CN105992817B

CN105992817B - 改良的芽孢杆菌宿主

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Publication number: CN105992817B
Application number: CN201580007604.1A
Authority: CN
Inventors: 埃弗特·特吉尔德·里杰·范; 玛蒂娜·施帕安斯; 翰德里克斯·伯纳德斯·卡罗勒斯·希勒布兰德
Original assignee: DSM IP Assets BV
Current assignee: DSM IP Assets BV
Priority date: 2014-02-07
Filing date: 2015-02-06
Publication date: 2020-09-11
Anticipated expiration: 2035-02-06
Also published as: CN105992817A; EP3102669B1; US20170175130A1; DK3102669T3; EP3102669A1; WO2015118126A1; US10287592B2

Abstract

本发明提供中性蛋白酶生产和碱性蛋白酶生产有缺陷的芽孢杆菌宿主细胞，所述宿主细胞包含核酸构建体，其中所述核酸构建体包含编码目标化合物或者编码参与目标化合物合成的化合物的多核苷酸，所述多核苷酸与启动子序列可操作地连接从而允许所述多核苷酸在所述宿主细胞中表达，其中所述启动子包含噬菌体启动子序列，更优选地噬菌体SPO1启动子序列。所述宿主细胞可有利地用于生产目标化合物的方法中。

Description

改良的芽孢杆菌宿主

发明领域

本发明涉及新的芽孢杆菌宿主细胞、生产所述宿主细胞的方法、利用所述宿主细胞生产目标化合物的方法、所述宿主细胞在生产目标化合物的方法中的用途。

发明背景

芽孢杆菌(Bacillus)菌株生产并分泌大量有用的蛋白质和代谢产物。由于它们的GRAS(一般认为安全)状态，芽孢杆菌宿主，例如属于Bacillus subtilis、Bacillusamyloliquefaciens和Bacillus licheniformis种的芽孢杆菌宿主，被广泛用于生产食品、饲料和制药行业的重要蛋白质。

应用芽孢杆菌宿主表达异源性目标蛋白或者过表达同源性目标蛋白中的常见问题与所述宿主细胞中编码与目标蛋白一起共表达的一些细胞外蛋白酶的基因的存在有关。对于对蛋白酶降解敏感的那些异源性目标蛋白，芽孢杆菌中同源性蛋白酶的共表达导致产率损失，而同源性芽孢杆菌目标蛋白被所述共表达的芽孢杆菌蛋白酶污染，从而导致纯化问题。

芽孢杆菌宿主中主要的细胞外蛋白酶是细胞外中性蛋白酶(又名芽孢杆菌溶素(bacillolysin)EC 3.4.24.28)和碱性蛋白酶(又名枯草杆菌蛋白酶EC 3.4.21.62)。通过使用所述细胞外中性蛋白酶和碱性蛋白酶有缺陷的芽孢杆菌菌株能够解决通过芽孢杆菌菌株的有用蛋白质的生产中由细胞外蛋白酶引起的的问题(参见例如Kawamura等人(Journal of Bacteriology,(1984)第442-444页，其描述了细胞外中性蛋白酶(nprE)和碱性蛋白酶(aprA)的结构基因有缺陷的Bacillus subtilis的突变菌株。

芽孢杆菌菌株中存在的其它基因显示出降低所述生产宿主中目标蛋白的生产力。US 7,585,674公开了：宿主细胞(例如，芽孢杆菌细胞)中目标蛋白或多肽的生产力可以通过使所述宿主细胞的基因组缺失参与孢子形成阶段II、III、IV或V的特定基因来改善。

然而，仍然需要增加芽孢杆菌宿主中蛋白质的表达的方法。

发明概述

出乎意料地已发现：当编码目标蛋白的目标基因与噬菌体启动子(优选噬菌体SPO1启动子)可操作地连接从而允许目标蛋白在宿主细胞中表达时，中性蛋白酶和/或碱性蛋白酶有缺陷的重组芽孢杆菌宿主细胞可被用于以高产率生产目标蛋白。

因此，本发明提供中性蛋白酶生产和/或碱性蛋白酶生产有缺陷的重组芽孢杆菌宿主细胞，所述宿主细胞包含核酸构建体，其中所述核酸构建体包含

编码目标化合物或者编码参与目标化合物合成的化合物的多核苷酸，所述多核苷酸与启动子序列可操作地连接从而允许多核苷酸在宿主细胞中表达，其中所述启动子包含噬菌体启动子序列，更优选地噬菌体SPO1启动子序列。

在本说明书全文中，术语“中性蛋白酶”旨在表示根据酶学委员会编号被归类为EC3.4.24.28的酶。在本说明书全文中，术语“碱性蛋白酶”旨在表示根据酶学委员会编号被归类为EC 3.4.21.62的酶。

本发明还提供生产根据本发明的重组芽孢杆菌宿主细胞的方法，所述方法包括：

a.提供芽孢杆菌宿主细胞，所述芽孢杆菌宿主细胞在中性蛋白酶生产和/或碱性蛋白酶生产上有缺陷，任选地在中性α-淀粉酶生产上有缺陷，任选地在孢子形成相关基因上有缺陷；

b.利用核酸构建体转化所述芽孢杆菌宿主细胞，所述核酸构建体包含编码目标化合物或者编码参与目标化合物合成的化合物的多核苷酸，所述多核苷酸与启动子序列可操作地连接从而允许多核苷酸在宿主细胞中表达，其中所述启动子包含噬菌体启动子序列，更优选地噬菌体SPO1启动子序列。

本发明还提供生产目标化合物的方法，所述方法包括：

a)在有益于生产目标化合物的条件下，培养根据本发明的重组芽孢杆菌宿主细胞或者根据用于生产根据本发明的重组宿主细胞的方法所生产的重组芽孢杆菌宿主细胞，和

b)任选地，从培养液中分离所述目标化合物。

本发明还提供根据本发明的重组芽孢杆菌宿主细胞或者根据用于生产根据本发明的重组宿主细胞的方法所生产的重组芽孢杆菌宿主细胞在生产目标化合物中的用途。

附图简介

图1展示了xynA表达质粒pDBC4XAS-1的示意图。

图2展示了摇瓶中在SMM培养基中的菌株BS154XAS-1(ΔaprE和ΔnprE)以及BS1A40XAS-1(aprE+和nprE+)随时间的相对的木聚糖酶的生产。

图3展示了整合表达载体pDBC1的物理图谱。BsmBI位点被用于将CAP标记换成启动子片段和目标基因。amyE侧翼区域之间的区域整合在amyE基因座并基于壮观霉素选择整合体(integrand)。

图4展示了基于pDBC1载体的xynA表达整合载体pDBC1G01XAS-1的示意图。

图5展示了24深孔板中在SMM培养基中的菌株BS154G00XAS-1(amyQ启动子)、BS154G01XAS-1(G01表达模块中的P15启动子)和BS154G02XAS-1(G02表达模块中的P15启动子)的相对的木聚糖酶的生产。

图6展示了载体pGB20的示意图。

图7展示了载体pDBC5的示意图。

图8展示了用于P_amyQ-AMY1在B.subtilis基因组的amyE基因座的不含标记整合的载体pDBC5AMY1的示意图。amyQ启动子和mobU RBS位于NotI和NdeI位点之间，amyE之间的葡聚糖1,4-α-麦芽糖水解酶(amyM)侧翼是neo^R、bleo(芽孢杆菌中赋予腐草霉素抗性的基因)、repE(温度敏感性ori)。

图9展示了24深孔板中在SMM培养基中的菌株BS154AMY1(amyQ启动子)、BS154G03AMY1(表达模块G03中的P15启动子)、BS154G04AMY1(表达模块G04中的P15启动子)、BS154G05AMY1(表达模块G05中的P15启动子)、BS154G06AMY1(表达模块G06中的P15启动子)、BS154G07AMY1(表达模块G07中的P15启动子)、BS154G01XAS-1(表达模块G01中的P15启动子)和BS154G02XAS-1(表达模块G02中的P15启动子)的相对的葡聚糖1,4-α-麦芽糖水解酶的生产。

序列表说明

SEQ ID NO:1展示了B.subtilis噬菌体SPO1的启动子PE4(本文称为P15启动子)的序列。

SEQ ID NO:2展示了B.subtilis噬菌体SPO1的启动子PE5的序列。

SEQ ID NO:3展示了xynA基因的5’侧翼区的正向引物的序列(包括AleI和PacI位点)。

SEQ ID NO:4展示了xynA基因的3’侧翼区的反向引物的序列(包括HindIII位点)。

SEQ ID NO:5展示了编码Bacillus subtilis中的碱性蛋白酶的基因aprE的多核苷酸序列。

SEQ ID NO:6展示了由SEQ ID NO:5的aprE基因编码的Bacillus subtilis中的碱性蛋白酶AprE的氨基酸序列。

SEQ ID NO:7展示了编码Bacillus subtilis中的中性蛋白酶NprE的基因nprE的多核苷酸序列。

SEQ ID NO:8展示了由SEQ ID NO:7的nprE基因编码的Bacillus subtilis中的中性蛋白酶NprE的氨基酸序列。

SEQ ID NO:9展示了包含TthIIII位点、340bp 5’-amyE、BsmBI位点、氯霉素选择标记、amyM终止子、BsmBI位点、lox 66位点、壮观霉素选择标记、lox71位点、120bp 3’-amyE和AsisI位点的合成DNA片段的序列。

SEQ ID NO:10展示了用于扩增来自B.subtilis 168的xynA基因和引入BsmBI位点的正向引物的序列。

SEQ ID NO:11展示了用于扩增来自B.subtilis 168的xynA基因和引入BsmBI位点的反向引物的序列。

SEQ ID NO:12展示了表达模块G00的序列，其包含B.amyloliquefaciens amyQ启动子序列、如在pDBC4XAS-1质粒上存在的mobU核糖体结合位点序列，包括在ATG起点的NdeI位点以及在5’和3’末端的两个BsmBI位点。

SEQ ID NO:13展示了表达模块G01的序列，包含P15启动子、如EP2186880中所述的经修饰的RNA前导序列和核糖体结合位点的P_Spo15_RK41_SWITCH缺失。

SEQ ID NO:14展示了通过包括在ATG起点的NdeI位点以及在5’和3’末端的两个BsmBI位点而被修饰的根据SEQ ID NO:13的表达模块G01的序列。

SEQ ID NO:15展示了表达模块G02P_15ΩgrpE的序列，其包含P15启动子、如WO2008148575中所述的mRNA稳定化元件和核糖体结合位点。

SEQ ID NO:16展示了通过包括在ATG起点的NdeI位点以及在5’和3’末端的两个BsmBI位点而被修饰的SEQ ID NO:14的表达模块G02的序列。

SEQ ID NO:17展示了用于在amyE基因座扩增的正向引物的序列。

SEQ ID NO:18展示了xynA上的反向引物的序列。

SEQ ID NO:19展示了编码Bacillus subtilis中的中性淀粉酶的amyE基因的序列。

SEQ ID NO:20展示了由amyE基因编码的来自Bacillus subtilis的中性淀粉酶的氨基酸序列。

SEQ ID NO:21展示了用于扩增5’-amyE区域和引入StuI位点的正向引物的序列。

SEQ ID NO:22展示了用于扩增5’-amyE区域和引入NotI、HindIII以及KnpI位点的反向引物的序列。

SEQ ID NO:23展示了用于扩增3’-amyE区域和引入NotI、HindIII以及KnpI位点的正向引物的序列。

SEQ ID NO:24展示了用于扩增3’-amyE区域和引入XhoI位点的反向引物的序列。

SEQ ID NO:25展示了用于扩增amyM基因和引入NotI位点以及amyQ启动子序列、PacI和NdeI位点的正向引物的序列。

SEQ ID NO:26展示了用于扩增amyM基因和引入HindIII位点的反向引物的序列。

SEQ ID NO:27展示了编码葡聚糖1,4-α-麦芽糖水解酶的获自Geobacillusstearothermophilus的amyM基因的序列。

SEQ ID NO:28展示了由根据SEQ ID NO:27的amyM基因编码的来自Geobacillusstearothermophilus的葡聚糖1,4-α-麦芽糖水解酶的序列。

SEQ ID NO:29展示了经修饰的表达模块G03的序列，其包含双重σ37和σ55启动子(Wang,P.Z.,Doi R.H.(1984)“Overlapping promoters transcribed by Bacillussubtilis sigma 55and sigma 37RNA polymerase holoenzymes during growth andstationary phases.”J Biol.Chem.259(13):8619-8625)、mobU核糖体结合位点，并且还含有在5’末端的NotI位点和在3’末端的NdeI位点。

SEQ ID NO:30展示了经修饰的表达模块G04的序列，其包含rapA启动子、mobU核糖体结合位点，并且还含有在5’末端的NotI位点和在3’末端的NdeI位点。

SEQ ID NO:31展示了经修饰的表达模块G05的序列，其包含PE5启动子、mobU核糖体结合位点，并且还含有在5’末端的NotI位点和在3’末端的NdeI位点。

SEQ ID NO:32展示了经修饰的表达模块G06的序列，其包含P15和PE5启动子、mobU核糖体结合位点，并且还含有在5’末端的NotI位点和在3’末端的NdeI位点。

SEQ ID NO:33展示了经修饰的表达模块G07的序列，其包含P15启动子、mobU核糖体结合位点，并且还含有在5’末端的NotI位点和在3’末端的NdeI位点。

SEQ ID NO:34展示了通过包括在5’末端的NotI位点和在3’末端的NdeI位点而被修饰的根据SEQ ID NO:13的表达模块G01的序列。

SEQ ID NO:35展示了通过包括在5’末端的NotI位点和在3’末端的NdeI位点而被修饰的SEQ ID NO:14的表达模块G02的序列。

SEQ ID NO:36展示了SEQ ID NO:1的B.subtilis噬菌体SPO1的启动子PE4(本文称为P15启动子)的第22-50位核苷酸的多核苷酸序列。

SEQ ID NO:37展示了用于在5’-侧翼之外扩增amyE基因座的正向引物的序列。

SEQ ID NO:38展示了用于在3’-侧翼之外扩增amyE基因座的反向引物的序列。

SEQ ID NO:39展示了来自B.subtilis的基因spoIIE的序列。

SEQ ID NO:40展示了由来自B.subtilis的基因spoIIE编码的多肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO:41展示了编码来自B.subtilis 168的内切-1,4-β木聚糖酶的xynA基因的多核苷酸序列。

SEQ ID NO:42展示了编码Bacillus amyloliquefaciens中的中性蛋白酶Npr的基因npr的多核苷酸序列。

SEQ ID NO:43展示了由SEQ ID NO:42的npr基因编码的Bacillusamyloliquefaciens中的中性蛋白酶Npr的氨基酸序列。

SEQ ID NO:44展示了编码Bacillus amyloliquefaciens中的碱性蛋白酶的基因apr的多核苷酸序列。

SEQ ID NO:45展示了由SEQ ID NO:44的apr基因编码的Bacillusamyloliquefaciens中的碱性蛋白酶Apr的氨基酸序列。

SEQ ID NO:46展示了编码Bacillus licheniformis中的碱性蛋白酶的基因apr的多核苷酸序列。

SEQ ID NO:47展示了由SEQ ID NO:46的apr基因编码的Bacillus licheniformis中的碱性蛋白酶Apr的氨基酸序列。

SEQ ID NO:48展示了根据WO08148575的SEQ ID NO:1的mRNA稳定化元件(aprE)的核酸序列。

SEQ ID NO:49展示了根据WO08148575的SEQ ID NO:2的mRNA稳定化元件(grpE)的核酸序列。

SEQ ID NO:50展示了根据WO08148575的SEQ ID NO:3的mRNA稳定化元件(cotG)的核酸序列。

SEQ ID NO:51展示了根据WO08148575的SEQ ID NO:4的mRNA稳定化元件的核酸序列。

SEQ ID NO:52展示了根据WO08148575的SEQ ID NO:5的mRNA稳定化元件的核酸序列。

SEQ ID NO:53展示了根据WO08140615的SEQ ID NO:4的mRNA稳定化元件的核酸序列。

SEQ ID NO:54展示了根据WO08140615的SEQ ID NO:6的mRNA稳定化元件的核酸序列。

SEQ ID NO:55展示了根据EP2186880的SEQ ID NO:42的rib前导序列的核酸序列。

SEQ ID NO:56展示了编码Bacillus amyloliquefaciens中的中性淀粉酶的amy基因的多核苷酸序列。

SEQ ID NO:57展示了由根据SEQ ID NO:56的amy基因编码的来自Bacillusamyloliquefaciens的中性淀粉酶的氨基酸序列。

SEQ ID NO:58展示了编码Bacillus licheniformis中的中性淀粉酶的amy基因的多核苷酸序列。

SEQ ID NO:59展示了由根据SEQ ID NO:58的amy基因编码的来自Bacilluslicheniformis的中性淀粉酶的氨基酸序列。

发明详述

贯穿本说明书和所附权利要求，词语“包含”、“包括”和“具有”以及它们的变体应被包含地解释。换言之，当语境允许时，这些词语旨在表达可能包含未明确列举的其它元素或整体。

本文中不使用冠词时指的是一个或多于一个(即，一个或至少一个)物体。例如，“元素”可表示一个元素或多于一个元素。

本文中作为现有技术所给出的专利文件或其它材料的引用并不应被认为是承认在任何一项权利要求的优先权日时所述文件或材料是已知的或者其所包含的信息是公知常识的一部分。

本文中陈述的每一参考文献的公开内容均通过引用以整体并入本文中。

在第一方面，本发明提供中性蛋白酶生产和/或碱性蛋白酶生产有缺陷的重组芽孢杆菌宿主细胞，所述宿主细胞包含核酸构建体，其中所述核酸构建体包含

中性蛋白酶(Npr，又名芽孢杆菌溶素或金属蛋白酶)和/或碱性蛋白酶(Apr，又名枯草杆菌蛋白酶)的生产有缺陷的芽孢杆菌宿主细胞已经例如被Kawamura等人(援引在此处)和在EP246678中描述。

在本发明的语境中，“化合物生产有缺陷的宿主细胞”在本文中被定义为来源于亲本宿主细胞的宿主细胞，所述亲本宿主细胞包含编码所述化合物的基因并表达所述化合物。在本发明的语境中，所述化合物可以是例如中性蛋白酶和/或碱性蛋白酶和/或α-淀粉酶和/或由孢子形成相关基因编码的化合物。优选地，芽孢杆菌宿主细胞的中性蛋白酶和碱性蛋白酶生产有缺陷。所述来源于亲本宿主细胞的宿主细胞已被修饰，优选地在其基因组中被修饰，以导致以下表型特征，其中与未被修饰的亲本宿主细胞所生产的化合物相比，当在相同条件下分析时，所述细胞：a)生产较少化合物或者实质上不生产化合物，和/或b)生产不具有生物活性(例如，酶活性)或者生物活性大幅降低的化合物，以及a)与b)的组合。在一种实施方式中，化合物生产有缺陷的宿主细胞是这样的宿主细胞，其已被修饰，优选地在其基因组中被修饰，且其实质上不生产所述化合物。

本文中所定义的化合物生产缺陷可通过本领域技术人员已知的方法来测量，例如如果与未被修饰的亲本宿主细胞相比，可通过测定化合物的浓度和/或(比)活性来测量和/或可以通过测定由编码本文所述化合物的基因转录的mRNA的浓度来测量和/或可以通过基因或基因组测序来测量。

可通过将化合物生产有缺陷的宿主细胞的DNA序列与亲本(未经修饰的)微生物宿主细胞的DNA序列进行比较来测定基因组中的修饰。可使用本领域中技术人员已知的标准方法，例如使用Sanger测序技术和/或新一代测序技术例如Illumina GA2、Roche 454等，进行DNA测序和基因组测序，如Elaine R.Mardis(2008),Next-Generation DNA SequencingMethods,Annual Review of Genomics and Human Genetics,9:387-402.(doi:10.1146/annurev.genom.9.081307.164359)中所综述的。

可使用技术人员可用的适合测量化合物的生物活性(例如本文所定义的多肽酶活性)的任何测定法，通过例如测量酶促反应涉及的代谢产物的水平、浓度和/或流，通过定量蛋白质组技术例如APEX或iTRAQ工具，通过转录谱，通过Northern印迹RT-PCR，通过Q-PCR或通过Western印迹法，来测量本文所述的化合物生产缺陷。特别地，例如可通过northern印迹法实现细胞中存在的mRNA的浓度的量化(在Molecular Cloning:A Laboratory Manual中，Sambrook等，New York:Cold Spring Harbour Press,1989)。例如可通过western印迹法实现细胞中存在的多肽的浓度的量化。还可通过DNA阵列分析量化mRNA浓度上的差异(Eisen,M.B.和Brown，P.O.DNA arrays for analysis of gene expression.MethodsEnzymol.1999,303:179-205)。例如，可以使用本领域技术人员已知适合测量多肽酶活性的任何测定法来测量如本文所述的蛋白酶生产缺陷或者如本文所述的α-淀粉酶生产缺陷。α-淀粉酶活性可例如使用Megazyme CERALPHAα-淀粉酶测定试剂盒(MegazymeInternational Ireland Ltd.,Co.Wicklow,爱尔兰)根据制造商的说明来测量。蛋白酶活性可例如基于Kawamura等人J.Bacteriol(1984)第442-444页中所述的脱脂乳平板试验和/或如Kawamura中所述并根据Millet J.Appl.Bacteriol(1970)33:207-219的方法通过测量上清液中的蛋白酶活性进行测量。

有化合物生产缺陷的宿主细胞的缺陷优选地相对于无缺陷的亲本细胞来测量。有化合物生产缺陷的宿主细胞生产较少化合物或者实质上不生产化合物和/或生产生物活性(例如，酶活性)较低或者实质上无生物活性的化合物。

在一种实施方式中，如果与未被修饰的亲本宿主细胞相比并且在相同条件下测量，芽孢杆菌宿主细胞生产少1％、至少少5％、至少少10％、至少少20％、至少少30％、至少少40％、至少少50％、至少少60％、至少少70％、至少少80％、至少少90％、至少少91％、至少少92％、至少少93％、至少少94％、至少少95％、至少少96％、至少少97％、至少少98％、至少少99％或至少少99.9％的本文所限定的化合物。优选地，如果与未被修饰的亲本微生物宿主细胞相比并且在相同条件下测量，芽孢杆菌宿主细胞实质上不生产本文所述化合物。

在一种实施方式中，如果与未被修饰的亲本宿主细胞相比并且在相同条件下测量，芽孢杆菌宿主细胞生产生物活性(例如，酶活性)低1％、活性至少低5％、活性至少低10％、活性至少低20％、活性至少低30％、活性至少低40％、活性至少低50％、活性至少低60％、活性至少低70％、活性至少低80％、活性至少低90％、活性至少低91％、活性至少低92％、活性至少低93％、活性至少低94％、活性至少低95％、活性至少低96％、活性至少低97％、活性至少低98％、活性至少低99％或活性至少低99.9％的本文所限定的化合物。优选地，如果与未被修饰的亲本宿主细胞相比并且在相同条件下测量，芽孢杆菌宿主细胞生产实质上无活性的化合物。

与未被修饰的亲本细胞相比，宿主细胞可生产至少少80％的化合物，且/或可以具有降低至少80％的由编码化合物的基因转录的mRNA的表达水平，且/或可以具有降低至少80％的化合物的生物活性，例如降低80％的(比)酶活性。优选地，与未被修饰的亲本细胞相比，当在相同条件下测量时，宿主细胞生产至少少85％、优选地至少少90％、甚至更优选地至少少95％、至少少96％、至少少97％、至少少98％、至少少99％、至少少99.5％、至少少99.9％的化合物，且/或具有降低至少85％、优选地至少90％、甚至更优选地至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.9％的由编码化合物的基因转录的mRNA的表达水平，且/或具有降低至少85％、优选地至少90％、甚至更优选地至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.9％的化合物的生物活性，例如降低的(比)酶活性。最优选地，如果与未被修饰的亲本细胞相比，宿主细胞不生产化合物，且/或不具有由编码化合物的基因转录的mRNA的表达水平，且/或生产无生物活性(例如，无(比)酶活性)的化合物。

在本发明的语境中，“在相同条件下测量”或“在相同条件下分析”意味着在相同条件下培养化合物生产有缺陷的芽孢杆菌宿主细胞和与其比较的宿主细胞(例如，亲本宿主细胞)并且如果与对比宿主细胞相比，使用相同条件、优选使用相同测定法和/或方法、更优选在同一实验中在两种宿主细胞中测量化合物有缺陷的芽孢杆菌宿主细胞中化合物的量和/或生物活性。

在一种根据本发明的实施方式中，芽孢杆菌宿主细胞中由npr基因(例如，nprE基因)或其同源基因编码的中性蛋白酶Npr(例如，NprE)或其同源物有缺陷。

在本发明的语境中，术语“同源的”可被理解为指的是来自相同或不同但通常相关的物种的基因或蛋白质，其彼此功能一致或者彼此非常相似。该术语包括直接同源基因或蛋白质和间接同源基因或蛋白质。直接同源基因或蛋白质指的是不同物种中由共同的祖先基因通过物种形成进化且在进化期间通常保留相同功能的基因或蛋白质。术语同源的还包括间接同源基因或蛋白质。间接同源基因或蛋白质涉及通过在基因组内复制而相关的基因或蛋白质，即涉及同一物种内具有相同或相关功能的基因或蛋白质。同源基因或蛋白质可以以高水平的序列同一性为特征。例如，来自B.subtilis的中性蛋白酶蛋白与来自B.amyloliquefaciens的中性蛋白酶蛋白具有82％的序列同一性。来自B.subtilis的碱性蛋白酶AprE与来自B.amyloliquefaciens的Apr具有86％的同一性且与来自B.licheniformis的Apr具有65％的同一性。

优选地，中性蛋白酶由根据SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:42的多核苷酸序列编码或者由与SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:42的同一性为至少60％的多核苷酸序列编码，优选地由与SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:42的同一性为至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％的多核苷酸序列编码。优选地，中性蛋白酶具有根据SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:43的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:43的同一性为至少60％的氨基酸序列，优选地与SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:43的同一性为至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％的氨基酸序列。

优选地，中性蛋白酶由根据SEQ ID NO:7的多核苷酸序列编码或者由与SEQ IDNO:7的同一性为至少60％的多核苷酸序列编码，优选地由与SEQ ID NO:7的同一性为至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％的多核苷酸序列编码。优选地，中性蛋白酶具有根据SEQ ID NO:8的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:8的同一性为至少60％的氨基酸序列，优选地与SEQ ID NO:8的同一性为至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％的氨基酸序列。

在另一种根据本发明的实施方式中，芽孢杆菌宿主细胞中由apr基因或其同源基因编码的碱性蛋白酶Apr或其同源物有缺陷。

优选地，碱性蛋白酶由根据SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:44或SEQ ID NO:46的多核苷酸序列编码或者由与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:44或SEQ ID NO:46的同一性为至少60％的多核苷酸序列编码，优选地由与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:44或SEQ ID NO:46的同一性为至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％的多核苷酸序列编码。优选地，碱性蛋白酶具有根据SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:45或SEQ ID NO:47的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:45或SEQ ID NO:47的同一性为至少60％的氨基酸序列，优选地与SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:45或SEQ ID NO:47的同一性为至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％的氨基酸序列。

优选地，碱性蛋白酶由根据SEQ ID NO:5的多核苷酸序列编码或者由与SEQ IDNO:5的同一性为至少60％的多核苷酸序列编码，优选地由与SEQ ID NO:5的同一性为至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％的多核苷酸序列编码。优选地，碱性蛋白酶具有根据SEQ ID NO:6的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:6的同一性为至少60％的氨基酸序列，优选地与SEQ ID NO:6的同一性为至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％的氨基酸序列。

在另一种根据本发明的实施方式中，芽孢杆菌宿主细胞还在中性α-淀粉酶生产上有缺陷，优选地其在由amy(例如，amyE)基因编码的中性α-淀粉酶生产上有缺陷。

优选地，中性α-淀粉酶由根据SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:56或SEQ ID NO:58的多核苷酸序列编码或者由与SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:56或SEQ ID NO:58的同一性为至少60％的多核苷酸序列编码，优选地由与SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:56或SEQ ID NO:58的同一性为至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％的多核苷酸序列编码。优选地，中性α-淀粉酶具有根据SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:57或SEQ ID NO:59的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:57或SEQ ID NO:59的同一性为至少60％的氨基酸序列，优选地与SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:57或SEQ ID NO:59的同一性为至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％的氨基酸序列。

优选地，中性α-淀粉酶由根据SEQ ID NO:19的多核苷酸序列编码或者由与SEQ IDNO:19的同一性为至少60％的多核苷酸序列编码，优选地由与SEQ ID NO:19的同一性为至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％的多核苷酸序列编码。优选地，中性α-淀粉酶具有根据SEQ ID NO:20的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:20的同一性为至少60％的氨基酸序列，优选地与SEQ ID NO:20的同一性为至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％的氨基酸序列。

在本发明的语境中，直接同源物可被理解为来源于芽孢杆菌宿主细胞的多核苷酸或氨基酸序列，所述芽孢杆菌宿主细胞不同于由蛋白酶基因编码的蛋白酶(例如，NprE或AprE)或者由中性α-淀粉酶基因(例如，amyE)编码的中性α-淀粉酶(例如，AmyE)所源自的芽孢杆菌宿主细胞。

间接同源物可被理解为与蛋白酶基因(例如，nprE或aprE)同源或者与蛋白酶(例如，NprE或AprE)同源或者与中性α-淀粉酶(例如，AmyE)同源或者与中性α-淀粉酶基因(例如，amyE)同源且来源于相同芽孢杆菌宿主的多核苷酸序列或氨基酸序列。

为了本发明的目的，此处明确为了测定两个氨基酸序列或两个核酸序列的序列同一性百分比，为最佳比较目的而比对所述序列。为了优化两个序列之间的比对，在比较的两个序列的任一个中引入空位。可在比较序列的整个长度上进行这种比对。或者，可在较短长度，例如在约20个、约50个、约100个或更多个核酸/碱基或氨基酸上进行比对。序列同一性是两个序列之间在报告比对区域上相同匹配的百分比。优选地，在氨基酸序列的全长上或者在核苷酸序列的全长上计算序列同一性百分比。

两个序列之间序列的比较和序列同一性百分比的测定可使用数学算法完成。技术人员将意识到可用几种不同的计算机程序比对两个序列并测定两个序列之间的同一性的事实(Kruskal,J.B.(1983)An overview of sequence comparison D.Sankoff和J.B.Kruskal,(编辑),Time warps,string edits and macromolecules:the theory andpractice of sequence comparison，第1-44页，Addison Wesley)。可使用Needleman和Wunsch算法比对两个序列，测定两个氨基酸序列或两个核苷酸序列之间的序列同一性百分比。(Needleman,S.B.和Wunsch,C.D.(1970)J.Mol.Biol.48,443-453)。氨基酸序列和核苷酸序列均可用所述算法比对。Needleman-Wunsch算法已经在计算机程序NEEDLE中执行。为了本发明的目的，使用来自EMBOSS包的NEEDLE程序(2.8.0版本或更高，EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件包(2000)Rice,P.Longden,I.和Bleasby,A.Trends in Genetics 16,(6)第276—277页，http://emboss.bioinformatics.nl/)。对于蛋白质序列，将EBLOSUM62用于替代矩阵。对于核苷酸序列，使用EDNAFULL。使用的可选参数是为10的空位开放罚分和为0.5的空位延伸罚分。技术人员将认识到，所有这些不同的参数将产生略有不同的结果，但是使用不同算法时两个序列的总体同一性百分比未显著改变。

用如上所述的程序NEEDLE比对后，查询序列和本发明序列之间的序列同一性百分比计算如下：两个序列在比对中显示出相同氨基酸或相同核苷酸的相应位置的数量除以在减去比对中空位总数后的比对总长度。可使用NOBRIEF选项由NEEDLE获得如本文所定义的同一性并且在程序输出中标记为“最长同一性”。

本发明的核酸和蛋白质序列可进一步用作“查询序列”以对公用数据库进行搜索，例如鉴定其他家族成员或相关序列。这种搜索可使用Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215:403—10的NBLAST和XBLAST程序(2.0版本)进行。可用NBLAST程序进行BLAST核苷酸搜索，得分＝100，字长＝12，以获得与本发明核酸分子同源的核苷酸序列。可用XBLAST程序进行BLAST蛋白质搜索，得分＝50，字长＝3，以获得与本发明蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了获得空位比对用于比较目的，如Altschul等(1997)Nucleic Acids Res.25(17):3389-3402所述，利用空位BLAST。利用BLAST和空位BLAST程序时，可使用各个程序(例如XBLAST和NBLAST)的默认参数。见http://www.ncbi.nlm.nih.gov/上国家生物技术信息中心的主页。

根据本发明的重组芽孢杆菌宿主细胞包含核酸构建体，所述核酸构建体包含编码目标化合物或者编码参与目标化合物合成的化合物的多核苷酸，所述多核苷酸与启动子序列可操作地连接从而允许多核苷酸在宿主细胞中表达。

在本发明的语境中，术语“核酸构建体”与表达盒或表达载体同义，其在本文中被定义为这样的核酸分子，其为单链或双链的，分离自天然存在的基因或已被修饰为含有以在自然界中不存在的方式组合和并置的核酸区段。核酸构建体含有DNA编码序列(例如，编码目标化合物或者编码参与目标化合物合成的化合物的多核苷酸)的表达所需的所有控制序列，其中所述控制序列与所述多核苷酸可操作地连接。核酸构建体通常至少包含与待在宿主细胞中表达的编码序列可操作地连接的启动子和终止子序列。

在本文中使用时，术语“可操作地连接”指的是彼此物理连接并且处于功能关系的两个或更多个核酸序列元件。例如，如果启动子能够启动或者调控编码序列的转录或表达，则控制序列(例如，启动子)与DNA编码序列可操作地连接，即处于以下构型，其中控制序列相对于编码序列置于合适位置，以便控制序列指导RNA的生产或mRNA的生产和任选由所述(m)RNA翻译的多肽的生产，在这种情况下，编码序列应被理解为“受启动子控制”。一般而言，当两个核酸序列可操作地连接时，它们朝向相同方向且通常还在同一阅读框内。它们通常基本上连续，但这不是必需的。

本文将术语“控制序列”定义为包括在体外或宿主细胞内，mRNA和/或多肽表达所必需或有利的所有组件。每个控制序列可对编码目标化合物或者与目标化合物有关的化合物的核酸序列为天然或外来的。这样的控制序列包括但不限于前导序列、Shine-Delgarno序列(也称为核糖体结合位点)、多聚腺苷酸化序列、肽原序列、前肽原序列、启动子、信号序列和转录终止子。

为了引入促进控制序列与编码多肽的核酸序列的编码区连接的特异性限制位点，可以为控制序列提供接头。

控制序列可为适当启动子序列(启动子)。

控制序列也可为适合转录终止子(终止子)序列，为宿主细胞识别以终止转录的序列。终止子序列与编码多肽的核酸序列的3'-末端可操作地连接。在细胞中为功能性的任何终止子均可用于本发明。本领域中的技术人员知道哪些类型的终止子可用于如本文所述的宿主细胞中。

控制序列也可为5'-非翻译序列(又名前导序列)、mRNA的非翻译区，其对于由宿主细胞翻译很重要。翻译起始序列或5’-非翻译序列与编码目标化合物或者与目标化合物有关的化合物的编码序列的5'-末端可操作地连接。在细胞中为功能性的任何前导序列均可用于本发明。前导序列可以是源于细菌α-淀粉酶(amyE、amyQ和amyL)、细菌碱性蛋白酶aprE和中性蛋白酶基因nprE(Bacillus)的那些或者如WO2010/121933、WO2013007821和WO2013007820中所述的信号序列。

每个控制序列可对编码多肽的核酸序列为天然或外来的。控制序列可经优化用于其特定目的。

控制序列也可为多聚腺苷酸化序列，其为与核酸序列的3'-末端可操作地连接并且在转录时由宿主细胞(突变或亲本)识别为信号以向转录mRNA添加多聚腺苷酸残基的序列。在细胞中为功能性的任何多聚腺苷酸化序列均可用于本发明。

本文将术语“启动子”定义为结合RNA聚合酶并指示聚合酶到编码生物化合物的核酸序列的正确下游转录起始位点以引发转录的DNA序列。RNA聚合酶有效催化与编码区适当DNA链互补的信使RNA的组装。还将术语“启动子”理解为包括在转录成mRNA后用于翻译的5'-非编码区(介于启动子和翻译起点之间)、顺式作用转录控制元件(例如增强子)和能够与转录因子相互作用的其他核苷酸序列。

在本发明的语境中，本文将“表达模块”定义为核酸构建体的一部分，其至少包含启动子、编码核糖体结合位点的序列并任选地包含mRNA稳定化元件和/或经修饰的rib前导序列。

在本发明的语境中，核糖体结合位点(RBS)是存在于mRNA上的在启动蛋白质翻译时被核糖体结合的序列。由B.subtilis的基因组分析得知：约90％的RBS位于从起始密码子的-5和-11之间且最常在-8处，并且强RBS接近共有序列AAAGGAGG(Rocha E.P.,DanchinA.,Viari A.Translation in Bacillus subtilis:roles and trends of initiationand termination,insights from a genome analysis Nucleic Acids Res.1999 27(17):3567-3576)。30种原核生物基因组的分析显示：大部分RBS序列含有AGGAGG核心基序的至少4个碱基(Ma J.,Campbell A.,Karlin S.J.Correlations between Shine-Dalgarno sequences and gene features such as predicted expression levels andoperon structures.Bacteriol.2002 184(20):5733-45)。

根据本发明的芽孢杆菌宿主细胞包含启动子序列，所述启动子序列允许编码目标化合物或者编码参与目标化合物合成的化合物的多核苷酸在宿主细胞中表达，其中所述启动子包含噬菌体启动子序列、更优选地噬菌体SPO1启动子序列。

本文将噬菌体启动子序列定义为来源于噬菌体(即，来源于感染细菌并在细菌中复制的病毒)的启动子序列。

术语“来源于”还包括术语“源自”、“获自”、“可获自”、“分离自”和“产生自”，其一般表示：一种指定材料源于另一种指定材料或者具有可以参照另一种指定材料描述的特征。在本文中使用时，“来源于”微生物的物质(例如，核酸分子或多肽)优选地表示该物质对所述微生物为天然的。

合适的噬菌体启动子是这样的启动子，其可以被芽孢杆菌RNA聚合酶识别并因此允许与所述噬菌体启动子可操作地连接的编码目标化合物或者编码参与目标化合物合成的化合物的多核苷酸在芽孢杆菌宿主细胞中表达。通常合适的噬菌体启动子可以来源于感染芽孢杆菌宿主细胞并在其中复制的噬菌体。感染芽孢杆菌宿主细胞的合适噬菌体有phie、SPO1、SP82、SP5、SP6、SP7、SP8、SP9、SP13、SP3、SP10、PBS1、SPα、和SPβ(AnnaM.Brodetsky1和W.R.Romig J Bacteriol.1965 90(6):1655–1663.Characterization ofBacillus subtilis Bacteriophages)。可针对噬菌体启动子在指导编码目标化合物或者编码参与目标化合物合成的化合物的多核苷酸在芽孢杆菌宿主中表达方面的效能而对其进行选择。合适的启动子可以是这样的，其是在特定条件下暂时引起基因的mRNA合成启动的“诱导型启动子”。或者，启动子可以是“组成型”启动子，即允许基因在几乎所有环境条件下表达的启动子，即指导恒定、非特异性基因表达的启动子。可以使用“强组成型启动子”，即相较于天然宿主细胞使得mRNA以高频率启动的启动子。

在根据本发明的优选实施方式中，噬菌体启动子序列是噬菌体SPO1启动子序列，即来源于B.subtilis噬菌体SPO1的启动子序列。Stewart等人VIROLOGY 246,329–340(1998)中已描述了噬菌体SPO1启动子序列。合适的噬菌体SPO1启动子序列可以是本文引用的Stewart等人的图2中所述的PE1、PE2、PE3、PE4、PE5、PE6、PE7、PE8、PE9、PE10、PE11或PE12噬菌体SPO1启动子序列中的任何。合适的启动子序列可以是PE1至PE2噬菌体SPO1启动子中的任何与PE1至PE2噬菌体SPO1启动子中的至少任何一种的融合体，其中所述融合体与编码目标化合物或者编码参与目标化合物合成的化合物的多核苷酸可操作地连接。

优选地，根据本发明的芽孢杆菌宿主细胞包含这样的噬菌体SPO1启动子序列，其中所述SPO1噬菌体启动子序列包含根据SEQ ID NO:36的多核苷酸序列或者与SEQ ID NO:36的同一性为至少70％的多核苷酸序列，优选与SEQ ID NO:36的同一性为至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％的多核苷酸序列。

在更优选的实施方式中，噬菌体SPO1启动子是根据SEQ ID NO:1的多核苷酸序列或者与SEQ ID NO:1的同一性为至少70％的多核苷酸序列，优选与SEQ ID NO:1的同一性为至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％的多核苷酸序列。优选地，噬菌体SPO1启动子是PE4或PE5，更优选根据SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的启动子。在本发明的语境中，PE4噬菌体SPO1启动子可被表示为P15启动子。

已出乎意料地发现：当根据本发明的芽孢杆菌宿主细胞包含其中编码目标化合物或者编码参与目标化合物合成的化合物的多核苷酸与噬菌体SPO1启动子序列(例如，PE4和/或PE5启动子序列)可操作地连接的核酸构建体时，如果相较于包含芽孢杆菌宿主细胞中大量使用的其它启动子(例如，Bacillus amyloliquefaciens amyQ启动子)的宿主细胞，可以获得较高的多核苷酸表达。

在优选的实施方式中，根据本发明的芽孢杆菌细胞中存在的噬菌体启动子、优选地SPO1噬菌体启动子、更优选地PE4和/或PE5 SPO1噬菌体启动子，例如根据SEQ ID NO:1或2的启动子或者本文所示的与其同一性为至少70％的启动子序列，是表达模块的一部分。

所述表达模块包括启动子、编码RBS的序列和任选的mRNA稳定化元件和/或经修饰的rib前导序列。优选地，表达模块包括启动子、mRNA稳定化元件和/或经修饰的rib前导序列以及编码RBS的序列。更优选地，表达模块包括位于启动子下游和编码RBS的序列上游的mRNA稳定化元件和/或经修饰的rib前导序列。在一种实施方式中，表达模块包括位于启动子下游和编码RBS的序列上游的mRNA稳定化元件。

在本发明的语境中，本文所使用的术语“mRNA稳定化元件”指的是位于编码目标化合物或者编码参与目标化合物合成的化合物的多核苷酸的启动子区下游和翻译起始位点(即，RBS)上游的DNA序列，其与启动子区可操作地连接以使得从启动子区合成的所有mRNA均可被加工以产生转录物的5’-末端具有稳定化序列的mRNA转录物。这种稳定化序列在mRNA转录物5’-末端的存在能够增加mRNA转录物的半衰期(Hue等人,(1995)Journal ofBacteriology 177:3465-3471)。合适的mRNA稳定化元件是WO08148575中所述的那些(优选WO08140615的SEQ ID NO:1-5)或者保持mRNA稳定化功能的这些序列的片段；和WO08140615中所述的那些(优选Bacillus thuringiensis CryIIIA mRNA稳定化序列或噬菌体SP82mRNA稳定化序列，更优选根据WO08140615的SEQ ID NO:4或5的mRNA稳定化序列，更优选根据WO08140615的SEQ ID NO:6的经修饰的mRNA稳定化序列)或者保持mRNA稳定化功能的这些序列的片段。优选的mRNA稳定化元件选自aprE、grpE、cotG、SP82、RSBgsiB、CryIIIAmRNA稳定化元件，优选分别根据SEQ ID NO:48-52的mRNA稳定化元件(分别对应于WO08148575的SEQ ID NO:1-5)和根据SEQ ID NO:53或54的mRNA稳定化元件(分别对应于WO08140615的SEQ ID NO:4和6)或者根据保持mRNA稳定化功能的这些序列的片段。优选的mRNA稳定化元件是grpE mRNA稳定化元件，优选地根据SEQ ID NO:49(对应于WO08148575的SEQ ID NO:2)。

在另一种实施方式中，表达模块包括位于启动子下游和编码RBS的序列上游的经修饰的rib前导序列。

在本发明的语境中，本文将rib前导序列定义为芽孢杆菌细胞中、更优选地Bacillus subtilis细胞中核黄素生物合成基因(rib操纵子)上游的前导序列。在Bacillussubtilis中，包含参与核黄素生物合成的基因的rib操纵子包括ribG(ribD)、ribB(ribE)、ribA和ribH基因。B.subtilis中从rib启动子(Prib)转录核黄素操纵子受核糖开关的控制，核糖开关涉及位于操纵子中第一个基因ribG的转录起点和翻译起始密码子之间的rib操纵子的5’-区域中的约300个核苷酸的未翻译的调控前导序列区(rib前导序列)。

在一种实施方式中，未修饰的rib前导序列是根据SEQ ID NO:55(对应于EP2186880的SEQ ID NO:42)的rib前导序列。经修饰的rib前导序列可包含一个或更多个ribO突变，即一个或更多个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个ribO突变，即在对应于SEQ ID NO:55中所示位置(其选自例如，第31、39、40、41、SS、85、86、88、93、116、121和128位)的位置上的取代。优选地，ribO突变选自T31G、G39A、G40A、G41A、C55T、C85T、C86T、G88A、C93T、A116C、G121A、C128G及其组合，其中核苷酸对应于SEQ ID NO:55中所示位置。更优选地，经修饰的rib前导序列是包含ribO突变C85T的rib前导序列，甚至更优选地其是含有在SEQ ID NO:55的相应位置的ribO突变C85T(在EP2186880和本文中命名为RK41)的根据SEQID NO:55的rib前导序列。经修饰的rib前导序列可包含对应于SEQ ID NO:55的第166-263位核苷酸的核苷酸的缺失(在EP2186880和本文中命名为“转换缺失”)，任选的与一个或更多个ribO突变组合，优选的与ribO突变C85T组合。因此，在优选的实施方式中，经修饰的rib前导序列是含有在SEQ ID NO:55的相应位置的ribO突变C85T(名为RK41)和对应于SEQ IDNO:55的第166-263位核苷酸的核苷酸的缺失(转换缺失)的根据SEQ ID NO:55的rib前导序列。

在一种根据本发明的实施方式中，根据本发明的芽孢杆菌宿主细胞包含这样的表达模块，所述表达模块包括启动子、RBS和任选的本文所定义的mRNA稳定化元件和/或本文所定义的经修饰的rib前导序列。

编码RBS的序列可以是下述序列，其编码包含编码目标化合物或者编码参与目标化合物合成的化合物的多核苷酸(当所述多核苷酸来源于原核细胞时)的基因中天然存在的RBS。或者，它可以是编码本领域技术人员已知的可用于芽孢杆菌宿主细胞中的RBS的任何合适序列。根据本发明的表达模块中编码RBS的合适序列是编码16S RBS、ribD RBS、mobURBS的序列。

根据本发明的优选表达模块具有选自SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ IDNO:35的多核苷酸序列。

根据本发明的芽孢杆菌宿主细胞包含本文所定义的核酸构建体，所述核酸构建体包含与启动子序列或表达模块可操作地连接的编码目标化合物或者编码参与目标化合物合成的化合物的多核苷酸，从而允许多核苷酸在本文所定义的宿主细胞中表达。

核酸构建体包含编码目标化合物或者编码参与目标化合物合成的化合物的多核苷酸。在一种实施方式中，目标化合物是选自核酸、多胺、多元醇、多肽(或聚酰胺)或多糖的生物聚合物，优选地多肽可以是酶。

目标化合物可以是任何生物化合物。生物化合物可以是生物质或生物聚合物或代谢产物。生物化合物可以由构成生物合成或代谢途径的单个多核苷酸或一系列多核苷酸编码或可为单个多核苷酸的产物的直接结果或一系列多核苷酸的产物的直接结果。生物化合物可以对宿主细胞是天然的或异源的。

本文将术语“异源性生物化合物”定义为对细胞并非天然的生物化合物；或其中已经进行结构修饰来改变天然生物化合物的天然生物化合物。

本文将术语“生物聚合物”定义为相同、相似或不相似的亚基(单体)的链(或聚合物)。生物聚合物可为任何生物聚合物。生物聚合物可例如但不限于核酸、多胺、多元醇、多肽(或聚酰胺)或多糖。

生物聚合物可为多肽。所述多肽可为具有目标生物活性的任何多肽。术语“多肽”在本文中并非意在指特定长度的编码产物，因此涵盖肽、寡肽和蛋白质。多肽进一步包括以上提到的多肽的天然存在的等位和工程化变异及杂合多肽。所述多肽对宿主细胞可为天然的或异源的。多肽可为胶原或明胶，或其变体或杂合物。多肽可为抗体或其部分、抗原、凝集因子、酶、激素或激素变体、受体或其部分、调节蛋白、结构蛋白、报告子或转运蛋白、分泌过程中涉及的蛋白质、折叠过程中涉及的蛋白质、伴侣蛋白、肽氨基酸转运体、糖基化因子、转录因子、合成肽或寡肽、细胞内蛋白。细胞内蛋白可为酶，例如蛋白酶、淀粉酶、神经酰胺酶、环氧化物水解酶、氨基肽酶、酰基转移酶、醛缩酶、羟化酶、氨基肽酶、脂肪酶。多肽也可为细胞外分泌的酶。这种酶可以属于以下的组，氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂解酶、异构酶、连接酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、角质酶、脱氧核糖核酸酶、葡聚糖酶、酯酶。所述酶可为碳水化合物酶，例如纤维素酶(例如葡聚糖内切酶、β-葡聚糖酶、纤维二糖水解酶或β-葡糖苷酶)、半纤维素酶或果胶分解酶(例如木聚糖酶、木糖苷酶、甘露聚糖酶、半乳聚糖酶、半乳糖苷酶、果胶甲基酯酶、果胶裂解酶、果胶酸裂解酶、多聚半乳糖醛酸内切酶、多聚半乳糖醛酸外切酶、鼠李糖半乳糖醛酸酶、阿拉伯聚糖酶、阿拉伯呋喃糖酶、阿糖基木聚糖水解酶、半乳醣醛酸酶、裂解酶或淀粉水解酶)；水解酶、异构酶或连接酶、磷酸酶(例如植酸酶)、酯酶(例如脂肪酶)、蛋白水解酶、氧化还原酶(例如氧化酶)、转移酶或异构酶。所述酶可为植酸酶。所述酶可为氨基肽酶、天冬酰胺酶、淀粉酶、麦芽糖淀粉酶、碳水化合物酶、羧肽酶、内切蛋白酶、金属蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、过氧化氢酶、几丁质酶、角质酶、环糊精葡萄糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、卤素过氧化物酶、蛋白质脱氨酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、变聚糖酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、磷脂酶、半乳糖脂酶、叶绿素酶、多酚氧化酶、核糖核酸酶、谷氨酰胺转移酶、叶绿素酶、脱镁叶绿素酶(pheophytinase)或葡萄糖氧化酶、己糖氧化酶、单加氧酶。

根据本发明，多肽或酶也可为如WO2010/102982中描述的产物。根据本发明，多肽也可为与另一多肽的融合多肽或杂合多肽，另一多肽在所述多肽或其片段的N端或C端融合。通过使编码一个多肽的核酸序列(或其部分)与编码另一多肽的核酸序列(或其部分)融合生产融合多肽。

生产融合多肽的技术在本领域中已知，并且包括连接编码多肽的编码序列，以致其在框内并且融合多肽的表达受相同启动子和终止子的控制。杂合多肽可包含从至少两个不同多肽获得的部分或完整多肽序列的组合，其中一个或更多个所述多肽可以与宿主细胞异源。在例如WO2010/121933中描述了融合多肽和信号序列融合的实例。

生物聚合物可为多糖。多糖可为任何多糖，包括但不限于粘多糖(例如，肝素和透明质酸)和含氮多糖(例如，几丁质)。在更优选的选项中，多糖为透明质酸。

根据本发明的编码目标化合物或者编码参与目标化合物生产的化合物的多核苷酸可编码在初级或次级代谢产物，例如有机酸、类胡萝卜素、(β-内酰胺)抗生素和维生素的合成中所涉及的酶。所述代谢产物可视为根据本发明的生物化合物。

术语“代谢产物”涵盖初级和次级代谢产物；代谢产物可为任何代谢产物。优选的代谢产物为柠檬酸、葡糖酸、己二酸、富马酸、衣康酸和琥珀酸。

代谢产物可由例如在生物合成或代谢途径中的一个或更多个基因编码。初级代谢产物是细胞初级或一般代谢的产物，其与能量代谢、生长和结构相关。次级代谢产物是次级代谢的产物(见，例如，R.B.Herbert,The Biosynthesis of Secondary Metabolites，Chapman和Hall，New York,1981)。

初级代谢产物可为但不限于氨基酸、脂肪酸、核苷、核苷酸、糖、甘油三酯或维生素。

次级代谢产物可为但不限于生物碱、香豆素、类黄酮、聚酮、奎宁、类固醇、肽或萜。次级代谢产物可为抗生素、拒食素、引诱剂、杀菌剂、杀真菌剂、激素、杀虫剂或杀鼠剂。优选的抗生素为头孢菌素和β-内酰胺。其他优选代谢产物为外代谢产物。外代谢产物的实例为Aurasperone B、Funalenone、Kotanin、Nigragillin、Orlandin、其他萘并-γ-吡喃酮、吡喃黑杆菌素A(Pyranonigrin A)、Tensidol B、伏马菌素B2和赭曲霉素A。

生物化合物也可为选择标记的产物。选择标记为目标多核苷酸的产物，所述产物提供了杀生物剂或病毒抗性、重金属抗性、对营养缺陷型的原营养等。选择标记包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨基甲酰转移酶)、bar(草胺膦乙酰转移酶)、hygB(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)、pyrG(乳清酸核苷-5'-磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷酰转移酶)、trpC(邻氨基苯甲酸合酶)、ble(腐草霉素抗性蛋白)、hyg(潮霉素)、NAT或NTC(诺尔丝菌素)、卡那霉素、四环素、氯霉素、新霉素、壮观霉素及其等效物。

根据本发明，目标化合物优选为目标化合物列表中描述的多肽。

优选地，目标化合物为淀粉酶，例如α-淀粉酶或β-淀粉酶，例如葡聚糖1,4-α-麦芽糖水解酶，例如根据SEQ ID NO:28的酶。在另一优选实施方式中，目标化合物为如从EMBL核苷酸序列数据库(http://www.ebi.ac.uk/embl/iNdex.html)检索号CDS:CAB13776(SEQ IDNO:41)检索到的内切-1,4-β-木聚糖酶蛋白质。

根据本发明的另一实施方式，目标化合物优选为代谢产物。

编码目标化合物或者编码参与目标化合物合成的化合物的多核苷酸可以是cDNA或基因组DNA。多核苷酸分子可以是单链的或双链的，但优选为双链DNA。基因组DNA可以指编码多肽链的核酸分子，其通常在开放阅读框之前和之后包括本文所定义的控制序列。基因组DNA可包括不编码多肽，但为功能RNA分子(例如，转移RNA、核糖体RNA、核糖酶、微RNA等)的转录提供模板的核酸。本文将开放阅读框定义为转录和翻译成多肽的基因区域，其从起始密码子(通常从起始密码子ATG)开始且不含任何终止密码子(TAA,TAG,TGA)。可在例如芽孢杆菌宿主细胞中找到的替代起始密码子为TTG和GTG(Rocha E.P.,Danchin A.,ViariA.Translation in Bacillus subtilis:roles and trends of initiation andtermination,insights from a genome analysis Nucleic Acids Res.1999 27(17):3567-3576)。在本发明的语境中，开放阅读框包含编码序列(外显子)并且可不含间隔序列(内含子)。在本发明的语境中，当编码目标化合物或者编码参与目标化合物合成的化合物的多核苷酸来源于基因组DNA时，所述基因组DNA通常不包括所述基因组DNA中天然存在的启动子序列且任选地不包括所述基因组DNA中天然存在的RBS序列。

编码目标化合物或者编码参与目标化合物合成的化合物的多核苷酸可通过重组生产，例如使用PCR(聚合酶链式反应)克隆技术；通过合成生产；或者通过本领域技术人员可用的任何方法生产。它们也可以通过标准技术来克隆。多核苷酸通常以经分离的和/或经纯化的形式提供。

为了增加本发明的细胞以活性形式表达引入的酶的可能性，可对相应的编码核苷酸序列进行调整以优化其密码子使用。本领域已知一些密码子优化方法。优化核苷酸序列的密码子使用至所选宿主细胞的优选方法是WO2006/077258和/或WO2008/000632中所公开的密码子对优化技术。WO2008/000632解决了密码子对优化。密码子对优化是这样的方法，其中编码多肽的核苷酸序列已针对其密码子使用、尤其是使用的密码子对而被修饰，以获得编码多肽的核苷酸序列的改善的表达和/或编码的多肽的改善的生产。将密码子对定义为编码序列中两个随后的三联体(密码子)的组。

当目标化合物是多肽时，多核苷酸可编码成熟多肽和野生型信号序列。或者，多核苷酸可编码成熟多肽和非天然信号序列。例如，当多核苷酸编码葡聚糖1,4-α-麦芽糖水解酶(例如根据SEQ ID NO:28的酶)时，信号序列yurI fliL、vpr、glpQ、phy、lytC、ywsB、ybbD、ybxI、yolA、ylqB、ybbC、pel、yckD、ywaD、ywmD、yweA、yraJ、dacF、yfjS、yybN、yrpD、yvcE、wprA、yxaL、ykwD、yncM2、sacB、phrC、SacC、yoqM、ykoJ、lip、yfkN、yurI、ybfO、yfkD、yoaJ、xynA、penP、ydjM、yddT、yojL、yomL、yqxI、yrvJ、yvpA、yjcM、yjfA、ypjP、ggt、yoqH、ywtD、ylaE、yraJ、lytB、lytD、nprB、nucB、rplR、yfhK、yjdB、ykvV、ybbE、yuiC、ylbL、yacD、yvpB和ynfF中的任何一种可被用于增加Bacillus subtilis中根据SEQ ID NO:28的葡聚糖1,4-α-麦芽糖水解酶的分泌(WO2013007820)。其它优选的信号序列是WO2013007821中所述的那些。

编码目标化合物或者编码参与目标化合物合成的化合物的多核苷酸可以是分离的多核苷酸。“经分离的多核苷酸”是下述DNA或RNA，其并不与其来源生物的天然存在的基因组中紧密相邻的两段编码序列(一段在5’末端，一段在3’末端)紧密相邻。

在本发明的语境中，核酸构建体与表达载体同义。根据本发明的表达载体包含与启动子序列可操作地连接的编码目标化合物或者编码参与目标化合物合成的化合物的多核苷酸，从而允许多核苷酸在宿主细胞中表达，其中所述启动子包含噬菌体启动子序列，更优选噬菌体SPO1启动子序列。

表达载体可包含下列元件，所述元件相对于编码目标化合物或者编码参与目标化合物合成的化合物的序列的编码链从5'-末端至3'-末端以连续顺序彼此可操作地连接：(1)能够指导编码目标化合物或者编码参与目标化合物合成的化合物的核苷酸序列转录的启动子序列；(2)任选地，促进转录的RNA翻译的序列，例如核糖体结合位点(也称为ShineDelgarno序列)；(3)任选地，能够指导目标化合物或者参与目标化合物合成的化合物从芽孢杆菌宿主细胞分泌到培养基中的信号序列；(4)本文所定义的编码目标化合物或者编码参与目标化合物合成的化合物的多核苷酸；和优选地(5)能够终止编码目标化合物或者编码参与目标化合物合成的化合物的核苷酸序列下游的转录的转录终止区(终止子)。元件(1)和任选的元件(2)可以是本文所定义的表达模块的部分。

终止子的来源并不关键。终止子可以，例如，对编码目标化合物或者编码参与目标化合物合成的化合物的DNA序列为天然的。然而，优选地，在细菌宿主细胞中使用细菌终止子。更优选地，终止子对宿主细胞(核苷酸序列将在其中表达)是内源性的。载体可包括这些控制序列和/或本文所定义的其它控制序列。

由构建体表达的成熟转录本的编码部分将包括起始密码子，其通常是AUG(或ATG)，但也有替代性起始密码子，例如GUG(或GTG)和UUG(或TTG)，它们被用于原核生物。而且停止或翻译终止密码子被适当地定位在待被翻译的多肽的末端。

表达载体可为任何载体(例如，质粒或病毒)，其可方便地进行重组DNA程序并且可引起编码目标化合物或者编码参与目标化合物合成的化合物的多核苷酸的表达。载体的选择通常将取决于载体与要向其中引入载体的芽孢杆菌宿主细胞的相容性。载体可为线性或闭环质粒。载体可为自主复制载体，即作为染色体外实体存在的其复制不依赖于染色体复制的载体，例如质粒、染色体外元件、微型染色体或人工染色体。自主复制载体通常还包括自主复制序列。自主复制序列可以是允许不依赖于染色体复制的质粒复制的本领域技术人员能够得到的任何合适序列。复制起点可以是在细胞中起作用的介导自主复制的任何质粒复制因子。本文将术语“复制起点”或“质粒复制因子”定义为使质粒或载体能够在体内复制的核苷酸序列。细菌复制起点的实例有允许在E.coli中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177和pACYC184的复制起点，例如F.Heffron等人在Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 72(9):3623-27(1975年9月)中所述的允许在Pseudomonas中复制的RSF1010，以及允许在芽孢杆菌中复制的pUB110、pE194、pTA1060和pAMβ1。

或者，载体可为引入宿主细胞时整合到基因组中并且与已经将其整合的染色体一起复制的载体。整合性载体可随机整合或整合在宿主细胞染色体内预定的靶基因座处。在本发明的优选实施方式中，整合性载体包含与宿主细胞基因组中预定靶基因座的DNA序列同源的DNA片段，以向该预定基因座靶向整合克隆载体。为了促进靶向整合，优选在转化细胞之前，使载体线性化。优选进行线性化，以致载体的至少一端但是优选两端的侧翼为与靶基因座同源的序列。靶基因座侧翼的同源序列的长度优选为至少30bp，优选至少50bp，优选至少0.1kb，甚至优选至少0.2kb，更优选至少0.5kb，甚至更优选至少1kb，最优选至少2kb。

在根据本发明的一个实施方式中，所述核酸构建体被整合入宿主细胞基因组内，其中所述核酸构建体包含与启动子序列可操作地连接的编码目标化合物或者编码参与目标化合物合成的化合物的多核苷酸，从而允许多核苷酸在宿主细胞中表达，其中所述启动子包含噬菌体启动子序列，更优选噬菌体SPO1启动子序列。

在本发明的一个实施方式中，核酸构建体被整合在选自npr基因座、apr基因座或amy基因座的基因座。更优选地，核酸构建体被整合在选自nprE基因座、amyE基因座或aprE基因座的基因座，更优选地其被整合在amyE基因座或其同源基因座。

在本发明的另一实施方式中，根据本发明的芽孢杆菌宿主细胞包含多于一个拷贝的本文所定义的核酸构建体，更优选地其包含多于一个拷贝的整合入宿主细胞基因组内的核酸构建体。

可将多于一个拷贝的核酸序列插入根据本发明的芽孢杆菌宿主细胞中以增加由所述序列编码的化合物生产(过表达)。这可优选通过将DNA序列的更多拷贝整合到其基因组进行。或者，这可通过包括与所述核酸序列一起的可扩增选择标记基因进行，其中可通过在适当选择剂的存在下培养细胞来选择含有选择标记基因的扩增拷贝并从而含有所述核酸序列的附加拷贝的细胞。

表达载体可为单个载体或质粒或两个或更多个载体或质粒，其共同含有待引入宿主细胞基因组中的总DNA，或转座子。

载体优选含有一个或更多个允许容易地选择转化细胞的选择标记。选择标记是其产物提供了杀生物剂或病毒抗性、重金属抗性、对营养缺陷型的原营养等的基因。选择标记可作为表达盒在表达载体上引入细胞或可在单独表达载体上引入。

可用于细菌中的标记包括ATP合成酶，亚基9(oliC)，乳清酸核苷-5'-磷酸脱羧酶(pvrA)，细菌G418抗性基因，新霉素、卡那霉素、四环素、壮观霉素、红霉素、氯霉素、腐草霉素、潮霉素、博来霉素、甲氨蝶呤或苯菌灵抗性(benA)的抗性基因(芽孢杆菌)和编码β-葡萄糖醛酸酶(GUS)的大肠杆菌uidA基因。

或者，可使用特定选择标记，例如需要相应突变宿主菌株的营养缺陷型标记：例如，D-丙氨酸消旋酶(来自芽孢杆菌)或trpC。在优选的实施方式中，引入表达构建体之后使经转化的宿主细胞缺失选择标记以获得不含选择标记基因的能够生产目标化合物或者参与目标化合物合成的化合物的经转化的宿主细胞。因此，在一个本发明的实施方式中，重组芽孢杆菌宿主细胞是不含标记的宿主细胞。

在一种实施方式中，待整合入芽孢杆菌宿主细胞基因组中的一个或更多个本文所定义的核酸构建体包含位于两个lox位点之间的选择标记，其中通过使用选择标记选择其中已发生基因组整合的那些细胞，所述标记通过Cre重组酶蛋白的作用经由两个lox位点的位点特异性重组而缺失。Cre重组酶蛋白导致选择标记从基因组缺失并在芽孢杆菌宿主细胞基因组中留下单lox位点。本文使用的术语“lox位点”指的是这样的核苷酸序列，在此处，噬菌体P1的cre基因产物Cre重组酶能够催化位点特异性重组事件。lox位点是Cre重组酶的位点特异性重组位点。本领域已知多种lox位点，包括天然存在的loxP、loxB、loxL和loxR，以及一些突变的或变种的lox位点，例如lox66、lox71、loxP511、loxP514、loxΔ86、loxΔ117、loxC2、loxP2、loxP3和lox P23。位点特异性重组位点可以是这样的，其使得重组酶表达之后的外重组在重组酶不识别的靶基因座产生单突变位点特异性重组位点。特别地，lox位点可以为lox66和lox 71(Albert,H.,Dale,E.C.,Lee,E.,&Ow,D.W.(1995).Site-specific integration of DNA into wild-type and mutant lox sites placed in theplant genome.Plant Journal,7(4),649-659)。在特定实施方式中，lox66和lox 71位点特异性重组位点可以是这样的，其使得重组酶表达之后的外重组在重组酶不识别的靶基因座产生lox72突变位点特异性重组位点。

因此，在根据本发明的一种实施方式中，在根据本发明的重组芽孢杆菌宿主细胞中，一个或更多个核酸构建体包含位于两个lox位点之间、优选位于lox66和lox 71位点之间的选择标记。

Cre-lox系统也可用于在根据本发明的重组芽孢杆菌宿主细胞中进行其他重组转化。例如，它可用于在芽孢杆菌宿主细胞基因组中的靶基因座插入、替换或缺失多核苷酸序列而不会在宿主细胞中留下选择标记。在这方面，可以利用例如WO2013/135729中所述的使用Cre-lox系统在宿主细胞中的靶基因座进行重组的方法。

因此，在另一实施方式中，根据本发明的重组芽孢杆菌宿主细胞是不含标记的宿主细胞，优选基因组中包含一个或更多个单lox位点的不含标记的宿主细胞，更优选基因组中包含一个或多个lox72位点的不含标记的宿主细胞。

本领域技术人员知道如何使用Cre-lox系统生产不含标记的宿主细胞。

用于连接上述元件以构建本发明的重组表达载体的程序为本领域技术人员所熟知(参见，例如，Sambrook&Russell,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第三版,CSHL Press,Cold Spring Harbor,NY,2001；和Ausubel等人,Current Protocols inMolecular Biology,Wiley InterScience,NY,1995)。

此外，标准分子克隆技术例如DNA分离、凝胶电泳、核酸的酶促限制修饰、Southern分析、细胞转化等为技术人员已知并且例如由Sambrook等人(1989)"Molecular Cloning:alaboratory manual",Cold Spring Harbor Laboratories,Cold Spring Harbor,NewYork和Innis等(1990)"PCR protocols,a guide to methods and applications"Academic Press,San Diego描述。

可使用cDNA、mRNA或使用基因组DNA作为模板和使用适当寡聚核苷酸引物，根据标准PCR扩增技术扩增核酸。可将这样扩增的核酸克隆到适当载体中并且通过DNA序列分析表征。

本领域技术人员知道如何利用一种或更多种表达载体和选择标记转化细胞。

在本发明的语境中，本文所定义的芽孢杆菌宿主细胞或所述宿主细胞的亲本可以是任何类型的芽孢杆菌宿主细胞并包括本领域技术人员已知的芽孢杆菌属内的所有种，包括但不限于B.agaradherens、B.alkalophilus、B.amyloliquefaciens、B.anthracis、B.atrophaeus、B.brevis、B.cereus、B.circulans、B.clausii、B.coagulans、B.firmus、B.halodurans、B.lautus、B.lentus、B.licheniformis、B.megaterium、B.mojavensis、B.pumilus、B.puntis、B.sphaericus、B.stearothermophilus、B.subtilis、B.thuringiensis、B.vallismortis。已认识到芽孢杆菌属继续经受分类学重新组织。因此，该属旨在包括已重新分类的种，包括但不限于生物体例如B.stearothermoplilus，其现在名为Geobacillus stearothermophilus。

在一种实施方式中，根据本发明的芽孢杆菌宿主细胞属于选自B.agaradherens、B.alkalophilus、B.amyloliquefaciens、B.anthracis、B.atrophaeus、B.brevis、B.cereus、B.circulans、B.clausii、B.coagulans、B.firmus、B.halodurans、B.lautus、B.lentus、B.licheniformis、B.megaterium、B.mojavensis、B.pumilus、B.puntis、B.sphaericus、B.stearothermophilus、B.subtilis、B.thuringiensis、B.vallismortis的种，优选地属于B.subtilis、B.amyloliquefaciens或Bacillus licheniformis。最优选地，芽孢杆菌宿主细胞是B.subtilis宿主细胞。

在本发明的优选实施方式中，根据本发明的的芽孢杆菌宿主细胞是中性蛋白酶生产和碱性蛋白酶生产有缺陷的Bacillus subtilis宿主细胞，优选地其中中性蛋白酶具有根据SEQ ID NO:8的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:8的同一性为至少60％的氨基酸序列，优选地与SEQ ID NO:8的同一性为至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％的氨基酸序列，且其中碱性蛋白酶具有根据SEQ ID NO:6的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:6的同一性为至少60％的氨基酸序列，优选地与SEQ ID NO:6的同一性为至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％的氨基酸序列。优选地，Bacillus subtilis宿主细胞还在中性淀粉酶生产上有缺陷，优选地其中中性淀粉酶具有根据SEQ ID NO:20的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:20的同一性为至少60％的氨基酸序列，优选地与SEQ ID NO:20的同一性为至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％的氨基酸序列。

在另一实施方式中，根据本发明的的芽孢杆菌宿主细胞是中性蛋白酶生产和碱性蛋白酶生产有缺陷的Bacillus amyloliquefaciens宿主细胞，优选地其中中性蛋白酶具有根据SEQ ID NO:43的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:43的同一性为至少60％的氨基酸序列，优选地与SEQ ID NO:43的同一性为至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％的氨基酸序列，且其中碱性蛋白酶具有根据SEQ ID NO:45的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:45的同一性为至少60％的氨基酸序列，优选地与SEQ ID NO:45的同一性为至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％的氨基酸序列。优选地，Bacillus amyloliquefaciens宿主细胞还在中性淀粉酶生产上有缺陷，优选地其中中性淀粉酶具有根据SEQ ID NO:57的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:57的同一性为至少60％的氨基酸序列，优选地与SEQ ID NO:57的同一性为至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％的氨基酸序列。

在另一实施方式中，根据本发明的的芽孢杆菌宿主细胞是碱性蛋白酶生产有缺陷的Bacillus licheniformis宿主细胞，优选地其中碱性蛋白酶具有根据SEQ ID NO:47的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:47的同一性为至少60％的氨基酸序列，优选地与SEQ ID NO:47的同一性为至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％的氨基酸序列。优选地，Bacillus licheniformis宿主细胞还在中性淀粉酶生产上有缺陷，优选地其中中性淀粉酶具有根据SEQ ID NO:59的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:59的同一性为至少60％的氨基酸序列，优选地与SEQ ID NO:59的同一性为至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％的氨基酸序列。

宿主细胞可额外在其它化合物生产上有缺陷，所述其它化合物不利于目标化合物或者参与目标化合物合成的化合物生产，或者不利于目标化合物的回收和/或应用，例如目标化合物为多肽，例如酶。在一个优选的方面，芽孢杆菌宿主细胞是蛋白酶缺陷宿主细胞。在另一优选的方面，芽孢杆菌宿主细胞还在由选自nprB、vpr、epr、wprA、mpr、bpr的基因编码的一种或更多种蛋白酶上有缺陷。

在另一优选的方面，芽孢杆菌宿主细胞不生产孢子，优选地其在孢子形成相关基因上有缺陷，更优选地其在选自spo0A、spoIISA、spoIIAC、sigE、sigF、spoIISB、spoIIE、sigG、spoIVCB、spoIIIC、spoIIGA、spoIIAA、spoIVFB、spoIIR、spoIIIJ的基因上有缺陷。在一种优选实施方式中，芽孢杆菌宿主细胞在spoIIAC基因上有缺陷。在另一优选实施方式中，芽孢杆菌宿主细胞在spoIIE基因上有缺陷，优选地具有根据SEQ ID NO:39的多核苷酸序列或者具有与SEQ ID NO:39的同一性为至少60％的多核苷酸序列，优选地与SEQ ID NO:39的同一性为至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％的多核苷酸序列的基因。优选地，spoIIE基因编码具有根据SEQ ID NO:40的氨基酸序列或者与SEQID NO:40的同一性为至少60％的氨基酸序列，优选地与SEQ ID NO:40的同一性为至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％的氨基酸序列的多肽。

可用于本发明的微生物可从不同来源公开可用，例如德国微生物菌种保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(DSMZ),Inhoffenstrasse 7B,D-38124Braunschweig,德国)；美国典型培养物保藏中心(AmericanType Culture Collection(ATCC),P.O,Box 1549,Manassas,VA 20108美国)；美国农业研究专利菌种保藏(Agricultural ResearchCulture Collection(NRRL),Peoria,IL,美国)；菌种保藏部门(Culture Collection Division,NITE生物资源中心,2-5-8,Kazusakamatari,Kisarazu-shi,Chiba,292-0818,日本)(原来:发酵研究所,Osaka(IFO),17-85,Juso-honmachi2-chome,Yodogawa-ku,Osaka 532-8686,日本)；或者芽孢杆菌遗传保藏中心(Bacillus Genetic Stock Center(BGSC),The Ohio StateUniversity,Columbus,Ohio 43210美国)。

在更优选的实施方式中，芽孢杆菌宿主细胞是Bacillus subtilis BS154、Bacillus subtilis 168、Bacillus subtilis CBS136327或其衍生物。

根据本发明的芽孢杆菌宿主细胞可以是重组宿主细胞。关于宿主细胞、核酸、蛋白质或载体使用时，术语“重组”表示：所述细胞、核酸、蛋白质或载体已通过异源性核酸或蛋白质引入或者天然核酸或蛋白质改变进行修饰，或者所述细胞来源于如此修饰的细胞。因此，例如，重组细胞可表达细胞天然(非重组)形式中未发现的基因，或表达其它情况下异常表达、低表达或完全不表达的天然基因。术语“重组”与“经遗传修饰”同义。

在另一方面，本发明涉及生产根据本发明的重组芽孢杆菌宿主细胞的方法，所述方法包括：

在该语境中，本领域技术人员清楚：适用于根据本发明的重组芽孢杆菌宿主细胞的实施方式可同样适用于本发明的其它方面。

在步骤a.中，生产根据本发明的芽孢杆菌宿主细胞的方法包括：提供芽孢杆菌宿主细胞，所述芽孢杆菌宿主细胞在中性蛋白酶生产和碱性蛋白酶生产上有缺陷，任选地在中性α-淀粉酶生产上有缺陷，任选地在孢子形成相关基因上有缺陷。

在一种实施方式中，步骤a.中的芽孢杆菌宿主细胞在中性蛋白酶生产和/或碱性蛋白酶生产，以及孢子形成相关基因上有缺陷。

在另一实施方式中，步骤a.中的芽孢杆菌宿主细胞在中性蛋白酶生产和/或碱性蛋白酶生产，以及中性α-淀粉酶生产上有缺陷。

在另一实施方式中，步骤a.中的芽孢杆菌宿主细胞在中性蛋白酶生产和/或碱性蛋白酶生产，中性α-淀粉酶生产，以及孢子形成相关基因上有缺陷。

在另一实施方式中，步骤a.中的芽孢杆菌宿主细胞在中性蛋白酶生产和碱性蛋白酶生产，中性α-淀粉酶生产，以及孢子形成相关基因上有缺陷。

芽孢杆菌宿主细胞可以是本文所定义的芽孢杆菌宿主细胞。

在本发明的一种实施方式中，步骤a)包括：提供亲本芽孢杆菌宿主细胞和修饰所述亲本宿主细胞以使得其在中性蛋白酶生产和/或碱性蛋白酶生产上有缺陷，任选地在孢子形成相关基因上有缺陷，任选地在中性α-淀粉酶生产上有缺陷。

可利用本领域技术人员已知的方法来提供本发明的步骤a)中的在中性蛋白酶生产和碱性蛋白酶生产上有缺陷，任选地在孢子形成相关基因上有缺陷，任选地在中性α-淀粉酶生产上有缺陷的芽孢杆菌宿主细胞。

宿主细胞中的缺陷可从无缺陷的亲本宿主细胞开始进行，通过对所述亲本宿主细胞、优选地在其基因组中进行修饰以导致以下表型特征，其中与未被修饰的亲本宿主细胞相比，当在相同条件下分析时，所述细胞：a)生产较少中性蛋白酶或不生产中性蛋白酶或者生产较少碱性蛋白酶或不生产碱性蛋白酶，任选地生产较少中性α-淀粉酶或不生产中性α-淀粉酶，任选地生产较少由孢子形成相关基因编码的化合物或不生产由孢子形成相关基因编码的化合物；和/或b)生产(生物或酶)活性降低或者基本上无(生物或酶)活性或者基本上无比(生物或酶)活性的中性蛋白酶、碱性蛋白酶、任选的中性α-淀粉酶和任选的由孢子形成相关基因编码的化合物，以及这些可能性中一种或更多种的组合。优选在基因组中的修饰被解释为一种或更多种修饰。

优选在基因组中的修饰可通过以下任一种实现：

a)使亲本宿主细胞经受重组基因操作技术；和/或

b)使亲本宿主细胞经受(传统)诱变；和/或

c)使亲本宿主细胞经受抑制性化合物或组合物。

本文将宿主细胞基因组修饰定义为导致细胞基因组中的多核苷酸序列改变的任何事件。在优选的实施方式中，本文所定义的在中性蛋白酶生产和碱性蛋白酶生产上有缺陷，任选地在中性α-淀粉酶生产上有缺陷，任选地在孢子形成相关基因上有缺陷的芽孢杆菌宿主细胞是具有(优选在基因组中的)修饰的宿主细胞，所述修饰包括：

a)如果与未被修饰的亲本宿主细胞相比，当在相同条件下分析时，导致基本无中性蛋白酶生产和/或无碱性蛋白酶生产，任选地无中性α-淀粉酶生产，任选地无由本文所定义的孢子形成相关基因编码的化合物生产的修饰，和/或

b)如果与未被修饰的亲本宿主细胞相比，当在相同条件下分析时，导致中性蛋白酶和/或碱性蛋白酶，任选地中性α-淀粉酶，任选地由本文所定义的孢子形成相关基因编码的化合物基本上无本文所定义的(生物或酶)活性的修饰。

修饰可通过传统菌株改良、随机诱变随后选择来引入。修饰也可通过定点诱变来引入。

修饰可以通过多核苷酸序列中一个或多个核苷酸的插入(引入)、置换(替代)或缺失(移除)来实现。可以实现编码中性蛋白酶的基因和/或编码碱性蛋白酶的基因、任选地编码中性α-淀粉酶的基因、任选地本文所定义的孢子形成相关基因的完全或部分缺失。可以利用不编码中性蛋白酶的多核苷酸序列和/或不编码碱性蛋白酶的基因的多核苷酸序列、任选地不编码中性α-淀粉酶的基因的多核苷酸序列、任选地不编码孢子形成相关基因的多核苷酸序列或者编码中性蛋白酶和/或碱性蛋白酶、任选地中性α-淀粉酶、任选地由本文所定义的孢子形成相关基因编码的化合物的部分或完全失活形式的多核苷酸序列来部分地或全部地替代编码中性蛋白酶的基因和/或编码碱性蛋白酶的基因、任选地编码中性α-淀粉酶的基因、任选地本文所定义的孢子形成相关基因。在另一替代实施方式中，可将一个或更多个核苷酸插入编码中性蛋白酶的基因和/或编码碱性蛋白酶的基因、任选地编码中性α-淀粉酶的基因、任选地本文所定义的孢子形成相关基因中，从而破坏所述基因，进而使由所述基因编码的多肽或化合物部分或完全失活。

在一种实施方式中，在中性蛋白酶生产和碱性蛋白酶生产上有缺陷，任选地在中性α-淀粉酶生产上有缺陷，任选地在本文所定义的孢子形成相关基因上有缺陷的芽孢杆菌宿主细胞包括在其基因组中的修饰，所述修饰选自：

a)编码中性蛋白酶的基因和/或编码碱性蛋白酶的基因、任选地编码中性α-淀粉酶的基因、任选地孢子形成相关基因的全部或部分缺失，

b)编码中性蛋白酶的基因和/或编码碱性蛋白酶的基因、任选地编码中性α-淀粉酶的基因、任选地孢子形成相关基因用不编码中性蛋白酶的多核苷酸序列和/或不编码碱性蛋白酶的多核苷酸序列、任选地不编码中性α-淀粉酶的基因的多核苷酸序列、任选地非本文所定义的孢子形成相关基因或者编码本文所定义的的相应多肽或化合物的部分或完全失活形式的多核苷酸序列全部或部分置换，

c)编码中性蛋白酶的基因和/或编码碱性蛋白酶的基因、任选地编码中性α-淀粉酶的基因、任选地本文所定义的孢子形成相关基因通过在所述基因的多核苷酸序列中插入一个或更多个核苷酸进行破坏，从而使由被破坏的多核苷酸编码的本文所定义的相应多核苷酸部分失活或完全失活。

该修饰可例如在必需基因的转录或翻译所需的调控元件或者编码序列中。例如，可插入或者移除核苷酸以导致终止密码子的引入，起始密码子的移除或者编码序列的开放阅读框的改变或移码。编码序列或其调控元件的修饰可依照本领域已知的方法通过定点诱变或随机诱变、DNA改组方法、DNA重新组装方法、基因合成(参见，例如，Young和Dong,(2004),Nucleic Acids Research 32,(7)electronic access http://nar.oupjournals.org/cgi/reprint/32/7/e59或者Gupta等人(1968),Proc.Natl.Acad.Sci USA,60:1338-1344；Scarpulla等人(1982),Anal.Biochem.121:356-365；Stemme等人(1995),Gene 164:49-53)或者PCR生产的诱变来实现。随机诱变程序的实例在本领域众所周知，例如化学(例如，NTG)诱变或者物理(例如，UV)诱变。定点诱变程序的实例有QuickChange^TM定点诱变试剂盒(Stratagene Cloning Systems,La Jolla,加拿大)、‘The Altered

II体外诱变系统’(Promega Corporation)或者使用如Gene.1989年4月15日；77(1):51-9.(Ho SN,Hunt HD,Horton RM,Pullen JK,Pease LR“Site-directedmutagenesis by overlap extension using the polymerase chain reaction”)中所述的PCR或使用如Molecular Biology:Current Innovations and Future Trends.(A.M.Griffin and H.G.Griffin.编ISBN 1-898486-01-8；1995Horizon ScientificPress,PO Box 1,Wymondham,Norfolk,英国)中所述的PCR通过重叠延伸。

优选的修饰方法基于重组基因操作技术例如部分或完整基因置换或者部分或完整基因缺失。

例如，在多核苷酸、核酸构建体或表达盒置换的情况下，可在待替换的靶基因座引入适当的DNA序列。适当的DNA序列优选地存在于克隆载体上。优选的整合性克隆载体包含这样的DNA片段，其与待替换的基因座侧翼的多核苷酸同源或与其具有同源性，用于将克隆载体靶向整合至该预定基因座。为了促进靶向整合，克隆载体在细胞转化之前优选地被线性化。优选地，进行线性化以使得克隆载体的至少一端但是优选地任一端的侧翼均为与待替换的DNA序列(或侧翼序列)同源的序列。该过程称为同源重组并且该技术还可用于实现(部分)基因缺失。

例如，编码相关化合物(例如，中性蛋白酶、碱性蛋白酶、中性α-淀粉酶、由孢子形成相关基因编码的化合物)的基因可以被缺陷型多核苷酸，即不能生产(完整功能性)相关化合物的多核苷酸替换。通过同源重组，缺陷型多核苷酸替换内源性多核苷酸。可以期望缺陷型多核苷酸也编码标记，其可以用于选择核酸序列已经被修饰的转化株。

或者，其中所述宿主细胞不生产或生产较少中性蛋白酶、不生产或生产较少碱性蛋白酶、任选地不生产或生产较少中性α-淀粉酶、任选地不生产或生产较少由本文所定义的孢子形成相关基因编码的化合物的修饰可以通过确立的反义技术使用与相关基因的核酸序列互补的核苷酸序列来进行。更具体地，可通过引入与基因的核酸序列互补的核苷酸序列来减少或消除宿主细胞的基因表达，所述核苷酸序列可以在细胞中转录并能够与细胞中生产的mRNA杂交。在允许互补的反义核苷酸序列与mRNA杂交的条件下，翻译的蛋白质的量因此减少或消除。

在一种实施方式中，如果与无缺陷的亲本宿主细胞相比并且在相同条件下测量，可通过消除编码所述多肽的mRNA的生产来实现在中性蛋白酶生产和/或碱性蛋白酶生产上有缺陷，任选地在中性α-淀粉酶生产上有缺陷，任选地在由孢子形成相关基因编码的化合物上有缺陷的芽孢杆菌宿主细胞的提供。在另一实施方式中，宿主细胞诱导型地在中性蛋白酶生产和/或碱性蛋白酶生产上有缺陷，任选地在中性α-淀粉酶生产上有缺陷，任选地在孢子形成相关基因上有缺陷。可通过将相应基因放置在宿主基因组中受诱导型启动子控制来实现诱导型地在中性蛋白酶生产和/或碱性蛋白酶生产上有缺陷，任选地在中性α-淀粉酶生产上有缺陷，任选地在孢子形成相关基因上有缺陷的宿主细胞的提供。诱导型启动子可以是适合目的的任何诱导型启动子，它可以是化学诱导的或物理诱导的启动子(例如，通过温度或光)。本领域技术人员知道如何选择这种启动子。来自革兰氏阳性微生物的合适启动子包括但不限于，gnt(葡糖酸盐操纵子启动子)；来自Bacillus licheniformis的penP；glnA(glutamine synthetase)；xylAB(木糖操纵子)；araABD(L-阿拉伯糖操纵子)和P_spac启动子。其它实例有被孢子形成特异性σ因子：σ^F、σ^E、σ^G和σ^K和一般应激σ因子σ^B激活的启动子。来自革兰氏阳性微生物的其它启动子包括但不限于，trp操纵子和sacB基因。

可经由RNA干扰(RNAi)技术(FEMS Microb.Lett.237(2004):317-324)获得本文所述的导致由相关基因转录的mRNA量为零的修饰。在这种方法中，表达将受影响的核苷酸序列的相同有义和反义部分克隆在对方后面且之间有核苷酸间隔物，并且被插入表达载体中。所述分子经转录后，小核苷酸片段的形成将导致将受到影响的mRNA的靶向降解。特定mRNA的消除可达到不同程度。本文所述的导致中性蛋白酶和/或碱性蛋白酶、任选地中性α-淀粉酶、任选地由孢子形成相关基因编码的化合物具有较低(酶或生物)活性或者无(酶或生物)活性的修饰可通过不同方法获得，例如通过针对所述多肽的抗体或化学抑制剂或蛋白抑制剂或物理抑制剂(Tour O.等人，(2003)Nat.Biotech:Genetically targetedchromophore-assisted light inactivation.第21卷no.12:1505-1508)或肽抑制剂或反义分子或RNAi分子(R.S.Kamath_等人，(2003)Nature:Systematic functional analysisof the Caenorhabditis elegans genome using RNAi.第421卷，231-237)。

除了以上提到的技术或作为替代方案，也可借助于替代性信号序列来抑制本文所定义的中性蛋白酶和/或碱性蛋白酶、任选地中性α-淀粉酶、任选地由孢子形成相关基因编码的化合物的活性，或使本文所定义的相应多肽重新定位。

可替代地或与以上提到的技术相结合，也可例如通过紫外或化学诱变或通过使用抑制本文所述多肽的酶活性的抑制剂(例如野尻霉素，其起到β-葡糖苷酶抑制剂的作用(Carrel F.L.Y.和Canevascini G.Canadian Journal of Microbiology(1991)37(6):459-464；Reese E.T.、Parrish F.W.和Ettlinger M.Carbohydrate Research(1971)381-388))获得对本文所定义的多肽酶活性的抑制。

在生产根据本发明的芽孢杆菌宿主细胞的方法的一种实施方式中，通过下列方法中的一种修饰亲本宿主细胞的基因组：a)使基因部分或完全缺失；b)用多核苷酸序列部分或完全替代基因；c)通过在基因的多核苷酸序列中插入一个或多个核苷酸来破坏所述基因；d)将基因放置在宿主细胞基因组中受诱导型启动子控制并在抑制基因转录成mRNA的条件下培养宿主细胞，其中所述基因是编码中性蛋白酶的基因和/或编码碱性蛋白酶的基因、任选地编码中性α-淀粉酶的基因、任选地孢子形成相关基因，其中所述宿主细胞i)不生产由所述基因编码的产物或者ii)生产无(酶或生物)活性的产物或者i)和ii)的组合。

在生产根据本发明的芽孢杆菌宿主细胞的方法的步骤b.中，用核酸构建体转化芽孢杆菌宿主细胞，所述核酸构建体包含与启动子序列可操作地连接的编码目标化合物或者编码参与目标化合物合成的化合物的多核苷酸，从而允许多核苷酸在宿主细胞中表达，其中所述启动子包含噬菌体启动子序列，更优选噬菌体SPO1启动子序列。本文中已描述了芽孢杆菌宿主细胞，核酸构建体，编码目标化合物或者编码参与目标化合物合成的化合物的多核苷酸，包含噬菌体启动子序列、更优选噬菌体SPO1启动子序列的启动子。

核酸构建体可以通过自然感受态、常规转化或感染技术被引入芽孢杆菌宿主细胞中。在本文中使用时，术语“转化”和“转染”意指多种用于将外源多核苷酸(例如DNA)引入宿主细胞的本领域公认的技术，包括磷酸钙或氯化钙共沉淀，DEAE-葡聚糖介导的转染、转导、感染，脂质转染(lipofection)，阳离子脂质介导的转染或电穿孔。用于转化或转染宿主细胞的合适方法可以在Sambrook&Russell,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第3版,CSHL Press,Cold Spring Harbor,NY,2001和其他实验室手册中找到并且为本领域技术人员众所周知。本领域技术人员知道如何将多核苷酸序列引入芽孢杆菌细胞(参见，例如，Ferrari等人,"Genetics,"Harwood等人(编),Bacillus,Plenum Publishing Corp.(1989)第57-72页；Saunders等人,J.Bacteriol,157:718-726(1984)；Hoch等人,J.Bacteriol,93:1925-1937(1967)；Mann等人,Current Microbiol,13:131-135(1986)；和Holubova,Folia Microbiol,30:97(1985)；对于B.subtilis,Chang等人,Mol.Gen.Genet.,168:11-115(1979)；对于B.megaterium,Vorobjeva等人,FEMS Microbiol Lett.,7:261-263[1980]；对于Bamyloliquefaciens,Smith等人,Appl Env.Microbiol,51:634(1986)；对于B.thuringiensis,Fisher等人,Arch.Microbiol,139:213-217(1981)；和对于B.sphaericus,McDonald,J.Gen.Microbiol,130:203(1984))。这种方法包括原生质体转化和中板集合(congression)、转导以及原生质体融合。对于将本发明提供的核酸构建体引入宿主细胞，转化方法是特别优选的。将核酸构建体引入宿主细胞包括将DNA引入宿主细胞而不插入质粒或载体中的本领域已知的那些物理和化学方法。这种方法包括但不限于，氯化钙沉淀、电穿孔、裸DNA、脂质体等。在附加实施方式中，DNA构建体与质粒一起共转化而不被插入质粒中。

为了增加芽孢杆菌宿主细胞中编码目标化合物或者编码参与目标化合物合成的化合物的多核苷酸的拷贝量，可能需要多次转化宿主细胞。以这种方式，可以影响由宿主细胞生产的不同酶的比例。此外，核酸构建体可包含多个表达盒以增加待转化多核苷酸的拷贝量。

另一种方法可以是针对不同多核苷酸选择不同控制序列，取决于选择，这可导致期望多肽的较高或较低生产。

用选择标记转化的细胞可基于选择标记的存在进行选择。在其它实施方式中，通过本领域已知的方法使选择标记从经改变的芽孢杆菌菌株中缺失(参见，Stahl等人,(1984)J.Bacteriol.,158:411-418；和Palmeros等人,(2000)Gene 247:255-264)

在另一方面，本发明提供生产目标化合物的方法，所述方法包括：

a)在有益于生产目标化合物的条件下，培养根据本发明的重组芽孢杆菌宿主细胞或者根据本发明所述的生产重组宿主细胞的方法所生产的重组芽孢杆菌宿主细胞，和

b)任选地，从培养液中分离所述目标化合物。

目标化合物可以是本文所定义的任何目标化合物。

本文已描述了中性蛋白酶生产和/或碱性蛋白酶生产有缺陷的重组芽孢杆菌宿主细胞，所述宿主细胞包含核酸构建体，其中所述核酸构建体包含编码目标化合物或者编码参与目标化合物合成的化合物的多核苷酸，所述多核苷酸与启动子序列可操作地连接从而允许多核苷酸在宿主细胞中表达，其中所述启动子包含噬菌体启动子序列，更优选地噬菌体SPO1启动子序列已在此被描述。本文所述宿主细胞的所有实施方式同样适用于本文所述生产目标化合物的方法。

根据本发明的生产目标化合物的方法的步骤a)包括：在有益于生产目标化合物的条件下，培养中性蛋白酶生产和/或碱性蛋白酶生产有缺陷的重组芽孢杆菌宿主细胞，其中所述宿主细胞包含核酸构建体，其中所述核酸构建体包含编码目标化合物或者编码参与目标化合物合成的化合物的多核苷酸，所述多核苷酸与启动子序列可操作地连接从而允许多核苷酸在宿主细胞中表达，其中所述启动子包含噬菌体启动子序列，更优选地噬菌体SPO1启动子序列。可以使用本领域已知的方法在适合目标化合物生产的营养培养基中培养宿主细胞。例如，可以通过在合适培养基中并且在允许生产和/或分离目标化合物的条件下，在实验室或工业发酵罐中进行的摇瓶培养、小规模发酵或大规模发酵(包括连续发酵、分批发酵、补料分批发酵或固态发酵)培养细胞。培养在包含碳源和氮源和无机盐的合适营养培养基中，使用本领域已知的程序进行。合适培养基可从商业供应商处获得或者可以使用公开的组分制备(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)。如果目标化合物分泌到营养培养基中，则可以从培养基中直接分离该化合物。如果目标化合物不分泌，则可以从细胞裂解物分离。

在一种实施方式中，根据本发明的生产目标化合物的方法在步骤a)之前可包括：提供本文所定义的中性蛋白酶生产和/或碱性蛋白酶生产有缺陷的重组芽孢杆菌宿主细胞，其中所述宿主细胞包含核酸构建体，其中所述核酸构建体包含编码目标化合物或者编码参与目标化合物合成的化合物的多核苷酸，所述多核苷酸与启动子序列可操作地连接从而允许多核苷酸在宿主细胞中表达，其中所述启动子包含噬菌体启动子序列，更优选地噬菌体SPO1启动子序列。生产芽孢杆菌宿主细胞的方法可以是本文所述的那些。

根据本发明的生产目标化合物的方法的步骤b)可包括：从培养液中分离目标化合物。可通过本领域已知方法分离本文所述目标化合物。例如，可通过常规程序，包括但不限于离心、过滤、萃取、喷雾干燥、蒸发或沉淀，从营养培养基中分离目标化合物。然后，可通过本领域已知的多种程序进一步纯化分离的目标化合物，所述程序包括但不限于，色谱法(例如，离子交换、亲和、疏水、色谱聚焦和尺寸排阻)、电泳程序(例如，制备型等电聚焦)、差示溶解(例如，硫酸铵沉淀)或萃取(见例如，Protein Purification,J.-C.Janson和LarsRyden编辑，VCH Publishers,New York,1989)。在一些应用中，可使用目标化合物而无需从培养液中实质上分离；将培养基与生物质分开可以已足够。

在根据本发明的生产目标化合物的方法的优选实施方式中，如果与其中使用第二宿主细胞的方法相比，其中所述第二宿主细胞与宿主细胞的差异仅仅在于核酸构建体包含不同的启动子和/或芽孢杆菌宿主细胞在本文所定义的中性蛋白酶生产和/或碱性蛋白酶生产上无缺陷，其中两种方法在相同条件下进行，目标化合物的产率提高。

优选地，产率提高至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少100％、更优选地至少110％、至少120％、至少130％、至少140％、至少150％、至少160％、至少170％、至少180％、至少190％或至少200％,、甚至更优选地至少210％、至少220％、至少230％、至少240％、至少250％、至少260％、至少270％、至少280％、至少290％或至少300％。

在另一实施方式中，本发明提供中性蛋白酶生产和/或碱性蛋白酶生产有缺陷的重组芽孢杆菌宿主细胞在生产目标化合物的方法中的用途，所述宿主细胞包含核酸构建体，其中所述核酸构建体包含编码目标化合物或者编码参与目标化合物合成的化合物的多核苷酸，所述多核苷酸与启动子序列可操作地连接从而允许多核苷酸在宿主细胞中表达，其中所述启动子包含噬菌体启动子序列，更优选地噬菌体SPO1启动子序列。

本发明的实施方式

1.中性蛋白酶生产和/或碱性蛋白酶生产有缺陷的重组芽孢杆菌宿主细胞，所述宿主细胞包含核酸构建体，其中所述核酸构建体包含

2.根据实施方式1的宿主细胞，其中所述噬菌体SPO1启动子序列包含根据SEQ IDNO:36的多核苷酸序列或者与SEQ ID NO:36的同一性为至少70％的多核苷酸序列。

3.根据实施方式1或2的宿主细胞，其中所述噬菌体SPO1启动子是根据SEQ ID NO:1的多核苷酸序列或者与SEQ ID NO:1的同一性为至少70％的多核苷酸序列，优选地所述噬菌体SPO1启动子是PE4或PE5，更优选地根据SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的启动子。

4.根据实施方式1-3中任一种的宿主细胞，其中所述噬菌体SPO1启动子序列是表达模块的一部分，所述表达模块包含所述启动子、编码核糖体结合位点(RBS)的序列和任选的mRNA稳定化元件和/或经修饰的rib前导序列。

5.根据实施方式4的宿主细胞，其中所述表达模块包含所述噬菌体SPO1启动子、mRNA稳定化元件和/或经修饰的rib前导序列和编码RBS的序列，更优选地所述表达模块包含位于所述启动子下游和编码RBS的序列上游的mRNA稳定化元件和/或经修饰的rib前导序列。

6.根据实施方式5的宿主细胞，其中所述mRNA稳定化元件选自aprE、grpE、cotG、SP82、RSBgsiB、CryIIIA mRNA稳定化元件，优选地根据SEQ ID NO:48-54的mRNA稳定化元件，更优选地grpE mRNA稳定化元件，甚至更优选地根据SEQ ID NO:49的mRNA稳定化元件。

7.根据实施方式5或6的宿主细胞，其中所述经修饰的rib前导序列是包含ribO突变C85T的rib前导序列，甚至更优选地其是包含ribO突变C85T的根据SEQ ID NO:55的rib前导序列，甚至更优选地在含有SEQ ID NO:55的相应位置的ribO突变C85T和对应于SEQ IDNO:55的第166-263位核苷酸的核苷酸缺失的根据SEQ ID NO:55的rib前导序列。

8.根据实施方式4-7中任一种的宿主细胞，其中所述编码RBS的序列选自编码16SRBS的序列和编码ribD RBS的序列。

9.根据实施方式1-8中任一种的宿主细胞，其中所述表达模块具有选自SEQ IDNO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ IDNO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35的多核苷酸序列。

10.根据实施方式1-9中任一种的宿主细胞，其中所述中性蛋白酶是由npr基因编码的中性蛋白酶，优选地所述中性蛋白酶由根据SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:42的多核苷酸序列编码或者由与SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:42的同一性为至少70％的多核苷酸序列编码，优选地其中所述中性蛋白酶由根据SEQ ID NO:7的多核苷酸序列编码或者由与SEQ IDNO:7的同一性为至少70％的多核苷酸序列编码。

11.根据实施方式1-10中任一种的宿主细胞，其中所述中性蛋白酶具有根据SEQID NO:8或SEQ ID NO:43的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:43的同一性为至少70％的氨基酸序列，优选地其中所述中性蛋白酶具有根据SEQ ID NO:8的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:8的同一性为至少70％的氨基酸序列。

12.根据实施方式1-11中任一种的宿主细胞，其中所述碱性蛋白酶是由apr基因编码的碱性蛋白酶，优选地所述碱性蛋白酶由根据SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:44或SEQ ID NO:46的多核苷酸序列编码或者由与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:44或SEQ ID NO:46的同一性为至少70％的多核苷酸序列编码，优选地其中所述碱性蛋白酶由根据SEQ ID NO:5的多核苷酸序列编码或者由与SEQ ID NO:5的同一性为至少70％的多核苷酸序列编码。

13.根据实施方式1-12中任一种的宿主细胞，其中所述碱性蛋白酶具有根据SEQID NO:6、SEQ ID NO:45或SEQ ID NO:47的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:45或SEQ ID NO:47的同一性为至少70％的氨基酸序列，优选地其中所述碱性蛋白酶具有根据SEQ ID NO:6的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:6的同一性为至少70％的氨基酸序列。

14.根据实施方式1-13中任一种的宿主细胞，其属于选自B.agaradherens、B.alkalophilus、B.amyloliquefaciens、B.anthracis、B.atrophaeus、B.brevis、B.cereus、B.circulans、B.clausii、B.coagulans、B.firmus、B.halodurans、B.lautus、B.lentus、B.licheniformis、B.megaterium、B.mojavensis、B.pumilus、B.puntis、B.sphaericus、B.stearothermophilus、B.subtilis、B.thuringiensis、B.vallismortis的种，更优选地其属于B.subtilis或B.amyloliquefaciens，最优选地所述宿主细胞是B.subtilis宿主细胞。

15.根据实施方式1-14中任一种的宿主细胞，其不生产孢子，优选地孢子形成相关基因有缺陷，优选地选自spo0A、spoIISA、spoIIAC、sigE、sigF、spoIISB、spoIIE、sigG、spoIVCB、spoIIIC、spoIIGA、spoIIAA、spoIVFB、spoIIR、spoIII的基因有缺陷，优选地spoIIE有缺陷或者spoIIAC基因有缺陷的宿主细胞。

16.根据实施方式1-15中任一种的宿主细胞，其还在中性α-淀粉酶生产上有缺陷，优选地在由amyE基因编码的中性α-淀粉酶生产上有缺陷的宿主细胞，甚至更优选地在由根据SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:56或SEQ ID NO:58的多核苷酸或者与SEQ ID NO:19、SEQ IDNO:56或SEQ ID NO:58的同一性为至少70％的多核苷酸编码的中性α-淀粉酶，更优选地由根据SEQ ID NO:19的多核苷酸或者与SEQ ID NO:19的同一性为至少70％的多核苷酸编码的中性α-淀粉酶上有缺陷的宿主细胞。

17.根据实施方式1-16中任一种的宿主细胞，其还在α-淀粉酶生产上有缺陷，所述α-淀粉酶具有根据SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:57或SEQ ID NO:59的氨基酸序列或者与SEQID NO:20、SEQ ID NO:57或SEQ ID NO:59的同一性为至少70％的氨基酸序列，甚至更优选地所述α-淀粉酶具有根据SEQ ID NO:20的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:20的同一性为至少70％的氨基酸序列。

18.根据实施方式1-17中任一种的宿主细胞，其中所述核酸构建体被整合到所述宿主细胞基因组中，优选地其被整合到选自nprE基因座、amyE基因座或aprE基因座的基因座，更优选地amyE基因座。

19.根据实施方式1-18中任一种的宿主细胞，其包含多于一个拷贝的所述核酸构建体，更优选地其包含多于一个拷贝的整合到所述宿主细胞基因组中的所述核酸构建体。

20.根据实施方式1-19中任一种的宿主细胞，其中所述目标化合物是选自核酸、多胺、多元醇、多肽(或聚酰胺)或多糖的生物聚合物，优选地所述多肽可以是酶。

21.根据实施方式1-20中任一种的宿主细胞，其中一个或更多个核酸构建体包括位于两个lox位点之间、优选地位于lox66和lox 71位点之间的选择标记。

22.根据实施方式1-21中任一种的宿主细胞，其是不含标记的宿主细胞，优选地基因组中包含一个或更多个单lox位点的不含标记的宿主细胞，更优选地基因组中包含一个或更多个lox72位点的不含标记的宿主细胞。

23.根据实施方式1-22中任一种的宿主细胞，其是中性蛋白酶生产和碱性蛋白酶生产有缺陷的Bacillus subtilis宿主细胞，优选地其中所述中性蛋白酶具有根据SEQ IDNO:8的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:8的同一性为至少70％的氨基酸序列，且其中所述碱性蛋白酶具有根据SEQ ID NO:6的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:6的同一性为至少70％的氨基酸序列。

24.根据实施方式23的宿主细胞，其中所述Bacillus subtilis宿主细胞还在中性淀粉酶生产上有缺陷，优选地其中所述中性淀粉酶具有根据SEQ ID NO:20的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:20的同一性为至少70％的氨基酸序列。

25.根据实施方式1-22中任一种的宿主细胞，其是中性蛋白酶生产和碱性蛋白酶生产有缺陷的Bacillus amyloliquefaciens宿主细胞，优选地其中所述中性蛋白酶具有根据SEQ ID NO:43的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:43的同一性为至少70％的氨基酸序列，且其中所述碱性蛋白酶具有根据SEQ ID NO:45的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:45的同一性为至少70％的氨基酸序列。

26.根据实施方式25的宿主细胞，其中所述Bacillus amyloliquefaciens宿主细胞还在中性淀粉酶生产上有缺陷，优选地其中所述中性淀粉酶具有根据SEQ ID NO:57的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:57的同一性为至少70％的氨基酸序列。

27.根据实施方式1-22中任一种的宿主细胞，其是碱性蛋白酶生产有缺陷的Bacillus licheniformis宿主细胞，优选地其中所述碱性蛋白酶具有根据SEQ ID NO:47的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:47的同一性为至少70％的氨基酸序列。

28.根据实施方式27的宿主细胞，其中所述Bacillus licheniformis宿主细胞还在中性淀粉酶生产上有缺陷，优选地其中所述中性淀粉酶具有根据SEQ ID NO:59的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:59的同一性为至少70％的氨基酸序列。

29.生产根据实施方式1-28中任一种的重组芽孢杆菌宿主细胞的方法，所述方法包括：

b.利用核酸构建体转化所述芽孢杆菌宿主细胞，所述核酸构建体包含编码目标化合物或者编码参与目标化合物合成的化合物的多核苷酸，所述多核苷酸与启动子序列可操作地连接从而允许所述多核苷酸在所述宿主细胞中表达，其中所述启动子包含噬菌体启动子序列，更优选地噬菌体SPO1启动子序列。

30.根据实施方式29的方法，其中步骤a.中的所述芽孢杆菌宿主细胞在中性蛋白酶生产和/或碱性蛋白酶生产上，并且在孢子形成相关基因上有缺陷。

31.根据实施方式29的方法，其中步骤a.中的所述芽孢杆菌宿主细胞在中性蛋白酶生产和/或碱性蛋白酶生产上，并且在中性α-淀粉酶生产上有缺陷。

32.根据实施方式29的方法，其中步骤a.中的所述芽孢杆菌宿主细胞在中性蛋白酶生产和/或碱性蛋白酶生产上，并且在中性α-淀粉酶生产上和孢子形成相关基因上有缺陷。

33.根据实施方式29的方法，其中步骤a.中的所述芽孢杆菌宿主细胞在中性蛋白酶生产和碱性蛋白酶生产上，并且在中性α-淀粉酶生产上和孢子形成相关基因上有缺陷。

34.根据实施方式29-33中任一种的方法，其中通过用下列方法中的一种修饰亲本宿主细胞的基因组来进行步骤a.：a)使基因部分或完全缺失；b)用多核苷酸序列部分或完全替代基因；c)通过在基因的多核苷酸序列中插入一个或多个核苷酸来破坏所述基因；d)将基因放置在宿主细胞基因组中受诱导型启动子控制并在抑制基因转录成mRNA的条件下培养宿主细胞，其中所述基因是编码中性蛋白酶的基因和/或编码碱性蛋白酶的基因、任选地编码中性α-淀粉酶的基因、任选地孢子形成相关基因，其中所述宿主细胞i)不生产由所述基因编码的产物或者ii)生产无(酶或生物)活性的产物或者i)和ii)的组合。

35.根据实施方式29-34中任一种的方法，其中所述噬菌体SPO1启动子序列包含根据SEQ ID NO:36的多核苷酸序列或者与SEQ ID NO:36的同一性为至少70％的多核苷酸序列。

36.根据实施方式29-35中任一种的方法，其中所述噬菌体SPO1启动子是根据SEQID NO:1的多核苷酸序列或者与SEQ ID NO:1的同一性为至少70％的多核苷酸序列，优选地所述噬菌体SPO1启动子是PE4或PE5，更优选地根据SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的启动子。

37.根据实施方式29-36中任一种的方法，其中所述启动子序列是表达模块的一部分，所述表达模块包含所述启动子、编码RBS的序列和任选的mRNA稳定化元件和/或经修饰的rib前导序列。

38.根据实施方式37的方法，其中所述表达模块包含所述启动子、mRNA稳定化元件和/或经修饰的rib前导序列和编码RBS的序列，更优选地所述表达模块包含位于所述启动子下游和编码RBS的序列上游的mRNA稳定化元件和/或经修饰的rib前导序列。

39.根据实施方式38的方法，其中所述mRNA稳定化元件选自aprE、grpE、cotG、SP82、RSBgsiB、CryIIIA mRNA稳定化元件，优选地根据SEQ ID NO:48-54的mRNA稳定化元件，更优选地grpE mRNA稳定化元件，甚至更优选地根据SEQ ID NO:49的mRNA稳定化元件。

40.根据实施方式38或39的方法，其中所述经修饰的rib前导序列是包含ribO突变C85T的rib前导序列，甚至更优选地其是包含ribO突变C85T的根据SEQ ID NO:55的rib前导序列，甚至更优选地含有在SEQ ID NO:55的相应位置的ribO突变C85T和对应于SEQ ID NO:55的第166-263位核苷酸的核苷酸缺失的根据SEQ ID NO:55的rib前导序列。

41.根据实施方式38-40中任一种所述的方法，其中所述编码RBS的序列选自编码16S RBS的序列和编码ribD RBS的序列。

42.根据实施方式29-41中任一种的方法，其中所述表达模块具有选自SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ IDNO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35的多核苷酸序列。

43.根据实施方式29-42中任一种的方法，其中所述中性蛋白酶是由npr基因编码的中性蛋白酶，优选地所述中性蛋白酶由根据SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:42的多核苷酸序列编码或者由与SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:42的同一性为至少70％的多核苷酸序列编码，优选地其中所述中性蛋白酶由根据SEQ ID NO:7的多核苷酸序列编码或者由与SEQ ID NO:7的同一性为至少70％的多核苷酸序列编码。

44.根据实施方式29-43中任一种的方法，其中所述中性蛋白酶具有根据SEQ IDNO:8或SEQ ID NO:43的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:43的同一性为至少70％的氨基酸序列，优选地其中所述中性蛋白酶具有根据SEQ ID NO:8的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:8的同一性为至少70％的氨基酸序列。

45.根据实施方式29-44中任一种的方法，其中所述碱性蛋白酶是由apr基因编码的碱性蛋白酶，优选地所述碱性蛋白酶由根据SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:44或SEQ ID NO:46的多核苷酸序列编码或者由与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:44或SEQ ID NO:46的同一性为至少70％的多核苷酸序列编码，优选地其中所述碱性蛋白酶由根据SEQ ID NO:5的多核苷酸序列编码或者由与SEQ ID NO:5的同一性为至少70％的多核苷酸序列编码。

46.根据实施方式29-45中任一种的方法，其中所述碱性蛋白酶具有根据SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:45或SEQ ID NO:47的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:45或SEQ ID NO:47的同一性为至少70％的氨基酸序列，优选地其中所述碱性蛋白酶具有根据SEQ ID NO:6的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:6的同一性为至少70％的氨基酸序列。

47.根据实施方式29-46中任一种的方法，其中所述宿主细胞属于选自B.agaradherens、B.alkalophilus、B.amyloliquefaciens、B.anthracis、B.atrophaeus、B.brevis、B.cereus、B.circulans、B.clausii、B.coagulans、B.firmus、B.halodurans、B.lautus、B.lentus、B.licheniformis、B.megaterium、B.mojavensis、B.pumilus、B.puntis、B.sphaericus、B.stearothermophilus、B.subtilis、B.thuringiensis、B.vallismortis的种，更优选地其属于B.subtilis或B.amyloliquefaciens，最优选地所述宿主细胞是B.subtilis宿主细胞。

48.根据实施方式29-47中任一种的方法，其中所述孢子形成相关基因是选自spo0A、spoIISA、spoIIAC、sigE、sigF、spoIISB、spoIIE、sigG、spoIVCB、spoIIIC、spoIIGA、spoIIAA、spoIVFB、spoIIR、spoIII的基因，更优选地spoIIE或者spoIIAC有缺陷。

49.根据实施方式29-48中任一种的方法，其中所述中性α-淀粉酶由amyE基因编码，甚至更优选地所述中性α-淀粉酶由根据SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:56或SEQ ID NO:58的多核苷酸序列或者与SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:56或SEQ ID NO:58的同一性为至少70％的多核苷酸序列编码，更优选地由根据SEQ ID NO:19的多核苷酸序列或者与SEQ ID NO:19的同一性为至少70％的多核苷酸序列编码的中性α-淀粉酶。

50.根据实施方式29-49中任一种的方法，其中所述α-淀粉酶具有根据SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:57或SEQ ID NO:59的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:57或SEQID NO:59的同一性为至少70％的氨基酸序列，甚至更优选地具有根据SEQ ID NO:20的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:20的同一性为至少70％的氨基酸序列的α-淀粉酶。

51.根据实施方式29-50中任一种的方法，其中在步骤b.中，所述核酸构建体被整合到所述宿主细胞基因组中，优选地其被整合到选自nprE基因座、amyE基因座或aprE基因座的基因座，更优选地amyE基因座。

52.根据实施方式29-51中任一种的方法，其中在步骤b.中，用多于一个拷贝的所述核酸构建体转化所述芽孢杆菌宿主细胞，更优选地多于一个拷贝的所述核酸构建体被整合到所述宿主细胞基因组中。

53.根据实施方式29-52中任一种的方法，其中所述目标化合物是选自核酸、多胺、多元醇、多肽(或聚酰胺)或多糖的生物聚合物，优选地所述多肽可以是酶。

54.根据实施方式29-53中任一种的方法，其中在步骤b.中，一个或更多个核酸构建体包含位于两个lox位点之间、优选地位于lox66和lox 71位点之间的选择标记。

55.根据实施方式54的方法，其中所述方法还包括以下步骤：

c.使用所述选择标记选择已经用一个或更多个核酸构建体转化的所述芽孢杆菌宿主细胞；和任选地

d.通过Cre重组酶介导的lox位点、优选地lox66和lox 71位点的重组移除所述选择标记以在所述芽孢杆菌宿主细胞基因组中产生lox72位点。

56.根据实施方式29-55中任一种的方法，其中步骤a.中的所述芽孢杆菌宿主细胞是中性蛋白酶生产和碱性蛋白酶生产有缺陷的Bacillus subtilis宿主细胞，优选地其中所述中性蛋白酶具有根据SEQ ID NO:8的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:8的同一性为至少70％的氨基酸序列，且其中所述碱性蛋白酶具有根据SEQ ID NO:6的氨基酸序列或者与SEQID NO:6的同一性为至少70％的氨基酸序列。

57.根据实施方式56的方法，其中步骤a.中的所述Bacillus subtilis宿主细胞还在中性淀粉酶生产上有缺陷，优选地其中所述中性淀粉酶具有根据SEQ ID NO:20的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:20的同一性为至少70％的氨基酸序列。

58.根据实施方式29-55中任一种的方法，其中步骤a.中的所述芽孢杆菌宿主细胞是中性蛋白酶生产和碱性蛋白酶生产有缺陷的Bacillus amyloliquefaciens宿主细胞，优选地其中所述中性蛋白酶具有根据SEQ ID NO:43的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:43的同一性为至少70％的氨基酸序列，且其中所述碱性蛋白酶具有根据SEQ ID NO:45的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:45的同一性为至少70％的氨基酸序列。

59.根据实施方式58的方法，其中步骤a.中的所述Bacillus amyloliquefaciens宿主细胞还在中性淀粉酶生产上有缺陷，优选地其中所述中性淀粉酶具有根据SEQ ID NO:57的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:57的同一性为至少70％的氨基酸序列。

60.根据实施方式29-55中任一种的方法，其中步骤a.中的所述芽孢杆菌宿主细胞是碱性蛋白酶生产有缺陷的Bacillus licheniformis宿主细胞，优选地其中所述碱性蛋白酶具有根据SEQ ID NO:47的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:47的同一性为至少70％的氨基酸序列。

61.根据实施方式60的方法，其中步骤a.中的所述Bacillus licheniformis宿主细胞还在中性淀粉酶生产上有缺陷，优选地其中所述中性淀粉酶具有根据SEQ ID NO:59的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:59的同一性为至少70％的氨基酸序列。

62.生产目标化合物的方法，所述方法包括：

a)在有益于生产所述目标化合物的条件下，培养根据实施方式1-28中任一种所述的重组芽孢杆菌宿主细胞或者根据实施方式29-61中任一种所述的用于生产重组芽孢杆菌宿主细胞的方法所生产的重组芽孢杆菌宿主细胞，和

b)任选地，从培养液中分离所述目标化合物。

63.根据实施方式1-28中任一种的重组芽孢杆菌宿主细胞或者根据实施方式29-61中任一种的方法所生产的重组芽孢杆菌宿主细胞在生产目标化合物中的用途。

64.实施方式62的方法或者实施方式63的用途，其中所述目标化合物是选自核酸、多胺、多元醇、多肽(或聚酰胺)或多糖的生物聚合物，优选地所述多肽可以是酶。

通过以下实施例进一步阐释本发明，但不应将其理解为限制本发明范围。

实施例

应该理解：当指出本发明的优选实施方式时，这些实施例仅以阐释方式给出。由以上讨论和这些实施例，本领域技术人员能够确定本发明的基本特征，且在不脱离其精神和范围的条件下，能够对本发明进行各种改变和修饰以使其适应各种用途和条件。因此，从前面的描述中，除了本发明展示和描述的那些之外的各种改变对本领域技术人员而言是明显的。这类改变也旨在落入所附权利要求的范围内。

材料和方法

菌株构建

Bacillus subtilis菌株BS154(于2013年10月9日作为CBS136327保藏在荷兰真菌培养物保藏中心(真菌生物多样性中心),乌普萨兰8号,3584CT乌特勒支,荷兰)(ΔaprE,ΔnprE,amyE^-,spo^-)描述在Quax和Broekhuizen 1994Appl.Microbiol.Biotechnol.41:425-431。E.coli/B.subtilis穿梭载体pBHA12描述在WO2008/000632。

Bacillus subtilus 168(ATCC 23857)(trpC2)描述在Anagnostopoulos C.和Spizizen J.(1961)J.Bacteriol.(1961)81(5):741-746。

Bacillus stearothermophilus(其被重命名为Geobacillusstearothermophilus)C599(NCIMB11873)描述在WO91/04669。

Bacillus subtilis菌株1A40或BR151(ATCC 33677)(TrpC2、lys3和metB10)描述在Young F.E.,Smith C.,Reilly B.E.(1969)J.Bacteriol.98:1087-1097。

B.subtilis噬菌体SPO1的启动子PE4(本文中称为P15启动子)和PE5描述在Lee等人,1980,Mol.Gen.Genet.180:57-65和Stewart C.R.等人(1998)Virology.246(2):329-340。P15启动子的多核苷酸序列展示在SEQ ID NO:1且PE5启动子的多核苷酸序列展示在SEQ ID NO:2。

分子生物学技术

使用的分子生物学技术是本领域技术人员已知的并描述在Sambrook&Russell,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第3版,CSHL Press,Cold Spring Harbor,NY,2001)。如Anagnostopolous,C.和J.Spizizen(1961,Requirements for transformationin Bacillus subtilis.J.Bacteriol.81:741-746)所述进行B.subtilis转化。在热循环仪上利用Phusion高保真DNA聚合酶(Finnzymes OY,Aspoo,Finland)根据制造商说明进行聚合酶链式反应(PCR)。葡聚糖1,4-α-麦芽糖水解酶的生产力

通过测量B.subtilis培养液中葡聚糖1,4-α-麦芽糖水解酶的活性来测定葡聚糖1,4-α-麦芽糖水解酶的生产力。这是使用Megazyme CERALPHAα淀粉酶检测试剂盒(Megazyme International Ireland Ltd.,Co.Wicklow,爱尔兰)根据制造商说明进行的。

木聚糖酶的活性

通过测量B.subtilis培养液中木聚糖酶的活性来测定木聚糖酶的生产力。这是通过

Ultra木聚糖酶检测试剂盒E33650(Invitrogen,Ltd.Paisley,英国)量化的，根据供应商说明使用该试剂盒。

实施例1

构建pDBC4XAS-1(内切-1,4-β-木聚糖酶(xynA)表达质粒)

编码内切-1,4-β-木聚糖酶蛋白的xynA基因的DNA序列从EMBL核苷酸序列数据库(http://www.ebi.ac.uk/embl/iNdex.html)检索号CDS:CAB13776(SEQ ID NO:41)检索到。为了表达来自Bacillus subtilis 168(芽孢杆菌遗传保藏中心)的内切-1,4-β-木聚糖酶，利用根据SEQ ID NO:2和3的引物通过PCR(聚合酶链式反应)扩增来自B.subtilis 168基因组的xynA基因。这些引物引入了xynA基因5’的AleI和PacI位点和xynA基因3’的HindIII位点。

xynA基因5’-侧翼区的正向引物序列(包括AleI和PacI位点)(SEQ ID NO:3)：

5’-CCAACACATTTGTGTTAATTAAAAAAGGAGCGATTTACATATGTTTAAGTTTAAAAAGAATTTC-3’。

xynA基因3’区的反向引物序列(包括HindIII位点)(SEQ ID NO:4)：

5’-TAAATATAAAAGCTTCTCCAGCAATTCCAAGGCCGTTC-3’。

利用限制酶AleI和HindIII消化产生的PCR片段，然后利用T4DNA连接酶将其连接到经AleI和HindIII消化的pNAPHB27质粒上(Quax和Broekhuizen 1994Appl.Microbiol.Biotechnol.41:425-431)。将连接混合物转化到B.subtilis菌株BS154中。选择克隆并将xynA表达质粒命名为pDBC4XAS-1(图1)。通过DNA测序验证质粒的序列。

实施例2

在B.subtilis中表达用于内切-1,4-β-木聚糖酶的经修饰表达构建体

将木聚糖酶表达载体pDBC4XAS-1转化到B.subtilis菌株1A40(TrpC2、lys3和metB10)中，这导致菌株BS1A40XAS-1，并将相同质粒转化到菌株BS154(ΔaprE和ΔnprE)中，这导致菌株BS154XAS-1。基因aprE(SEQ ID NO:5)的多核苷酸序列编码Bacillussubtilis中的细胞外碱性蛋白酶AprE(SEQ ID NO:6)。基因nprE(SEQ ID NO:7)的多核苷酸序列编码Bacillus subtilis中的细胞外中性蛋白酶NprE(SEQ ID NO:8)。

使这两种菌株在摇瓶发酵实验中生长。这些摇瓶含有20ml SMM培养基。SMM预培养基含有1.25％(w/w)酵母提取物、00.5％(w/w)CaCl₂、0.075％(w/w)MgCl₂.6H₂O、15μg/lMnSO₄.4H₂O、10μg/l CoCl₂.6H₂O、0.05％(w/w)柠檬酸、0.025％(w/w)消泡剂86/013(Basildon Chemicals,Abingdon,英国)。为了完成SMM培养基，将20ml 5％(w/v)麦芽糖和20ml 200mM磷酸钠缓冲储液(pH 6.8)(二者分别制备和灭菌)加入60ml SMM预培养基中。在37℃、550rpm和80％湿度下在Microto恒温振荡培养箱(Infors AG,Bottmingen,瑞士)中孵育这些培养物48小时。24小时、48小时和72小时后对培养物进行取样并通过

Ultra木聚糖酶检测试剂盒E33650(Invitrogen,Ltd.Paisley,英国)对上清液中的木聚糖酶生产进行量化。随时间跟踪这两种生产菌株的木聚糖酶生产并描述在图2中。

显然，包含nprE和aprE缺失的菌株BS154XAS-1比包含两个完整拷贝的编码细胞外蛋白酶AprE和NprE的基因的菌株BS1A40XAS-1生产更多木聚糖酶。生产水平的差异随时间增加且可在72小时后观察到最大差异。该实施例清楚显示了：用于表达有用化合物例如酶的芽孢杆菌菌株中编码主要细胞外蛋白酶AprE和NprE的基因的失活或缺失导致通过所述菌株的所述产物生产增加。

实施例3.构建pDBC1

多用途整合表达载体pDBC1被设计为利用II型S限制酶(type two S restrictionenzyme)克隆以组合启动子和目标基因。II型S限制酶的一个例子是BsmBI。通过用合成DNA片段(SEQ ID NO:9)替代壮观霉素标记和lacZ基因来修饰WO2008/148575中描述的amyE整合载体pBest4。

5’-GACGCGGTCATCAATCATACCACCAGTGATTATGCCGCGATTTCCAATGAGGTTAAGAGTATTCCAAACTGGACACATGGAAACACACAAATTAAAAACTGGTCTGATCGATGGGATGTCACGCAGAATTCATTGCTCGGGCTGTATGACTGGAATACACAAAATACACAAGTACAGTCCTATCTGAAACGGTTCTTAGACAGGGCATTGAATGACGGGGCAGACGGTTTTCGATTTGATGCCGCCAAACATATAGAGCTTCCAGATGATGGCAGTTACGGCAGTCAATTTTGGCCGAATATCACAAATACATCTGCAGAGTTCCAATACGGAGAAATCGCGGCCGCGGAGACGCGCTCCTGTGACGGAAGATCACTTCGCAGAATAAATAAATCCTGGTGTCCCTGTTGATACCGGGAAGCCCTGGGCCAACTTTTGGCGAAAATGAGACGTTGATCGGCACGTAAGAGGTTCCAACTTTCACCATAATGAAATAAGATCACTACCGGGCGTATTTTTTGAGTTATCGAGATTTTCAGGAGCTAAGGAAGCTAAAATGGAGAAAAAAATCACTGGATATACCACCGTTGATATATCCCAATGGCATCGTAAAGAACATTTTGAGGCATTTCAGTCAGTTGCTCAATGTACCTATAACCAGACCGTTCAGCTGGATATTACGGCCTTTTTAAAGACCGTAAAGAAAAATAAGCACAAGTTTTATCCGGCCTTTATTCACATTCTTGCCCGCCTGATGAATGCTCATCCGGAATTCCGTATGGCAATGAAAGACGGTGAGCTGGTGATATGGGATAGTGTTCACCCTTGTTACACCGTTTTCCATGAGCAAACTGAAACGTTTTCATCGCTCTGGAGTGAATACCACGACGATTTCCGGCAGTTTCTACACATATATTCGCAAGATGTGGCGTGTTACGGTGAAAACCTGGCCTATTTCCCTAAAGGGTTTATTGAGAATATGTTTTTCGTCTCAGCCAATCCCTGGGTGAGTTTCACCAGTTTTGATTTAAACGTGGCCAATATGGACAACTTCTTCGCCCCCGTTTTCACCATGGGCAAATATTATACGCAAGGCGACAAGGTGCTGATGCCGCTGGCGATTCAGGTTCATCATGCCGTTTGTGATGGCTTCCATGTCGGCAGAATGCTTAATGAATTACAACAGTACTGCGATGAGTGGCAGGGCGGGGCGTAAAGCGCGTCTCCATAAGTTTAAACAAATCTTTTTCGAAAAAAGGCCGCCCCGTTAAGAGGCGGCCTTATTCAAATTTCAGGATATGCACTTGCTTGCAAGCTTTACCGTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATTATTTTTAAAACAATGAATAGGTTTACACTTACTTTAGTTTTATGGAAATGAAAGATCATATCATATATAATCTAGAATAAAATTAACTAAAATAATTATTATCTAGATAAAAAATTTAGAAGCCAATGAAATCTATAAATAAACTAAATTAAGTTTATTTAATTAACAACTATGGATATAAAATAGGTACTAATCAAAATAGTGAGGAGGATATATTTGAATACATACGAACAAATTAATAAAGTGAAAAAAATACTTCGGAAACATTTAAAAAATAACCTTATTGGTACTTACATGTTTGGATCAGGAGTTGAGAGTGGACTAAAACCAAATAGTGATCTTGACTTTTTAGTCGTCGTATCTGAACCATTGACAGATCAAAGTAAAGAAATACTTATACAAAAAATTAGACCTATTTCAAAAAAAATAGGAGATAAAAGCAACTTACGATATATTGAATTAACAATTATTATTCAGCAAGAAATGGTACCGTGGAATCATCCTCCCAAACAAGAATTTATTTATGGAGAATGGTTACAAGAGCTTTATGAACAAGGATACATTCCTCAGAAGGAATTAAATTCAGATTTAACCATAATGCTTTACCAAGCAAAACGAAAAAATAAAAGAATATACGGAAATTATGACTTAGAGGAATTACTACCTGATATTCCATTTTCTGATGTGAGAAGAGCCATTATGGATTCGTCAGAGGAATTAATAGATAATTATCAGGATGATGAAACCAACTCTATATTAACTTTATGCCGTATGATTTTAACTATGGACACGGGTAAAATCATACCAAAAGATATTGCGGGAAATGCAGTGGCTGAATCTTCTCCATTAGAACATAGGGAGAGAATTTTGTTAGCAGTTCGTAGTTATCTTGGAGAGAATATTGAATGGACTAATGAAAATGTAAATTTAACTATAAACTATTTAAATAACAGATTAAAAAAATTATAAAAAAATTGAAAAAATGGTGGAAACACTTTTTTCAATTTTTTTGTTTTATTATTTAATATTTGGGAAATATTCATTATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAACGGTACCTGCAGGATCCGTTTAGGCTGGGCGGTGATAGCTTCTCGTTCAGGCAGTACGCCTCTTTTCTTTTCCAGACCTGAGGGAGGCGGAAATGGTGTGAGGTTCCCGGGGAAAAGCCAAATAGGCGATCGC-3’(SEQ ID NO:9)

利用TthIIII和AsisI消化载体pBest4并插入含有TthIIII位点、340 bp的5’-amyE、BsmBI位点、氯霉素选择标记、amyM终止子、BsmBI位点、lox 66位点、壮观霉素选择标记、lox71位点、120bp的3’-amyE和AsisI位点的合成DNA片段(SEQ ID NO:9)，这导致载体pDBC1(图3)。

实施例4.构建木聚糖酶表达菌株

II型S限制酶克隆被用于在载体pDBC1中组装木聚糖酶表达模块。根据制造商说明使用StarGate 2型S限制酶克隆系统(IBA,GmbH,

德国)。利用以下引物通过PCR扩增来自B.subtilis 168的xynA基因：正向引物，其用于扩增来自B.subtilis 168的xynA基因和引入BsmBI位点：5’-CCAGAGCTCAGCGCGTCTCCTATGTTTAAGTTTAAAAAG-3’(SEQ ID NO:10)

反向引物，其用于扩增来自B.subtilis 168的xynA基因和引入BsmBI位点：5’-CTCCAGGTACCAGCGCGTCTCCTTATTACCACACTGTTACGTTAGAAC-3’(SEQ ID NO:11)。

将两个BsmBI位点添加到两种核酸的5’末端以允许PCR产物克隆到pDBC1。含有xynA基因和两个BsmBI位点的0.7kb DNA片段的这种PCR产物被命名为构建体XAS-1。

经修饰的表达模块G00(SEQ ID NO:12)含有B.amyloliquefaciens amyQ启动子，如出现在质粒pDBC4XAS-1上的mobU核糖体结合位点序列,包括在ATG起点的NdeI位点以及在5’末端和3’末端的两个BsmBI位点

5’-AGCGCGTCTCCCCGCCCAGACTGTCCGCTGTGTAAAAATAAGGAATAAAGGGGGGTTGTTATTATTTTACTGATATGTAAAATATAATTTGTATAAGAAAATGAGAGGGAGAGGAAATTAATTAAAAAAGGAGCGATTTAC ATATGGGAGACGCGCT-3’(SEQ ID NO:12)。

G01(SEQ ID NO:13)表达模块P_Spo15_RK41_SWITCH缺失含有P15启动子、如EP2186880中所述的经修饰的RNA前导序列(SEQ ID NO:70中的第31-251位核苷酸)和核糖体结合位点,G02(SEQ ID NO:15)表达模块P_15ΩgrpE含有P15启动子，如WO2008148575中所述的mRNA稳定化元件和核糖体结合位点

5’-TAAAAATTTTACAAAAAGGTATTGACTTTCCCTACAGGGTGTGTAATAATTTAATTATAAGGACAAATGAATAAAGATTGTATCCTTCGGGGCAGGGTGGAAATCCCGACCGGCGGTAGTAAAGCACATTTGCTTTAGAGTCCGTGACCCGTGTGCATAAGCACGCGGTGGATTCAGTTTAAGCTGAAGCCGACAGTGAAAGTCTGGATGGGAGAAGGATGGACGGTAAATAACAAAAGAAAGGAGGTGATCAT-3’((SEQ ID NO:13)

5’-TAAAAATTTTACAAAAAGGTATTGACTTTCCCTACAGGGTGTGTAATAATTTAATTATAAGGACAAATGAATAAAGATTGATTTTATCGAAGGGCAGCACCTGTCCTTCTCCTTACACTTTGAGGGAGGTGAACACAGACGGTAAATAACAAAAGAGGGGAGGGAAACAT-3’(SEQ ID NO:15)。

G01和G02表达模块分别通过包括在ATG起点的NdeI位点和在5’末端及3’末端的两个BsmBI位点来进行修饰以分别产生SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:16。表达模块G00、G01和G02通过合成产生。

5’-AGCGCGTCTCCCCGCTAAAAATTTTACAAAAAGGTATTGACTTTCCCTACAGGGTGTGTAATAAT TTAATTATAAGGACAAATGAATAAAGATTGTATCCTTCGGGGCAGGGTGGAAATCCCGACCGGCGGTAGTAAAGCACATTTGCTTTAGAGTCCGTGACCCGTGTGCATAAGCACGCGGTGGATTCAGTTTAAGCTGAAGCCGACAGTGAAAGTCTGGATGGGAGAAGGATGGACGGTAAATAACAAAAGAAAGGAGGTGATCATATGGGAGACGCGCT-3’(SEQ IDNO:14)

5’-AGCGCGTCTCCCCGCTAAAAATTTTACAAAAAGGTATTGACTTTCCCTACAGGGTGTGTAATAATTTAATTATAAGGACAAATGAATAAAGATTGATTTTATCGAAGGGCAGCACCTGTCCTTCTCCTTACACTTTGAGGGAGGTGAACACAGACGGTAAATAACAAAAGAGGGGAGGGAAACATATGGGAGACGCGCT-3’(SEQ ID NO:16)。

根据制造商说明使用StarGate 2型S限制酶克隆系统(IBA,GmbH,

德国)以组装两个整合载体。由载体pDBC1、G00表达模块和XAS-1模块组装第一载体pDBC1G00XAS-1。由载体pDBC1、G01表达模块和XAS-1模块组装第二载体pDBC1G01XAS-1。由载体pDBC1、G02表达模块和XAS-1模块组装第三载体pDBC1G02XAS-1。图4中描述了pDBC1G01XAS-1载体的示意图作为例子。最终载体pDBC1G00XAS-1、pDBC1G01XAS-1和pDBC1G02XAS-1仅在位于出现在XAS-1模块上的木聚糖酶基因xynA的5’的启动子模块有差异。

将这些载体转化到B.subtilis菌株BS154(ΔaprE和ΔnprE)中，从而导致表1中所列的菌株BS154G00XAS-1、BS154G01XAS-1、BS154G02XAS-1。在含壮观霉素(100μg/ml)的琼脂平板上选择转化株。pDBC1上的amyE区域使构建体靶向amyE基因座。双交叉转化株仅对壮观霉素有抗性，而不期望的单交叉转化株还对红霉素有抗性。还使用下列引物组合通过PCR检验克隆：

用于在amyE基因座扩增的正向引物：

5’-GGGAAGCGTTCACAGTTTCG-3’(SEQ ID NO:17)

xynA上的反向引物：

5’-GGTTGCCGAAAACAAGCTAA-3’(SEQ ID NO:18)。

正确的克隆产生1.3kb的片段。

amyE基因(SEQ ID NO:19)的多核苷酸序列编码Bacillus subtilis中的中性淀粉酶(SEQ ID NO:20)。

表1.

实施例5.在B.subtilis中表达内切-1,4-β-木聚糖酶

使表达内切-1,4-β-木聚糖酶的B.subtilis菌株BS154G00XAS-1、BS154G01XAS-1和BS154G02XAS-1(表1)在24深孔板(Axygen,Union City,美国)中生长。在由1.6％(w/w)Bacto胰蛋白胨、1％(w/w)酵母提取物和0.5％(w/w)NaCl组成的2xTY培养基中生产1ml预培养物。用Breathseal(Greiner bio-one,Frickenhausen,德国)覆盖24深孔板。在37℃、550rpm和80％湿度下在Microto恒温振荡培养箱(Infors AG,Bottmingen,瑞士)中过夜生长之后，用1％(v/v)预培养物接种24深孔板(Axygen,Union City,美国)中的2ml SMM培养基。SMM预培养基含有1.25％(w/w)酵母提取物、00.5％(w/w)CaCl₂、0.075％(w/w)MgCl₂.6H₂O、15μg/l MnSO₄.4H₂O、10μg/l CoCl₂.6H₂O、0.05％(w/w)柠檬酸、0.025％(w/w)消泡剂86/013(Basildon Chemicals,Abingdon,英国)。为了完成SMM培养基，将20ml 5％(w/v)麦芽糖和20ml 200mM磷酸钠缓冲储液(pH 6.8)(二者分别制备和灭菌)加入60ml SMM预培养基中。在37℃、550rpm和80％湿度下在Microto恒温振荡培养箱(Infors AG,Bottmingen,瑞士)中孵育这些培养物48小时。

24小时和48小时后对培养物进行取样，通过以4000g离心30分钟将细胞与上清液分离，然后通过

Ultra木聚糖酶检测试剂盒E33650(Invitrogen,Ltd.Paisley,英国)分析上清液中的内切-1,4-β-木聚糖酶生产。

在图5中可以可出，如果与其中xynA基因在amyQ启动子之后的菌株BS154G00XAS-1比较，含有在包含P15启动子的表达模块G01和G02之后的xynA基因的两种菌株BS154G01XAS-1和BS154G02XAS-1表达较高水平的木聚糖酶。该结果清楚显示了根据SEQ IDNO:1的P15启动子对酶生产力的有益效果。

实施例6.构建整合载体pDBC5

pGB20载体(图6)通过合成产生，其含有pE194ori包括oripE、palA和repE，用于低于37℃时在B.subtilis中复制并在48℃时整合(Byeon W.H.和Weisblum B.,1990“Replication genes of plasmid pE194-cop and repF:transcripts and encodedproteins.”J Bacteriol.10:5892-5900)；来自pUB110的博来霉素抗生素标记，在B.subtilis中产生腐草霉素抗性(McKenzie等人1986,“The nucleotide sequence ofpUB110:some salient features in relation to replication and its regulation.”Plasmid.2:93-103)；pMB1的pUC ori，其用于在E.coli中复制(Sgorbati等人,1982,“Plasmids in the genus Bifidobacterium”J.Gen.Microbiol.9:2121-2131)；和卡那霉素抗性基因，其用于在E.coli中选择(Nakano等人1984,“Cloning of the kanamycinresistance gene from a kanamycin-producing Streptomyces species.”J.Bacteriol.1:79-83)。

pGB20载体用于构建靶向B.subtilis的amyE基因组的整合载体。利用以下引物通过聚合酶链式反应(PCR)扩增来自B.subtilis 168的amyE基因的5’-和3’-区域。

正向引物，其用于扩增5’-amyE区域和引入StuI位点：

5’-CCAAAGGCCTATGTTTGCAAAACGATTCAAAACCTC-3’(SEQ ID NO:21)

反向引物，其用于扩增5’-amyE区域和引入NotI、HindIII及KnpI位点：

5’-

AGGTACCTCTAGAAGCTTACTAGTGCGGCCGCGATTTCTCCGTATTGGAACTCTGCAG-3’(SEQ IDNO:22)

正向引物，其用于扩增3’-amyE区域和引入NotI、HindIII及KnpI位点：

5’-

GCGGCCGCACTAGTAAGCTTCTAGAGGTACCTGGCGTTGTGCTGGCAAATGCAG-3’(SEQ ID NO:23)

反向引物，其用于扩增3’-amyE区域和引入XhoI位点：

5’-GTTTCTCGAGATGGGGAAGAGAACCGCTTAAG-3’(SEQ ID NO:24)

凭借融合PCR通过在一个PCR反应中添加5ng 5’-amyE和3’-amyE片段以及引物SEQ-ID NO:19和SEQ-ID NO:22来融合两个片段。得到的1500bp PCR片段用StuI和XhoI消化并将其克隆到用StuI和XhoI消化的pGB20中。将连接反应混合物转化到E.coli TOP10细胞中。选择克隆并将该amyE整合质粒命名为pDBC5(图7)。通过DNA测序验证质粒的序列。

实施例7.构建表达质粒pDBC5AMY1

为了构建葡聚糖1,4-α-麦芽糖水解酶表达载体pDBC5AMY1(图8)，利用以下引物通过PCR扩增来自Geobacillus stearothermophilus C599的amyM基因(包括其天然终止子)。

正向引物，其用于扩增amyM基因和引入NotI位点和amyQ启动子序列、PacI和NdeIStuI位点：

5’-ATCGCGGCCGCCCAGACTGTCCGCTGTGTAAAAATAAGGAATAAAGGGGGGTTGTTATTATTTTACTGATATGTAAAATATAATTTGTATAAGAAAATGAGAGGGAGAGGAAATTAATTAAAAAAGGAGCGATTTACATATGAAAAAGAAAACGCTTTCTTTATTTGTGGG-3’(SEQ ID NO:25)

反向引物，其用于扩增amyM基因和引入HindIII位点：

5’-TAAATATAAAAGCTTGCAAGCAAGTGCATATCCTG-3’(SEQ ID NO:26)。

用NotI和HindIII消化该2.4kb amyM DNA片段并将其克隆到用相同的两种酶消化的pDBC5中。该表达和整合载体被命名为pDBC5AMY1(图8)。

SEQ ID NO:27展示了获自Geobacillus stearothermophilus C599的amyM基因的核苷酸序列,而SEQ ID NO:28展示了由amyM基因编码的获自Geobacillusstearothermophilus C599的葡聚糖1,4-α-麦芽糖水解酶的氨基酸序列。

实施例8.构建葡聚糖1,4-α-麦芽糖水解酶表达菌株

将pDBC5AMY1载体转化到BS154(ΔaprE和ΔnprE)中，这导致菌株BS154AMY(表2)。通过经由NotI和NdeI消化移除含有amyQ启动子和mobU核糖体结合位点的139bp参考表达模块和插入含有目标启动子序列的表达模块来检验附加的启动子。这些启动子模块(SEQ IDNO:29-35)通过合成产生，其含有在5’末端的NotI位点和在3’末端的NdeI位点。

经修饰的表达模块G03(SEQ ID NO:29)包含双重σ37和σ55启动子(Wang,P.Z.,DoiR.H.(1984)“Overlapping promoters transcribed by Bacillus subtilis sigma 55andsigma 37RNA polymerase holoenzymes during growth and stationary phases.”JBiol.Chem.259(13):8619-8625)、mobU核糖体结合位点，并且还含有在5’末端的NotI位点和在3’末端的NdeI位点。

5’-GCGGCCGCAGAAATGGGCGTGAAAAAAAGCGCGCGATTATGTAAAATATAAAGTGATAGCGGTACCATTATAGTTAATTAAAAAAGGAGCGATTTACATATG-3’(SEQ ID NO:29)

经修饰的表达模块G04(SEQ ID NO:30)包含rapA启动子、mobU核糖体结合位点，并且还含有在5’末端的NotI位点和在3’末端的NdeI位点。

5’-GCGGCCGCGAGAGCAAAGAAAAAGCCAGCGGGGAAGCTGGATGGAAAGAAACAAAGTCGGTTTTCACTAAAAGAAAGCACGGGTGTTTGAAAAACCCGTGCTTTTTTGTTGCGGTTAGCCGAAATTCGACAATTGCGGTTATTTTGCGTTCTTCTTTTTCTTGTAAATATGATAAAATATGACATATCTCGGGTAATTCAAAATTAATTAAAAAAGG AGCGATTTACATATG-3’(SEQ ID NO:30)

经修饰的表达模块G05(SEQ ID NO:31)包含PE5启动子、mobU核糖体结合位点，并且还含有在5’末端的NotI位点和在3’末端的NdeI位点。

5’-GCGGCCGCGCTAAAATTCCTGAAAAATTTTGCAAAAAGTTGTTGACTTTATCTACAAGGTGTGGCATAATAATCTTAAAGAAAATGAGAGGGAGAGGAAATTAATTAAAAAAGGAGCGATTTACATATG-3’(SEQ IDNO:31)

经修饰的表达模块G06(SEQ ID NO:32)包含P15和PE5启动子、mobU核糖体结合位点，并且还含有在5’末端的NotI位点和在3’末端的NdeI位点。

5’-GCGGCCGCATCCACGCTGTGTAAAAATTTTACAAAAAGGTATTGACTTTCCCTACAGGGTGTGTAATAATTTAATTAAGATCTGCTAAAATTCCTGAAAAATTTTGCAAAAAGTTGTTGACTTTATCTACAAGGTGTGGCATAATAATCTTAAAGAAAATGAGAGGGAGAGGAAATTAATTAAAAAAGGAGCGATTTACATATG-3’(SEQ ID NO:32)

经修饰的表达模块G07(SEQ ID NO:33)包含P15启动子、mobU核糖体结合位点，并且还含有在5’末端的NotI位点和在3’末端的NdeI位点。

5’-GCGGCCGCATCCACGCTGTGTAAAAATTTTACAAAAAGGTATTGACTTTCCCTACAGGGTGTGTAATAATTTAATTAAAGAAAATGAGAGGGAGAGGAAATTAATTAAAAAAGGAGCGATTTACATATG-3’(SEQ IDNO:33)

经修饰的表达模块G01(SEQ ID NO:34)包含根据SEQ ID NO:13的表达模块G01，其是通过包括在5’末端的NotI位点和在3’末端的NdeI位点而被修饰的。

5’-GCGGCCGCTAAAAATTTTACAAAAAGGTATTGACTTTCCCTACAGGGTGTGTAATAATTTAATTATAAGGACAAATGAATAAAGATTGTATCCTTCGGGGCAGGGTGGAAATCCCGACCGGCGGTAGTAAAGCACATTTGCTTTAGAGTCCGTGACCCGTGTGCATAAGCACGCGGTGGATTCAGTTTAAGCTGAAGCCGACAGTGAAAGTCTGGATGGGAGAAGGATGGACGGTAAATAACAAAAGAAAGGAGGTGATCATATG-3’(SEQ ID NO:34)

经修饰的表达模块G02(SEQ ID NO:35)包含根据SEQ ID NO:14的表达模块G02，其是通过包含在5’末端的NotI位点和在3’末端的NdeI位点而被修饰的。

GCGGCCGCTAAAAATTTTACAAAAAGGTATTGACTTTCCCTACAGGGTGTGTAATAATTTAATTATAAGGACAAATGAATAAAGATTGATTTTATCGAAGGGCAGCACCTGTCCTTCTCCTTACACTTTGAGGGAGGTGAACACAGACGGTAAATAACAAAAGAGGGGAGGGAAACATATG-3’(SEQ ID NO:35)

根据SEQ ID NO:29-35的经修饰的表达模块G03、G04、G05、G06、G07、G01和G02被分别克隆到pDBC5AMY1中amyM基因的5’，这产生载体pDBC5G03AMY1、pDBC5G04AMY1、pDBC5G05AMY1、pDBC5G06AMY1、pDBC5G07AMY1、pDBC5G01AMY1和pDBC5G02AMY1。

将这些载体转化到BS154(ΔaprE和ΔnprE)中以产生表3中所示的菌株。由于这些菌株含有热敏性复制起点，所以通过将生长温度提高至48℃并保持抗生素选择压力(4μg/ml腐草霉素)从而使这些载体整合到B.subtilis染色体中。由amyE区域指导的同源重组允许整合到amyE基因座。经整合的克隆被用于通过在抗生素压力不存在时在许可温度下生长来切除经整合的质粒。使用以下引物通过PCR验证amyM插入和质粒切除。

正向引物，其用于在5’-侧翼之外扩增amyE位点

5’-TTTTGACTCCGAAGTAAGTCTTC-3’(SEQ ID NO:37)

反向引物，其用于在3’-侧翼之外扩增amyE位点

5’-ATGGTTTCTTTCGGTAAGTCCCG-3’(SEQ ID NO:38)

核实扩增的PCR片段的序列。

表3.

实施例9.通过B.subtilis表达葡聚糖1,4-α-麦芽糖水解酶

使表达葡聚糖1,4-α-麦芽糖水解酶的B.subtilis菌株BS154AMY1、BS154G03AMY1、BS154G04AMY1、BS154G05AMY1、BS154G06AMY1、BS154G07AMY1、BS154G01AMY1、BS154G02AMY1(表3)在24深孔板(Axygen,Union City,美国)中生长。在由1.6％(w/w)Bacto胰蛋白胨、1％(w/w)酵母提取物和0.5％(w/w)NaCl组成的2xTY培养基中生产1ml预培养物。用Breathseal(Greiner bio-one,Frickenhausen,德国)覆盖24深孔板。在37℃、550rpm和80％湿度下在Microto恒温振荡培养箱(Infors AG,Bottmingen,瑞士)中过夜生长之后，用1％(v/v)预培养物接种24深孔板(Axygen,Union City,美国)中的2ml SMM培养基。SMM预培养基含有1.25％(w/w)酵母提取物、00.5％(w/w)CaCl₂、0.075％(w/w)MgCl₂.6H₂O、15μg/lMnSO₄.4H₂O、10μg/l CoCl₂.6H₂O、0.05％(w/w)柠檬酸、0.025％(w/w)消泡剂86/013(Basildon Chemicals,Abingdon,英国)。为了完成SMM培养基，将20ml 5％(w/v)麦芽糖和20ml 200mM磷酸钠缓冲储液(pH 6.8)(二者分别制备和灭菌)加入60ml SMM预培养基中。在37℃、550rpm和80％湿度下在Microto恒温振荡培养箱(Infors AG,Bottmingen,瑞士)中孵育这些培养物48小时。在37℃和250rpm下孵育这些培养物。48小时后对培养物进行取样并利用Megazyme CERALPHAα淀粉酶检测试剂盒(Megazyme International Ireland Ltd.,Co.Wicklow,爱尔兰)量化葡聚糖1,4-α-麦芽糖水解酶的生产力。如果相较于在amyM基因的5’含有amyQ或σ37和σ55启动子的菌株，在amyM基因的5’含有PE5启动子的菌株BS154G05AMY1和BS154G06AMY1以及含有P15启动子的菌株BS154G06AMY1、BS154G07AMY1、BS154G01AMY1、BS154G02AMY1表达较高水平的葡聚糖1,4-α-麦芽糖水解酶。该结果清楚显示了来自噬菌体SPO1的PE5和P15对酶生产力的有益效果。图9中报告了结果。

申请人或代理人文件参考编号30132-WO-PCT

国际申请号：

与被保藏的微生物相关的说明

(PCT Rule 13bis)

表PCT/RO/134(1992年7月)。

Claims

1.由npr基因编码的中性蛋白酶生产和/或由apr基因编码的碱性蛋白酶生产有缺陷的重组芽孢杆菌宿主细胞，所述宿主细胞包含核酸构建体，其中所述核酸构建体包含

编码多肽或者编码参与多肽合成的化合物的多核苷酸，所述多核苷酸与启动子序列可操作地连接从而允许所述多核苷酸在所述宿主细胞中表达，其中所述启动子是噬菌体SPO1启动子序列，所述噬菌体SPO1启动子序列是根据SEQ ID NO:1的多核苷酸序列或者根据SEQID NO:2的多核苷酸序列，其中所述噬菌体SPO1启动子序列是表达模块的一部分，所述表达模块包含位于所述启动子下游和编码RBS的序列上游的经修饰的rib前导序列，其中所述经修饰的rib前导序列是包含ribO突变C85T和对应于SEQ ID NO:55的第166-263位核苷酸的核苷酸缺失的根据SEQ ID NO:55的rib前导序列。

2.根据权利要求1的宿主细胞，其中所述噬菌体SPO1启动子是PE4或PE5。

3.根据权利要求1的宿主细胞，其中所述表达模块包含位于所述启动子下游和编码RBS的序列上游的mRNA稳定化元件和经修饰的rib前导序列。

4.根据权利要求3的宿主细胞，其中所述mRNA稳定化元件选自aprE、grpE、cotG、SP82、RSBgsiB、CryIIIA mRNA稳定化元件。

5.根据权利要求4的宿主细胞，其中所述mRNA稳定化元件选自根据SEQ ID NO:48-54的mRNA稳定化元件。

6.根据权利要求1的宿主细胞，其中所述表达模块由选自SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ IDNO:34、SEQ ID NO:35的多核苷酸序列组成。

7.根据权利要求1的宿主细胞，其中所述宿主细胞属于选自B.agaradherens、B.alkalophilus、B.amyloliquefaciens、B.anthracis、B.atrophaeus、B.brevis、B.cereus、B.circulans、B.clausii、B.coagulans、B.firmus、B.halodurans、B.lautus、B.lentus、B.licheniformis、B.megaterium、B.mojavensis、B.pumilus、B.puntis、B.sphaericus、B.stearothermophilus、B.subtilis、B.thuringiensis、B.vallismortis的种。

8.根据权利要求1的宿主细胞，其中所述宿主细胞不生产孢子。

9.根据权利要求8的宿主细胞，其中所述宿主细胞为孢子形成相关基因有缺陷的宿主细胞。

10.根据权利要求9的宿主细胞，其中所述宿主细胞为选自spo0A、spoIISA、spoIIAC、sigE、sigF、spoIISB、spoIIE、sigG、spoIVCB、spoIIIC、spoIIGA、spoIIAA、spoIVFB、spoIIR、spoIII的基因有缺陷的宿主细胞。

11.根据权利要求1的宿主细胞，其中所述宿主细胞包含多于一个拷贝的所述核酸构建体。

12.根据权利要求11的宿主细胞，其中所述宿主细胞包含多于一个拷贝的整合到所述宿主细胞基因组中的所述核酸构建体。

13.根据权利要求1的宿主细胞，其是不含标记的宿主细胞。

14.根据权利要求1的宿主细胞，其中所述宿主细胞是中性蛋白酶生产和碱性蛋白酶生产有缺陷的Bacillus subtilis宿主细胞。

15.根据权利要求14的宿主细胞，其中所述中性蛋白酶由根据SEQ ID NO:8的氨基酸序列组成，且其中所述碱性蛋白酶由根据SEQ ID NO:6的氨基酸序列组成。

16.根据权利要求14的宿主细胞，其中所述Bacillus subtilis宿主细胞还在中性淀粉酶生产上有缺陷。

17.根据权利要求16的宿主细胞，其中所述中性淀粉酶由根据SEQ ID NO:20的氨基酸序列组成。

18.生产根据权利要求1所述的重组芽孢杆菌宿主细胞的方法，所述方法包括：

a.提供芽孢杆菌宿主细胞，所述芽孢杆菌宿主细胞在由npr基因编码的中性蛋白酶生产和/或由apr基因编码的碱性蛋白酶生产上有缺陷，任选地在中性淀粉酶生产上有缺陷，任选地在孢子形成相关基因上有缺陷；

b.利用核酸构建体转化所述芽孢杆菌宿主细胞，所述核酸构建体包含编码多肽或者编码参与多肽合成的化合物的多核苷酸，所述多核苷酸与启动子序列可操作地连接从而允许所述多核苷酸在所述宿主细胞中表达，其中所述启动子是噬菌体SPO1启动子序列，所述噬菌体SPO1启动子序列是根据SEQ ID NO:1的多核苷酸序列或者根据SEQ ID NO:2的多核苷酸序列，其中所述噬菌体SPO1启动子序列是表达模块的一部分，所述表达模块包含位于所述启动子下游和编码RBS的序列上游的经修饰的rib前导序列，其中所述经修饰的rib前导序列是包含ribO突变C85T和对应于SEQ ID NO:55的第166-263位核苷酸的核苷酸缺失的根据SEQ ID NO:55的rib前导序列。

19.根据权利要求18的方法，其中所述噬菌体SPO1启动子是PE4或PE5。

20.根据权利要求18的方法，其中所述表达模块包含位于所述启动子下游和编码RBS的序列上游的mRNA稳定化元件和经修饰的rib前导序列。

21.根据权利要求20的方法，其中所述mRNA稳定化元件选自aprE、grpE、cotG、SP82、RSBgsiB、CryIIIA mRNA稳定化元件。

22.根据权利要求21的方法，其中所述mRNA稳定化元件选自根据SEQ ID NO:48-54的mRNA稳定化元件。

23.根据权利要求18的方法，其中所述表达模块由选自SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35的多核苷酸序列组成。

24.根据权利要求18所述的方法，其中所述宿主细胞属于选自B.agaradherens、B.alkalophilus、B.amyloliquefaciens、B.anthracis、B.atrophaeus、B.brevis、B.cereus、B.circulans、B.clausii、B.coagulans、B.firmus、B.halodurans、B.lautus、B.lentus、B.licheniformis、B.megaterium、B.mojavensis、B.pumilus、B.puntis、B.sphaericus、B.stearothermophilus、B.subtilis、B.thuringiensis、B.vallismortis的种。

25.根据权利要求18所述的方法，其中所述宿主细胞不生产孢子。

26.根据权利要求25所述的方法，其中所述宿主细胞为孢子形成相关基因有缺陷的宿主细胞。

27.根据权利要求26所述的方法，其中所述宿主细胞为选自spo0A、spoIISA、spoIIAC、sigE、sigF、spoIISB、spoIIE、sigG、spoIVCB、spoIIIC、spoIIGA、spoIIAA、spoIVFB、spoIIR、spoIII的基因有缺陷的宿主细胞。

28.根据权利要求18的方法，其中所述宿主细胞是中性蛋白酶生产和碱性蛋白酶生产有缺陷的Bacillus subtilis宿主细胞。

29.根据权利要求28的方法，其中所述中性蛋白酶由根据SEQ ID NO:8的氨基酸序列组成，且其中所述碱性蛋白酶由根据SEQ ID NO:6的氨基酸序列组成。

30.根据权利要求28的方法，其中所述Bacillus subtilis宿主细胞还在中性淀粉酶生产上有缺陷。

31.根据权利要求30的方法，其中所述中性淀粉酶由根据SEQ ID NO:20的氨基酸序列组成。

32.根据权利要求18的方法，其中在步骤b.中，用多于一个拷贝的所述核酸构建体转化所述芽孢杆菌宿主细胞。

33.根据权利要求32的方法，其中多于一个拷贝的所述核酸构建体被整合到所述宿主细胞基因组中。

34.根据权利要求18的方法，其中在步骤b.中，一个或更多个核酸构建体包含位于两个lox位点之间的选择标记。

35.根据权利要求34的方法，其中在步骤b.中，一个或更多个核酸构建体包含位于lox66和lox 71位点之间的选择标记。

36.根据权利要求34的方法，其中所述方法还包括以下步骤：

c.选择已经用包含所述选择标记的一个或更多个核酸构建体转化的所述芽孢杆菌宿主细胞；和任选地

d.通过Cre重组酶介导的lox位点的重组移除所述选择标记以在所述芽孢杆菌宿主细胞基因组中产生lox72位点。

37.根据权利要求36的方法，其中所述lox位点为lox66和lox 71位点。

38.生产多肽的方法，所述方法包括：

a)在有益于生产所述多肽的条件下，培养根据权利要求1-17中任一项的重组芽孢杆菌宿主细胞或者根据权利要求18-37中任一项的生产根据权利要求1所述的重组芽孢杆菌宿主细胞的方法所生产的重组芽孢杆菌宿主细胞，和

b)任选地，从培养液中分离所述多肽。

39.根据权利要求1-17中任一项的重组芽孢杆菌宿主细胞或者根据权利要求18-37中任一项所述的方法所生产的重组芽孢杆菌宿主细胞在生产多肽中的用途。