CN102703543B - 一种利用薯类原料制备细菌纤维素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种利用薯类原料制备细菌纤维素的方法，包括：（1）薯类原料的预处理：将薯类原料用汽蒸熟化软化后捣烂，或将薯类原料匀浆细碎化，得到预处理后的薯类原料；（2）在上述预处理后的薯类原料中加入酸，进行酸水解；或加入酶，进行酶水解，得到薯类原料水解液；（3）将上述薯类原料水解液作为培养基碳源，加氮源配制成发酵培养基，接入细菌纤维素生产菌株的种子液，经过3~23天发酵制得细菌纤维素。本发明的工艺简单、能耗低、反应迅速，原料来源广泛；且经处理的木薯、番薯以及马铃薯等薯类原料水解液生产的细菌纤维素产量高于其它常规碳源生产的细菌纤维素，在细菌纤维素的生产领域具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于细菌纤维素的制备领域，特别涉及一种利用薯类原料制备细菌纤维素的方法。
背景技术
细菌纤维素（Bacterial Cellulose，简称BC）是一种新型纳米微生物材料，具有较好的生物相容性、生物可降解性、较强的持水能力和较高的力学性能等特性。鉴于其优良特性，细菌纤维素被广泛应用于各种特殊领域。
在医用材料领域，细菌纤维素可以用于合成人造皮肤、人造血管、外科敷料、缓释药物的载体等；在食品工业领域，细菌纤维素本身就可以作为一种食品食用，另外，BC还可以作为食品工业中的增稠剂、成型剂、添加剂等；在造纸工业方面，细菌纤维素的添加可以提高纸张抗张强度和耐破度，降低透气度，提高撕裂度等；在音响领域可以用作生产超性能的声音振动膜；在材料领域，BC纳米纤维与其他高分子、有机或无机分子的复合掺杂，可获得各种新的功能复合材料，譬如燃料电池质子交换膜。
目前大规模利用细菌纤维素的主要障碍是其产量低、成本高、价格不敌普通纤维素，因此研究的重点集中在找寻新碳源上，寻找廉价合适的原料，既降低生产成本又能提高纤维素的产量。
木薯，英文名：Cassava，又称木番薯或树薯，属大戟科，原产于美洲。木薯适应性强，病虫害少，耐瘠耐旱，产量高，其用途相当广泛。木薯在19世纪20年代由印度尼西亚引进我国，现如今广泛分布于华南地区，其中，以广西种植面积为最大，2010年广西木薯种植面积达344.39万亩。木薯块根淀粉含量丰富为薯类之首，含量为25%～35%，素有“淀粉之王”、“地下粮仓”及“特用作物”之称。木薯的主要用途是食用、饲用和工业上开发利用。作为工业原料，木薯能加工为淀粉，变性淀粉，有机酸，酒精等2000多个品种，广泛应用于食品、医药、纺织等行业。科技发展，能源的需求不断增长，木薯已成为我国生物燃料产业发展的重要资源。与其他作物相比，木薯投入少，易栽培，全身可用，因而，木薯得到越来越多国家的重视，并积极开展研究，大力发展。除了木薯，我国还有大量的番薯、甘薯、地瓜和马铃薯，有时由于运输等问题，造成这些薯类农产品大量烂在地里和仓库，浪费严重。因此如有一种技术能充分利用这些现有农产品资源，提升其附加值，同时降低细菌纤维素生产成本，将对我国农业产品升级，推广纳米纤维素的应用具有很大帮助。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种利用薯类原料制备细菌纤维素的方法，该方法具有原料来源广泛，工艺简单、能耗低、反应迅速等优点；且使用薯类原料水解液生产的细菌纤维素产量高于其他碳源生产的细菌纤维素，在细菌纤维素的生产领域具有良好的应用前景。
本发明的一种利用薯类原料制备细菌纤维素的方法，包括：
（1）薯类原料的预处理：将薯类原料用汽蒸熟化软化后捣烂，或将薯类原料匀浆细碎化，得到预处理后的薯类原料；
（2）在上述预处理后的薯类原料中加入酸，进行酸水解；或加入酶，进行酶水解，得到薯类原料水解液；所述的酸水解的具体工艺为：酸的浓度为0.005-0.03g/mL，于温度60-150°C下水解0.1-5h；所述的酶水解的具体工艺包括：
a.薯类原料的液化
在上述预处理后的薯类原料中，按照酶/薯类原料干物质=1-4w/w%加入酶，再用酸或碱调节pH值为4.0-7.0，以50-120r/min的速度振荡反应30-120min，得到液化后的薯类原料；
b.薯类原料的糖化
在上述液化后的薯类原料，加入糖化酶66-270U/g薯类原料干物质，用酸调节pH值为4.0-5.5，在温度40-70℃的条件下反应0.5-48h，然后离心得到上清液，即薯类原料水解液；
（3）将上述薯类原料水解液作为培养基碳源，加氮源配制成发酵培养基，接入细菌纤维素生产菌株的种子液，经过3~23天发酵制得细菌纤维素。
所述步骤（1）中的薯类原料为木薯、番薯、甘薯、地瓜或马铃薯中的一种或几种。
所述步骤（1）中的用汽蒸熟化软化的具体工艺为：将薯类原料整体或切碎后，于温度50-110°C下水煮或者汽蒸30-60min熟化软化，水煮时薯类原料干物质与水的质量比例为1:1-1:3；匀浆细碎化的具体工艺为：将清洗干净的薯类原料直接加水匀浆，薯类原料干物质与水的质量体积比为1g:1.5mL。
所述步骤（2）中的酸水解中酸为硫酸、盐酸、磷酸、醋酸或柠檬酸。
所述步骤（2）中的酶水解中酶为淀粉酶、糊精酶、纤维素酶、糖化酶、葡聚糖酶、果胶酶中的一种或几种。
所述步骤（2）a中的酶/薯类原料干物质=3w/w%，pH值为6.0，反应的温度为87.5℃，反应时间为53min。
所述步骤（2）a中的酶为淀粉酶，当反应的温度为80-97°C时，采用高温淀粉酶；当反应的温度为30-60°C时，采用普通淀粉酶。
所述步骤（2）b中糖化酶的加入量为133U/g，pH值为4.5，反应的温度为62.2℃，反应时间为86min。
所述步骤（2）b中上述的离心的速度为6000rpm/min，离心时间为20min。
所述步骤（2）a中的碱为Ca(OH)2、NaOH或NH4OH，所述步骤（2）a和b中的酸为硫酸、磷酸、盐酸或硝酸。
所述步骤（3）中的薯类原料水解液可以首先补加0.1-1wt%的酵母浸膏和0.1-0.5wt%胰蛋白胨，调节pH至5.0，接入面包酵母/酿酒酵母（Saccharomyce scerevisiae）室温下或者30°C条件下自然发酵1-3天，再补加氮源配制成发酵培养基，接入细菌纤维素生产菌株的种子液，经过3~23天发酵制得细菌纤维素。
所述步骤（3）中的氮源为0.1~1wt%的酵母浸膏和0.1~0.5wt%的胰蛋白胨；或者为0.1-2wt%的硫酸铵、玉米浆或麦芽汁。
所述步骤（3）中发酵培养基的pH值调节为4.0~6.0，所述的发酵为在20~30℃温度下静止培养或者在50~500rpm转速下动态培养。
所述步骤（3）中的细菌纤维素生产菌株为醋酸菌属(Acetobacter sp.)、葡萄糖酸杆菌属（Gluconobacter sp.）、葡糖酸醋杆菌属(Gluconacetobacter sp.)、葡萄糖氧化杆菌（Gluconobacter oxydans）、根瘤菌属(Rhizobium sp.)、八叠球菌属(Sarcina sp.)、假单胞菌属(Pseudomounas sp.)、无色杆菌属(Achromobacter sp.)、产碱菌属(Alcaligenes sp.)、气杆菌属(Aerobacter sp.)、固氮菌属(Azotobacter sp.)、土壤杆菌属(Agrobacterium sp.)、洋葱假单胞菌（Seudomonas cepacia）、空肠弯曲菌（Campylobacter jejuni）、木葡糖酸醋杆菌（Gluconacetobacter xylinus）或红茶菌（kombucha），优选木葡糖酸醋杆菌（Gluconacetobacter xylinus）或红茶菌（kombucha）。
所述细菌纤维素生产菌株中除红茶菌以外的菌种按2~3接种环的接种量接入液体种子培养基（5－50g/L的甘露醇/或葡萄糖，1－10g/L酵母浸膏、1－5g/L蛋白胨，培养基pH值为5.0）制备种子液，然后按体积百分比3-15%的接种量转接到发酵培养基；细菌纤维素生产菌株为红茶菌时按接入1~3片直径1cm圆片菌膜的接种量接入液体种子培养基，然后按1~3片直径1cm圆片菌膜的接种量转接到发酵培养基。
本发明利用木薯、番薯、甘薯、地瓜、马铃薯等这些在我国资源丰富，种植广泛，存储方便且价格低廉的薯类原料进行。实验数据表明，在同等条件下，使用薯类原料水解液生产的细菌纤维素产量高于其他碳源，如蔗糖、葡萄糖、果糖、甘露醇等碳源生产的细菌纤维素。因此证实本发明所生产的廉价碳源是一种培养细菌纤维素的优质碳源。
有益效果：
（1）本发明以薯类为原料，具有来源广泛，工艺简单、水解液糖含量高；薯类原料预处理水解工艺具有简单、能耗低、反应迅速等优点。
（2）本发明经处理的薯类原料水解液生产的细菌纤维素产量高于其他碳源生产的细菌纤维素，在细菌纤维素的生产领域具有良好的应用前景。
附图说明
图1为不同单因素对高温α淀粉酶液化木薯的影响；
图2为不同单因素对糖化酶酶解木薯效果的影响；
图3为新鲜木薯、甘薯以及马铃薯水解液和其它常规碳源生产的细菌纤维素的结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
高温α淀粉酶液化最适条件的确定
1.木薯匀浆液制备
新鲜木薯先用水清洗干净，用打汁机在22000rpm/min下匀浆5分钟，木薯与水的比例（g/ml）是1:1.5，然后在5000rpm/min下离心10分钟，固液分离，将上清液和固行物存于4℃冰箱备用。
2.单因素实验
选择反应温度、反应时间、酶量、pH这4个影响液化效果的因素进行单因素实验，通过比较还原糖浓度来确定各个最优单因素条件。
（1）液化最适反应pH
在加酶量为3%（m/m），反应时间为90min，温度为87℃，实验对象为固液比是1:8（g/mL）的木薯匀浆液的条件下，不同的pH值对还原糖浓度的影响见图1（a），实验表明淀粉水解产生还原糖的量的最适pH为6.0。
（2）液化最适反应时温度
在pH=6.0，反应温度在90min，酶量在3%（m/m），实验对象为固液比是1:8（g/mL）的木薯匀浆液的条件下，反应温度对还原糖浓度的影响见图1（b），实验表明最适合的反应温度是87℃。
（3）液化最适反应时间
在pH=6.0，酶量在3%（m/m），反应温度为87℃的条件下，实验对象为固液比是1:8（g/mL）的木薯匀浆液的条件下，反应时间对还原糖浓度的影响见图1（c），液化最合适反应时间是60min。
（4）液化最适酶用量
在pH=6.0，反应温度为87℃，反应时间为90min，实验对象为固液比是1:8（g/mL）的木薯匀浆液的条件下，反应酶量对还原糖浓度的影响见图1（d）时，综合考虑水解度和实际生产成本等因素，暂时确定酶添加量为2%。
通过单因素实验，我们得到液化的最佳反应条件为温度87℃，反应时间60min，酶量为3%（m/m），pH值为6.0，实验原料木薯匀浆液。
3.多因素实验
在单因素实验的基础上，考虑实际的操作，我们调节木薯匀浆液的pH为6.0，选择反应温度、时间、酶量进行响应面优化，利用Design Experts8.0软件进行Box-Behnken设计。Box-Behnken是一种寻找多因素系统中最佳条件的数学统计方法。取反应温度、反应时间、酶量3个因素，每个因素取三个水平，根据设计进行实验后，对数据进行二次回归拟合，得到包括一次项、平均项、交互项的二次方程，分析各因素的主效应和交互效应，最后在一定水平范围内求最佳值。实验设计如下：
表1：淀粉酶响应面设计
表2：淀粉酶响应面分析实验设计与结果
利用Design Expert分析软件软件对实验数据（表2）进行回归拟合，得出淀粉酶水解木薯还原糖得率的回归方程：
还原糖浓度=59.61-0.48×A-1.36×B+2.49×C-1.43×A×B+0.020×A×C+1.57×B×C-1.16×A2-3.42×B2-1.01×C2
方差分析见表3，本实验所选用模型的F值为23.45，“Prob>F“为0.0002，具有高度显著性。失拟项在0.83水平上不显著，模型的R2=0.9679，C.V.%=1.47。R值与1越接近，相关性越好。从回归方程系数显著性检验可知，方程一次项C(P<0.0001)高度显著，B(P=0.0025)高度显著，交互项BC(P=0.0072)高度显著，二次项B2（P<0.0001）高度显著，A2（P=0.0248）显著，C2（P=0.0419）显著，故在本实验范围内，还原糖浓度受温度，酶用量影响较为显著。
表3：淀粉酶液化回归方程各项方差分析结果
在给定的范围内，通过响应面实验，根据模型回归方程分析得出高温α-淀粉酶水解木薯的最佳工艺条件是：酶用量3%，水解温度为87.5℃、pH值为6.0、水解时间53min。该组合不在试验设计内，因此需要通过验证试验，将响应面实验结论与响应面设计还原糖得率最高的组合进行比较，以检验响应面实验结果，实验结果见表4。
表4：淀粉酶不同实验条件比较
由上表可知响应面给出的实验条件得出的还原糖浓度时高于同等条件下的中心点的，所以是比较可信的。
实施例2
糖化酶最适反应条件的确定
1.木薯酶解液的制备
新鲜木薯先用水清洗干净，用打汁机在22000rpm/min下匀浆5分钟，木薯与水的比例（g/ml）是1:1.5，然后用碱调节pH为6.0，在淀粉酶酶用量3%，水解温度为87.5℃、的条件下，水解时间53min，取出冷却备用。
2.单因素实验
选择反应温度、反应时间、酶量、pH这4个影响糖化效果的因素进行单因素实验，通过比较还原糖浓度来确定各个最优单因素条件。
（1）糖化反应最合适的加酶量
在反应时间为90min，温度为60℃，实验对象为高温液化后的木薯匀浆液的条件下，不同糖化酶量对还原糖浓度的影响见图2（a），实验表明较适合的糖化酶添加量为133U/g。
（2）糖化反应最合适的pH
在酶的添加量133U/g，温度为60℃，实验对象为高温液化后的木薯匀浆液的条件下，不同的pH值对还原糖浓度的影响见图2（b），实验表明最适合的反应温度是4.6。
（3）糖化最适反应温度
在pH=4.6，酶的添加量133U/g，反应时间为90min，实验对象为高温液化后的木薯匀浆液的条件下，不同的反应温度对还原糖浓度的影响见图2（c），实验表明最适合反应温度是60℃。
（4）糖化最适反应时间
在pH=4.6，反应温度为60℃，酶的添加量133U/g，实验对象为高温液化后的木薯匀浆液的条件下，糖化时间对还原糖浓度的影响见图2（d）时，综合考虑水解度和实际生产成本等因素，暂时确定酶添加量为60min。
通过单因素实验，我们得到液化的最佳反应条件为温度60℃，反应时间60min，酶的添加量133U/g，pH值为4.6，实验原料高温液化后的木薯匀浆液。
3.多因素实验
在单因素实验的基础上，考虑实际的操作，我们统一糖化酶的酶添加量为133U/g，选择反应温度、时间、酶量进行响应面优化，利用Design Experts8.0软件进行Box-Behnken设计。实验设计如表5：
表5：糖化酶实验的因素和水平编码值
表6：糖化酶响应面分析实验设计与结果
利用Design Expert软件分析，通过实验数据（表3-6）进行回归拟合，得出糖化酶水解木薯还原糖得率的回归方程：还原糖浓度=+97.94+5.06×A+2.02×B-0.52×C+0.86×A×B+1.16×A×C -2.500E-003×B×C-3.22×A2-3.10×B2-3.37×C2
由模型方程进行方差分析可见（表7），本实验所选用模型的F值为22.81，“Prob>F“为0.0002，具有高度显著性。失拟项在3.57水平上不显著，模型的R2=0.9670，C.V.%=1.49。R值与1越接近，相关性越好。
从表7中回归方程系数显显著检验可知，方程一次项A(P<0.0001)高度显著，B(P=0.0045)高度显著，二次项A2（P=0.0021）高度显著，B2（P=0.0025）高度显著，C2（P=0.0016）显著，在本实验范围内，还原糖浓度受时间，温度影响较为显著。
表7回归方程各项方差分析结果
在给定的范围内，通过响应面实验，根据模型分析得出糖化酶的最佳工艺条件是：酶用量133U/g，水解温度为62.2℃、pH值为4.54、水解时间85min。该组合不在试验设计内，因此需要通过验证试验，将响应面实验结论与响应面设计还原糖得率最高的组合进行比较，以检验响应面实验结果，实验结果见表8。
表8：糖化酶不同实验条件比较
由上表可知响应面给出的实验条件得出的还原糖浓度时高于同等条件下的中心点实验，所以是比较可信的，此工艺是可行的。
实施例3
1.木薯匀浆液的制备
新鲜木薯先用水清洗干净，用打汁机在22000rpm/min下匀浆5分钟，木薯与水的比例（g/ml）是1:1.5，将木薯匀浆液存于4℃冰箱备用。
2.高温淀粉酶处理
将上面得到的木薯匀浆将按酶的添加量为3%（m/m），在温度为87.5℃、pH值为6.0的条件下水解时间53min，取出冷却备用。
3.糖化酶处理
将上面得到的经过高温液化处理后的木薯匀浆液用酸调节pH至4.54，往其中添加糖化酶，酶量为133U/g，在温度为62.2℃的条件下，水解时间85min，取出，在6000rpm/min的高速冷冻离心机下离心20分钟，取上清液于4℃冰箱备用。
4.细菌纤维素的制备
取上述上清液作为培养基碳源，以去离子水进行稀释，调节糖浓为25g/L，同时分别配置同样浓度的葡萄糖、果糖、甘露糖、蔗糖、甘油，再在其中补加0.1-1wt%的酵母浸膏和0.1-0.5wt%胰蛋白胨，分别配成100ml木薯水解液培养基、葡萄糖培养基、果糖培养基、甘露糖培养基、蔗糖培养基、甘油培养基。将醋酸杆菌或葡萄糖氧化杆菌等细菌以6-10vol%的接种量接入，于20-30℃培养箱内静止培养7天（3-23天都可），用玻砂漏斗（G-2，30ml）收取未经碱煮的纤维素膜，于105℃烘干并测量其绝干重，实验结果见图3。
实验结果表明，在细菌纤维素产量上，木薯水解液配制的培养基生产的细菌纤维素产量高于以葡萄糖、果糖、蔗糖或甘露糖为碳源的培养基，达7.84g/L。实验结果表明木薯水解液作为碳源生产细菌纤维素的效果明显优于其他几种常规碳源。由于木薯干资源丰富，价格低廉，因此可以作为生产细菌纤维素的廉价碳源，降低其生产成本，在工业生产上具有明显优势。
实施例4
1.木薯的预处理
新鲜木薯先用水清洗干净，于温度50-120°C下水煮或者汽蒸30-60min熟化软化，水煮时原料干物质与水的质量比例（g/ml）是1:1-5，熟化后将甘薯捣碎成糊状后存于4℃冰箱备用。
2.木薯的酸水解糖化
在上面得到的木薯糊中加入0.5w/v%硫酸，在温度为150℃的条件下水解时间5h；或者在上面得到的木薯糊中加入3w/v%硫酸，在温度为90℃的条件下水解时间2h。木薯水解后在6000rpm/min的高速冷冻离心机下离心20-30分钟，取上清液于4℃冰箱冷藏备用。
3.细菌纤维素的制备
取上述上清液作为培养基碳源，以去离子水进行稀释，调节糖浓为25g/L，同时分别配置同样浓度的葡萄糖、果糖、甘露糖、蔗糖、甘油，再在其中补加0.1-1wt%的酵母浸膏和0.1-0.5wt%胰蛋白胨，分别配成100ml木薯水解液培养基、葡萄糖培养基、果糖培养基、甘露糖培养基、蔗糖培养基、甘油培养基。将醋酸杆菌或葡萄糖氧化杆菌等细菌以6-10vol%的接种量接入，于20-30℃培养箱内静止培养或者以50-500rpm的转速动态培养7天（3-23天都可），用玻砂漏斗（G-2，30ml）收取未经碱煮的纤维素膜，于105℃烘干并测量其绝干重。实验结果表明，在细菌纤维素产量上，木薯水解液配制的培养基生产的细菌纤维素产量高于以葡萄糖、果糖、蔗糖或甘露糖为碳源的培养基，结果与图3类似。
实施例5
1.甘薯的预处理
新鲜甘薯先用水清洗干净，于温度50-120°C下水煮或者汽蒸30-60min熟化软化，水煮时原料干物质与水的质量比例（g/ml）是1:1-5，熟化后将甘薯捣碎后存于4℃冰箱备用。
2.淀粉酶液化甘薯
向上面得到的甘薯中，以4%（w/w）的添加量加入淀粉酶，在温度为30-60℃、pH值为4.0-6.0的条件下水解时间60-120min，取出冷却备用。
3.糖化酶处理
将上面得到的经过高温液化处理后的甘薯匀浆液用酸调节pH至4.54，以酶量为133U/g的添加量往其中添加糖化酶，在温度为62.2℃的条件下，水解时间85min后取出，在6000rpm/min的高速冷冻离心机下离心20分钟，取上清液于4℃冰箱备用。
4.细菌纤维素的制备
取上述上清液作为培养基碳源，以去离子水进行稀释，调节糖浓为25g/L，同时分别配置同样浓度的葡萄糖、果糖、甘露糖、蔗糖、甘油，再在其中补加0.1-1wt%的酵母浸膏和0.1-0.5wt%胰蛋白胨，分别配成100ml甘薯水解液培养基、葡萄糖培养基、果糖培养基、甘露糖培养基、蔗糖培养基、甘油培养基。将醋酸杆菌或葡萄糖氧化杆菌等细菌以6-10vol%的接种量接入，于20-30℃培养箱内静止培养7天（3-23天都可），用玻砂漏斗（G-2，30ml）收取未经碱煮的纤维素膜，于105℃烘干并测量其绝干重，实验结果见图3。
实验结果表明，在细菌纤维素产量上，甘薯水解液配制的培养基是最高的，达8.45g/L。实验结果表明甘薯水解液作为碳源生产细菌纤维素的效果明显优于其他几种常规单糖和双糖碳源。由于甘薯干资源丰富，价格低廉，因此可以作为生产细菌纤维素的廉价碳源，降低其生产成本，在工业生产上具有明显优势。
实施例6
1.土豆匀浆液的制备
新鲜土豆先用水清洗干净，用打汁机在22000rpm/min下匀浆5分钟，土豆与水的比例（g/ml）是1:1.5，将土豆匀浆液存于4℃冰箱备用。
2.高温淀粉酶处理
将上面得到的土豆匀浆将按酶的添加量为3%（m/m），在温度为87.5℃、pH值为6.0的条件下水解时间53min，取出冷却备用。
3.糖化酶处理
将上面得到的经过高温液化处理后的土豆匀浆液用酸调节pH至4.54，往其中添加糖化酶，酶量为133U/g，在温度为62.2℃的条件下，水解时间85min，取出，在6000rpm/min的高速冷冻离心机下离心20分钟，取上清液于4℃冰箱备用。
4.细菌纤维素的制备
取上述上清液作为培养基碳源，以去离子水进行稀释，调节糖浓为25g/L，同时分别配置同样浓度的葡萄糖、果糖、甘露糖、蔗糖、甘油，再在其中补加0.1-1wt%的酵母浸膏和0.1-0.5wt%胰蛋白胨，分别配成100ml土豆水解液培养基、葡萄糖培养基、果糖培养基、甘露糖培养基、蔗糖培养基、甘油培养基。将醋酸杆菌或葡萄糖氧化杆菌等细菌以6-10vol%的接种量接入，于20-30℃培养箱内静止培养7天（3-23天都可），用玻砂漏斗（G-2，30ml）收取未经碱煮的纤维素膜，于105℃烘干并测量其绝干重，实验结果见图3。
实验结果表明，在细菌纤维素产量上，土豆水解液配制的培养基生产的细菌纤维素产量高于以葡萄糖、果糖、蔗糖或甘露糖为碳源的培养基，达6.52g/L。实验结果表明土豆水解液作为碳源生产细菌纤维素的效果明显优于其他几种碳源。由于土豆干资源丰富，价格低廉，因此可以作为生产细菌纤维素的廉价碳源，降低其生产成本，在工业生产上具有明显优势。
实施例7
取实施例6中的上清液作为培养基碳源，补加0.1-1wt%的酵母浸膏和0.1-0.5wt%胰蛋白胨，调节pH至5.0，接入面包酵母/酿酒酵母（Saccharomyce scerevisiae）室温下或者30°C条件下自然发酵1-3天。然后以去离子水进行稀释，调节糖浓为25g/L，同时分别配置同样浓度的葡萄糖、果糖、甘露糖、蔗糖、甘油，再在其中补加0.1-1wt%的酵母浸膏和0.1-0.5wt%胰蛋白胨，分别配成100ml土豆水解液培养基、葡萄糖培养基、果糖培养基、甘露糖培养基、蔗糖培养基、甘油培养基。将醋酸杆菌或葡萄糖氧化杆菌等细菌以6-10vol%的接种量接入，于20-30℃培养箱内静止培养7天（3-23天都可），用玻砂漏斗（G-2，30ml）收取未经碱煮的纤维素膜，于105℃烘干并测量其绝干重，实验结果显示细菌纤维素产量比未经酵母发酵预处理的高10-30%。
Claims (13)
1.一种利用薯类原料制备细菌纤维素的方法，包括：
（1）将薯类原料用汽蒸熟化软化后捣烂，或将薯类原料匀浆细碎化，得到预处理后的薯类原料；
（2）在上述预处理后的薯类原料中加入酶，进行酶水解，得到薯类原料水解液；所述的酶水解的具体工艺包括：
a.在上述预处理后的薯类原料中，按照酶/薯类原料干物质=1-4w/w%加入酶，再用酸或碱调节pH值为4.0-7.0，以50-120r/min的速度振荡反应30-120min，得到液化后的薯类原料；
b.在上述液化后的薯类原料，加入糖化酶66-270U/g薯类原料干物质，用酸调节pH值为4.0-5.5，在温度40-70℃的条件下反应0.5-48h，然后离心得上清液，即薯类原料水解液；
（3）将上述薯类原料水解液作为培养基碳源，加氮源配制成发酵培养基，接入细菌纤维素生产菌株的种子液，经过3～23天发酵制得细菌纤维素。
2.根据权利要求1所述的一种利用薯类原料制备细菌纤维素的方法，其特征在于：所述步骤（1）中的薯类原料为木薯、番薯、甘薯、地瓜或马铃薯中的一种或几种。
3.根据权利要求1所述的一种利用薯类原料制备细菌纤维素的方法，其特征在于：所述步骤（1）中的用汽蒸熟化软化的具体工艺为：将薯类原料整体或切碎后，于温度50-110℃下水煮或者汽蒸30-60min熟化软化，水煮时薯类原料干物质与水的质量比例为1:1-1:3；匀浆细碎化的具体工艺为：将清洗干净的薯类原料直接加水匀浆，薯类原料干物质与水的质量体积比为1g:1.5mL。
4.根据权利要求1所述的一种利用薯类原料制备细菌纤维素的方法，其特征在于：所述步骤（2）中的酶水解中酶为淀粉酶、糊精酶、纤维素酶、糖化酶、葡聚糖酶、果胶酶中的一种或几种。
5.根据权利要求1所述的一种利用薯类原料制备细菌纤维素的方法，其特征在于：所述步骤（2）a中的酶/薯类原料干物质=3w/w%，pH值为6.0，反应的温度为87.5℃，反应时间为53min。
6.根据权利要求1所述的一种利用薯类原料制备细菌纤维素的方法，其特征在于：所述步骤（2）a中的酶为淀粉酶，当反应的温度为80-97℃时，采用高温淀粉酶；当反应的温度为30-60℃时，采用普通淀粉酶。
7.根据权利要求1所述的一种利用薯类原料制备细菌纤维素的方法，其特征在于：所述步骤（2）b中糖化酶的加入量为133U/g，pH值为4.5，反应的温度为62.2℃，反应时间为86min。
8.根据权利要求1所述的一种利用薯类原料制备细菌纤维素的方法，其特征在于：所述步骤（2）a中的碱为Ca(OH)2、NaOH或NH4OH，所述步骤（2）a和b中的酸为硫酸、磷酸、盐酸或硝酸。
9.根据权利要求1所述的一种利用薯类原料制备细菌纤维素的方法，其特征在于：所述步骤（3）中的薯类原料水解液首先补加0.1-1wt%的酵母浸膏和0.1-0.5wt%胰蛋白胨，调节pH至5.0，接入面包酵母/酿酒酵母（Saccharomyce scerevisiae）室温下或者30℃条件下自然发酵1-3天，再补加氮源配制成发酵培养基，接入细菌纤维素生产菌株的种子液，经过3～23天发酵制得细菌纤维素。
10.根据权利要求1或9所述的一种利用薯类原料制备细菌纤维素的方法，其特征在于：所述步骤（3）中的氮源为0.1～1wt%的酵母浸膏和0.1～0.5wt%的胰蛋白胨；或者为0.1-2wt%的硫酸铵、玉米浆或麦芽汁。
11.根据权利要求1所述的一种利用薯类原料制备细菌纤维素的方法，其特征在于：所述步骤（3）中发酵培养基的pH值调节为4.0～6.0，所述的发酵为在20～30℃温度下静止培养或者在50～500rpm转速下动态培养。
12.根据权利要求1所述的一种利用薯类原料制备细菌纤维素的方法，其特征在于：所述步骤（3）中的细菌纤维素生产菌株为醋酸菌属(Acetobacter sp.)、葡萄糖酸杆菌属（Gluconobacter sp.）、葡糖酸醋杆菌属(Gluconacetobacter sp.)、葡萄糖氧化杆菌（Gluconobacter oxydans）、根瘤菌属(Rhizobium sp.)、八叠球菌属(Sarcina sp.)、假单胞菌属(Pseudomounas sp.)、无色杆菌属(Achromobacter sp.)、产碱菌属(Alcaligenes sp.)、气杆菌属(Aerobacter sp.)、固氮菌属(Azotobacter sp.)、土壤杆菌属(Agrobacterium sp.)、洋葱假单胞菌（Seudomonas cepacia）、空肠弯曲菌（Campylobacter jejuni）、木葡糖酸醋杆菌（Gluconacetobacter xylinus）或红茶菌（kombucha）。
13.根据权利要求12所述的一种利用薯类原料制备细菌纤维素的方法，其特征在于：所述细菌纤维素生产菌株中除红茶菌以外的菌种按2～3接种环的接种量接入液体种子培养基制备种子液，然后按体积百分比3-15%的接种量转接到发酵培养基；细菌纤维素生产菌株为红茶菌时按接入1～3片直径1cm圆片菌膜的接种量接入液体种子培养基，然后按1～3片直径1cm圆片菌膜的接种量转接到发酵培养基。
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