CN104630124A - 一株产纳豆激酶的地衣芽胞杆菌工程菌和用该菌生产纳豆激酶的方法 - Google Patents

一株产纳豆激酶的地衣芽胞杆菌工程菌和用该菌生产纳豆激酶的方法 Download PDF

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Abstract

一株产纳豆激酶的地衣芽胞杆菌工程菌和用该菌生产纳豆激酶的方法，属于微生物基因工程和酶工程技术领域。本发明通过PCR技术扩增获得枯草芽胞杆菌MBS04-6的纳豆激酶基因，利用地衣芽胞杆菌BL10作为表达宿主，以枯草芽胞杆菌168的启动子P43为启动子，以地衣芽胞杆菌WX-02的胞外丝氨酸蛋白酶Vpr的信号肽为信号肽，以地衣芽胞杆菌WX-02的α-淀粉酶的终止子序列为终止子，将这些表达元件与穿梭载体pHY300PLK连接，构成表达载体，转化地衣芽胞杆菌BL10，即为产纳豆激酶的地衣芽胞杆菌工程菌BL10(pP43SNT)，该菌株于2013年9月10日保存于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：M2013401。本发明还提供了该菌株生产纳豆激酶的方法，在液体发酵培养基中最大酶活力达到11.37FU/mL。

Description

一株产纳豆激酶的地衣芽胞杆菌工程菌和用该菌生产纳豆激酶的方法
技术领域
本发明属于微生物基因工程和酶工程技术领域，具体涉及一株产纳豆激酶的地衣芽胞杆菌工程菌和用该菌生产纳豆激酶的方法 
背景技术
纳豆激酶(NK)是由枯草芽胞杆菌合成的一种纤溶酶，具有很强的溶解纤维蛋白活性，目前已经广泛应用于食品和保健领域。其活性中心为Asp32、His64、Ser221组成的催化三联体。纳豆激酶(E.C.3.4.21.62)是一种单链多肽酶，由275个氨基酸残基组成，分子量为27,728Da。室温条件下，在pH7-9范围内，酶活性最为稳定，pH低于5则酶不稳定。金属离子会影响纳豆激酶(NK)的活力，Cu2+、Zn2+、Al3+、Ca2+等离子对该酶有不同程度的抑制作用，Fe2+对其酶活力具有强烈抑制作用，汞离子会使NK完全失活，而Mg2+、Co2+则对其有激活作用。 
纳豆激酶不仅能直接降解血栓纤维蛋白，而且还能激活动物细胞纤溶酶原转变为成熟的纤溶酶，进而促进纤维蛋白溶解(Fujita et al1993)。Li等人在2007年，将NK的基因编码区和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)融合表达，利用重组杆状病毒为载体，导入Spodoptera frugiperda(SF-9)细胞中，获得了活性表达(Li et al2007)。利用诱导型启动子PnisZ和信号肽SPUsp在乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)中诱导表达NK，大约94％的NK分泌到胞外；但是，利用组成型P32启动子未成功表达NK。地衣芽胞杆菌被认为是安全菌株，且能分泌大量的胞外蛋白，是一个很好的分泌表达系统。地衣芽胞杆菌BL10来源于野生菌地衣芽胞杆菌WX-02，缺失野生菌的胞外蛋白酶的表达宿主，有利于外源蛋白的的分泌表达。纳豆激酶已经在大肠杆菌和枯草芽胞杆菌中获得不同程度的表达，但还未有在地衣芽胞杆菌中分泌表达的报道。 
发明内容
本发明目的是提供一种产纳豆激酶的地衣芽胞杆菌工程菌[地衣芽胞杆菌工程菌BL10(pP43SNT)，2013年9月10日保存于武汉市武昌珞珈山的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：M2013401]和用该菌生产纳豆激酶的方法，为工业大规模生产纳豆激酶奠定基础。 
本发明的技术方案： 
1.纳豆激酶原基因的克隆 
根据NCBI上公布的B.subtilis MBS04-6的纳豆激酶(NK)基因aprN(登陆编号为FJ374767，如序列SEQ ID NO：1)的序列设计一对引物PaprNF和PaprNR。 
PaprNF：5’-CTCACCGGAGTGCAGGCAGCCGGAAAAAGCAGTACAG-3’ 
PaprNR：5’-AATCCGTCCTCTCTGCTCTTTTATTGTGCAGCTGCTTGTA-3’ 
以B.subtilis MBS04-6基因组为模板PCR得到aprN基因片段(无信号肽序列)。 
2.纳豆激酶组成型表达质粒的构建 
根据本实验测得的B.licheniformis WX-02全基因组序列中的vpr基因序列，以B.licheniformis WX-02的基因组DNA作为模板，PCR扩增得到vpr的信号肽Svpr片段；根据NCBI公布的B.subtillis168基因组上P43启动子序列，PCR扩增得到启动子P43片段。根据B.licheniformis WX-02全基因组序列中amyL基因的终止子序列，设计一对引物，以基因组为模板PCR，得到终止子序列片段TamyL。先将P43启动子片段、vpr信号肽片段Svpr和aprN三个片段用SOE-PCR连接在一起，纯化后回收后得到片段PSN。再以PSN和TamyL为模板，第二次SOE-PCR将这两个片段连接在一起得到PSNT，纯化回收。用EcoR I和Bgl II双酶切PSNT，酶切后纯化回收检测。然后将pHY300PLK空质粒用同样的酶双酶切，纯化回收后与前面得到的片段连接。连接产物转化E.coli DH5α。转化子经PCR验证确定为阳性克隆后，抽质粒进行酶切验证(图1)并测序。得到的重组纳豆激酶分泌表达质粒为pP43SNT。 
3.纳豆激酶分泌表达工程菌BL10(pP43SNT)的构建 
将测序验证正确的载体pP43SNT和空载体pHY300PLK电转化到地衣芽胞杆菌BL10。接种B.licheniformis BL10于5mL LB培养基，37℃，180r/min过夜培养；过夜培养物2.5mL转接至50mL B.licheniformis的电转化生长培养基中，250r/min，37℃2h(OD600为0.8～0.9)，将摇瓶置冰浴10min；5500r/min离心6min后收集菌体，用B.licheniformis的电转化洗涤培养基洗涤菌体3次(30mL洗涤液/次)，最后重悬于1mL洗涤培养基中，并迅速分装于1.5mL离心管中，每管100μL，-80℃保存，即为感受态细胞。取一管感受态细胞加入5μL质粒DNA(50ng/μL)，将细胞转至预冷的电转化杯(0.2cm)中，冰浴1～1.5min，用电脉冲转化仪2.5kV电击1次，电击完后迅速加900μL B.licheniformis的电转化恢复培养基，37℃(T2(ori)质粒是温敏质粒在30℃)下恒温水浴1h，再在摇床上100r/min恢复培养2h，涂含有20μg/mL的四环素抗性平板，37℃培养20h，筛选转化子。 
挑取转化子单菌落在含抗生素的平板上划线，过夜培养，挑适量的菌落于装有30μL的1.5mL EP管中，混匀，沸水浴中20min。取出后在离心机中10000r/min离心30sec，吸取上清作为菌落PCR的模板。PCR和测序验证阳性克隆，即得到纳豆激酶分泌表达工程菌BL10(pP43SNT)，同时得到含有空载体pHY300PLK的对照菌株BL10(pHY300PLK)。 
利用工程菌生产纳豆激酶的工艺为： 
(1)出发菌株：地衣芽胞杆菌BL10(pP43SNT) 
(2)种子培养： 
种子培养基为LB培养基：10g/L蛋白胨；5g/L酵母浸出粉；10g/L氯化钠；pH7.0-7.2；固体培养基加琼脂15g/L； 
种子培养：250mL三角瓶，装液量50mL，培养温度37℃，摇床转速180r/min，培养到OD600为1.0； 
(3)液体发酵培养： 
液体发酵培养基：10g/L大豆蛋白胨；10g/L酵母浸出粉；10g/L麦芽糖；pH7.0-7.2； 
液体发酵培养条件：250mL三角瓶，装液量50mL，发酵温度37℃，摇床转速200r/min，发酵时间32h。 
本发明的优势在于：本发明首次实现了纳豆激酶在B.licheniformis中分泌表达，且验证了Vpr信号肽能高效介导外源蛋白分泌表达。 
附图说明
图1表达质粒pP43SNT的酶切鉴定。泳道1：SOE-PCR扩增产物(引物P43F/PaprNR；模板PSN；片段长度1448bp)；泳道2：SOE-PCR扩增产物(引物P43F/PamyTR；模板PSNT；片段长度1949bp)；泳道3：质粒pHY300PLK的BglII/EcoR I(4870bp)酶切结果；泳道4：质粒pP43SNT的Bgl II/EcoR I(4870bp，1949bp)酶切结果；泳道M：DL5000DNA分子量Maker。 
图2BL10(pP43SNT)与其他菌株的SDS-PAGE电泳结果比较。泳道1：野生菌WX-02的SDS-PAGE图谱；泳道2：负对照BL10(pHY300PLK)的SDS-PAGE图谱；泳道3：正对照纳豆激酶样品；泳道4：BL9(pP43SNT)的SDS-PAGE图谱；泳道5：BL10(pP43SNT)的SDS-PAGE图谱；泳道M：蛋白标准分子量maker。 
图3不同时间点的BL10(pP43SNT)的SDS-PAGE电泳结果。泳道1-5：BL10 (pP43SNT)在12h，16h，20h，24h，28h发酵产物上清的SDS-PAGE图谱；泳道M：蛋白标准分子量maker。 
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明进一步说明。 
实施例1：工程菌B.licheniformis BL10(pP43SNT)的构建 
根据本实验测得的B.licheniformis WX-02全基因组序列中的vpr基因序列，设计一对引物PspF和PspR， 
PspF：5’-GAGAGGAATGTACACATGAATTGAGAAAAAGTATCGTGCG-3’ 
PspR：5’-CTGTACTGCTTTTTCCGGCTGCCTGCACTCCGGTGAG-3’ 
以B.licheniformis WX-02的基因组DNA作为模板，PCR扩增得到vpr的信号肽Svpr片段；根据NCBI公布的B.subtillis168基因组上P43启动子的序列设计一对引物P43F和P43R3， 
P43F：5’-GGAATTCTGATAGGTGGTATGTTTTCG-3’(EcoRI) 
P43R3：5’-CGCACGATACTTTTTCTCAATTCATGTGTACATTCCTCTC-3’ 
PCR扩增得到启动子P43片段。根据NCBI上公布的B.subtilis MBS04-6的纳豆激酶(NK)基因aprN(登陆编号为FJ374767)的序列设计一对引物PaprNF和PaprNR， 
PaprNF：5’-CTCACCGGAGTGCAGGCAGCCGGAAAAAGCAGTACAG-3’ 
PaprNR：5’-AATCCGTCCTCTCTGCTCTTTTATTGTGCAGCTGCTTGTA-3’ 
以B.subtilis MBS04-6基因组为模板PCR得到aprN基因片段(无信号肽序列)，纯化回收。根据本实验测得的B.licheniformis WX-02全基因组序列中amyL基因的终止子序列，设计一对引物PamyTF1和PamyTR， 
PamyTF1： 
5’-TACAAGCAGCTGCACAATAAAAGAGCAGAGAGGACGGATT-3’ 
PamyTR：5’-GAAGATCTCGCAATAATGCCGTCGCACTG-3’(BglII) 
以基因组为模板PCR，得到终止子序列片段TamyL，纯化回收。先将P43启动子片段、vpr信号肽片段Svpr和aprN三个片段用SOE-PCR连接在一起，纯化后回收后得到片段PSN。再以PSN和TamyL为模板，第二次SOE-PCR将这两个片段连接在一起得到PSNT，纯化回收。用EcoR I和Bgl II双酶切PSNT，酶切后纯化回收检测。然后将pHY300PLK空质粒用同样的酶双酶切，纯化回收后与前面得到的片段连 接。连接产物转化E.coli DH5α。转化子经PCR验证确定为阳性克隆后，抽质粒进行双酶切验证并测序。得到的重组纳豆激酶分泌表达质粒为pP43SNT(图1)。 
接种B.licheniformis BL10于5mL LB培养基，37℃，180r/min过夜培养；过夜培养物2.5mL转接至50mL B.licheniformis的电转化生长培养基中，250r/min，37℃2h(OD600为0.8～0.9)，将摇瓶置冰浴10min；5500r/min离心6min后收集菌体，用B.licheniformis的电转化洗涤培养基洗涤菌体3次(30mL洗涤液/次)，最后重悬于1mL洗涤培养基中，并迅速分装于1.5mL离心管中，每管100μL，-80℃保存，即为感受态细胞。取一管感受态细胞加入5μL质粒DNA(50ng/μL)，将细胞转至预冷的电转化杯(0.2cm)中，冰浴1～1.5min，用电脉冲转化仪2.5kV电击1次，电击完后迅速加900μL B.licheniformis的电转化恢复培养基，37℃(T2(ori)质粒是温敏质粒在30℃)下恒温水浴1h，再在摇床上100r/min恢复培养2h，涂含有20μg/mL的四环素抗性平板，37℃培养20h，筛选转化子。 
挑取转化子单菌落在含抗生素的平板上划线，过夜培养，挑适量的菌落于装有30μL的1.5mL EP管中，混匀，沸水浴中20min。取出后在离心机中10000r/min离心30sec，吸取上清作为菌落PCR的模板。PCR和测序验证阳性克隆，将正确的菌株命名为BL10(pP43SNT)，同时得到含有空载体pHY300PLK的对照菌株BL10(pHY300PLK)，用相同的方法将质粒pP43SNT转化另一株地衣芽胞杆菌B.licheniformis BL9，得到BL9(pP43SNT)，保存甘油管于-80℃备用。 
实施例2：纳豆激酶的表达及纤溶酶活力测定 
分别挑取菌B.licheniformis BL10(pP43SNT)、B.licheniformis BL10(pHY300PLK)和B.licheniformis BL9(pP43SNT)接种于5mL的有四环素(20μg/mL)的LB培养基中，37℃，180r/min振荡培养过夜。再以4％的接种量转接到50mL新鲜的LB培养基中，直到OD600为1.0时，以1％的接种量接种到50mL新鲜的LB培养基中，37℃，200r/min振荡培养28h。培养12h后每隔4h取一次样分别测定纳豆激酶纤溶活性，按照纤维蛋白溶解法(刘会洲等2012)测定纤溶酶活力。再取芽胞杆菌发酵上清液或细胞破碎液0.9ml于离心管中，加入1/9体积的100％TCA，颠倒10次混匀，4℃过夜放置，13000r/min离心10～20min，倒掉上清，加入0.2ml无水乙醇，洗去管底和管壁残余的TCA，13000r/min离心10～20min，倒掉上清，重复无水乙醇清洗3次。37℃吹干，待管底无明显液体残留，加入30μL的包含8mol/L尿素和2mol/L硫脲的溶液溶解，再加入30μL2×SDS-PAGE上样缓冲液和3μL1 mol/L DTT，100℃水浴10min溶解沉淀。不同菌株发酵上清液的SDS-PAGE检测结果如图2所示，过程样的SDS-PAGE检测结果如图3所示。在LB培养基中培养28h到衰亡期，外源蛋白纳豆激酶能在蛋白酶缺失株中高效分泌表达，胞内SDS-PAGE的结果未能检测到相应的27.7KDa的条带，也就表明，本实验中所用的信号肽Svpr，能够高效的介导NK分泌到胞外；构建的NK分泌表达质粒pP43SNT能在蛋白酶缺失菌株中高效表达，在BL10(pP43SNT)的最高酶活力达到6.00FU/mL 
实施例3：纳豆激酶液体发酵 
挑取菌落B.licheniformis BL10(pP43SNT)接种于5mL的有四环素(20μg/mL)的LB培养基中，37℃，180r/min振荡培养过夜。再以4％的接种量转接到50mL新鲜的LB培养基中，直到OD600为1.0时，以5％的接种量(1mL)接种到预先准备好的纳豆激酶液体发酵培养基(10g/L大豆蛋白胨；10g/L酵母浸出粉；10g/L麦芽糖；pH7.0-7.2)中，37℃，200r/min，发酵时间32h，BL10(pP43SNT)的酶活力达到11.37FU/mL。 
序列表
 

Claims (6)

1.一株产纳豆激酶的地衣芽胞杆菌工程菌，保藏编号为CCTCC NO：M2013401，其特征在于，将分泌表达载体pP43SNT导入表达宿主地衣芽胞杆菌BL10，获得具有纳豆激酶表达活性的工程菌BL10(pP43SNT)。 
2.根据权利要求1所述的表达载体pP43SNT，其中的启动子元件来源于枯草芽胞杆菌168的组成型表达启动子P43(序列如SEQ ID NO：1)。 
3.根据权利要求1所述的表达载体，其信号肽元件来源于地衣芽胞杆菌WX-02的胞外丝氨酸蛋白酶Vpr(序列见SEQ ID NO：2)。 
4.根据权利要求1所述的表达载体，其目的蛋白纳豆激酶原来源于枯草芽胞杆菌MBS04-6(序列见SEQ ID NO：3)。 
5.根据权利要求1所述的表达载体，其终止子元件来源于地衣芽胞杆菌WX-02的α-淀粉酶终止子序列(序列见SEQ ID NO：4)。 
6.根据权利要求1所述的地衣芽胞杆菌工程菌发酵生产纳豆激酶的方法，其特征在于，包括以下步骤： 
(1)出发菌株：地衣芽胞杆菌BL10(pP43SNT)； 
(2)种子培养： 
种子培养基为LB培养基：10g/L蛋白胨；5g/L酵母浸出粉；10g/L氯化钠；pH7.0-7.2；固体培养基加琼脂15g/L； 
种子培养：250mL三角瓶，装液量50mL，培养温度37℃，摇床转速180r/min，培养到OD600为1.0； 
(3)液体发酵培养： 
液体发酵培养基：10g/L大豆蛋白胨；10g/L酵母浸出粉；10g/L麦芽糖；pH7.0-7.2； 
液体发酵培养条件：250mL三角瓶，装液量50mL，发酵温度37℃，摇床转速200r/min，发酵时间32h。 
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