CN103060229B - 一种木醋杆菌及混合菌群发酵高产细菌纤维素的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种木醋杆菌及混合菌群发酵高产细菌纤维素的方法，所述木醋杆菌（Gloconacetobacter xylinum）HNX01，已于2011年8月19日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏编号为CGMCC No.5173。混合菌群发酵高产细菌纤维素的方法，其中混合菌群包括木醋杆菌CGMCC No.5173、醋杆菌CGMCC No.6641和乳杆菌CGMCC No.5172。本发明得到细菌纤维素的产量为26.5g/L(干基重)以上。该方法为木醋杆菌的生长提供了充分的营养，对培养基进行了充分的利用，发酵出高产、质构致密和均匀的细菌纤维素。

Description

一种木醋杆菌及混合菌群发酵高产细菌纤维素的方法
技术领域
本发明涉及细菌纤维素的生产，具体是指一种木醋杆菌及混合菌群发酵高产细菌纤维素的方法。
背景技术
“椰果”是一种以椰子水为主要原料，经过微生物发酵产生的凝胶状厚膜，在农业行业标准NY/T1522-2007中，又称为“椰纤果”。“椰果”作为一种食品已有70多年的历史，因为大部分具有产生“椰果”的微生物主要以细菌为主例如木醋杆菌（Gloconacetobacter xylinum）、醋化醋杆菌（Acetobaceria aceti）、产醋醋杆菌（Acetobacter acotigenum）和巴氏醋杆菌（Acetobacer pastcurianum），而以木醋杆菌合成能力最强。再者，由于“椰果”的实质就是一种纯度很高的纤维素，因此“椰果”也可称为细菌纤维素（Bacterial Cellulose），根据所使用原料的不同，细菌纤维素就有不同的称谓，“椰果”就是以椰子水作为主要原料制得，因而得名为“椰果”，也是细菌纤维素中的一种。
细菌纤维素具有良好的透水、透气性能、很强的亲水性、非凡的持水性（吸收600-700倍于其干基重的水分）并具有高湿强度，因此具有许多潜在的应用前景。细菌纤维素在音响、食品、日化、医药、造纸等工业中已经实现了商业化应用，被认为是目前世界上性能最好的纤维素。自该产品面市以来，在国际市场上一直畅销不衰。现有细菌纤维素生产企业的生产能力远无法满足市场的对细菌纤维素的大量需求。因此改进细菌纤维素的发酵工艺得到理想的产量已成为当今的研究热点。
现有的细菌纤维素的生产技术主要存在如下问题：（1）发酵周期长，长达7~12天；（2）采用浅盘发酵，菌体生长繁殖与发酵产纤维素的生产没有分开进行，造成发酵周期长、生产效率低，大规模生产受到限制；（3）发酵生产细菌纤维素的培养基不合适，没有按照木醋杆菌本身的生长需要来设计生产配方，使得生产效率低下。
贾原媛等人的论文{多菌种混合发酵生产细菌纤维素和饮料，食品工业科技，2008，29（7）：188~191}中用假丝酵母、胚乳杆菌和木醋杆菌进行混合发酵，细菌纤维素最高的产量为2.0g/L，而以产生大量饮料为主。可见该技术无法达到细菌纤维素的高产量，这和其中三种菌的相互竞争性抑制有关。假丝酵母在静止发酵时，会产生不可控的乙醇，会使培养基偏离合适的范围，从而影响木醋杆菌最佳发酵生产细菌纤维素的条件。
申请号为200810022129.7的中国发明公开了“一种动静结合制备细菌纤维素的方法”，该发明的方法的细菌纤维素的产量为13.6g/L，由于培养基营养不充分，产量不高，没有涉及到木醋杆菌与乳酸菌混合发酵生产细菌纤维素。目前报道的细菌纤维素最高产量为17.5g/L（干基重）（刘冬梅等人的发明专利：利用菠萝皮汁进行“二步法”发酵生产细菌纤维素的方法，专利号为：ZL200910193119.4）。上述现有技术都没有涉及到木醋杆菌、乳杆菌和醋酸菌的混合培养。
研究还表明，椰子水中天然含有K+、Na+、Ga2+、Mn2+、Mg2+等具有良好缓冲力的无机盐和含有促生长的生长激素，若用其它营养成分替代椰子水，要仔细研究各成分之间的科学配比，才能尽可能多地发酵生产细菌纤维素。
发明内容
本发明的目的是为了解决上述现有技术存在的不足，提供一种利用多菌种分两阶段发酵进行高效生产细菌纤维素的方法。该方法生产成本低廉，生长周期短、产量高。
本发明公开了一种木醋杆菌及混合菌群发酵高产细菌纤维素的方法。将醋杆菌AC-0720（保藏号为：CGMCC No.6641），乳杆菌DMDL9010（保藏号为：CGMCC No.5172），木醋杆菌HNX01（保藏号为：CGMCC No.5173）分别进行高密度培养；再将醋杆菌AC-0720和乳杆菌DMDL9010的种子液分别接种到椰子水中，进行混合发酵后，然后再配制细菌纤维素发酵培养基，再加入木醋杆菌HNX01种子液进行浅盘静止发酵，得到细菌纤维素的产量为26.5g/L(干基重)以上。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
一种木醋杆菌（Gloconacetobacter xylinum）HNX01，已于2011年8月19日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏编号为CGMCC No.5173。保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。所述木醋杆菌具有如下性质：（1）形态特征：该菌为需氧菌，菌落为无色透明状，菌体为杆状。（2）生理特征：最适生长温度为20℃~35℃，最适生长和产细菌纤维素的pH为3.0~6.0，在一定的缓冲体系中能将蔗糖转化为细菌纤维素，产量最高达到25g/L(干基重)以上。
一种醋杆菌（Acetobacter sp.）AC-0720，已于2012年9月28日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏编号为CGMCC No.6641。保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
一种乳杆菌（Lactobacillus sp.）DMDL9010，已于2011年8月19日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏编号为CGMCC No.5172。保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
一种混合菌群发酵高产细菌纤维素的方法，其中混合菌群包括木醋杆菌CGMCC No.5173、醋杆菌CGMCC No.6641和乳杆菌CGMCC No.5172。
所述发酵高产细菌纤维素的方法包括如下步骤：
（1）分别将乳杆菌DMDL9010、醋杆菌AC-0720、木醋杆菌HNX01分别按如下的步骤进行高密度培养，三株菌的种子液的活菌数分别达到108CFU/mL以上：
（2）将醋杆菌AC-0720与乳杆菌DMDL9010的种子液在椰子水中混合发酵，使两菌的活菌数分别达到108CFU/mL以上，制成发酵椰子水；所述椰子水的处理工艺为：将椰子破壳取水，然后用100目~300目的滤网过滤，过滤后灭菌，冷却后备用，制得椰子水；
（3）细菌纤维素发酵培养基的配制：首先，制备水合发酵培养基：蔗糖50g/L~70g/L，蛋白胨1.0g/L~1.9g/L，酵母提取粉0.1g/L~0.4g/L，柠檬酸0.2g/L~0.9g/L，KH2PO40.1g/L~0.9g/L，MgSO4.H2O1.5g/L~1.9g/L，(NH4)2SO41.0g/L~1.9g/L，将上述原料搅拌溶解均匀后，调节pH至3.5~5.0，灭菌，冷却后备用；然后，以体积百分比计，将发酵椰子水20份~50份与50份~80份水合发酵培养基混合均匀后灭菌，冷却后即得到细菌纤维素发酵培养基；
（4）发酵生产细菌纤维素：以体积比为10~30：100，将木醋杆菌HNX01种子液接种到细菌纤维素发酵培养基中，于20°C~35°C，静止培养120h~216h，即得到细菌纤维素。
所述乳杆菌DMDL9010种子液的制备：将0.1g~0.5g乳杆菌DMDL9010冻干粉接种到10mL的DMDL9010种子培养基中，于25℃~40℃静止培养20h~28h，制成DMDL9010第一次种子液；以体积比为5~10：100，将第一次种子液接种到DMDL9010种子培养基中，于25℃~40℃静止培养20h~28h。
所述醋杆菌AC-0720种子液的制备：将0.1g~0.5g醋杆菌AC-0720冻干粉接种到10mL的AC-0720种子培养基中，于20℃~35℃静止培养24h~72h，制成AC-0720第一次种子液；以体积比为5~10：100，将AC-0720第一次种子液接种到AC-0720种子培养基中，于20℃~35℃静止培养24h~72h。
所述木醋杆菌HNX01种子液的制备：将0.1g~0.5g木醋杆菌HNX01冻干粉接种到10mL的HNX01种子培养基中，于20℃~35℃静止培养24h~72h，制成HNX01第一次种子液；以体积比为5~10：100，将HNX01第一次种子液接种到HNX01种子培养基中，于20℃~35℃静止培养24h~72h。
所述乳杆菌DMDL9010种子培养基的配方为：蛋白胨8.0g/L~12g/L，酵母粉2g/L~8g/L，葡萄糖15g/L~25g/L，柠檬酸三胺1.0g/L~3g/L，MgSO4.7H2O0.1g/L~0.3g/L，牛肉膏5g/L~15g/L，KH2PO40.5g/L~3.5g/L，MnSO4.4H2O0.01g/L~0.09g/L，乙酸钠0.5g/L~3.5g/L，吐温800.5g/L~1.5g/L；所述DMDL9010种子培养基的制备方法为：按配方称取上述原料搅拌溶解均匀后用0.08MPa~0.10MPa灭菌15min~20min，冷却至20℃~35℃备用。
所述醋杆菌AC-0720种子培养基的配方为：酵母粉5g/L~15g/L，葡萄糖10g/L~50g/L，95%酒精10mL/L~50mL/L；所述AC-0720种子培养基的制备方法为：按配方称取上述原料搅拌溶解均匀后用0.08MPa~0.10MPa灭菌15min~20min，冷却至20℃~35℃备用。
所述木醋杆菌HNX01种子培养基的配方为：蔗糖10g/L~39g/L，蛋白胨2.5g/L~2.9g/L，KH2PO40.1g/L~0.9g/L，MgSO4.H2O1.0g/L~1.9g/L，(NH4)2SO41.0g/L~1.9g/L；所述HNX01种子培养基的制备方法为：按配方称取上述原料搅拌溶解均匀后用0.08MPa~0.10MPa灭菌15min~20min，冷却至20℃~35℃备用。
步骤（2）中所述醋杆菌AC-0720和乳杆菌DMDL9010分别按体积比10%~20%接种。
步骤（2）中混合发酵的条件为：15°C~30°C、发酵72h~168h。
步骤（3）中发酵培养的条件为：20°C~35°C、发酵120h~216h。
步骤（4）发酵培养采用厚度为40mm~50mm的浅盘。
步骤（3）用醋酸调节培养基的pH值。
本发明与现有技术相比，具有如下优点和有益效果：
（1）本发明的木醋杆菌工作发酵剂先经过第一步活化培养，再进行大量增殖培养，使木醋杆菌尽量被活化，处于同步生长状态，并增殖到菌数最多，有利于后期的大量发酵生产细菌纤维素。实验证明，利用产醋酸的醋杆菌和产乳酸的乳杆菌预先进行椰子水的发酵，以充分地产生乙酸和乳酸等有机酸，使溶液的缓冲能力强，更有利于细菌纤维素产量的提高。
（2）本发明采用木醋杆菌、醋杆菌、乳杆菌三菌分别进行增菌培养，使各自的活菌数达到108CFU/mL，再将醋杆菌和乳杆菌分别接种到椰子水中进行发酵以产生木醋杆菌发酵生产所需的营养物质，例如乳酸根离子、氯离子、磷酸根离子、硫酸根离子和柠檬酸根离子。该方法为木醋杆菌的生长提供了充分的营养，对培养基进行了充分的利用，发酵出高产、质构致密和均匀的细菌纤维素，为工业化大批量生产细菌纤维素打下了坚实的基础。
（3）将木醋杆菌细胞生长与细菌纤维素的发酵生产分开两步的方法，充分利用木醋杆菌的生长特点，最大化地生产细菌纤维素，并大大缩短了生产时间，简化了手工操作的劳动强度。发酵周期从7～12天缩短到3～7天。
（4）由于科学分析了木醋杆菌生产细菌纤维素所需的营养物质，由此对阳离子（K+、Na+、Ga2+、Mg2+）、阴离子（乳酸根离子、氯离子、磷酸根离子、硫酸根离子和柠檬酸根离子。）和促生长素等各成分之间的进行了科学配比，使细菌纤维素的产量高达26.5g/L（干基）以上。
（5）由于生产周期大大缩短，减少了操作过程中的污染环节，保证了产品质量的稳定性，符合规模化生产的需要。
附图说明
图1为木醋杆菌在实施例1中发酵椰子水的阳离子离子色谱图。
图2为木醋杆菌在实施例1中发酵椰子水的阴离子离子色谱图。
具体实施方式
为更好理解本发明，下面结合实施例对本发明做进一步地详细说明，但是本发明要求保护的范围并不局限于实施例表示的范围。
实施例1
第一步分别将醋杆菌AC-0720、乳杆菌DMDL9010和木醋杆菌HNX01分别按如下的步骤进行高密度培养，三株菌的种子液的活菌数分别达到108CFU/mL以上：
1．将0.1g乳杆菌DMDL9010冻干粉接种到10mL的DMDL9010种子培养基中，于25℃静止培养20h，制成DMDL9010第一次种子液；以体积比为5：100，将第一次种子液接种到DMDL9010种子培养基中，于25℃静止培养28h，制成DMDL9010第二次种子液。
所述乳杆菌DMDL9010种子培养基的配方为：蛋白胨8.0g/L，酵母粉8g/L，葡萄糖25g/L，柠檬酸三胺1.0g/L，MgSO4.7H2O0.3g/L，牛肉膏12.5g/L，KH2PO42.0g/L，MnSO4.4H2O0.04g/L，乙酸钠2.0g/L，吐温801.1g/L；所述DMDL9010种子培养基的制备方法为：按配方称取上述原料搅拌溶解均匀后灭菌，冷却后备用。
2．将0.3g醋杆菌AC-0720冻干粉接种到10mL的AC-0720种子培养基中，于25℃静止培养24h，制成AC-0720第一次种子液；以体积比为10：100，将AC-0720第一次种子液接种到AC-0720种子培养基中，于25℃静止培养48h，制成AC-0720第二次种子液。
所述醋杆菌AC-0720种子培养基的配方为：酵母粉15g/L，葡萄糖10g/L，95%酒精10mL/L；所述AC-0720种子培养基的制备方法为：按配方称取上述原料搅拌溶解均匀后灭菌，冷却后备用。
3．将0.25g木醋杆菌HNX01冻干粉接种到10mL的HNX01种子培养基中，于29℃静止培养48h，制成HNX01第一次种子液；以体积比为10：100，将HNX01第一次种子液接种到HNX01种子培养基中，于29℃静止培养24h，制成HNX01第二次种子液。
所述木醋杆菌HNX01种子培养基的配方为：蔗糖35g/L，蛋白胨2.5g/L，KH2PO40.5g/L，MgSO4.H2O1.6g/L，(NH4)2SO41.6g/L；所述HNX01种子培养基的制备方法为：按配方称取上述原料搅拌溶解均匀后灭菌，冷却后备用。
第二步醋杆菌AC-0720与乳杆菌DMDL9010在椰子水中的混合发酵，使两菌的活菌数分别达到108CFU/mL以上，制成混合种子液，按以下步骤实现：
以体积比为15：100，将AC-0720第二次种子液和DMDL9010第二次种子液分别接种到椰子水中，于25℃静止培养120h，制成发酵椰子水，利用离子色谱仪测定阴、阳离子的浓度。如图1、2所示，发酵椰子水中Na+、K+、Mg2+、Ca2+分别为327.556mg/L、2365.226mg/L、103.38mg/L、200.028mg/L。发酵椰子水中乳酸根离子、氯离子、磷酸根离子、硫酸根离子分别为2602.73mg/L、713.63mg/L、29.19mg/L、42.82mg/L。
所述椰子水的处理工艺为：将椰子破壳取水，然后用200目的滤网过滤，过滤后灭菌，冷却后备用，制得椰子水。
第三步发酵生产细菌纤维素：以体积比为20：100，HNX01第二次种子液接种到细菌纤维素发酵培养基中，于30°C，浅盘静止培养144h，得到细菌纤维素膜产率为26.8g/L(干基重)；所述细菌纤维素发酵培养基，以体积百分比计，将发酵椰子水20份与水合发酵培养基80份混合均匀后灭菌，冷却后备用。所述水合发酵培养基的配方为：蔗糖70g/L，蛋白胨1.6g/L，酵母提取粉0.4g/L，柠檬酸0.9g/L，KH2PO40.6g/L，MgSO4.H2O1.5g/L，(NH4)2SO41.6g/L；所述水合发酵培养基的制备方法为：各组分充分溶解后调节pH至3.5，将上述原料搅拌溶解均匀后灭菌，冷却后备用。
分别对木醋杆菌（Gloconacetobacter xylinum）HNX01、乳杆菌DMDL9010、醋杆菌AC-0720等三菌的培养条件进行深入研究，经过二步的增殖培养，尽量使所有的细胞处于同步生长时期，在线控制发酵pH和严格控制收获时间，使各菌株的活细胞数达到108CFU/g以上，再使乳杆菌和醋杆菌在椰子水中进行混合培养，以产生大量乙酸和乳酸等有机酸，为木醋杆菌发酵生产细菌纤维素提供条件。由于木醋杆菌先经过两次活化培养，再进行大量增殖培养，且处于同步生长状态，有利于后期大量发酵生产细菌纤维素；本发明将木醋杆菌的增菌培养与发酵生产分开“两步”的方法，以及将混合培养的木醋杆菌与乳杆菌、醋杆菌分别进行增+菌活化的方法，可将三菌的活细胞数达到最大，再者通过乳杆菌和醋杆菌在椰子水中进行发酵，产生丰富的营养物质，以利于细菌纤维素的大量生产和发酵。这样充分利用木醋杆菌的生长特点，最大化地生产细菌纤维素，大大缩短了生产时间，简化了手工操作的劳动强度；葡萄糖和果糖比例是生产细菌纤维素的关键因素，本发明发酵过程中不会产生大量的葡萄糖酸，而保证发酵产生大量的细菌纤维素；本发明还科学运用了K+、Na+、Ga2+、Mg2+和促生长素各成分之间的科学配比；减少了操作过程中的污染环节，保证了产品质量的稳定性，符合规模化生产的需要，使得生产细菌纤维素的成本大大降低，产量大大提高。
实施例2
第一步分别将醋杆菌AC-0720、乳杆菌DMDL9010和木醋杆菌HNX01按如下的步骤进行高密度培养，三株菌的种子液的活菌数分别达到108CFU/mL以上。
1．将0.5g乳杆菌DMDL9010冻干粉接种到10mL的DMDL9010种子培养基中，于30℃静止培养24h，制成DMDL9010第一次种子液；以体积比为10：100，将第一次种子液接种到DMDL9010种子培养基中，于30℃静止培养24h，制成DMDL9010第二次种子液。
所述乳杆菌DMDL9010种子培养基的配方为：蛋白胨12.0g/L，酵母粉5g/L，葡萄糖15g/L，柠檬酸三胺1.5g/L，MgSO4.7H2O0.1g/L，牛肉膏15g/L，KH2PO40.5g/L，MnSO4.4H2O0.09g/L，乙酸钠3.5g/L，吐温800.5g/L；所述DMDL9010种子培养基的制备方法为：按配方称取上述原料搅拌溶解均匀后灭菌，冷却后备用。
2．将0.5g醋杆菌AC-0720冻干粉接种到10mLAC-0720种子培养基中，于35℃静止培养48h，制成AC-0720第一次种子液；以体积比为5：100，将AC-0720第一次种子液接种到AC-0720种子培养基中，于35℃静止培养36h，制成AC-0720第二次种子液。
所述醋杆菌AC-0720种子培养基的配方为：酵母粉5g/L，葡萄糖30g/L，95%酒精50mL/L；所述AC-0720种子培养基的制备方法为：按配方称取上述原料搅拌溶解均匀后灭菌，冷却后备用。
3．将0.5g木醋杆菌HNX01冻干粉接种到10mL的HNX01种子培养基中，于35℃静止培养24h，制成HNX01第一次种子液；以体积比为5：100，将HNX01第一次种子液接种到HNX01种子培养基中，于35℃静止培养48h，制成HNX01第二次种子液。
所述木醋杆菌HNX01种子培养基的配方为：蔗糖15g/L，蛋白胨2.9g/L，KH2PO40.8g/L，MgSO4.H2O1.0g/L，(NH4)2SO41.9g/L；所述HNX01种子培养基的制备方法为：按配方称取上述原料搅拌溶解均匀后灭菌，冷却后备用。
第二步醋杆菌AC-0720与乳杆菌DMDL9010在椰子水中的混合发酵，使两菌的活菌数分别达到108CFU/mL以上，制成混合种子液，按以下步骤实现：
以体积比为10：100，将AC-0720第二次种子液和DMDL9010的第二次种子液分别接种到椰子水中，于30℃静止培养156h，制成发酵椰子水。
所述椰子水的处理工艺为：将椰子破壳取水，然后用300目的滤网过滤，过滤后灭菌，冷却后备用，制得椰子水。
第三步发酵生产细菌纤维素：以体积比为10：100，HNX01第二次种子液接种到细菌纤维素发酵培养基中，于35°C，浅盘静止培养216h，得到细菌纤维素膜产率为27.3g/L(干基重)；所述细菌纤维素发酵培养基是：以体积百分比计，将发酵椰子水40份和水合发酵培养基60份混合均匀后灭菌，冷却后备用。所述水合发酵培养基的配方为：蔗糖50g/L，蛋白胨1.0g/L，酵母提取粉0.2g/L，柠檬酸0.45g/L，KH2PO40.9g/L，MgSO4.H2O1.6g/L，(NH4)2SO41.0g/L；所述水合发酵培养基的制备方法为：各组分充分溶解后调节pH至5.0，将上述原料搅拌溶解均匀后灭菌，冷却后备用。
实施例3
第一步分别将醋杆菌AC-0720、乳杆菌DMDL9010和木醋杆菌HNX01分别按如下的步骤进行高密度培养，三株菌的种子液的活菌数分别达到108CFU/ml以上。
1．将0.3g乳杆菌DMDL9010冻干粉接种到10mL的DMDL9010种子培养基中，于28℃静止培养26h，制成DMDL9010第一次种子液；以体积比为6：100，将第一次种子液接种到DMDL9010种子培养基中，于28℃静止培养26h，制成DMDL9010第二次种子液。
所述乳杆菌DMDL9010种子培养基的配方为：蛋白胨10.0g/L，酵母粉2g/L，葡萄糖23g/L，柠檬酸三胺3.0g/L，MgSO4.7H2O0.2g/L，牛肉膏5.0g/L，KH2PO43.5g/L，MnSO4.4H2O0.01g/L，乙酸钠0.5g/L，吐温800.7g/L；所述DMDL9010种子培养基的制备方法为：按配方称取上述原料搅拌溶解均匀后灭菌，冷却后备用。
2．将0.1g醋杆菌AC-0720冻干粉接种到10mL的AC-0720种子培养基中，于29℃静止培养72h，制成AC-0720第一次种子液；以体积比为6：100，将AC-0720第一次种子液接种到AC-0720种子培养基中，于20℃静止培养72h，制成AC-0720第二次种子液。
所述醋杆菌AC-0720种子培养基的配方为：酵母粉10g/L，葡萄糖50g/L，95%酒精30mL/L；所述AC-0720种子培养基的制备方法为：按配方称取上述原料搅拌溶解均匀后灭菌，冷却后备用。
3．将0.1g木醋杆菌HNX01冻干粉接种到10mL的HNX01种子培养基中，于25℃静止培养72h，制成HNX01第一次种子液；以体积比为7：100，将HNX01第一次种子液接种到HNX01种子培养基中，于25℃静止培养36h，制成HNX01第二次种子液。
所述木醋杆菌HNX01种子培养基的配方为：蔗糖39g/L，蛋白胨2.6g/L，KH2PO40.9g/L，MgSO4.H2O1.9g/L，(NH4)2SO41.0g/L；所述HNX01种子培养基的制备方法为：按配方称取上述原料搅拌溶解均匀后灭菌，冷却后备用。
第二步醋杆菌AC-0720与乳杆菌DMDL9010在椰子水中的混合发酵，使两菌的活菌数分别达到108CFU/mL以上，制成混合种子液，按以下步骤实现：
以体积比为20：100，将AC-0720第二次种子液和DMDL9010第二次种子液分别接种到椰子水中，于35℃静止培养72h，制成发酵椰子水。
所述椰子水的处理工艺为：将椰子破壳取水，然后用100目的滤网过滤，过滤后灭菌，冷却后备用，制得椰子水。
第三步发酵生产细菌纤维素：以体积比为30：100，HNX01的第二次种子液接种到细菌纤维素发酵培养基中，于20°C，浅盘静止培养192h，得到细菌纤维素膜产率为27.9g/L(干基重)；所述细菌纤维素发酵培养基为，以体积百分比计，将发酵椰子水50份和水合发酵培养基50份混合均匀后灭菌，冷却后备用。所述水合发酵培养基的配方为：蔗糖60g/L，蛋白胨1.9g/L，酵母提取粉0.1g/L，柠檬酸0.2g/L，KH2PO40.1g/L，MgSO4.H2O1.9g/L，(NH4)2SO41.9g/L；所述水合发酵培养基的制备方法为：各组分充分溶解后调节pH至4.3，将上述原料搅拌溶解均匀后灭菌，冷却后备用。
实施例4
第一步分别将醋杆菌AC-0720、乳杆菌DMDL9010和木醋杆菌HNX01分别按如下的步骤进行高密度培养，三株菌的种子液的活菌数分别达到108CFU/ml以上。
1．将0.25g乳杆菌DMDL9010冻干粉接种到10mL的DMDL9010种子培养基中，于40℃静止培养28h，制成DMDL9010第一次种子液；以体积比为8：100，将第一次种子液接种到DMDL9010种子培养基中，于35℃静止培养20h，制成DMDL9010第二次种子液。
所述乳杆菌DMDL9010种子培养基的配方为：蛋白胨9.5g/L，酵母粉6g/L，葡萄糖19g/L，柠檬酸三胺2.5g/L，MgSO4.7H2O0.25g/L，牛肉膏14.5g/L，KH2PO41.5g/L，MnSO4.4H2O0.03g/L，乙酸钠2.5g/L，吐温801.5g/L；所述DMDL9010种子培养基的制备方法为：按配方称取上述原料搅拌溶解均匀后灭菌，冷却后备用。
2．将0.2g醋杆菌AC-0720冻干粉接种到10mL的AC-0720种子培养基中，于20℃静止培养36h，制成AC-0720第一次种子液；以体积比为10：100，将AC-0720第一次种子液接种到AC-0720种子培养基中，于29℃静止培养24h，制成AC-0720第二次种子液。
所述醋杆菌AC-0720种子培养基的配方为：酵母粉11g/L，葡萄糖25g/L，95%酒精25mL/L；所述AC-0720种子培养基的制备方法为：按配方称取上述原料搅拌溶解均匀后灭菌，冷却后备用。
3．将0.3g木醋杆菌HNX01冻干粉接种到10mL的HNX01种子培养基中，于20℃静止培养36h，制成HNX01第一次种子液；以体积比为6：100，将HNX01第一次种子液接种到HNX01种子培养基中，于20℃静止培养72h，制成HNX01第二次种子液。
所述木醋杆菌HNX01种子培养基的配方为：蔗糖25g/L，蛋白胨2.4g/L，KH2PO40.1g/L，MgSO4.H2O1.2g/L，(NH4)2SO41.5g/L；所述HNX01种子培养基的制备方法为：按配方称取上述原料搅拌溶解均匀后灭菌，冷却后备用。
第二步醋杆菌AC-0720与乳杆菌DMDL9010在椰子水中的混合发酵，使两菌的活菌数分别达到108CFU/ml以上，制成混合种子液，按以下步骤实现：
以体积比为14：100，将AC-0720的第二次种子液和DMDL9010的第二次种子液分别接种到椰子水中，于28℃静止培养168h，制成发酵椰子水。
所述椰子水的处理工艺为：将椰子破壳取水，然后用250目的滤网过滤，过滤后灭菌，冷却后备用，制得椰子水。
第三步发酵生产细菌纤维素：以体积比为25：100，HNX01的第二次种子液接种到细菌纤维素发酵培养基中，于32°C，浅盘静止培养168h，得到细菌纤维素膜产率为28.2g/L(干基重)；所述细菌纤维素发酵培养基为：以体积百分比计，将发酵椰子水35份和水合发酵培养基65份混合均匀后灭菌，冷却后备用。所述水合发酵培养基的配方为：蔗糖55g/L，蛋白胨1.5g/L，酵母提取粉0.25g/L，柠檬酸0.65g/L，KH2PO40.4g/L，MgSO4.H2O1.8g/L，(NH4)2SO41.5g/L；所述水合发酵培养基的制备方法为：各组分充分溶解后调节pH至3.9，将上述原料搅拌溶解均匀后灭菌，冷却后备用。
实施例5
第一步：分别将醋杆菌AC-0720、乳杆菌DMDL9010和木醋杆菌HNX01分别按如下的步骤进行高密度培养，三株菌的种子液的活菌数分别达到108CFU/mL以上。
1．将0.2g乳杆菌DMDL9010冻干粉接种到10mL的DMDL9010种子培养基中，于35℃静止培养22h，制成DMDL9010第一次种子液；以体积比为6.5：100，将第一次种子液接种到DMDL9010种子培养基中，于40℃静止培养25h，制成DMDL9010第二次种子液。
所述乳杆菌DMDL9010种子培养基的配方为：蛋白胨11g/L，酵母粉4g/L，葡萄糖21g/L，柠檬酸三胺2.0g/L，MgSO4.7H2O0.22g/L，牛肉膏11.5g/L，KH2PO43.0g/L，MnSO4.4H2O0.06g/L，乙酸钠1.5g/L，吐温801.3g/L；所述DMDL9010种子培养基的制备方法为：按配方称取上述原料搅拌溶解均匀后灭菌，冷却后备用。
2．将0.25g醋杆菌AC-0720冻干粉接种到10mL的AC-0720种子培养基中，于31℃静止培养60h，制成AC-0720第一次种子液；以体积比为10：100，将AC-0720第一次种子液接种到AC-0720种子培养基中，于31℃静止培养32h，制成AC-0720第二次种子液。
所述醋杆菌AC-0720种子培养基的配方为：酵母粉13g/L，葡萄糖40g/L，95%酒精40mL/L；所述AC-0720种子培养基的制备方法为：按配方称取上述原料搅拌溶解均匀后灭菌，冷却后备用。
3．将0.15g木醋杆菌HNX01冻干粉接种到10mL的HNX01种子培养基中，于22℃静止培养44h，制成HNX01第一次种子液；以体积比为9：100，将HNX01第一次种子液接种到HNX01种子培养基中，于27℃静止培养32h，制成HNX01第二次种子液。
所述木醋杆菌HNX01种子培养基的配方为：蔗糖10g/L，蛋白胨2.8g/L，KH2PO40.6g/L，MgSO4.H2O1.5g/L，(NH4)2SO41.4g/L；所述HNX01种子培养基的制备方法为：按配方称取上述原料搅拌溶解均匀后灭菌，冷却后备用。
第二步醋杆菌AC-0720与乳杆菌DMDL9010在椰子水中的混合发酵，使两菌的活菌数分别达到108CFU/mL以上，制成混合种子液，按以下步骤实现：
以体积比为18：100，将AC-0720第二次种子液和DMDL9010第二次种子液分别接种到椰子水中，于15℃静止培养144h，制成发酵椰子水。
所述椰子水的处理工艺为：将椰子破壳取水，然后用150目的滤网过滤，过滤后灭菌，冷却后备用，制得椰子水汁。
第三步发酵生产细菌纤维素：以体积比为15：100，HNX01的第二次种子液接种到细菌纤维素发酵培养基中，于25°C，浅盘静止培养120h，得到细菌纤维素膜产率为28.7g/L(干基重)；所述细菌纤维素发酵培养基为：以体积百分比计，将发酵椰子水30份和水合发酵培养基70份混合均匀后灭菌，冷却后备用。所述水合发酵培养基的配方为：蔗糖50g/L，蛋白胨1.8g/L，酵母提取粉0.3g/L，柠檬酸0.55g/L，KH2PO40.8g/L，MgSO4.H2O1.7g/L，(NH4)2SO41.4g/L；所述水合发酵培养基的制备方法为：各组分充分溶解后调节pH至4.5，将上述原料搅拌溶解均匀后灭菌，冷却后备用。
实施例6
第一步分别将醋杆菌AC-0720、乳杆菌DMDL9010和木醋杆菌HNX01分别按如下的步骤进行高密度培养，三株菌的种子液的活菌数分别达到108CFU/mL以上。
1．将乳杆菌DMDL9010冻干粉接种到10mL的DMDL9010种子培养基中，于37℃静止培养28h，制成DMDL9010第一次种子液；以体积比为7：100，将第一次种子液接种到DMDL9010种子培养基中，于37℃静止培养22h，制成DMDL9010第二次种子液。
所述乳杆菌DMDL9010种子培养基的配方为：蛋白胨9.0g/L，酵母粉7g/L，葡萄糖20g/L，柠檬酸三胺1.2g/L，MgSO4.7H2O0.15g/L，牛肉膏13.5g/L，KH2PO42.5g/L，MnSO4.4H2O0.08g/L，乙酸钠3.0g/L，吐温800.9g/L；所述DMDL9010种子培养基的制备方法为：按配方称取上述原料搅拌溶解均匀后灭菌，冷却后备用。
2．将0.4g醋杆菌AC-0720冻干粉接种到10mL的AC-0720种子培养基中，于27℃静止培养32h，制成AC-0720第一次种子液；以体积比为6.5：100，将AC-0720第一次种子液接种到AC-0720种子培养基中，于27℃静止培养60h，制成AC-0720第二次种子液。
所述醋杆菌AC-0720种子培养基的配方为：酵母粉9g/L，葡萄糖15g/L，95%的酒精15mL/L；所述AC-0720种子培养基的制备方法为：按配方称取上述原料搅拌溶解均匀后灭菌，冷却后备用。
3．将0.4g木醋杆菌HNX01冻干粉接种到10mL的HNX01种子培养基中，于27℃静止培养60h，制成HNX01第一次种子液；以体积比为8：100，将HNX01第一次种子液接种到HNX01种子培养基中，于25℃静止培养60h，制成HNX01第二次种子液。
所述木醋杆菌HNX01种子培养基的配方为：蔗糖20g/L，蛋白胨2.8g/L，KH2PO40.7g/L，MgSO4.H2O1.8g/L，(NH4)2SO41.2g/L；所述HNX01种子培养基的制备方法为：按配方称取上述原料搅拌溶解均匀后灭菌，冷却后备用。
第二步醋杆菌AC-0720与乳杆菌DMDL9010在椰子水中的混合发酵，使两菌的活菌数分别达到108CFU/mL以上，制成混合种子液，按以下步骤实现：
以体积比为16：100，将AC-0720的第二次种子液和DMDL9010第二次种子液分别接种到椰子水中，于20℃静止培养144h，制成发酵椰子水。
所述椰子水的处理工艺为：将椰子破壳取水，然后用200目的滤网过滤，过滤后灭菌，冷却后备用，制得椰子水。
第三步发酵生产细菌纤维素：以体积比为15：100，HNX01的第二次种子液接种到细菌纤维素发酵培养基中，于28°C，浅盘静止培养180h，得到细菌纤维素膜产率为26.5g/L(干基重)；所述细菌纤维素发酵培养基为：以体积百分比计，将发酵椰子水25份和水合发酵培养基75份混合均匀后灭菌，冷却后备用。所述水合发酵培养基的配方为：蔗糖60g/L，蛋白胨1.2g/L，酵母提取粉0.15g/L，柠檬酸0.35g/L，KH2PO40.3g/L，MgSO4.H2O1.9g/L，(NH4)2SO41.7g/L；所述水合发酵培养基的制备方法为：各组分充分溶解后调节pH至3.7，将上述原料搅拌溶解均匀后灭菌，冷却后备用。

Claims (6)

1.一种混合菌群发酵生产细菌纤维素的方法，其特征在于，其中混合菌群包括木醋杆菌（Gloconacetobacter xylinum）HNX01，已于2011年8月19日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏编号为CGMCC No.5173、醋杆菌（Acetobacter sp.）AC-0720，已于2012年9月28日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏编号为CGMCC No.6641；和乳杆菌（Lactobacillus sp.）DMDL9010，已于2011年8月19日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏编号为CGMCC No.5172；
所述发酵生产细菌纤维素的方法包括如下步骤：
（1）分别将乳杆菌DMDL9010、醋杆菌AC-0720、木醋杆菌HNX01进行高密度培养，三株菌的种子液的活菌数分别达到108CFU/mL以上；
（2）将醋杆菌AC-0720与乳杆菌DMDL9010的种子液在椰子水中混合发酵，使两菌的活菌数分别达到108CFU/mL以上，制成发酵椰子水；所述椰子水的处理工艺为：将椰子破壳取水，然后用100目～300目的滤网过滤，过滤后灭菌，冷却后备用，制得椰子水；
（3）细菌纤维素发酵培养基的配制：首先，制备水合发酵培养基：蔗糖50g/L～70g/L，蛋白胨1.0g/L～1.9g/L，酵母提取粉0.1g/L～0.4g/L，柠檬酸0.2g/L～0.9g/L，KH2PO40.1g/L～0.9g/L，MgSO4.H2O1.5g/L～1.9g/L，(NH4)2SO41.0g/L～1.9g/L，将上述原料搅拌溶解均匀后，调节pH至3.5～5.0，灭菌，冷却后备用；然后，以体积百分比计，将发酵椰子水20份～50份与50份～80份水合发酵培养基混合均匀后灭菌，冷却后即得到细菌纤维素发酵培养基；
（4）发酵生产细菌纤维素：以体积比为10～30：100，将木醋杆菌HNX01种子液接种到细菌纤维素发酵培养基中，于20℃～35℃，静止培养120h～216h，即得到细菌纤维素。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，
所述乳杆菌DMDL9010种子液的制备：将0.1g～0.5g乳杆菌DMDL9010冻干粉接种到10mL的DMDL9010种子培养基中，于25℃～40℃静止培养20h～28h，制成DMDL9010第一次种子液；以体积比为5～10：100，将第一次种子液接种到DMDL9010种子培养基中，于25℃～40℃静止培养20h～28h；
所述醋杆菌AC-0720种子液的制备：将0.1g～0.5g醋杆菌AC-0720冻干粉接种到10mL的AC-0720种子培养基中，于20℃～35℃静止培养24h～72h，制成AC-0720第一次种子液；以体积比为5～10：100，将AC-0720第一次种子液接种到AC-0720种子培养基中，于20℃～35℃静止培养24h～72h；
所述木醋杆菌HNX01种子液的制备：将0.1g～0.5g木醋杆菌HNX01的冻干粉接种到10mL的HNX01种子培养基中，于20℃～35℃静止培养24h～72h，制成HNX01第一次种子液；以体积比为5～10：100，将HNX01第一次种子液接种到HNX01种子培养基中，于20℃～35℃静止培养24h～72h；
所述乳杆菌DMDL9010种子培养基的配方为：蛋白胨8.0g/L～12g/L，酵母粉2g/L～8g/L，葡萄糖15g/L～25g/L，柠檬酸三胺1.0g/L～3g/L，MgSO4.7H2O0.1g/L～0.3g/L，牛肉膏5g/L～15g/L，KH2PO40.5g/L～3.5g/L，MnSO4.4H2O0.01g/L～0.09g/L，乙酸钠0.5g/L～3.5g/L，吐温800.5g/L～1.5g/L；
所述醋杆菌AC-0720种子培养基的配方为：酵母粉5g/L～15g/L，葡萄糖10g/L～50g/L，95%酒精10mL/L～50mL/L；
所述木醋杆菌HNX01种子培养基的配方为：蔗糖10g/L～39g/L，蛋白胨2.5g/L～2.9g/L，KH2PO40.1g/L～0.9g/L，MgSO4.H2O1.0g/L～1.9g/L，(NH4)2SO41.0g/L～1.9g/L。
3.根据权利要求1或2所述方法，其特征在于，步骤（2）中所述醋杆菌AC-0720和乳杆菌DMDL9010分别按体积比10%～20%接种。
4.根据权利要求3所述方法，其特征在于，步骤（2）中混合发酵的条件为：15℃～30℃、发酵72h～168h。
5.根据权利要求1或2所述方法，其特征在于，步骤（4）发酵培养采用厚度为40mm～50mm的浅盘。
6.根据权利要求1或2所述方法，其特征在于，步骤（3）用醋酸调节培养基的pH值。
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