CN101671708A - 利用菠萝皮汁进行“二步法”发酵生产细菌纤维素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用菠萝皮汁进行“二步法”发酵生产细菌纤维素的方法。该方法将木醋杆菌菌体增殖与发酵生产细菌纤维素两个阶段分开,于22~28℃,在发酵过程中不断通入无菌空气,并用100~200rpm搅拌下培养24h~72h,此时木醋杆菌活菌数为108~109cfu/ml,经过菌体增殖培养,尽量使细胞处于同步生长时期,然后在菠萝皮清汁的发酵培养基中,浅盘静止培养72h~168h,得到细菌纤维素产量为17.5g/L以上。该方法使细菌纤维素的生产周期大大缩短,将菠萝皮进行了综合利用,保护了环境,生产出的细菌纤维素质构致密、均匀。
Description
技术领域
本发明涉及细菌纤维素的生产及菠萝皮的综合利用,具体是指一种利用菠萝皮汁进行“二步法”发酵生产细菌纤维素的方法。
背景技术
细菌纤维素具有良好的透水、透气性能、很强的亲水性、非凡的持水性(吸收600-700倍于其干重的水分)并具有高湿强度,因此具有许多潜在的应用前景。细菌纤维素在音响、食品、日化、医药、造纸等工业中已经实现了商业化应用,被认为是目前世界上性能最好的纤维素。自该产品面市以来,在国际市场上一直畅销不衰。现有细菌纤维素生产企业的生产能力远无法满足市场的对细菌纤维素的大量需求。因此改进细菌纤维素的发酵工艺得到理想的产量已成为当今的研究热点。
现有的细菌纤维素的生产技术主要存在两个问题:(1)发酵周期长,长达7~12天;(2)采用浅盘发酵,菌体生长繁殖与发酵产纤维素的生产没有分开进行,造成发酵周期长、生产效率低,大规模生产受到限制。
申请号为200710030072.0的中国发明专利申请公开了“深层与浅层静态偶联发酵生产高纤椰果的方法”,该方法是将木醋杆菌接入20~100%的椰子水中进行84~132h(3.5~5.5天)的深层静态发酵,之后再装入浅盘进行40~192h(1.7~8.0天)的产椰果的发酵,其优点是将木醋杆菌增值培养(非生产时间)与发酵产纤维素(生产时间)的两个阶段分开,在一定程度上可以缩短生产周期,提高生产效率。但是由于木醋杆菌是需氧菌,在菌体大量增殖期间需要大量的氧气,而深层静态培养会影响氧的传递,因此木醋杆菌增值不充分,耗费大量的增值培养时间;同时两个阶段使用的培养基相同,很难体现增菌培养的效果,增值培养阶段是木醋杆菌细胞大量繁殖的阶段,需要比较多的蛋白质,而发酵产纤维素的阶段是大量利用碳源进行发酵生产细菌纤维素,需要比较多的碳水化合物(葡萄糖、果糖),因此,两个阶段不仅要分开,而且培养基也要不同,才能满足不同目的的需要。
申请号为200810022129.7的中国发明公开了“一种动静结合制备细菌纤维素的方法”,该发明的方法的细菌纤维素的产量仅为13.6g/L,由于培养基营养不充分,产量不高,没有用到菠萝皮作原料。
上述现有技术由于没有将菌体生长繁殖与发酵生产分开,或选用的培养基、培养条件和发酵条件不合适,普遍存在细菌纤维素的生长周期长,产量低。
菠萝(Pineapple)是热带、亚热带特有的水果,在加工过程中有50%~60%的菠萝皮、渣被加工厂丢弃(菠萝皮薄多汁,不耐储运),这既浪费了大量的资源,又严重污染加工区的生态环境,研究表明菠萝皮、渣含有的营养成分与果肉的基本成分相接近。用菠萝皮、渣可制成低度果酒、白兰地、果醋、果冻、酸乳饮料、酚类抗氧化剂、柠檬酸等。菠萝加工中产生大量的菠萝皮、渣,严重污染生态环境。Keshk和Sameshima研究表明碳源的种类对细菌纤维素的产量影响很大,单纯用葡萄糖作碳源会产生大量的葡萄糖酸,使pH下降,不利于菌株生长从而降低产量,因此葡萄糖和果糖比例是生产细菌纤维素的关键因素。研究还表明,椰子水中天然含有K+、Na+、Ga2+、Mn2+、Mg2+、Fe2+和含有促生长的生长激素,若用其它营养成分替代椰子水,要仔细研究各成分之间的科学配比,才能尽可能多地发酵生产细菌纤维素。
发明内容
本发明的目的是为了解决上述现有技术存在的不足,提供一种生产成本低廉,生长周期为3~7天、产量为17.5g/L(干重)以上的利用菠萝皮汁进行“二步法”发酵生产细菌纤维素的方法。
本发明以菠萝皮榨出的汁(Juice of Pineapple by-Products,简称JPP)为原料,将木醋杆菌(Acetobacter xylinum)进行“二步法”发酵,“二步法”发酵是指将菌体“生长繁殖”与“发酵生产”两个过程分开,在两个过程中分别采用不同的培养基进行发酵,即是采用发酵罐进行通气培养,经精确的可控发酵,使菌种在良好的培养条件下快速繁殖,将经过快速增长后的菌种分装发酵盆进行产膜(细菌纤维素)发酵,有效控制杂菌的污染,大幅度缩短静置培养时间,显著提高生产效率,将发酵周期缩短至3~7天,得到产量17.5g/L(干基重)以上的细菌纤维素。
本发明的目的通过如下技术方案实现:
1、一种利用菠萝皮汁进行“二步法”发酵生产细菌纤维素的方法,其特征在于包括如下步骤和工艺条件:
第一步 活化菌种:以重量百分比为0.01~0.50%的比例将木醋杆菌(Acetobacterxylinum)的菌种接入到100~200ml的种子培养基中,于22~28℃,100~200rpm中培养8~12h,制成母发酵剂;以重量份数计,所述种子培养基配方为:蛋白胨0.5~4.0份和椰子水96.0~99.5份,搅拌溶解均匀后调节pH至4.5~5.5,用0.08~0.10MPa灭菌15~20min,冷却至22~28℃备用;
第二步 菌体大量增殖培养:以体积比为4~20∶100的比例,将母发酵剂接入工作发酵剂培养基中,于22~28℃,发酵过程中在不断通入无菌空气,并在100~200rpm搅拌下培养24h~72h,木醋杆菌活菌数为108~109cfu/ml,制成工作发酵剂;以重量份数计,所述工作发酵剂培养基原料配方为:蛋白胨0.5~4.0份和椰子水96.0~99.5份,搅拌溶解均匀后调节pH至4.5~5.5,用0.08~0.10MPa灭菌15~20min,冷却至22~28℃备用;
第三步 发酵生产细菌纤维素:以体积比为10~30∶100的比例,将所述工作发酵剂接入发酵培养基中,于25~35℃,浅盘静止培养72h~168h,得到细菌纤维素膜;以重量份数计,所述发酵培养基原料配方为:菠萝皮清汁30~40份、椰子水20~40份、葡萄糖1.5~2.5份、果糖4.5~7.5份、醇0.02~1.00份、r-氨基丁酸0.0002~0.001份、柠檬酸三钠0.01~0.30份、KH2PO4 0.1~0.3份、硫酸镁0.01~0.04份、FeSO40.0001~0.0005份、硫酸锰0.015~0.025份、CaCl2 0.020~0.075份和蒸馏水8~44份,搅拌溶解均匀后调节pH至3.5~5.0,用0.08~0.10MPa灭菌15~20min,冷却至25-35℃备用;所述菠萝皮清汁的制作:将菠萝皮榨汁,用100~300目的过滤网过滤后,清汁用0.08~0.10MPa灭菌15~20min,冷却至25-35℃备用,制得菠萝皮清汁。
为进一步实现本发明目的,第一步、第二步和第三步中优选用醋酸调节培养基的pH值。
第三步的浅盘厚度为40~50mm。
第二步中母发酵剂与工作发酵剂培养基的体积比优选为10∶100,pH优选为5.5,发酵温度优选为25℃。
第三步的发酵温度优选为30℃,搅拌转速优选150rpm,工作发酵剂培养基的葡萄糖与果糖的质量比为1∶3。
本发明与现有技术相比,具有如下优点和有益效果:
(1)本发明的木醋杆菌工作发酵剂先经过第一步活化培养,再进行大量增殖培养,使木醋杆菌尽量被活化,处于同步生长状态,并增殖到菌数最多,有利于后期的大量发酵生产细菌纤维素。
(2)本发明所用的生产培养基,采用菠萝皮清汁和椰子水的可控配方,一方面可以降低生产成本,另外,还变废为宝。
(3)本发明采用木醋杆菌增菌培养与发酵生产两步法的方法,充分利用木醋杆菌的生长特点,最大化地生产细菌纤维素,并大大缩短了生产时间,简化了手工操作的劳动强度。发酵周期从7~12天缩短到3~7天。
(4)由于考虑了葡萄糖和果糖比例是生产细菌纤维素的关键因素,因此发酵过程中不会产生大量的葡萄糖酸,而保证发酵产生大量的细菌纤维素。
(5)由于科学运用了K+、Na+、Ga2+、Mn2+、Mg2+、Fe2+和促生长素各成分之间的科学配比,细菌纤维素的产量高达17.5g/L(干基重)以上。
(6)由于生产周期大大缩短,减少了操作过程中的污染环节,保证了产品质量的稳定性,符合规模化生产的需要。
附图说明
图1为木醋杆菌在实施例1中经过第二步大量增殖培养后的电子显微镜照片(放大3000倍);
图2为木醋杆菌在实施例1中培养5天后细菌纤维素的电子显微镜照片(放大10000倍)。
具体实施方式
为更好理解本发明,下面结合实施例对本发明做进一步地详细说明,但是本发明要求保护的范围并不局限于实施例表示的范围。
实施例1
一种利用菠萝皮汁进行“二步法”发酵生产细菌纤维素的方法,包括如下步骤:
第一步 活化菌种:以重量百分比为0.01%的比例将木醋杆菌ATCC 23767(Gluconacetobacter xylinum,简称Acetobacter xylinum,中国普通微生物保藏管理中心保藏,地址:北京市朝阳区北辰西路1号院,邮编:100101,电话:86-10-64807596)菌种接入到100ml的种子培养基中,于25℃,150rpm中培养10h,制成母发酵剂;所述种子培养基配方为:蛋白胨20g,椰子水980g,搅拌溶解均匀后用醋酸调节pH为4.5,用0.10MPa灭菌15min,冷却至25℃备用。
第二步 菌体大量增殖培养:以体积比为10∶100的比例,将母发酵剂接入工作发酵剂培养基中,于25℃,在发酵过程中不断通入无菌空气,并用150rpm搅拌下培养72h,此时木醋杆菌活菌数为6.9×109cfu/ml,制成工作发酵剂;所述工作发酵剂培养基配方为:蛋白胨3.0g,椰子水970g,搅拌溶解均匀后用醋酸调节pH为4.5,用0.10MPa灭菌15min,冷却至25℃备用。
第三步 发酵生产细菌纤维素:以体积比为20∶100的比例,将工作发酵剂接入发酵培养基中,于30℃,浅盘静止培养120h(5天),即得到细菌纤维素膜;发酵培养基配方为:菠萝皮清汁400g,椰子水200g,葡萄糖15g,果糖45g,乙醇0.5ml,r-氨基丁酸0.002g,柠檬酸三钠0.1g,磷酸二氢钾1.0g,硫酸镁0.1g,硫酸亚铁0.001g,硫酸锰0.15g,氯化钙0.20g,蒸馏水338g,搅拌溶解均匀后用醋酸调节pH为3.5,用0.10MPa灭菌15min,冷却至30℃备用。所述菠萝皮清汁的制作:将菠萝皮榨汁,用300目的过滤网过滤后,清汁用0.10MPa灭菌15min,冷却至30℃备用,为菠萝皮清汁;
通过对木醋杆菌(Acetobacter xylinum)培养条件的深入研究,严格控制发酵剂的发酵培养条件、发酵时间,选择经过第一、二步的增殖培养,尽量使所有的细胞处于同步生长时期,在线控制发酵pH和严格控制收获时间,活细胞数达到107-108cfu/g,通过大量增殖培养后的菌体见图1,从图1可以看出,木醋杆菌经过大量增值后生长旺盛,菌体成团状分布,收获时间以看不见可见纤维团为准,增菌培养时间过长,会使纤维素包裹住菌体肉眼可见成团状。研究表明利用菠萝皮清汁进行生产的细菌纤维素质构紧密、均匀,见图2。实施例1中细菌纤维素膜的干重为20.5g/L。由于木醋杆菌先经过第一步活化培养,再进行大量增殖培养,且处于同步生长状态,有利于后期的大量发酵生产细菌纤维素;而且由于采用菠萝皮清汁和椰子水的可控配方,降低了生产成本;本发明将木醋杆菌增菌培养与发酵生产两步法的方法,充分利用木醋杆菌的生长特点,最大化地生产细菌纤维素,大大缩短了生产时间,简化了手工操作的劳动强度,发酵周期从7~12天缩短到3~7天;葡萄糖和果糖比例是生产细菌纤维素的关键因素,本发明发酵过程中不会产生大量的葡萄糖酸,而保证发酵产生大量的细菌纤维素;本发明还科学运用了K+、Na+、Ga2+、Mn2+、Mg2+、Fe2+和促生长素各成分之间的科学配比,细菌纤维素的产量高达17.5g/L(干基重)以上;由于生产周期大大缩短,减少了操作过程中的污染环节,保证了产品质量的稳定性,符合规模化生产的需要,使得生产细菌纤维素的成本大大降低,产量大大提高。
实施例2
一种利用菠萝皮汁进行“二步法”发酵生产细菌纤维素的方法,包括如下步骤:
第一步 活化菌种:以重量百分比为0.50%的比例将木醋杆菌ATCC 23767(Gluconacetobacter xylinum,简称Acetobacter xylinum,中国普通微生物保藏管理中心保藏,地址:北京市朝阳区北辰西路1号院,邮编:100101,电话:86-10-64807596)菌种接入到200ml的种子培养基中,于22℃,100rpm中培养8h,制成母发酵剂;以重量分数计,所述种子培养基配方为:蛋白胨5g,椰子水995g,搅拌溶解均匀后用醋酸调节pH为5.5,用0.08MPa灭菌20min,冷却至22℃备用。
第二步 菌体大量增殖培养:以体积比为4∶100的比例,将母发酵剂接入工作发酵剂培养基中,于22℃,在发酵过程中不断通入无菌空气,并用100rpm搅拌下培养24h,此时木醋杆菌活菌数为8.7×108cfu/ml,制成工作发酵剂;以重量分数计,所述工作发酵剂培养基配方为:蛋白胨5g,椰子水995g,搅拌溶解均匀后用醋酸调节pH为5.5,用0.08MPa灭菌20min,冷却至22℃备用。
第三步 发酵生产细菌纤维素 以体积比为10∶100的比例,将工作发酵剂接入发酵培养基中,于25℃,浅盘静止培养168h(7天),即得到细菌纤维素膜;以重量分数计,所述发酵培养基配方为:菠萝皮清汁300g,椰子水300g,葡萄糖25g,果糖75g,乙醇0.2ml,r-氨基丁酸0.01g,柠檬酸三钠3g,磷酸二氢钾3g,硫酸镁0.4g,硫酸亚铁0.005g,硫酸锰0.25g,氯化钙0.75g,蒸馏水292g,搅拌溶解均匀后用醋酸调节pH为5.0,用0.08MPa灭菌20min,冷却至25℃备用。所述菠萝皮清汁的制作:将菠萝皮榨汁,用100目的过滤网过滤后,清汁用0.08MPa灭菌20min,冷却至25℃备用,为菠萝皮清汁;
实施例2中细菌纤维素膜的干重为17.9g/L。
实施例3
一种利用菠萝皮汁进行“二步法”发酵生产细菌纤维素的方法,包括如下步骤:
第一步 活化菌种:以重量百分比为0.25%的比例将木醋杆菌ATCC 23767(Gluconacetobacter xylinum,简称Acetobacter xylinum,中国普通微生物保藏管理中心保藏,地址:北京市朝阳区北辰西路1号院,邮编:100101,电话:86-10-64807596)菌种接入到150ml的种子培养基中,于28℃,200rpm中培养12h,制成母发酵剂;以重量分数计,所述种子培养基配方为:蛋白胨40g,椰子水960g,搅拌溶解均匀后用醋酸调节pH为5.0,用0.09MPa灭菌18min,冷却至28℃备用。第二步 菌体大量增殖培养:以体积比为20∶100的比例,将母发酵剂接入工作发酵剂培养基中,于28℃,在发酵过程中不断通入无菌空气,并用200rpm搅拌下培养72h,此时木醋杆菌活菌数为1.6×109cfu/ml,制成工作发酵剂;以重量分数计,所述工作发酵剂培养基配方为:蛋白胨40份,椰子水960g,搅拌溶解均匀后用醋酸调节pH为5.0,用0.09MPa灭菌18min,冷却至28℃备用。
第三步 发酵生产细菌纤维素:以体积比为30∶100的比例,将工作发酵剂接入发酵培养基中,于35℃,浅盘静止培养72h(3天),即得到细菌纤维素膜;以重量分数计,所述发酵培养基配方为:菠萝皮清汁200g,椰子水400g,葡萄糖20g,果糖60g,乙醇10ml,r-氨基丁酸0.004g,柠檬酸三钠1.5g,磷酸二氢钾2g,硫酸镁0.3g,硫酸亚铁0.003g,硫酸锰0.20g,氯化钙0.48g,蒸馏水526g,搅拌溶解均匀后用醋酸调节pH为4.5,用0.09MPa灭菌18min,冷却至35℃备用。所述菠萝皮清汁的制作:将菠萝皮榨汁,用200目的过滤网过滤后,清汁用0.09MPa灭菌18min,冷却至35℃备用,为菠萝皮清汁;
实施例3中细菌纤维素膜的干重为17.5g/L。
Claims (5)
1、一种利用菠萝皮汁进行“二步法”发酵生产细菌纤维素的方法,其特征在于包括如下步骤和工艺条件:
第一步活化菌种:以重量百分比为0.01~0.50%的比例将木醋杆菌(Acetobacterxylinum)的菌种接入到100~200ml的种子培养基中,于22~28℃,100~200rpm中培养8~12h,制成母发酵剂;以重量份数计,所述种子培养基配方为:蛋白胨0.5~4.0份和椰子水96.0~99.5份,搅拌溶解均匀后调节pH至4.5~5.5,用0.08~0.10MPa灭菌15~20min,冷却至22~28℃备用;
第二步菌体大量增殖培养:以体积比为4~20∶100的比例,将母发酵剂接入工作发酵剂培养基中,于22~28℃,发酵过程中在不断通入无菌空气,并在100~200rpm搅拌下培养24h~72h,木醋杆菌活菌数为108~109cfu/ml,制成工作发酵剂;以重量份数计,所述工作发酵剂培养基原料配方为:蛋白胨0.5~4.0份和椰子水96.0~99.5份,搅拌溶解均匀后调节pH至4.5~5.5,用0.08~0.10MPa灭菌15~20min,冷却至22~28℃备用;
第三步发酵生产细菌纤维素:以体积比为10~30∶100的比例,将所述工作发酵剂接入发酵培养基中,于25~35℃,浅盘静止培养72h~168h,得到细菌纤维素膜;以重量份数计,所述发酵培养基原料配方为:菠萝皮清汁30~40份、椰子水20~40份、葡萄糖1.5~2.5份、果糖4.5~7.5份、醇0.02~1.00份、r-氨基丁酸0.0002~0.001份、柠檬酸三钠0.01~0.30份、KH2PO40.1~0.3份、硫酸镁0.01~0.04份、FeSO40.0001~0.0005份、硫酸锰0.015~0.025份、CaCl2 0.020~0.075份和蒸馏水8~44份,搅拌溶解均匀后调节pH至3.5~5.0,用0.08~0.10MPa灭菌15~20min,冷却至25-35℃备用;所述菠萝皮清汁的制作:将菠萝皮榨汁,用100~300目的过滤网过滤后,清汁用0.08~0.10MPa灭菌15~20min,冷却至25-35℃备用,制得菠萝皮清汁。
2、根据权利要求1所述的一种利用菠萝皮汁进行“二步法”发酵生产细菌纤维素的方法,其特征在于:第一步、第二步和第三步中用醋酸调节培养基的pH值。
3、根据权利要求1所述的一种利用菠萝皮汁进行“二步法”发酵生产细菌纤维素的方法,其特征在于:第三步的浅盘厚度为40~50mm。
4、根据权利要求1所述的一种利用菠萝皮汁进行“二步法”发酵生产细菌纤维素的方法,其特征在于:第二步中母发酵剂与工作发酵剂培养基的体积为10∶100,pH为5.5,发酵温度为25℃。
5、根据权利要求1所述的一种利用菠萝皮汁进行“二步法”发酵生产细菌纤维素的方法,其特征在于:第三步的发酵温度为30℃,搅拌转速为150rpm,工作发酵剂培养基的葡萄糖与果糖的质量比为1∶3。
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