，简化了流程和设备，提高了生产效率，降低了设备投资，而且整体降低了过程成本，可操作性强，有利于维持较高的生产强度，从而具有良好的工业化应用前景。
(3)本发明的工艺原料来源广泛，成本低，且生产所得的细菌纤维素产量高，在细菌纤维素的生产领域具有应用前景。
附图说明
图1为本发明同步糖化制备细菌纤维素的技术路线图；
图2为实施例1菊芋/菊粉同步糖化制备细菌纤维素过程中0-24小时体系中还原糖的变化情况；
图3为实施例1菊芋/菊粉同步糖化制备细菌纤维素的粗干重产量；
图4为实施例2菊芋/菊粉同步糖化制备细菌纤维素过程中0-24小时体系中还原糖的变化情况；
图5为实施例2菊芋/菊粉同步糖化制备细菌纤维素的粗干重产量；
图6为实施例3菊芋同步糖化制备细菌纤维素的粗干重产量；
图7为实施例4菊芋同步糖化制备细菌纤维素过程中0-24小时体系中糖的变化情况；
图8为实施例5菊芋同步糖化制备细菌纤维素过程中0-24小时体系中糖的变化情况；
图9为实施例6菊芋同步糖化制备细菌纤维素过程中0-24小时体系中糖的变化情况；
图10为实施例7菊芋/菊粉同步糖化制备细菌纤维素过程中0-24小时体系中还原糖的变化情况；
图11为实施例7菊芋/菊粉同步糖化制备细菌纤维素过程中0-13天体系中还原糖的变化情况；
图12为实施例8菊芋同步糖化/非同步糖化制备细菌纤维素过程中0-24小时体系中还原糖的变化情况；
图13为实施例8菊芋同步糖化/非同步糖化制备细菌纤维素过程中0-13天体系中还原糖的变化情况；
图14为实施例9果糖/葡萄糖/菊芋同步糖化制备细菌纤维素过程中0-24小时体系中还原糖的变化情况；
图15为实施例9果糖/葡萄糖/菊芋同步糖化制备细菌纤维素过程中0-13天体系中还原糖的变化情况；
图16为实施例10果糖/葡萄糖/菊芋同步糖化/非同步糖化制备细菌纤维素的净湿重产量；
图17为实施例11葡萄糖/菊芋同步糖化/非同步糖化制备细菌纤维素的净湿重产量；
图18为实施例12果糖//菊芋同步糖化制备细菌纤维素的净干重产量；
图19为实施例13菊芋/菊粉同步糖化制备细菌纤维素过程中0-24小时体系中还原糖的变化情况；
图20为实施例13菊芋/菊粉同步糖化制备细菌纤维素的粗干重产量。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
(1)将10kg清洗干净的菊芋置于加温加压反应器中，加入10L去离子水，在80℃条件下蒸煮60min，回收蒸煮用水作为蒸煮液，将蒸煮灭酶后的菊芋和回收的蒸煮液分别分装，在4℃冰箱内冷藏备用。将蒸煮后的菊芋与蒸煮液以质量体积比为1g:1ml混合，匀浆，得到菊芋匀浆液。
(2)将步骤(1)得到的菊芋匀浆液与pH为4的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液按体积比1:1混合。配制20g/L菊糖溶液，用醋酸将pH调节到4。在上述两种溶液中，分别加入0.1wt％酵母浸提物和1wt％胰蛋白胨，灭菌备用。
(3)在步骤(2)中得到的两种液体体系中同时加入总体系体积800U/L菊粉酶以及200U/L的果聚糖酶，以及接种量为10v/v％的木醋细菌G.xylinus ATCC 23770菌悬液，在30℃条件下进行同步糖化发酵培养，同步糖化周期设定为7天。其中前24h以转速为80rpm的摇瓶动态培养，后6天静置培养。
(4)发酵培养结束后收集纤维素，在浓度为1％的NaOH溶液80℃水浴条件下碱煮2h，再水煮2h，依次交替循环3次，直至细菌纤维素膜呈现干净白色或透明状，且水煮溶液的pH为中性，得到细菌纤维素纯净物。
同步糖化的前24h以DNS法测还原糖，实验结果如图2所示，菊粉为原料时，在同步糖化的前两个小时内迅速水解，还原糖达到18g/L，之后还原糖仅少量增加。菊芋为原料时，在同步糖化的前10个小时内，还原糖量逐渐增加，第10-24小时内还原糖量有小幅度的变化。将同步糖化发酵得到的细菌纤维素膜，在105℃条件下烘干至恒重，其结果如图3所示，经过7天的同步糖化发酵，以菊粉和菊芋为原料，得到的细菌纤维素产量分别为6.5g/L和15.6g/L。以上结果表明采用菊芋同步糖化工艺生产的细菌纤维素产量高于菊粉同步糖化工艺生产的细菌纤维素。
实施例2
(1)将5kg清洗干净的菊芋置于加温加压反应器中，加入20L去离子水，在130℃条件下蒸煮15min，回收蒸煮用水作为蒸煮液，将蒸煮灭酶后的菊芋和回收的蒸煮液分别分装，在4℃冰箱内冷藏备用。将蒸煮后的菊芋与蒸煮液以质量体积比为1g:5ml混合，匀浆，得到菊芋匀浆液。
(2)将步骤(1)得到的菊芋匀浆液调节pH为6。配制200g/L菊粉溶液，用醋酸将pH调节到6。在上述两种溶液中，加入1wt％酵母浸提物和0.1wt％胰蛋白胨，灭菌备用。
(3)在步骤(2)中得到的两种液体体系中同时加入总体系体积1000U/L菊粉酶以及200U/L的纤维素酶，以及接种量为10v/v％的木醋细菌G.xylinus ATCC 23770菌悬液，在30℃条件下进行同步糖化实验，同步糖化周期设定为14天。其中前24h以转速为100rpm的摇瓶动态培养，后13天静置培养。
(4)发酵培养结束后收集纤维素，在浓度为1％的NaOH溶液80℃水浴条件下碱煮2h，再水煮2h，依次交替循环3次，直至细菌纤维素膜呈现干净白色或透明状，且水煮溶液的pH为中性，得到细菌纤维素纯净物。
同步糖化的前24h以DNS法测还原糖，实验结果如图4所示，菊粉组的还原糖在同步糖化前2小时内迅速增加至38g/L，菊芋组在6小时内水解得到还原糖40g/L。将同步糖化发酵得到的细菌纤维素膜，在105℃条件下烘干至恒重，其结果如图5所示，经过14天的同步糖化发酵过程，菊粉组和菊芋组分别得到11.5g/L和10.6g/L的细菌纤维素。以上结果表明菊粉同步糖化工艺生产的细菌纤维素产量高于菊芋同步糖化工艺生产的细菌纤维素。
实施例3
(1)将10kg清洗干净的菊芋置于加温加压反应器中，加入10L去离子水，在110℃条件下蒸煮30min，回收蒸煮用水作为蒸煮液，将蒸煮灭酶后的菊芋和回收的蒸煮液分别分装，在4℃冰箱内冷藏备用。将蒸煮后的菊芋与蒸煮液以质量体积比为1g:10ml混合，匀浆，得到菊芋匀浆液1。
(2)称取500g清洗过的菊芋，加入1500mL去离子水，直接匀浆，得到菊芋匀浆液2。
(3)将步骤(1)和步骤(2)得到的菊芋匀浆液调节pH到5。在上述两种溶液中，加入10％的麦芽汁，得到菊芋培养基，灭菌备用。
(4)在步骤(2)中得到的两种液体体系中同时加入总体系体积5000U/L的菊粉酶以及200U/L的果胶酶，以及接种量为10v/v％的木醋细菌G.xylinus ATCC 23767菌悬液，在30℃条件下进行同步糖化发酵实验，同步糖化周期设定为10天。其中前48h以转速为120rpm的摇瓶动态培养，后8天静置培养。
(5)发酵培养结束后收集纤维素，在浓度为1％的NaOH溶液80℃水浴条件下碱煮2h，再水煮2h，依次交替循环3次，直至细菌纤维素膜呈现干净白色或透明状，且水煮溶液的pH为中性，得到细菌纤维素纯净物。
将得到的细菌纤维素膜，在105℃条件下烘干至恒重，其结果如图6所示，经过10天的同步糖化发酵，两组菊芋匀浆中的到的细菌纤维素粗干重分别为6.3g/L和8.4g/L。结果表明菊芋匀浆液2同步糖化工艺生产的细菌纤维素产量高于菊芋匀浆液1同步糖化工艺生产的细菌纤维素。
实施例4
(1)将10kg清洗干净的菊芋置于加温加压反应器中，加入10L去离子水，在80℃条件下蒸煮15min，回收蒸煮用水作为蒸煮液，将蒸煮灭酶后的菊芋和回收的蒸煮液分别分装，在4℃冰箱内冷藏备用。将蒸煮后的菊芋与蒸煮液以质量体积比为1g:1ml混合，匀浆，得到菊芋匀浆液。
(2)将步骤(1)得到的菊芋匀浆液与pH为5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液按体积比1:1混合。在上述溶液中，分别加入0.1wt％酵母浸提物和1wt％胰蛋白胨，灭菌，得到菊芋培养基备用。
(3)在步骤(2)中得到的液体体系中同时加入总体系体积200U/L的菊粉酶，以及接种量为10v/v％的木醋细菌G.xylinus ATCC 23767菌悬液，在30℃条件下进行同步糖化发酵培养，同步糖化周期设定为11天。其中前24h以转速为100rpm的摇瓶动态培养，后10天静置培养。
(4)设计一组不加酶只加菊芋和缓冲溶液的空白对照实验。
(5)发酵培养结束后收集纤维素，在浓度为1％的NaOH溶液80℃水浴条件下碱煮2h，再水煮2h，依次交替循环3次，直至细菌纤维素膜呈现干净白色或透明状，且水煮溶液的pH为中性，得到细菌纤维素纯净物。
以硫酸苯酚法测总糖，以DNS法测还原糖，实验结果如图7所示，同步糖化24小时，还原糖浓度达到19g/L，此时总糖含量为48.6g/L，还原糖相对于总糖的比值为39％，表明水解率不高。菊芋原料水解不完全的主要原因是加酶量偏低。
实施例5
(1)将10kg清洗干净的菊芋置于加温加压反应器中，加入10L去离子水，在121℃条件下蒸煮20min，回收蒸煮用水作为蒸煮液，将蒸煮灭酶后的菊芋和回收的蒸煮液分别分装，在4℃冰箱内冷藏备用。将蒸煮后的菊芋与蒸煮液以质量体积比为1g:2ml混合，匀浆，得到菊芋匀浆液。
(2)将步骤(1)得到的菊芋匀浆液用硫酸调节pH为5.5。在上述溶液中，加入0.1wt％酵母浸提物和1wt％胰蛋白胨，灭菌，得到菊芋培养基，备用。
(3)在步骤(2)中得到的液体体系中同时加入总体系体积1000U/L的菊粉酶，以及接种量为5v/v％的木醋细菌G.xylinus ATCC 23770菌悬液，在30℃条件下进行同步糖化发酵培养，同步糖化周期设定为7天。其中前24h以转速为100rpm的摇瓶动态培养，后6天静置培养。
(4)设计一组不加酶只加菊芋和缓冲溶液的空白对照实验。
(5)发酵培养结束后收集纤维素，在浓度为1％的NaOH溶液80℃水浴条件下碱煮2h，再水煮2h，依次交替循环3次，直至细菌纤维素膜呈现干净白色或透明状，且水煮溶液的pH为中性，得到细菌纤维素纯净物。
以硫酸苯酚法测总糖，以DNS法测还原糖，实验结果如图8所示，同步糖化24小时，还原糖浓度达到87g/L，此时总糖含量121g/L，还原糖相对于总糖的比率为72％，表明随着加酶量的提高，菊芋的水解程度也有所提高。
实施例6
(1)将5kg清洗干净的菊芋置于加温加压反应器中，加入10L去离子水，在115℃条件下蒸煮30min，回收蒸煮用水作为蒸煮液，将蒸煮灭酶后的菊芋和回收的蒸煮液分别分装，在4℃冰箱内冷藏备用。将蒸煮后的菊芋与蒸煮液以质量体积比为1g:1ml混合，匀浆，得到菊芋匀浆液。
(2)将步骤(1)得到的菊芋匀浆液与pH为5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液按体积比1:1混合。在上述溶液中，加入0.1wt％酵母浸提物和1wt％胰蛋白胨，灭菌，得到菊芋培养基备用。
(3)在步骤(2)中得到的液体体系中同时加入总体系体积1800U/L的菊粉酶，以及接种量为5v/v％的木醋细菌G.xylinus ATCC 23767菌悬液，在30℃条件下进行同步糖化发酵培养，同步糖化周期设定为7天。其中前24h以转速为100rpm的摇瓶动态培养，后6天静置培养。
(4)设计一组不加酶只加菊芋和缓冲溶液的空白对照实验。
(5)发酵培养结束后收集纤维素，在浓度为1％的NaOH溶液80℃水浴条件下碱煮2h，再水煮2h，依次交替循环3次，直至细菌纤维素膜呈现干净白色或透明状，且水煮溶液的pH为中性，得到细菌纤维素纯净物。
以硫酸苯酚法测总糖，以DNS法测还原糖，实验结果如图9所示，同步糖化24小时，还原糖浓度达到50g/L，此时总糖含量55g/L，还原糖相对于总糖的比率为91％，表明菊芋的水解比较完全。
实施例7
(1)将5kg清洗干净的菊芋置于加温加压反应器中，加入10L去离子水，在115℃条件下蒸煮30min，回收蒸煮用水作为蒸煮液，将蒸煮灭酶后的菊芋和回收的蒸煮液分别分装，在4℃冰箱内冷藏备用。将蒸煮后的菊芋与蒸煮液以质量体积比为1g:2ml混合，匀浆，得到菊芋匀浆液。
(2)将步骤(1)得到的菊芋匀浆液与pH为5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液按体积比1:1混合。配制35g/L菊粉溶液，用醋酸将pH调节到5。在上述两种溶液中，分别加入0.5wt％酵母浸提物和0.3wt％胰蛋白胨，灭菌备用。
(3)在步骤(2)中得到的两种液体体系中分别同时加入总体系体积800U/L菊粉酶，以及接种量为5v/v％的木醋细菌G.xylinus ATCC 23770菌悬液，在30℃条件下进行同步糖化发酵培养。将这一时间记为0h，同步糖化周期设定为13天。其中前24h以转速为80rpm的摇瓶动态培养，后12天静置培养。
(4)发酵培养结束后收集纤维素，在浓度为1％的NaOH溶液80℃水浴条件下碱煮2h，再水煮2h，依次交替循环3次，直至细菌纤维素膜呈现干净白色或透明状，且水煮溶液的pH为中性，得到细菌纤维素纯净物。
同步糖化前24h酶解反应占主要作用。分析此阶段的总糖和还原糖变化情况，可以验证菊芋的水解程度，以及检测酶在同步糖化中是否有效，其结果如图10所示，菊粉同步糖化组的还原糖生成速度比菊芋同步糖化组的快，24h后菊芋组和菊粉组的还原糖分别为31g/L和35g/L。每隔两天取样测定糖的残余量，其结果如图11所示，在13天的同步糖化过程中，菊芋和菊粉都可逐渐被菌种利用，发酵13天后还原糖分别为10.4g/L和23.1g/L。通过比较可知，同步糖化工艺在简化工艺，减少操作单元的情况下，菊芋和菊粉都可以作为同步糖化的碳源使用。
实施例8
(1)将10kg清洗干净的菊芋置于加温加压反应器中，加入20L去离子水，在121℃条件下蒸煮20min，回收蒸煮用水作为蒸煮液，将蒸煮灭酶后的菊芋和回收的蒸煮液分别分装，在4℃冰箱内冷藏备用。将蒸煮后的菊芋与蒸煮液以质量体积比为1g:2ml混合，匀浆，得到菊芋匀浆液。
(2)将步骤(1)得到的菊芋匀浆液与pH为5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液按体积比1:1.5混合，加入0.5wt％酵母浸提物和0.5wt％胰蛋白胨，灭菌备用。
(3)在步骤(2)中得到的液体体系中同时加入总体系体积1000U/L菊粉酶，以及接种量为5v/v％的木醋细菌G.xylinus ATCC 23770菌悬液，在30℃条件下进行同步糖化发酵培养。将这一时间记为0h，同步糖化周期设定为13天。其中前24h以转速为80rpm的摇瓶动态培养，后12天静置培养。
(4)设计非同步糖化对照实验，在步骤(2)得到的菊芋培养基中先加入总体系体积1000U/L菊粉酶，24h后加入接种量为5v/v％的木醋细菌G.xylinus ATCC 23770菌悬液，在30℃恒温培养箱静态培养。发酵周期为13天的条件下进行非同步糖化发酵培养。
(5)发酵培养结束后收集纤维素，在浓度为1％的NaOH溶液80℃水浴条件下碱煮2h，再水煮2h，依次交替循环3次，直至细菌纤维素膜呈现干净白色或透明状，且水煮溶液的pH为中性，得到细菌纤维素纯净物。
同步糖化前24h还原糖变化情况如图12所示，同步糖化组和非同步糖化组(区别在于接种时间)在前24h的底物水解趋势基本相同。同步糖化组第24h的还原糖浓度为38.7g/L，略低于非同步糖化组的41.6g/L，这是由于可能存在菌种少量耗糖的情况。0-13天发酵周期内糖代谢的结果如图13所示，在13天的培养周期中，两组的还原糖都被消耗，第13天，非同步糖化组的糖浓为13g/L，同步糖化组为4g/L，接种较早的同步糖化组中的微生物细胞耗糖代谢更为活跃。实验结果显示，非同步糖化工艺适用于多个菌种，且适用于静态发酵。
实施例9
(1)将10kg清洗干净的菊芋置于加温加压反应器中，加入20L去离子水，在121℃条件下蒸煮20min，回收蒸煮用水作为蒸煮液，将蒸煮灭酶后的菊芋和回收的蒸煮液分别分装，在4℃冰箱内冷藏备用。将蒸煮后的菊芋与蒸煮液以质量体积比为1g:2ml混合，匀浆，得到菊芋匀浆液。
(2)将步骤(1)得到的菊芋匀浆液与pH为5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液按体积比1:1混合，加入0.5wt％酵母浸提物和0.5wt％胰蛋白胨，灭菌备用。
(3)在步骤(2)中得到的液体体系中同时加入总体系体积1800U/L菊粉酶，以及接种量为5v/v％的木醋细菌G.xylinus ATCC 23770菌悬液，在30℃条件下进行同步糖化发酵培养。将这一时间记为0h，同步糖化周期设定为13天。其中前24h以转速为80rpm的摇瓶动态培养，后12天静置培养。
(4)设计果糖培养基对照实验，在浓度为50g/L的果糖培养基中加入0.5wt％酵母浸提物和0.5wt％胰蛋白胨，用硫酸将pH调为5.5，灭菌。加入接种量为5v/v％的木醋细菌G.xylinus ATCC 23770菌悬液，在30℃恒温培养箱静态培养，发酵周期为13天的条件下进行果糖糖化发酵培养。
(5)设计葡萄糖培养基对照实验，在浓度为40g/L的葡萄糖培养基，加入0.5wt％酵母浸提物和0.5wt％胰蛋白胨，用硫酸将pH调为5.5，灭菌。加入接种量为5v/v％的木醋细菌G.xylinus ATCC 23770菌悬液，在30℃恒温培养箱静态培养，发酵周期为13天的条件下进行葡萄糖糖化发酵培养。
(6)发酵培养结束后收集纤维素，在浓度为1％的NaOH溶液80℃水浴条件下碱煮2h，再水煮2h，依次交替循环3次，直至细菌纤维素膜呈现干净白色或透明状，且水煮溶液的pH为中性，得到细菌纤维素纯净物。
菊芋同步糖化前24h还原糖变化情况如图14所示，前24h中，随着底物的水解，菊芋同步糖化组的还原糖上升到38.7g/L，水平接近葡萄糖和果糖对照组(分别为41.6g/L和40.7g/L)。0-13天发酵周期内糖代谢的结果如图15所示，在13天的发酵周期中，可见同步糖化组的还原糖消耗速度明显大于葡萄糖和果糖对照组，在发酵结尾时，同步糖化组的还原糖浓度下降为4.1g/L，此时葡萄糖和果糖对照组的残余还原糖浓度分别为18.9g/L和14.5g/L。由此可见菊芋同步糖化实验组的碳源利用速度更快，效率更高。
实施例10
(1)将5kg清洗干净的菊芋置于加温加压反应器中，加入15L去离子水，在115℃条件下蒸煮20min，回收蒸煮用水作为蒸煮液，将蒸煮灭酶后的菊芋和回收的蒸煮液分别分装，在4℃冰箱内冷藏备用。将蒸煮后的菊芋与蒸煮液以质量体积比为1g:2ml混合，匀浆，得到菊芋匀浆液。
(2)将步骤(1)得到的菊芋匀浆液与pH为5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液按体积比1:1混合，加入0.5wt％酵母浸提物和0.5wt％胰蛋白胨，灭菌备用。
(3)在步骤(2)中得到的液体体系中同时加入总体系体积1000U/L菊粉酶，以及接种量为5v/v％的木醋细菌G.xylinus ATCC NBRC 3288实验菌种，在30℃条件下进行同步糖化发酵培养。将这一时间记为0h，同步糖化周期设定为7天。其中前24h以转速为80rpm的摇瓶动态培养，后6天静置培养。
(4)设计非同步糖化对照实验，在步骤(2)得到的液体体系中先加入总体系体积1000U/L菊粉酶，24h后加入接种量为5v/v％的木醋细菌G.xylinus ATCC NBRC 3288实验菌种，在30℃条件下进行恒温培养箱静态培养，发酵周期为7天。
(5)设计果糖培养基对照实验，在浓度为50g/L的果糖培养基中加入0.5wt％酵母浸提物和0.5wt％胰蛋白胨，调节pH为5，灭菌备用。加入接种量为5v/v％的木醋细菌G.xylinus ATCC NBRC 3288实验菌种，在30℃条件下进行恒温培养箱静态培养，发酵周期为7天。
(6)设计葡萄糖培养基对照实验，在浓度为40g/L的葡萄糖培养基中加入0.5wt％酵母浸提物和0.5wt％胰蛋白胨，调节pH为5，灭菌备用。加入接种量为5v/v％的木醋细菌G.xylinus ATCC NBRC 3288实验菌种，在30℃条件下进行恒温培养箱静态培养，发酵周期为7天。
(7)发酵培养结束后收集纤维素，在浓度为1％的NaOH溶液80℃水浴条件下碱煮2h，再水煮2h，依次交替循环2次，直至细菌纤维素膜呈现干净白色或透明状，且水煮溶液的pH为中性，得到细菌纤维素纯净物。
得到的细菌纤维素纯净湿重如图16所示，同步糖化实验组的细菌纤维素产量(粗湿重)为27.6g/100mL，高于非同步糖化实验组的21.6g/100mL，远大于果糖和葡萄糖对照组的9.6g/100mL和7.0g/100mL。实验数据表明，在同等条件下，菊芋原料优于单一碳源的葡萄糖或者果糖，采用同步糖化工艺生产的细菌纤维素产量高于非同步糖化组。
实施例11
(1)将5kg清洗干净的菊芋置于加温加压反应器中，加入10L去离子水，在121℃条件下蒸煮20min，回收蒸煮用水作为蒸煮液，将蒸煮灭酶后的菊芋和回收的蒸煮液分别分装，在4℃冰箱内冷藏备用。将蒸煮后的菊芋与蒸煮液以质量体积比为1g:2ml混合，匀浆，得到菊芋匀浆液。
(2)将步骤(1)得到的菊芋匀浆液与pH为5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液按体积比1:1混合，加入0.5wt％酵母浸提物和0.5wt％胰蛋白胨，灭菌备用。
(3)在步骤(2)中得到的液体体系中同时加入总体系体积1000U/L菊粉酶，以及接种量为5v/v％的木醋细菌G.xylinus ATCC NBRC 3288实验菌种，在30℃条件下进行同步糖化发酵培养。将这一时间记为0h，同步糖化周期设定为13天。其中前24h以转速为80rpm的摇瓶动态培养，后12天静置培养。
(4)设计非同步糖化对照实验，步骤(2)中得到的液体体系中先加入总体系体积1000U/L菊粉酶，24h后加入接种量为5v/v％的木醋细菌G.xylinus ATCC NBRC 3288实验菌种，在30℃条件下进行恒温培养箱静态培养，发酵周期为13天。
(5)设计葡萄糖培养基对照实验，在浓度为40g/L的葡萄糖培养基中加入0.5wt％酵母浸提物和0.5wt％胰蛋白胨，调节pH为5，灭菌备用。加入接种量为5v/v％的木醋细菌G.xylinus ATCC NBRC 3288实验菌种，在30℃条件下进行恒温培养箱静态培养，发酵周期为13天。
(6)发酵培养结束后收集纤维素，在浓度为1％的NaOH溶液80℃水浴条件下碱煮2h，再水煮2h，依次交替循环2次，直至细菌纤维素膜呈现干净白色或透明状，且水煮溶液的pH为中性，得到细菌纤维素纯净物。
得到的细菌纤维素纯净湿重如图17所示。同步糖化实验组的细菌纤维素产量(粗湿重)为41g/100mL，高于非同步糖化实验组的31g/100mL，大于葡萄糖对照组的17g/100mL。实验数据表明，在同等条件下，菊芋原料明显优于葡萄糖组，采用同步糖化工艺生产的细菌纤维素产量高于非同步糖化组，也明显高于对照组。
实施例12
(1)将5kg清洗干净的去皮和未去皮的菊芋分别置于加温加压反应器中，加入10L去离子水，在121℃条件下蒸煮20min，回收蒸煮用水作为蒸煮液，将蒸煮灭酶后的菊芋和回收的蒸煮液分别分装，在4℃冰箱内冷藏备用。将蒸煮后的菊芋与蒸煮液以质量体积比为1g:2ml混合，匀浆，得到去皮菊芋匀浆液和未去皮菊芋匀浆液。
(2)将步骤(1)得到的两种菊芋匀浆液与pH为5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液按体积比1:1混合，加入0.5wt％酵母浸提物和0.5wt％胰蛋白胨，灭菌备用。
(3)在步骤(2)中得到的两种液体体系中同时加入总体系体积1200U/L菊粉酶，以及接种量为5v/v％的木醋细菌G.xylinus ATCC 23770实验菌种，在30℃条件下进行同步糖化发酵培养。将这一时间记为0h，同步糖化周期设定为7天。其中前24h以转速为80rpm的摇瓶动态培养，后6天静置培养。
(4)设计果糖培养基对照实验，在浓度为50g/L的果糖培养基中加入0.5wt％酵母浸提物和0.5wt％胰蛋白胨，调节pH为5，灭菌备用。加入接种量为5v/v％的木醋细菌G.xylinus ATCC 23770实验菌种，在30℃条件下进行恒温培养箱静态培养，发酵周期为7天。
(5)发酵培养结束后收集纤维素，在浓度为1％的NaOH溶液80℃水浴条件下碱煮2h，再水煮2h，依次交替循环3次，直至细菌纤维素膜呈现干净白色或透明状，且水煮溶液的pH为中性，得到细菌纤维素纯净物。
得到的细菌纤维素纯净物在105℃条件下烘干至恒重，其产量结果如图18所示。经过纯化和烘干的细菌纤维素产量如下：菊芋同步糖化组2.4g/L，菊糖同步糖化组2.1g/L，果糖对照组0.7g/L。实验数据表明，在同等条件下，采用同步糖化工艺生产的细菌纤维素产量高于对照组。
实施例13
(1)配制200g/L菊粉溶液，与pH为6的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液以体积比1:4混合。在上述溶液中，加入1wt％酵母浸提物和0.1wt％胰蛋白胨，灭菌备用。
(2)在步骤(1)中得到的液体体系中同时加入总体系体积1000U/L菊粉酶以及200U/L的纤维素酶，以2块2cm×2cm的红茶菌膜接种，在30℃条件下进行同步糖化实验，同步糖化周期设定为14天。其中前24h以转速为100rpm的摇瓶动态培养，后13天静置培养。
(3)发酵培养结束后收集纤维素，在浓度为1％的NaOH溶液80℃水浴条件下碱煮2h，再水煮2h，依次交替循环3次，直至细菌纤维素膜呈现干净白色或透明状，且水煮溶液的pH为中性，得到细菌纤维素纯净物。
同步糖化的前24h以DNS法测还原糖，实验结果如图19所示。在同步糖化的前24h中，菊糖的水解比菊芋的水解快。第24h，菊糖和菊芋两组还原糖量分别为35g/L和41g/L。14天后取出细菌纤维素膜，用清水清洗后，在105℃条件下烘干至恒重，其结果如图20所示，红茶菌同步糖化中，菊芋组和菊粉组的细菌纤维素粗干重分别为8.4g/L和9.3g/L。

Claims (9)

1.一种同步糖化制备细菌纤维素的方法，包括：
(1)将菊芋清洗去泥后直接机械粉碎，匀浆，得到菊芋匀浆液；
或将清洗干净的菊芋直接加入蒸煮用水中，进行蒸煮、灭酶，匀浆，得到菊芋匀浆液，其中菊芋与蒸煮用水的质量体积比为5～10kg：10～20L；
或将清洗干净的菊芋直接加入蒸煮用水中，进行蒸煮、灭酶，回收蒸煮用水作为蒸煮液，将蒸煮后的菊芋与回收的蒸煮液混合，匀浆，得到菊芋匀浆液，其中菊芋与蒸煮用水的质量体积比为5～10kg：10～20L；蒸煮后的菊芋与蒸煮液的质量体积比为1g：1～10mL；
(2)将步骤(1)中的菊芋匀浆液，补加氮源，调节pH为4～6，灭菌备用；
或将菊粉溶解于水中得到菊粉溶液，其中菊粉溶液的浓度小于200g/L，补加氮源，调节pH为4～6，灭菌备用；
(3)将水解酶和产纤维素微生物同时加入步骤(2)得到的溶液体系中，进行同步糖化培养发酵，经碱煮-水煮纯化，去除杂质，得到细菌纤维素纯净物，其中水解酶的用量为200～5500U/L；产纤维素微生物的用量为5～15v/v％接种量。
2.根据权利要求1所述的一种同步糖化制备细菌纤维素的方法，其特征在于：所述步骤(1)中蒸煮的工艺参数为：蒸煮温度为80～130℃，蒸煮时间为15～60min。
3.根据权利要求1所述的一种同步糖化制备细菌纤维素的方法，其特征在于：所述步骤(2)中调节pH值采用缓冲溶液或酸。
4.根据权利要求3所述的一种同步糖化制备细菌纤维素的方法，其特征在于：所述缓冲溶液为柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液；所述酸选自醋酸或硫酸。
5.根据权利要求1所述的一种同步糖化制备细菌纤维素的方法，其特征在于：所述步骤(2)中的氮源为0.1～1wt％的酵母提取物和0.1～1wt％的胰蛋白胨；或为0.1～2wt％的硫酸铵、玉米浆或麦芽汁。
6.根据权利要求1所述的一种同步糖化制备细菌纤维素的方法，其特征在于：所述步骤(3)中的水解酶为菊粉酶、果聚糖酶、葡聚糖酶、纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、糖化酶、糊精酶或淀粉酶中的一种或几种。
7.根据权利要求1所述的一种同步糖化制备细菌纤维素的方法，其特征在于：所述步骤(3)中的产纤维素微生物为醋酸菌属(Acetobacter sp.)、葡萄糖酸杆菌属(Gluconobactersp.)、葡糖酸醋杆菌属(Gluconacetobacter sp.)、葡萄糖氧化杆菌(Gluconobacteroxydans)、根瘤菌属(Rhizobium sp.)、八叠球菌属(Sarcina sp.)、假单胞菌属(Pseudomounas sp.)、无色杆菌属(Achromobacter sp.)、产碱菌属(Alcaligenes sp.)、气杆菌属(Aerobacter sp.)、固氮菌属(Azotobacter sp.)、土壤杆菌属(Agrobacteriumsp.)、洋葱假单胞菌(Seudomonas cepacia)、空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)、木葡糖酸醋杆菌(Gluconacetobacter xylinus)或红茶菌(kombucha)的一种或几种。
8.根据权利要求1所述的一种同步糖化制备细菌纤维素的方法，其特征在于：所述步骤(3)中的培养的工艺参数为：培养周期为7～14天，培养温度为25～35℃，先进行动态培养，然后进行静态培养，其中动态培养摇瓶转速为80～170rpm。
9.根据权利要求1所述的一种同步糖化制备细菌纤维素的方法，其特征在于：所述步骤(3)中的碱煮-水煮纯化的工艺为：在浓度为0.5～1.5％的NaOH溶液70～90℃水浴条件下碱煮1～3h，再水煮1～3h，依次交替，循环3～5次，直至细菌纤维素膜呈现干净白色或透明状，且水煮溶液的pH为中性。
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