CN101603015A - 一种地衣芽孢杆菌菌株及用途和用其生产聚γ-谷氨酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种地衣芽孢杆菌菌株，菌株保藏名称为地衣芽孢杆菌WX－02，保藏单位CCTCC，保藏编号为CCTCC NO：M208065，保藏日期2008年4月24日。本发明同时公开了该菌株的一种用途以及该菌株用于生产聚γ－谷氨酸的方法。本发明通过种子液制备、液体深层发酵工艺生产聚γ－谷氨酸产品，所属菌株遗传性能稳定、生产效率高、生产成本低。利用本发明的菌株及其发酵方法制备聚γ－谷氨酸3000L发酵罐产量可达35.05g/L。

Description

一种地衣芽孢杆菌菌株及用途和用其生产聚γ-谷氨酸的方法

技术领域

本发明涉及芽孢杆菌及其用途，具体地说是地衣芽孢杆菌菌株及用途和用其生产聚γ-谷氨酸的方法。

背景技术

地衣芽孢杆菌(Bacillus Licheniformis)是一类自然界广泛存在的兼性厌氧腐生菌。在工业上常常作为蛋白水解酶、淀粉酶、生物活性剂、抗生素等的生产菌。目前已有研究者采用特定的地衣芽孢杆菌生产聚γ-谷氨酸，如有人采用地衣芽孢杆菌A35生产聚γ-谷氨酸(详见参考文献1：Cheng C，Asada Y，AaidaT.Production of γ-polyglutamic acid by Bacillus licheniformi A35 underdenitrifying conditions.Agric Biol Chem，1989，53：2369-2375；)。但采用该菌株生产聚γ-谷氨酸存在发酵周期长，发酵产率低的缺陷。为了解决这一问题，有研究者公开了一种采用地衣芽孢杆菌(B.licheniformis ATCC9945A)生产聚γ-谷氨酸的方法(详见参考文献：US Patent 5378807，1995；Yoon SH，DO JH，Lee SY.Production of poly-γ-glutamic acid by fed-batch culture of Bacilluslicheniformis.Biotechnology Letters，2000，22：585-588)。上述方法虽然对聚γ-谷氨酸的产量有所提高，但其在发酵过程中需添加高浓度的甘油，故其生产成本高。由于聚γ-谷氨酸[Poly(γ-glutamic acid)，γ-PGA](以下简称γ-PGA))在医药、工业、农业等领域具有广阔的应用前景，因此，发明一株具有良好生产γ-PGA特性的地衣芽孢杆菌就具有非常重要的意义。

发明内容

本发明目的就是要提供一种可克服现有地衣芽孢杆菌菌株缺陷的新地衣芽孢杆菌菌株，同时提供一种该菌株的用途以及用该菌株生产聚γ-谷氨酸的方法。

本发明的目的是这样实现的：

本发明所提供的新的地衣芽孢杆菌菌株，其保藏名称为一株地衣芽孢杆菌WX-02，保藏单位在CCTCC，保藏编号为CCTCC NO：M208065。保藏日期2008年4月28日。

本发明的菌种的分离与筛选方法是：

称取湖北应城盐矿高盐环境土样1g于灭菌试管中，加无菌水9mL，用棉塞封口，振荡2min，然后放水浴锅中，80℃加热10分钟，再静置30min。冷却后，吸取上清液0.1mL，稀释10^-2，10^-3，分别取0.2mL，涂布LB平板，37℃培养48h观察结果，挑选在LB培养基上呈乳液状能拉丝的单菌落，接入新鲜液体种子培养基中，37℃摇床培养12h后，按2％的接种量分别接种到装有50mL灭菌基本发酵培养基的250mL摇瓶中，37℃，190r/min，振荡培养36h结束发酵。对发酵产物分别取样离心除去菌体，用3倍乙醇沉淀上清液，轻轻振荡后12000r/min离心15min，收集沉淀物，冷冻干燥，再加入蒸馏水溶解沉淀物，透析去除离子，利用HPLC检测产物。将筛选到的菌株按照规定方法进行菌种鉴定。

本发明所提供的新地衣芽孢杆菌菌株菌体直杆状，革兰氏染色阳性，芽孢近似圆形，偏端生。在LB固体培养基上菌落圆形，边缘不齐，毛发状，菌苔干燥，不透明，蔓延，灰白色。最适生长温度30-37℃，适宜pH6.8-7.2。接触酶实验阳性，硝酸盐利用阳性，柠檬酸盐利用阳性，明胶液化实验阳性。

本发明所提供的新地衣芽孢杆菌菌株16S rRNA基因序列有1263个碱基，经采用Genebank登记号：EU564336对比16S rRNA分子鉴定与前面的生理生化鉴定结果结合分析，鉴定为芽孢杆菌属地衣芽孢杆菌。

本发明的第二个目的是提供一种该地衣芽孢杆菌菌株的用途，即该菌株用于生产聚γ-谷氨酸。

本发明同时提供了一种用该菌株生产聚γ-谷氨酸的方法。该方法包括以下步骤：

a、采用地衣芽孢杆菌WX-02、保藏单位CCTCC、保藏编号为CCTCC NO：M208065、保藏日期2008年4月24日的菌株作为生产菌株；

b、将上述WX-02菌株接在LB培养基固体斜面上30℃-37℃培养；刮取菌苔至无菌的20％甘油保藏管中；-60～-70℃冷冻保藏；

c、制备种子液：

(1)将上述冷冻保藏的菌种接种到LB固体培养基平板上，30℃-37℃培养24-36小时，使其活化；

LB固体培养基的优选配方为：蛋白胨1-10克/升、酵母浸出物1-5克/升、NaCl 1-10克/升、琼脂10-20克/升，pH 6.0-8.0。

LB固体培养基更为优选配方为：蛋白胨3-5克/升、酵母浸出物3-5克/升、NaCl 5-10克/升、琼脂15-20克/升、pH 6.0-8.0。

(2)将上述活化的种子转接到L B液体种子培养基中，30℃-37℃，200rpm培养14-16小时至对数生长中期；

d、发酵培养：

(1)按照每1升培养基的加入量配置发酵培养基：谷氨酸钠7-100克；碳源10-100克；无机氮源3-20克；K₂HPO₄·3H₂O 0.1-2克；MgSO₄·7H₂O 0.1-2克；FeCl₃·6H₂O 0.01-0.1克；CaCl₂·2H₂O 0.1-2克；MnSO₄ 0.01-0.2克；ZnSO₄ 0.1-2克，补充蒸馏水至1000mL，pH 6.0-7.5；

(2)按50-100mL/500mL三角瓶的装液量，投入上述培养基，121℃，30min灭菌后，接种量为1-5％，30-37℃培养24-48小时；或按发酵罐容积的40-80％投入上述发酵培养基，以0.07-0.1Mpa高压蒸汽灭菌维持30分钟，冷却至30℃-37℃接入种子液；在30℃-37℃条件下培养，通气量1∶0.5-2(v/v)；

其中谷氨酸钠的优选含量为20-100克/升。

发酵培养基中的无机氮源优选硫酸铵、氯化铵、尿素、硝酸铵、或硝酸钠。无机氮源含量优选5-20克/升。

培养基中的碳源优选葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖、淀粉、或淀粉水解液。碳源含量优选30-100克/升。

e、提取：

将d步骤所述的菌株培养液深层发酵24-48小时；离心除去菌体、收集上清液，并用95％的乙醇沉淀、回收聚-γ-谷氨酸。

本发明所提供的地衣芽孢杆菌菌株wx-02在用于生产聚γ-谷氨酸时，其效果明显优于现已知的地衣芽孢杆菌菌株。其总体表现在以下几个方面：

(1)发酵周期短，生产效率高：本发明的菌株在实验室3L发酵罐中发酵周期为28-36小时，聚γ-谷氨酸产量可达到42g/L；在中试3000L发酵罐产量达到35.05g/L，扩大过程中产量稳定。

(2)发酵工艺相对简单：如不需要补料控制及温度、pH值的控制。发酵过程中不起泡，不需要控制泡沫，不会发生逃液及染菌现象。

(3)生产成本低：培养基中不需要添加甘油和有机氮源，发酵成本低，培养基无色透明，易于产物分离提取。

(4)遗传稳定性好。该菌株遗传操作简单，可制备高感受态细胞，转化效率高。遗传性能稳定，连续传代20次以上，该菌株合成聚γ-谷氨酸的能力不变。

本发明用于生产聚γ-谷氨酸时发酵周期短、生产效率高的有益效果通过以下对比试验得到验证：

试验材料：

试验组采用本发明菌株，生产聚γ-谷氨酸的方法采用本发明实施例4所述方法；

对照组采用参考文献1所述的地衣芽孢杆菌菌株及其生产聚γ-谷氨酸的方法。

试验结果对比见表1。

附图说明：

图1：是本发明菌株生产聚-γ-谷氨酸发酵产物水解样品的HPLC分析图谱。(保留时间为2.74分钟的峰为聚γ-谷氨酸的水解产物谷氨酸的峰)

具体实施方式

以下通过实施例对本发明进行详细说明，但所有实施例并不对本发明构成任何限制。

实施例1：本发明菌株的分离、筛选

称取湖北应城盐矿高盐环境土样1g于灭菌试管中，加无菌水9mL，用棉塞封口，振荡2min，然后放水浴锅中，80℃加热10分钟，再静置30min。冷却后，吸取上清液0.1mL，稀释10-2，10-3，分别取0.2mL，涂布LB平板，37℃培养48h观察结果，挑选在LB培养基上呈乳液状能拉丝的单菌落，接入新鲜液体种子培养基中，37℃摇床培养12h后，按2％的接种量分别接种到装有50

mL灭菌基本发酵培养基的250mL摇瓶中，37℃，190r/min，振荡培养36h结束发酵。对发酵产物分别取样离心除去菌体，用3倍乙醇在沉淀上清液，轻轻振荡后12000r/min离心15min，收集沉淀物，冷冻干燥，再加入蒸馏水溶解沉淀物，透析去除离子，利用HPLC检测产物。

实施例2：本发明菌株的鉴定

生理生化鉴定

菌体直杆状，革兰氏染色阳性，芽孢近似圆形，偏端生。在LB固体培养基上菌落圆形，边缘不齐，毛发状，菌苔干燥，不透明，蔓延，灰白色。最适生长温度30-37℃，适宜pH6.8-7.2。接触酶实验阳性，硝酸盐利用阳性，柠檬酸盐利用阳性，明胶液化实验阳性。

利用16S rRNA基因序列分析进行菌种鉴定

地衣芽孢杆菌WX-02基因组DNA抽提

将地衣芽孢杆菌WX-02在LB(含蛋白胨10克/升、酵母浸出物5克/升、NaCl 10克/升、琼脂15克/升、pH 7.0)平板上划线，置37℃过夜培养后，挑取少量菌体，转接于LB摇瓶培养液，于37℃以190r/min振荡培养到OD600的值约为0.2～0.3；离心收集所有菌体，以STE(100mmol/L NaCl，10mmol/LTris·HCl，pH 8.0，1mmol/L EDTA)洗涤菌体1次；加100μL溶液I(50mmol/L蔗糖，25mmol/L Tris·HCl，pH 8.0，10mmol/L EDTA)悬浮菌体，再加30mg/mL的溶菌酶20μL，冰浴上放置过夜；加200μL 2％SDS，轻缓混匀后置60℃水浴上30min；加100μL溶液5M NaCl，轻缓混匀后置冰浴上放10min；以12000r/min离心5min，吸取上清液到一个新的Eppendorf管，用苯酚氯仿异戊醇溶液(24∶24∶1，v/v)抽提2次；上清液加2倍体积的95％乙醇，于室温下放5～10min后，把溶液吸除后，以12000r/min离心5min，弃上清液，再用70％乙醇离心洗涤沉淀1次；真空干燥沉涤，用20μL ddH2O，加入10mg/mL的RNase溶液1～2μL，混匀后置37℃0.5h以上，即为制备的总DNA溶液。

16S rRNA基因序列的PCR扩增：

引物由北京奥科生物技术公司合成。

原核生物16S rDNA扩增通用引物：

Primer1：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′

Primer2：5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′

反应体系

PCR反应体系：

模板DNA(1-3ug)                            1uL

10×buffer(含Mg 2+)                       2.5uL

d NTP(10mmol/L)                           2.5uL

Primer 1(10umol/L)                        1uL

Primer 2(10umol/L)                        1uL

Ly DNA聚合酶                              0.25uL

ddHzO                                     16.75uL

                                                                   

Total                                     25uL

扩增条件：

94℃预变性5分钟；94℃变性1分钟、57℃退火1分钟、72℃延伸1.5分钟、28个循环；72℃补平末端5分钟；4℃保温10分钟。

16S rRNA基因序列PCR扩增产物的纯化：

参照上海华舜生物生物工程有限公司的小量胶回收试剂盒对PCR产物进行回收。

16S rRNA基因测序：

纯化后的产物测序委托北京奥科生物技术公司测序，测序所得聚γ-谷氨酸产生菌Bacillus Licheniformis WX-02 16S rRNA基因序列有1263个碱基，Genebank登记号：EU564336，测得的16S rRNA序列输入GenBank，EMBL，DDBJ等数据库用BLAST软件进行比对处理，同Bacillus licheniformisCICC10103(Genebank登记号：DQ212969.1)同源性达到100％。结合16S rRNA分子鉴定与前面的生理生化鉴定结果，鉴定WX-02为芽孢杆菌属地衣芽孢杆菌。

质粒检测：

将Bacillus Licheniformis WX-02在LB上划线，置37℃过夜培养后，挑取少量菌体，转接于5mL LB试管培养液，于30℃以190r/min振荡培养到OD600的值约为0.2～0.3；离心收集所有菌体，以STE(100mmol/L NaCl，10mmol/LTris·HCl，pH 8.0，1mmol/L EDTA)洗涤菌体1次；加100μL溶液I(50mmol/L蔗糖，25mmol/L Tris·HCl，pH 8.0，10mmol/L EDTA)悬浮菌体，再加30mg/mL的溶菌酶20μL，冰浴上放置1h以上；加200μL新鲜配制的溶液II(0.2mol/LNaOH，1％SDS)，轻缓混匀后置冰浴中5min；加150μL溶液III(50mol/L KAc60mL，冰乙酸11.5mL，ddH2028.5mL)，混匀后置冰浴上放5min；以12000r/min离心5min，吸取上清液到一个新的Eppendorf管，用苯酚氯仿异戊醇溶液(24∶24∶1，v/v)抽提1次；上清液加2X体积的95％乙醇，于室温下放5～10min后，以12000r/min离心5min，弃上清液，再用70％乙醇离心洗涤沉涤1次；真空干燥沉涤，用20μL TE溶液(1mmol/L EDTA，10mmol/L Tris·HCl，pH 8.0)溶解沉淀，加入10mg/mL的RNase溶液1～2μL，混匀后置37℃放置0.5h以上，0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，经过5次重复未检测到质粒。

高感受态细胞制备

地衣芽孢杆菌感受态制备用培养基：

10×最低盐溶液：K₂HPO₄ 14g、KH₂PO₄ 6g、(NH4)₂SO₄ 2g、Na₃C₆H₅O₇·2H₂O1g、MgSO₄·7H₂O 0.2g，在蒸馏水中依次溶解，加水至100ml。

L-trp：2mg/mL，贮于棕色试剂瓶内，过滤灭菌，用黑纸包裹保存。

葡萄糖：50％，过滤灭菌。

GM I溶液：1×最低盐溶液95ml、50％葡萄糖1ml、5％酸水解酪蛋白0.4ml、10％酵母汁1ml、2mg/mL L-trp 2.5ml。

GM II溶液：1×最低盐溶液97.5ml、50％葡萄糖1ml、5％酸水解酪蛋白0.08ml、10％酵母汁0.04ml、0.5M MgCl₂ 0.5ml、0.1M CaCl₂ 0.5ml、2mg/ml L-trp 0.5ml。

LB平板上活化Bacillus Licheniformis WX-02；接种于5ml GM I溶液，在37℃慢摇床(100r/min)振荡培养过夜；次日取2ml转接到18ml GM I溶液中，37℃快摇床(200r/min)培养3.5h；再取10ml转接到90ml GM II溶液中，37℃摇床培养90min，离心收集菌体；用10ml上清液悬浮菌体，并加30％的灭菌甘油至10％，混匀后分装1.5ml离心管中，随即放到-70℃冰箱保存；用于直接转化时不加甘油，在0.5ml菌液中加入适量DNA(1μg/ml)于37℃缓慢振荡保温30min后涂抗性平板，在37℃培养过夜，次日检查转化子。本实验室构建的整合载体pDG1730-vgb为每次取5μL线性化质粒转化0.5mL感受态细胞，质粒浓度为125ng/μL，长出的抗性转化子约50-100个/平板，则整合效率约80-160个转化子/μg质粒。经PCR鉴定，都是阳性克隆。

实施例3采用本发明菌株所生产的聚γ-谷氨酸的产量测定

用本发明菌株所生产的聚γ-谷氨酸其定量分析由HPLC完成，色谱柱Agilent1100，流动相为100m mol.L^-1 KH₂PO₄加5.0％甲醇(用磷酸调pH值至2.5)过滤，超声波除气，紫外检测波长为210nm，流速为1mL/min，谷氨酸作为定量的标准物。

具体测定步骤如下：

取5毫升发酵离心上清液，加3倍体积酒精沉淀PGA，溶解产物，加等体积浓盐酸真空条件下110℃水解24h，水解后把水解液加10mol.L^-1NaOH中和定容，经0.22μm膜过滤，测定谷氨酸的含量，聚γ-谷氨酸浓度＝水解后谷氨酸浓度*129/147。详见图1所示结果。

实施例4聚γ-谷氨酸的发酵生产

a、用冷冻保藏的本发明菌种为原始菌种；

b、斜面菌种活化：

将冷冻保藏的菌种(本发明菌株WX-02)，接种到LB固体培养基斜面(含蛋白胨10克/升、酵母浸出物5克/升、NaCl 10克/升、琼脂20克/升、pH 7.0)，30℃-37℃培养24-36小时。刮取菌苔至无菌的20％甘油保藏管中；-70℃冷冻保藏；

c、种子液培养：

将上述冷冻保藏的菌种子转接到LB固体培养基平板上，30℃-37℃培养24-36小时，使其活化；将活化的种子转接到三角瓶液体种子培养基中(蛋白胨10克/升、酵母浸出物5克/升、NaCl 10克/升、pH 7.0)，30℃-37℃，200rpm培养14-16小时至对数生长中期；

d摇瓶发酵培养：

按照每1升培养基的加入量配置发酵培养基：谷氨酸钠10克；葡萄糖10克；氯化铵3克；K₂HPO₄·3H₂O 0.1克；MgSO₄·7H₂O 0.1克；FeCl₃·6H₂O 0.01克；CaCl₂·2H₂O 0.1克；MnSO₄ 0.01克；ZnSO₄ 0.1克，补充蒸馏水至1000mL，pH7.5，配置210mL发酵液分装500mL三角瓶，每瓶装液量70mL，以121℃高压蒸汽灭菌维持30分钟，冷却至37℃按照1％的接种量接入种子液，摇床转速180rpm，发酵温度37℃，通气量1∶0.5-2(v/v)，发酵至36小时结束发酵。

e、提取：

将上述发酵液离心除去菌体、收集上清液，用95％的乙醇沉淀、回收聚-γ-谷氨酸。

采用实施例3所述方法，检测分析所得到的聚γ-谷氨酸，其浓度为8g/L。

实施例5聚γ-谷氨酸的发酵生产

a、用冷冻保藏的本发明菌种为原始菌种；

b、斜面菌种活化：

将冷冻保藏的菌种(本发明菌株WX-02)，接种到LB固体斜面(含蛋白胨5克/升、酵母浸出物3克/升、NaCl5克/升、琼脂15克/升、pH6.0)，30℃-37℃培养36小时。

c、种子液培养同实施例4。

d、摇瓶发酵培养

按照每1升培养基的加入量配置发酵培养基：谷氨酸钠30克；蔗糖30克；硫酸铵10克；K₂HPO₄·3H₂O 0.5克；MgSO₄·7H₂O 0.5克；FeCl₃·6H₂O 0.05克；CaCl₂·2H₂O 0.5克；MnSO₄ 0.5克；ZnSO₄ 0.6克，补充蒸馏水至1000mL，pH 7.5，配置210mL发酵液分装500mL三角瓶，每瓶装液量70mL，以121℃高压蒸汽灭菌维持30分钟，冷却至37℃按照1％的接种量接入种子液，摇床转速180rpm，发酵温度37℃，通气量1∶0.5-2(v/v)，发酵至24小时结束发酵。

e、同实施例4

采用实施例3所述方法，检测分析所得到的聚γ-谷氨酸，其浓度为15g/L。

实施例6聚γ-谷氨酸的发酵生产

a、用冷冻保藏的本发明菌种为原始菌种；

b、斜面菌种活化：

将冷冻保藏的菌种(本发明菌株WX-02)，接种到LB固体斜面(含蛋白胨1克/升、酵母浸出物1克/升、NaCl 1克/升、琼脂10克/升、pH8.0)，30℃-37℃培养24小时。

c、种子液培养同实施例4。

d、摇瓶发酵培养

按照每1升培养基的加入量配置发酵培养基：谷氨酸钠50克；葡萄糖60克；氯化铵12克；K₂HPO₄·3H₂O 0.8克；MgSO₄·7H₂O 0.8克；FeCl₃·6H₂O 0.06克；CaCl₂·2H₂O 0.8克；MnSO₄ 0.08克；ZnSO₄ 1.0克，补充蒸馏水至1000mL，pH7.5，配置210mL发酵液分装500mL三角瓶，每瓶装液量70mL，以121℃高压蒸汽灭菌维持30分钟，冷却至37℃按照2％的接种量接入种子液，摇床转速180rpm，发酵温度37℃，发酵至48小时结束发酵。

e、同实施例4

采用实施例3所述方法，检测分析所得到的聚γ-谷氨酸，其浓度为30.8g/L。

实施例7聚γ-谷氨酸的发酵生产

a、用冷冻保藏的本发明菌种为原始菌种；

b、斜面菌种活化。

将冷冻保藏的菌种(本发明菌株WX-02)，接种到LB固体斜面(含蛋白胨10克/升、酵母浸出物5克/升、NaCl 10克/升、琼脂20克/升、pH6.5)，30℃-37℃培养30小时。

c、种子液培养同实施例4。

d、摇瓶发酵培养

按照每1升培养基的加入量配置发酵培养基：谷氨酸钠60克；葡萄糖90克；硝酸铵15克；K₂HPO₄·3H₂O 1.5克；MgSO₄·7H₂O 1.5克；FeCl₃·6H₂O 0.08克；CaCl₂·2H₂O 1.5克；MnSO₄ 0.1克；ZnSO₄ 1.5克，补充蒸馏水至1000mL，pH 7.5，配置210mL发酵液分装500mL三角瓶，每瓶装液量70mL，以121℃高压蒸汽灭菌维持30分钟，冷却至37℃按照4％的接种量接入种子液，摇床转速180rpm，发酵温度37℃，发酵至32小时结束发酵。

e、同实施例4。

采用实施例3所述方法，检测分析所得到的聚γ-谷氨酸，其浓度为45g/L。

实施例8：聚γ-谷氨酸的发酵生产聚

a、用冷冻保藏的本发明菌种为原始菌种；

b、斜面菌种活化

将冷冻保藏的菌种(本发明菌株WX-02)，接种到LB固体斜面(含蛋白胨8克/升、酵母浸出物4克/升、NaCl8克/升、琼脂18克/升、pH7.0)，30℃-37℃培养24小时。

c、种子液培养同实施例4。

d、摇瓶发酵培养

按照每1升培养基的加入量配置发酵培养基：谷氨酸钠100克；淀粉100克；氯化铵20克；K₂HPO₄·3H2O 2克；MgSO₄·7H₂O 2克；FeCl₃·6H₂O 0.1克；CaCl₂·2H₂O 2克；MnSO₄ 0.2克；ZnSO4 2克，补充蒸馏水至1000mL，pH 7.5，配置210mL发酵液分装500mL三角瓶，每瓶装液量70mL，以121℃高压蒸汽灭菌维持30分钟，冷却至37℃按照4％的接种量接入种子液，摇床转速180rpm，发酵温度37℃，发酵至36小时结束发酵。

e、同实施例4。

采用实施例3所述方法，检测分析所得到的聚γ-谷氨酸，其浓度为42.3g/L。

实施例9：聚γ-谷氨酸的发酵生产聚

a、用冷冻保藏的本发明菌种为原始菌种；

b、斜面菌种活化同实施例4。

c、种子液培养同实施例4。

d、摇瓶发酵培养

谷氨酸钠7％；葡萄糖7％；氯化铵2％；K₂HPO₄·3H₂O 0.01％；MgSO₄·7H₂O0.01％；FeCl₃·6H₂O 0.001％；CaCl₂·2H₂O 0.01％；MnSO₄ 0.001％；ZnSO₄ 0.01％，装液量1.5L/3L发酵罐，以121℃高压蒸汽灭菌维持30分钟，接入上述种子液，接种量3％，pH 7.0，通气量1∶1(v/v)，转速400rpm，温度37℃，发酵至36小时结束发酵。

e、同实施例4。

检测分析所得到的聚γ-谷氨酸的浓度为42g/L。

实施例1O聚γ-谷氨酸的发酵生产聚

a、用冷冻保藏的本发明菌种为原始菌种；

b、斜面菌种活化同实施例4。

c、种子液培养同实施例4。

d、摇瓶发酵培养

谷氨酸钠7％；葡萄糖7％；氯化铵2％；K₂HPO₄·3H₂O 0.01％；MgSO₄·7H₂O0.01％；FeCl₃·6H₂O 0.001％；CaCl₂·2H₂O 0.01％；MnSO₄ 0.001％；ZnSO₄ 0.01％，装液量1500L/3000L发酵罐，以121℃高压蒸汽灭菌维持30分钟，接入上述种子液，接种量3％，pH 7.0，通气量75L/min，转速150r/min，温度37℃，发酵至36小时结束发酵。

e、同实施例4。

检测同实施例4。分析所得到的聚γ-谷氨酸的浓度为35.05g/L。

Claims (10)

1、一种地衣芽孢杆菌菌株，其特征在于所述菌株保藏名称为地衣芽孢杆菌WX-02，保藏单位CCTCC，保藏编号为CCTCC NO：M208065，保藏日期2008年4月24日。

2、根据权利要求1所述的地衣芽孢杆菌菌株的用途，其特征在于该菌株用于生产聚γ-谷氨酸。

3、根据权利要求1所述的地衣芽孢杆菌菌株用于生产聚γ-谷氨酸的方法，其特征在于它包括以下步骤：

a、采用地衣芽孢杆菌WX-02、保藏单位CCTCC、保藏编号为CCTCC NO：M208065、保藏日期2008年4月24日的菌株作为生产菌株；

b、上述wx-02菌株接在LB培养基固体斜面上30℃-37℃培养；刮取菌苔至无菌的20％甘油保藏管中；-60～-70℃冷冻保藏；

c、制备种子液：

(1)将上述冷冻保藏的菌种接种到LB固体培养基平板上，30℃-37℃培养24-36小时，使其活化；

(2)将上述活化的种子转接到L B液体种子培养基中，30℃-37℃，200rpm培养14-16小时至对数生长中期；

d、发酵培养：

(1)按照每1升培养基的加入量配置发酵培养基：谷氨酸钠7-100克；碳源10-100克；无机氮源3-20克；K₂HPO₄·3H₂O 0.1-2克；MgSO₄·7H₂O 0.1-2克；FeCl₃·6H₂O 0.01-0.1克；CaCl₂·2H₂O 0.1-2克；MnSO₄ 0.01-0.2克；ZnSO₄ 0.1-2克，补充蒸馏水至1000mL，pH 6.0-7.5；

(2)按50-100mL/500mL三角瓶的装液量，投入上述培养基，121℃，30min灭菌后，接种量为1-5％，30-37℃培养24-48·小时；或按发酵罐容积的40-80％投入上述发酵培养基，以0.07-0.1Mpa高压蒸汽灭菌维持30分钟，冷却至30℃-37℃接入种子液；在30℃-37℃条件下培养；

e、提取：

将d步骤所述的菌株培养液深层发酵24-48小时；离心除去菌体、收集上清液，并用95％的乙醇沉淀、回收聚-γ-谷氨酸。

4、根据权利要求3所述的生产聚γ-谷氨酸的方法，其特征在于所说的LB固体培养基的组成为：蛋白胨1-10克/升、酵母浸出物1-5克/升、NaCl1-10克/升、琼脂10-20克/升，pH6.0-8.0。

5、根据权利要求3所述的生产聚γ-谷氨酸的方法，其特征在于所说的LB固体培养基的组成为：

蛋白胨5-10克/升；酵母浸出物3-5克/升；NaCl 5-10克/升；琼脂15-20克/升；pH 6.0-8.0。

6、根据权利要求3所述的生产聚γ-谷氨酸的方法，其特征在于所说的谷氨酸钠的含量为20-100克/升。

7、根据权利要求3所述的生产聚γ-谷氨酸的方法，其特征在于所说的无机氮源是硫酸铵、氯化铵、尿素、硝酸铵或硝酸钠中的任意一种。

8、根据权利要求3所述的生产聚γ-谷氨酸的方法，其特征在于所说的发酵培养基中的无机氮源含量为5-20克/升。

9、根据权利要求3所述的生产聚γ-谷氨酸的方法，其特征在于所说的发酵培养基中的碳源是葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖、淀粉或淀粉水解液中的任意一种。

10、根据权利要求3所述的生产聚γ-谷氨酸的方法，其特征在于所说的发酵培养基中的碳源含量为30-100克/升。

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