CN110964756A - 一种菊芋全值化利用制备l-乳酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种菊芋全值化利用制备L‑乳酸的方法。该方法选用适应性和繁殖力强但缺乏开发利用的生物质资源菊芋，替代葡萄糖、果糖类碳源，制备菊粉粗提液和菊芋渣，根据原料组成成分的差异选用不同的酶进行催化，利用L‑乳酸的优良发酵菌株米根霉进行液态发酵，采用分步糖化发酵或同步糖化发酵两种方式发酵制备L‑乳酸。发酵原材料菊芋来源广泛，成本低廉，实现了对菊芋资源的全值化高效利用，同时，为生物法催化发酵制备L‑乳酸提供了新的有效途径。

Description

一种菊芋全值化利用制备L-乳酸的方法
技术领域
本发明属于生物化工领域，具体涉及一种菊芋全值化利用制备L-乳酸的方法。
背景技术
菊芋，多年生草本植物，向日葵属植物。我国菊芋分布广泛，因其适应力及繁殖力强，不需要专门管理，抗逆高产，并可改良土壤。菊芋的生长期为3～10月，每年10月上旬，秋霜偏寒，地上茎叶枯萎，为菊芋地下块茎的丰收时节。菊芋块茎中富含菊粉(也称菊糖)，作为仅次于淀粉的第二大储存多糖，含量约占菊芋干重的50％-80％。
菊糖是由果糖通过β-2,1-糖苷键连接而成的天然线性果聚糖，末端常带有成的天然线性果聚糖，末端常带有一个葡萄糖残基，聚合度为2-60。新鲜菊芋中还含有少量菊粉酶，植物和微生物均可分泌菊粉酶。菊粉酶可使菊芋菊粉降解成果糖、蔗糖或低聚果糖的果聚糖水解酶。在菊芋加工过程中，会有较大部分的菊芋渣残留，其主要成分为纤维素，还有部分残糖以及少量的氨基酸和蛋白质等营养物质。通过对菊芋的全值化利用，针对菊粉和菊芋渣的组成成分，能降解菊糖、纤维素等大分子化合物，增加果糖、蔗糖、葡萄糖、氨基酸和其他小分子营养物质的含量，使其可发酵获得更高价值的产物如L-乳酸。由于对菊粉及残渣利用完全，该过程中基本不会造成二次污染，实现了菊芋的综合高效全值化利用，减少了对环境的污染。发展农业经济作物菊芋的规模化种植，并以之为基础形成高品质菊芋开发利用的产业链，实现L-乳酸的绿色生产加工。
乳酸是重要的精细化学品和聚乳酸材料生产的单体物质，是美国能源部确定的石油替代战略十二个平台化合物之一，可广泛应用于食品、饲料、农药、日用化工、造纸等领域。根据空间结构不同，乳酸分为D-乳酸和L-乳酸两种同分异构体，人体和动物只含有L-乳酸脱氢酶，只能利用L-乳酸；过量D-乳酸或DL-乳酸的摄入易造成人体或动物代谢紊乱。以L-乳酸为单体聚合得到的聚乳酸具有良好的生物相容性及降解性，且其降解的终产物为二氧化碳和水，对人体和环境均无害，以乳酸为原料的聚乳酸新型生物质材料的研究成为未来最有潜力的新材料之一，为乳酸产业的发展提供了市场空间。
乳酸的传统制造方法是以粮食为主的淀粉质原料通过发酵法制备，但全球粮食供求矛盾突出的现状，使以粮食为主要原料发展乳酸工业受到制约。目前L-乳酸的制备方法主要为液态发酵，生产菌株主要为乳酸杆菌属和根霉菌属，根霉菌属中的米根霉能糖化淀粉，产L-乳酸能力强，发酵产物L-乳酸具有光学纯度高、发酵过程中易形成菌球而利于产物分离纯化、营养要求简单(利用单一的无机氮源和少量无机盐发酵)等特点可作为L-乳酸的优良生产菌株。米根霉发酵大多以葡萄糖或淀粉为碳源，纯糖或淀粉质原料的乳酸发酵原料成本约占总成本的70％。对于乳酸化学品制造，围绕降低生产成本，选择来源广泛而又廉价的原料生产乳酸成为研究热点。开发廉价易得菊芋原料用于乳酸的生产，既能解决资源问题，同时也能解决环境问题。
在菊芋糖化过程中，酶水解产物对酶解反应存在着明显的反馈抑制作用，消除果糖等在反应体系的累积可有效提高菊芋酶解效率。在菊芋发酵制备L-乳酸的过程中，菊芋糖化与糖液发酵在同一反应器中进行，由于菊芋降解产生的果糖被微生物迅速消耗，可以有效解除产物果糖对菊粉酶的反馈抑制，提高菊粉的转化率，简化了酶解发酵工艺。
目前文献暂无运用米根霉液态发酵菊芋、菊芋渣的方式来生产L-乳酸的方法报道。
发明内容
针对上述技术问题，本发明提供一种菊芋全值化利用制备L-乳酸的方法，该方法简单，对设备要求低，且可实现对菊粉的高效利用。
一种菊芋全值化利用制备L-乳酸的方法，包括以下步骤：
步骤1，菊芋干粉的制备
将菊芋经组分分析后，块茎洗净并切成薄片，经沸水浴5～10min后，再放入70℃干燥箱中干燥7h，然后经过捣碎、研磨、过40目筛得菊芋干粉；
步骤2，菊粉粗提液和菊芋渣的制备方法
取菊芋干粉，在固液比1:6的条件下与水充分混合，75℃水浴搅拌反应2h后，降至室温，用Ca(OH)2调节混合液的pH值至9.0，85℃水浴浸提1h，固液分离，得到富含菊粉的菊粉粗提液和菊芋渣；
步骤3，菊芋酶解液及其糖化发酵
当糖化发酵为分步糖化发酵时
碳源为菊芋酶解液或菊芋渣酶解液一种或两种混合而成，加入氮源及营养盐溶液，搅拌，自然pH，即得液体培养基，高压蒸汽灭菌后冷却至室温，接种米根霉种子液，40℃，摇床转速为170r/min发酵2-3d，发酵产物离心过滤，得到含有L-乳酸的发酵液；
当糖化发酵为同步糖化发酵时
碳源为10mL菊粉粗提液，催化剂为10g 25μ/g菊粉酶，同时加入5mL米根霉种子液与液体培养基至总体积为100mL，同步糖化发酵温度为40℃，摇床转速为170r/min发酵2-3d，发酵产物离心过滤，得到含有L-乳酸的发酵液；所述菊粉酶来源于真菌或菊芋；
碳源为10g菊芋渣，催化剂10g 25μ/g纤维素酶，同时加入5mL米根霉种子液，与液体培养基至总体积为100mL，同步糖化发酵温度为40℃，摇床转速为170r/min发酵2-3d，发酵产物离心过滤，得到含有L-乳酸的发酵液；所述纤维素酶来自真菌。
作为改进的是，步骤3中当糖化发酵为分步糖化发酵时，所述菊芋酶解液的制备方法为：取10mL菊芋粗提液，加入10g 25μ/g菊粉酶作为催化剂，加入75mL蒸馏水和5mL 的1mol/L柠檬酸缓冲液，调pH至4.8，50℃，150r/min的摇床中酶解48h，酶解结束后，将酶解液装于50mL离心管中，5000r/min离心5min，上清液即为菊芋酶解液；所述菊粉酶来自真菌或新鲜的菊芋；菊芋渣酶解液的制备方法：碳源为10g菊芋渣，加入10g 25μ /g纤维素酶，75mL蒸馏水和5mL的1mol/L柠檬酸缓冲液，调pH至4.8，50℃，150 r/min的摇床中酶解48h，酶解结束后，将酶解液装于50mL离心管中，5000r/min离心5 min，上清液即为菊芋渣酶解液，所述纤维素酶来自真菌。
作为改进的是，步骤3中菊粉酶来源于酵母菌。
有益效果：
与现有技术相比，本发明提供了一种菊芋全值化利用制备L-乳酸的方法。利用米根霉发酵菊芋分步糖化发酵或同步糖化发酵制备L-乳酸，目前尚无此方面的研究，通过菊粉酶对菊粉的酶解，纤维素酶对菊芋渣的酶解，再由米根霉对酶解产物果糖和葡萄糖的发酵，实现了对廉价菊粉的高效利用，产生高附加值的L-乳酸，整个过程在锥形瓶中完成，操作简单，且L-乳酸浓度和糖酸转化率较高。
附图说明
图1米根霉全值化利用菊芋发酵制备L-乳酸工艺流程图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步描述。
实施例1菊芋的组分分析
100g菊芋干粉中含有蛋白质0.591g、总糖45.716g、还原糖3.140g、粗脂肪1.021g、纤维素19.511g、半纤维素7.071g、木质素17.318g、灰分5.573g。
通过高效液相色谱测定菊芋粗提液中16种氨基酸的含量，结果表明Arg含量最高而 Trp含量最低。通过原子吸收光谱分析法测定菊芋中的微量元素，结果显示菊芋是一种低钠高钾的植物。
菊粉酶液来自菊粉时，制备方法为：新鲜菊芋洗净、晾干、称重记录，取处理后的菊芋切片加50mL冷藏的pH7.0磷酸缓冲液放入小型果汁机，打浆均匀后，5000r/min离心10min，收集上清液即为菊粉酶粗酶液。
实施例2米根霉分步糖化发酵菊芋制备L-乳酸
米根霉的来源：米根霉NRRL395购于北纳生物。
米根霉种子液的制备过程为：将保存于斜面培养基上的米根霉孢子接种于种子培养液中，35℃有氧条件下培养2-3d，菌体生长至对数生长中后期变成球状，得到供液态发酵的米根霉种子液；所用的种子培养液配方为：果糖50g/L，(NH4)2SO4 3g/L，KH2PO4 0.30 g/L，ZnSO4·7H2O 0.20g/L，MgSO4·7H2O 0.75g/L，CaCO3 10g/L。摇床温度为40℃，转速为170r/min。
1)配制25μ/g的菊粉酶液，可使用来源于酵母等真菌的菊粉酶，也可使用来源于菊粉的菊粉酶；
2)菊芋切成薄片经100℃沸水中5-10min，于电热恒温鼓风干燥箱中70℃烘干，称重记录，经磨粉机磨成粉后过40目筛得到菊芋干粉。菊芋干粉与蒸馏水按照质量体积比为 1:8进行混合，搅拌均匀后于70℃水浴锅中水浴2h，石灰乳调节pH到10.0，继续于水浴锅中80℃水浴1h，八层纱布趁热过滤得到菊芋菊粉粗提液和菊芋渣；
3)量取10mL菊芋菊粉粗提液加入10g 25μ/g菊粉酶，或10g菊芋渣加入10g 25μ/g纤维素酶；再加入75mL蒸馏水和5mL的1mol/L柠檬酸缓冲液，调pH至4.8。放置在 50℃，150r/min的摇床中酶解48h，酶解结束后，将酶解液分别装于50mL离心管中， 5000r/min离心5min，取得的上清液即为菊芋酶解液或菊芋渣酶解液。取上清液，测pH，注射器通过0.22μm的过滤膜注入到色谱瓶中，HPLC进行检测。产物的检测方法为：高效液相色谱法，色谱柱：AminexHPX-87H；流动相：0.005M的H2SO4；流速：0.6mL/min；柱温：65℃采用示差检测器检测；
4)取上述离心后的酶解上清液95mL加入到250mL锥形瓶中，再加入除碳源以外的发酵培养基(按100mL进行配制，((NH4)2SO4 2g/L，KH2PO4 0.30g/L，MgSO4·7H2O 0.75 g/L，ZnSO4·7H2O 0.20g/L)，115℃0.1MPa条件下灭菌30min，冷却后，按5％的接种量将米根霉种子液接种到发酵培养基中，置于40℃、170r/min的摇床中培养2-3d。
待发酵结束后，取适量发酵液进行样品测定。过0.22μm的滤膜，检测底物果糖含量、产物L-乳酸及附属产物的含量。
发酵产物的检测方法为：高效液相色谱法，色谱柱：Aminex HPX-87H；流动相：0.005M的H2SO4；流速：0.6mL/min；柱温：65℃，采用示差检测器检测。
本发明中转化率的计算方法为：α＝C2/C1，C1为果糖或葡萄糖消耗的浓度，g/L，C2为L-乳酸的浓度，g/L。
米根霉菊芋酶解液作为碳源进行发酵培养，L-乳酸浓度和糖酸转化率3.31g/L、0.16。米根霉菊芋渣酶解液作为碳源进行发酵培养，L-乳酸浓度和糖酸转化率1.29g/L、0.11。
实施例3米根霉同步糖化发酵菊芋制备L-乳酸
1)配制25μ/g的菊粉酶液，可使用来源于酵母等真菌的菊粉酶，也可使用来源于菊粉的菊粉酶。
2)菊芋切成薄片经100℃沸水中5～10min，于电热恒温鼓风干燥箱中70℃烘干，称重记录，经磨粉机磨成粉后过40目筛得到菊芋干粉。菊芋干粉与蒸馏水按照质量体积比为1:8进行混合，搅拌均匀后于70℃水浴锅中水浴2h，石灰乳调节pH到10.0，继续于水浴锅中80℃水浴1h，八层纱布趁热过滤得到菊芋菊粉粗提液和菊芋渣。
3)称取10mL菊芋粗提液加入10g 25μ/g菊粉酶，或10g菊芋渣加入10g 25μ/g 纤维素酶；加入5mL米根霉种子液，再加入70mL蒸馏水和5mL的1mol/L柠檬酸缓冲液及营养物质((NH4)2SO4 2g/L，KH2PO4 0.30g/L，MgSO4·7H2O 0.75g/L，ZnSO4·7H2O 0.20g/L)，调pH至4.8。放置在40℃，170r/min的摇床中同步糖化发酵2-3d后将样品分别装于50mL离心管中，5000r/min离心5min，取得的清液即为L-乳酸发酵液。取上清液，测pH。取部分上清液，用注射器通过0.22μm的过滤膜注入到色谱瓶中，HPLC进行检测。
发酵产物的检测方法为：高效液相色谱法，色谱柱：Aminex HPX-87H；流动相：0.005M的H2SO4；流速：0.6mL/min；柱温：65℃，采用示差检测器检测。
本发明中转化率的计算方法为：α＝m2/m1，m1为底物质量，g；m2为L-乳酸的质量，g。米根霉以菊芋粗提液作为碳源同步糖化发酵，L-乳酸浓度和糖酸转化率5.84g/L、0.28。米根霉以菊芋渣作为碳源同步糖化发酵，L-乳酸浓度和糖酸转化率2.26g/L、0.19。

Claims (3)

1.一种菊芋全值化利用制备L-乳酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1，菊芋干粉的制备
将菊芋经组分分析后，块茎洗净并切成薄片，经沸水浴5~10 min后，再放入70 ℃干燥箱中干燥7 h，然后经过捣碎、研磨、过40目筛得菊芋干粉；
步骤2，菊粉粗提液和菊芋渣的制备方法
取菊芋干粉，在固液比1:6的条件下与水充分混合，75 ℃水浴搅拌反应2 h后，降至室温，用Ca(OH)2调节混合液的pH值至9.0， 85 ℃水浴浸提1 h，固液分离，得到富含菊粉的菊粉粗提液和菊芋渣；
步骤3，菊芋酶解液及其糖化发酵
当糖化发酵为分步糖化发酵时
碳源为菊芋酶解液或菊芋渣酶解液一种或两种混合而成，加入氮源及营养盐溶液，搅拌，自然pH，即得液体培养基，高压蒸汽灭菌后冷却至室温，接种米根霉种子液，40℃，摇床转速为170 r/min发酵2-3 d，发酵产物离心过滤，得到含有L-乳酸的发酵液；
当糖化发酵为同步糖化发酵时
碳源为10 mL菊粉粗提液，催化剂为10 g 25μ/g菊粉酶，同时加入5 mL米根霉种子液与液体培养基至总体积为100 mL，同步糖化发酵温度为40 ℃，摇床转速为170 r/min发酵2-3d，发酵产物离心过滤，得到含有L-乳酸的发酵液；所述菊粉酶来源于真菌或菊芋；
碳源为10 g菊芋渣，催化剂10 g 25μ/g纤维素酶，同时加入5 mL米根霉种子液，与液体培养基至总体积为100 mL，同步糖化发酵温度为40 ℃，摇床转速为170 r/min发酵2-3 d，发酵产物离心过滤，得到含有L-乳酸的发酵液；所述纤维素酶来自真菌。
2.根据权利要求所述的一种菊芋全值化利用制备L-乳酸的方法，其特征在于；步骤3中当糖化发酵为分步糖化发酵时，所述菊芋酶解液的制备方法为：取10 mL菊芋粗提液，加入10 g 25μ/g菊粉酶作为催化剂，加入75 mL蒸馏水和5 mL的1 mol/L柠檬酸缓冲液，调pH至4.8，50 ℃，150 r/min的摇床中酶解48 h，酶解结束后，将酶解液装于50 mL离心管中，5000r/min离心5 min，上清液即为菊芋酶解液；所述菊粉酶来自真菌或新鲜的菊芋；菊芋渣酶解液的制备方法：碳源为10 g菊芋渣，加入10 g 25μ/g纤维素酶，75 mL蒸馏水和5 mL的1mol/L 柠檬酸缓冲液，调pH至4.8，50 ℃，150 r/min的摇床中酶解48 h，酶解结束后，将酶解液装于50 mL离心管中，5000r/min离心5 min，上清液即为菊芋渣酶解液，所述纤维素酶来自真菌。
3.根据权利要求所述的一种菊芋全值化利用制备L-乳酸的方法，其特征在于；步骤3中菊粉酶来源于酵母菌。
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