KR20230042368A - 온도 이동을 이용한 바실러스의 산업적 발효 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 산업적 발효 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 바실러스 숙주 세포의 배양 방법에 관한 것이다 (a) 발효 배지에 관심 단백질을 인코딩하는 유전자에 대한 발현 작제물을 포함하는 바실러스 숙주 세포를 접종하는 단계, (b) 바실러스 숙주 세포의 성장 및 관심 단백질의 발현에 도움이 되는 조건 하에서 상기 발효 배지에서 바실러스 숙주 세포를 제 1 배양 단계 동안 배양하는 단계로서, 바실러스 숙주 세포의 배양은 적어도 하나의 공급 용액의 첨가를 포함하고, 제 1 배양 단계 동안 배양은 제 1 온도에서 수행되는 단계, 및 (c) 바실러스 숙주 세포의 성장 및 관심 단백질의 발현에 도움이 되는 조건 하에서 단계 (b) 에서 수득된 바실러스 숙주 세포 배양물을 제 2 배양 단계 동안 배양하는 단계로서, 배양은 적어도 하나의 공급 용액의 첨가를 포함하고, 제 2 배양 단계 동안 배양은 제 2 온도에서 수행되고, 상기 제 2 온도는 제 1 온도보다 높은 단계. 본 발명은 또한 상기 방법에 의해 수득가능한 바실러스 숙주 세포 배양물을 제공한다.

Description

온도 이동을 이용한 바실러스의 산업적 발효 방법

본 발명은 산업적 발효 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 바실러스 숙주 세포의 배양 방법에 관한 것으로, (a) 발효 배지에 관심 단백질을 인코딩하는 유전자의 발현 작제물을 포함하는 바실러스 숙주 세포를 접종하는 단계, (b) 숙주 세포의 성장 및 관심 단백질의 발현에 도움이 되는 조건 하에서 상기 발효 배지에서 바실러스 숙주 세포를 1 차 배양 단계 동안 배양하되, 바실러스 숙주 세포의 배양은 적어도 하나의 공급 용액의 첨가를 포함하고, 상기 제 1 배양 단계 동안의 배양은 제 1 온도에서 수행되는 단계, 및 (c) 단계 (b) 에서 수득된 바실러스 숙주 세포 배양물을 제 2 배양 단계 동안 바실러스 숙주 세포의 성장 및 관심 단백질의 발현에 도움이 되는 조건 하에서 배양하되, 배양은 적어도 하나의 공급 용액의 첨가를 포함하고, 제 2 배양 단계 동안 배양은 제 2 온도에서 수행되되, 상기 제 2 온도는 제 1 온도보다 높은 단계를 포함하는 바실러스 숙주 세포의 배양 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 방법에 의해 수득가능한 바실러스 숙주 세포 배양물을 제공한다.

미생물은 관심 생성물, 특히 단백질, 및 특히 효소의 생산을 위한 산업용 작업마로 널리 사용된다. 관심 생성물의 생물공학적 생산은 발효 및 생산물의 후속 정제를 통해 수행된다. 미생물, 예컨대 바실러스 종은 발효 브로스 내로 상당한 양의 생성물을 분비할 수 있다. 이것은 세포내 생산과 비교하여 단순한 생산물 정제 과정을 가능하게 하고 산업적 적용에서 바실러스의 성공을 설명한다.

미생물을 이용한 산업적 생물공정은 전형적으로 50 m³ 이상의 크기를 갖는 대규모 생산 생물반응기에서 수행된다. 상기 대규모 생물반응기에서의 발효 공정을 위해, 전형적으로, 생물반응기에서의 발효 브로스의 접종은 바실러스 세포의 예비-배양물로 수행된다. 보다 작은 종자 발효조에서 바실러스 세포를 배양함으로써 예비-배양물을 얻을 수 있다.

대규모 발효 공정은 일반적으로 생산될 관심 단백질의 성장 및 발현을 허용하는 조건 하에서 접종된 바실러스 세포를 성장시키는 것을 포함한다. 전형적으로, 바실러스 세포는 복합 또는 한정된 발효 배지에서 성장되고, 탄소 공급원은 배양 동안 일정량 또는 다양한 양으로 공급될 것이다.

대규모 생물반응기에서의 상기 배양 동안 바실러스 세포에 의해 생성된 관심 단백질의 수율을 증가시키는 것을 목표로 하는 상이한 접근법이 보고되었다. 이들 접근법은, 예를 들어, 매체의 조성물 내의 변이에 관련된다. 다른 접근법은 특히, 봉입체 형성의 가능성을 감소시키기 위한 온도의 감소와 관련되었다 (Hashemi 2012, Food Bioprocess Technol 5:1093-1099; Wenzel 2011, Applied and Environmental Microbiology 77: 6419-6425).

그러나, 대규모 산업 발효 공정에서 수율을 추가로 증가시키기 위한 수단이 매우 요망된다.

본 발명의 근본적인 기술적 문제는 전술한 요구를 충족시키기 위한 수단 및 방법의 제공으로 볼 수 있다. 이것은 하기 청구항 및 본 명세서에서 특징규명한 구현예에 의해 해결될 수 있다.

따라서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 바실러스 숙주 세포의 배양 방법에 관한 것이다

(a) 발효 배지에 관심 단백질을 인코딩하는 유전자에 대한 발현 작제물을 포함하는 바실러스 숙주 세포를 접종하는 단계;

(b) 바실러스 숙주 세포의 성장 및 관심 단백질의 발현에 도움이 되는 조건 하에서 상기 발효 배지에서 바실러스 숙주 세포를 제 1 배양 단계 동안 배양하는 단계로서, 바실러스 숙주 세포의 배양은 적어도 하나의 공급 용액의 첨가를 포함하고, 제 1 배양 단계 동안 배양은 제 1 온도에서 수행되는 단계; 및

(c) 바실러스 숙주 세포의 성장 및 관심 단백질의 발현에 도움이 되는 조건 하에서 단계 (b) 에서 수득된 바실러스 숙주 세포 배양물을 제 2 배양 단계 동안 배양하는 단계로서, 배양은 적어도 하나의 공급 용액의 첨가를 포함하고, 제 2 배양 단계 동안 배양은 제 2 온도에서 수행되고, 상기 제 2 온도는 제 1 온도보다 높은 단계.

명세서 및 청구항에서 사용되는 바와 같은, 단수형은 이것이 사용되는 문맥에 따라서, 하나 이상을 의미할 수 있다는 것을 이해해야 한다. 따라서, 예를 들어, "세포" 에 대한 언급은 적어도 하나의 세포가 이용될 수 있다는 것을 의미할 수 있다.

또한, 본 명세서에서 사용되는 용어 "적어도 하나"는 용어 뒤에 언급된 항목 중 하나 이상이 본 발명에 따라서 사용될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 예를 들어, 용어가 적어도 하나의 공급 용액이 사용되어야 한다는 것을 의미하는 경우에 이것은 하나의 공급 용액 또는 하나 초과의 공급 용액, 즉, 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 임의의 다른 개수의 공급 용액으로서 이해될 수 있다. 항목에 따라서, 용어는 그 용어가 있다면 참조할 수 있는 상한값에 관하여 당업자가 이해한다는 것을 의미한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "약"은 상기 용어 뒤에 인용되는 임의 숫자와 관련하여 기술적 효과가 달성될 수 있는 간격 정확도가 존재한다는 것을 의미한다. 따라서, 본 명세서에서 언급되는 약은 바람직하게, ±20%, 바람직하게 ±15%, 보다 바람직하게 ±10%, 또는 보다 더 바람직하게 ±5%의 정확한 수치값 또는 상기 정확한 수치값 근처 범위를 의미한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "포함하는"은 제한적인 의미로 이해해서는 안된다. 그 보다 이 용어는 언급된 실제 항목 이상이 존재할 수 있다는 것을 의미하고, 예를 들어, 일정 단계를 포함하는 방법을 언급하는 경우에, 추가 단계의 존재를 배제해서는 안된다. 그러나, 용어는 또한 언급된 항목만이 존재하는 구현예를 포함하고, 다시말해서, "∼이루어지는"의 의미에서 제한적인 의미를 갖는다.

본 발명은 따라서, 실험실 및 산업적 규모의 발효 과정으로 박테리아 숙주 세포의 배양에 적용될 수 있는 방법을 제공한다. 본 발명에 따라 언급되는 "산업적 발효" 는 초기 발효 배지 리터 당 적어도 200 g 의 탄소 공급원이 첨가될 것인 배양 방법을 의미하고, 전형적으로 탄소 공급원은 1차 탄소 공급원으로서 언급된다. 바람직하게는, 1차 탄소 공급원은 숙주 세포가 소모하는 탄소의 주요 공급원으로 정의된다.

"탄소의 주요 공급원" 또는 "주요 탄소 공급원" 은 전형적으로, 배양 동안 존재하는, 전형적으로 공급 용액 및/또는 초기 발효 배지 중에 존재하는, 더욱 전형적으로는 제 1 및/또는 제 2 배양 단게 및/또는 후속 배양 단게에 존재하는 탄수화물 및/또는 탄소 공급원의 질량 비율에 기초하여 탄소의 주요 공급원을 나타내는 탄소 공급원을 지칭한다. 용어 "탄소 공급원" 은 전형적으로 그의 바이오매스 및/또는 그의 성장을 구축하기 위한 탄소의 공급원으로서 유기체에 의해 대사되는 화합물로서 이해된다. 적합한 탄소 공급원은 예를 들어 탄수화물과 같은 유기 화합물을 포함한다.

본 발명에 따른 방법은 또한 추가 단계를 포함할 수 있다. 이러한 추가 단계는 배양의 종결 및/또는 적절한 정제 기술에 의해 바실러스 숙주 세포 배양물로부터 관심 단백질과 같은 생성물의 수득을 포괄할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 방법은 단계 (c) 이후에 수득된 박테리아 숙주 세포 배양물로부터 관심 단백질을 수득하는 단계를 더 포함한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "배양되는" 또는 "배양" 은 적어도 사전결정된 시간 동안 배양물에 포함된 박테리아 세포를 살아있도록 유지시키고/시키거나 번식시키는 것을 의미한다. 이 용어는 접종 이후 성장 시작 시 기하급수적 세포 성장기를 비롯하여 성장 정지기를 포괄한다.

본 발명의 방법에서, 제 1 단계로서 발효 배지에 관심 단백질을 인코딩하는 유전자에 대한 발현 작제물을 포함하는 바실러스 숙주 세포를 접종한다.

본원에서 사용되는 용어 "접종" 은 배양을 위해 사용되는 발효 배지에 바실러스 숙주 세포를 도입하는 것을 의미한다. 발효 배지에 바실러스 숙주 세포를 접종하는 것은 예비-배양물 (스타터 배양물) 의 바실러스 숙주 세포를 도입함으로써 달성될 수 있다. 바람직하게는, 발효는 당업자에게 공지된 조건 하에서 성장된 예비-배양물로 접종된다. 예비-배양물은 화학적으로 규정된 예비-배양 배지 또는 복합 예비-배양 배지일 수 있는 예비-배양 배지에서 세포를 배양함으로써 수득될 수 있다. 예비-배양 배지는 본 발명의 방법에서 배양에 사용된 발효 배지와 동일하거나 상이할 수 있다. 복합 예비-배양 배지는 복합 질소 및/또는 복합 탄소 공급원을 함유할 수 있다. 바람직하게는, 접종에 사용되는 예비-배양물은 복합 배양 배지를 사용하여 수득된다. 예비-배양물은 주 발효 배지에 전부 또는 부분적으로 첨가될 수 있다. 바람직하게는, 예비-배양물 중의 바실러스 숙주 세포는 활발하게 세포를 성장시키는데, 즉 세포의 수가 증가하는 단계에 있다. 전형적으로, 예비-배양물 중의 세포는 정체 단계에서 예비-배양물의 접종 시에 있고, 시간에 따라 지수적 성장의 단계로 전환된다. 바람직하게는, 지수적 성장 단계의 세포는 발효 배지의 접종을 위한 예비-배양물로부터 사용된다. 접종에 사용되는 예비-배양물과 주 발효 배지 사이의 부피비는 바람직하게는 0.1 내지 30% (v/v) 이다.

용어 "바실러스 숙주 세포" 는 관심 단백질을 인코딩하는 유전자에 대한 발현 작제물에 대한 숙주로서 역할을 하는 바실러스 세포를 의미한다. 상기 발현 작제물은 바실리쿠스 세포에서 유전적으로 변형된 자연 발생 발현 작제물, 재조합적으로 도입된 발현 작제물 또는 자연 발생 발현 작제물일 수 있다. 바실러스 숙주 세포는 박테리아 속 바실러스 중 임의의 구성원으로부터의 숙주 세포, 바람직하게는 바실러스 리체니포르미스 (Bacillus licheniformis), 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis), 바실러스 알칼로필러스 (Bacillus alkalophilus), 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 (Bacillus amyloliquefaciens), 바실러스 브레비스 (Bacillus brevis), 바실러스 서큘란스 (Bacillus circulans), 바실러스 클라우시 (Bacillus clausii), 바실러스 코아굴란스 (Bacillus coagulans), 바실러스 피르무스 (Bacillus firmus), 바실러스 자우투스 (Bacillus jautus), 바실러스 렌투스 (Bacillus lentus), 바실러스 메가테리움 (Bacillus megaterium), 바실러스 푸밀러스 (Bacillus pumilus), 바실러스 스테아로테르모필러스 (Bacillus stearothermophilus), 바실러스 투린지엔시스 (Bacillus thuringiensis) 또는 바실러스 벨레젠시스 (Bacillus velezensis) 일 수 있다. 더욱 바람직하게는, 바실러스 숙주 세포는 바실러스 리체니포르미스, 바실러스 푸밀러스, 또는 바실러스 서브틸리스 숙주 세포, 더욱 더 바람직하게는 바실러스 리체니포르미스 또는 바실러스 서브틸리스 숙주 세포, 가장 바람직하게는 바실러스 리체니포르미스 숙주 세포이다. 특히 바람직하게는, 바실러스 리체니포르미스는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 번호 ATCC 14580, ATCC 31972, ATCC 53757, ATCC 53926, ATCC 55768 하에, 및 DSMZ 번호 (저먼 콜렉션 오브 마이크로오르가니즘 및 셀 컬쳐 GmbH) DSM 13, DSM 394, DSM 641, DSM 1913, DSM 11259, 및 DSM 26543 하에 기탁된 바실러스 리체니포르미스로 이루어진 군으로부터 선택된다.

전형적으로, 숙주 세포는 종 바실러스 리체니포르미스, 예컨대 바실러스 리체니포르미스 균주 ATCC 14580 의 숙주 세포 (이것은 DSM 13 과 동일함, Veith et al. "The complete genome sequence of Bacillus licheniformis DSM 13, an organism with great industrial potential." J. Mol. Microbiol. Biotechnol. (2004) 7:204-211 참조) 에 속한다. 대안적으로, 숙주 세포는 바실러스 리케니포르미스 균주 ATCC 53926 의 숙주 세포일 수 있다. 대안적으로, 숙주 세포는 바실러스 리케니포르미스 균주 ATCC 31972 의 숙주 세포일 수 있다. 대안적으로, 숙주 세포는 바실러스 리케니포르미스 균주 ATCC 53757 의 숙주 세포일 수 있다. 대안적으로, 숙주 세포는 바실러스 리케니포르미스 균주 ATCC 53926 의 숙주 세포일 수 있다. 대안적으로, 숙주 세포는 바실러스 리케니포르미스 균주 ATCC 55768 의 숙주 세포일 수 있다. 대안적으로, 숙주 세포는 바실러스 리케니포르미스 균주 DSM 394 의 숙주 세포일 수 있다. 대안적으로, 숙주 세포는 바실러스 리케니포르미스 균주 DSM 641 의 숙주 세포일 수 있다. 대안적으로, 숙주 세포는 바실러스 리케니포르미스 균주 DSM 1913 의 숙주 세포일 수 있다. 대안적으로, 숙주 세포는 바실러스 리케니포르미스 균주 DSM 11259 의 숙주 세포일 수 있다. 대안적으로, 숙주 세포는 바실러스 리케니포르미스 균주 DSM 26543 의 숙주 세포일 수 있다.

본 발명의 방법에 적용되는 바실러스 숙주 세포는 상기 숙주 세포가 발현할 수 있는 관심 단백질을 인코딩하는 유전자에 대한 발현 작제물을 포함할 수 있다. 용어 "발현 작제물" 은 발현 조절 서열에 작동가능하게 연결된 관심 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 프로모터를 의미한다. 전형적으로, 본 발명에 따른 방법에서 사용되는 발현 작제물은 프로모터에 작동가능하게 연결된 관심 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 적어도 포함할 수 있다.

본원에 언급된 프로모터" 는 상기 유전자의 전사를 가능하게 하는 유전자와 동일한 가닥 상의 유전자의 업스트림에 위치된 뉴클레오티드 서열이다. 프로모터의 활성 (프로모터 활성으로도 지칭됨) 은 본 명세서에서 상기 유전자의 전사를 가능하게 하고 개시시키는 프로모터의 능력으로서 이해되고, 즉 유전자 발현을 구동하는 프로모터의 능력으로서 이해된다. 프로모터는 유전자의 전사 출발 부위가 후속된다. 프로모터는 RNA 중합효소에 의해, 전형적으로 필요한 전사 인자와 함께 인식되어서, 전사가 개시된다. 프로모터의 기능성 단편 또는 기능성 변이체는 RNA 중합효소에 의해 인식가능하고, 전사를 개시할 수 있는, 뉴클레오티드 서열이다. 프로모터의 기능성 단편 또는 기능성 변이체가 또한 본 발명의 의미에서 프로모터로서 포함된다.

프로모터는 활성이 활성화 신호 분자, 즉 유도인자 분자의 존재에 의존하는 유도인자-의존성 프로모터일 수 있거나, 또는 유도인자-비의존성 프로모터, 즉 발효 배지에 첨가된 또는 존재하는 유도인자 분자의 존재에 의존하지 않고 구성적으로 활성이거나 발효 배지에 첨가된 또는 존재하는 유도인자 분자의 존재에 관계 없이 활성이 증가될 수 있는 프로모터일 수 있다. 바람직하게는, 프로모터는 유도인자-비의존성 프로모터이다. 전형적으로, 숙주 세포는 유도인자 분자를 흡수하거나 대사하는 능력에 있어 유전적으로 변형되지 않았고, 바람직하게는, 숙주 세포는 manP 및/또는 manA 결핍이 아니다.

바람직하게는, 프로모터는 aprE 프로모터 (바실러스 서브틸리신 칼스베르그 프로테아제를 코딩하는 유전자로부터의 천연 프로모터), 바실러스 아밀로리퀴파시엔스로부터의 amyQ 프로모터, 바실러스 리체니포르미스로부터의 amyL 프로모터 및 그의 변이체 (바람직하게는 US5698415 에 기재된 바와 같음), 박테리오파지 SPO1 프로모터, 예컨대 프로모터 PE4, PE5, 또는 P15 (바람직하게는 WO2015118126, 또는 Stewart, C. R., Gaslightwala, I., Hinata, K., Krolikowski, K. A., Needleman, D. S., Peng, A. S., Peterman, M. A., Tobias, A., and Wei, P. 1998, Genes and regulatory sites of the "host-takeover module" in the terminal redundancy of Bacillus subtilis bacteriophage SPO1. Virology 246(2), 329-340 에 기재된 바와 같음), 바실러스 투린지엔시스로부터의 cryIIIA 프로모터 (바람직하게는 WO9425612 또는 Agaisse, H. and Lereclus, D. 1994. Structural and functional analysis of the promoter region involved in full expression of the cryIIIA toxin gene of Bacillus thuringiensis. Mol. Microbiol. 13(1). 97-107. 에 기재된 바와 같음), 및 그의 조합, 및 그의 활성 단편 또는 변이체의 프로모터 서열로 이루어진 군으로부터 선택된다.

바람직하게는, 프로모터 서열은 본원에 기재된 바와 같이, 숙주 세포에 대해 천연 또는 이종성인 5'-UTR 서열과 조합될 수 있다. 바람직하게는, 프로모터는 유도인자-비의존성 프로모터이다. 더욱 바람직하게는, 프로모터는 veg 프로모터, lepA 프로모터, serA 프로모터, ymdA 프로모터, fba 프로모터, aprE 프로모터, amyQ 프로모터, amyL 프로모터, 박테리오파지 SPO1 프로모터, cryIIIA 프로모터, 이들의 조합, 및 이들의 활성 단편 또는 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 더 더욱 바람직하게는, 프로모터 서열은 aprE 프로모터, amyL 프로모터, veg 프로모터, 박테리오파지 SPO1 프로모터, 및 cryIIIA 프로모터, 및 이들의 조합, 또는 이들의 활성 단편 또는 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 더 더욱 바람직하게는, 프로모터는 aprE 프로모터, SPO1 프로모터, 예컨대 PE4, PE5, 또는 P15 (바람직하게는 WO15118126 에 기재된 바와 같음), 프로모터 서열 amyl 및 amyQ 를 포함하는 탠덤 프로모터 (바람직하게는 WO9943835 에 기재된 바와 같음), 및 프로모터 서열 amyL, amyQ, 및 cryIIIa 를 포함하는 삼중 프로모터 (바람직하게는 WO2005098016 에 기재된 바와 같음) 로 이루어진 군으로부터 선택된다. 가장 바람직하게는, 프로모터는 aprE 프로모터, 바람직하게는 바실러스 아밀로리퀴파시엔스, 바실러스 클라우시, 바실러스 할로두안스, 바실러스 렌투스, 바실러스 리체니포르미스, 바실러스 푸밀러스, 서브틸리스 또는 바실러스 벨레젠시스로부터의 aprE 프로모터, 더욱 바람직하게는 바실러스 리체니포르미스, 바실러스 푸밀러스 또는 바실러스 서브틸리스로부터의 aprE 프로모터, 가장 바람직하게는 바실러스 리체니포르미스로부터의 aprE 프로모터이다.

본원에서 상술된 바와 같은 유도인자-비의존성 프로모터를 이용하는 것은 유도인자 분자의 필요 없이 연속적이고 안정적인 단백질 생산을 초래하는 발효 전체에 걸쳐 관심 유전자의 연속적인 발현을 허용하기 때문에 유리할 수 있다. 따라서, 유도인자-비의존성 프로모터를 사용하면 관심 단백질의 수율을 향상시키는데 기여할 수 있다.

본 발명의 방법에 따라 사용되는 프로모터의 활성은 바람직하게는 열-유도성 요소에 의존하지 않는 것으로 이해될 것이다. 따라서, 본 발명에 따른 발현 조절 서열로서 사용되는 프로모터는, 바람직하게는 온도-무관성 프로모터이고, 및/또는 열-유도성 요소가 결여된다.

반대로, "유도인자-비의존성 프로모터" 는 본 명세서에서 "유도인자 분자"를 발효 배지에 첨가 시 프로모터가 작동적으로 연결된 유전자의 전사가 가능하도록 이의 활성이 증가된 프로모터로서 이해된다. 따라서, 유도인자-의존적 프로모터 경우에 유도인자 분자의 존재는 신호 전달을 통해서 프로모터에 작동적으로 연결된 유전자의 발현 증가를 촉발시킨다. 유도인자 분자의 존재에 의한 활성화 이전에 유전자 발현은 부재할 필요는 없지만, 또한 유도인자 분자의 첨가 이후에 증가되는 낮은 수준의 기본 유전자 발현으로 존재할 수 있다. "유도인자 분자"는 발효 배지 중 존재가 유전자에 작동적으로 연결된 유도인자-의존적 프로모터의 활성을 증가시켜서 유전자의 발현 증가에 영향을 미칠 수 있는 분자이다. 당업계에 공지된 유도인자 분자는 글루코스와 같은 1차 탄소 공급원 이외에 2차 탄소원으로서 기능할 수 있는 탄수화물 또는 이의 유사체를 포함한다. 전형적으로, 바실러스 숙주 세포는 유도인자 분자를 흡수하거나 대사하는 능력에 있어 유전적으로 변형되지 않았고, 더욱 전형적으로는, 바실러스 숙주 세포는 manP 및/또는 manA 결핍이 아니다.

바람직하게는, 본 발명에 따른 배양 방법은 만노스, 수크로스, β-글루코시드, 올리고-β-글루코시드, 프룩토스, 만니톨, 락토스, 알로락토스, 이소프로필-β-D-1-티오갈락토피라노시드 (IPTG), L-아라비노스, 자일로스와 같은 2차 탄소원을 첨가하지 않고 수행된다. 훨씬 더 바람직하게는, 발효 배지는 임의의 2차 탄소 공급원이 없다.

또한, 상기 발현 작제물은 번역의 적절한 종결에 필요한 추가적인 요소 또는 상기 발현 작제물의 삽입, 안정화, 숙주 세포로의 도입 또는 복제에 필요한 요소를 포함할 수 있다. 이러한 서열은, 특히 5'-UTR (리더 서열이라고도 함), 리보솜 결합 부위 (RBS, 샤인-달가노 서열), 3'-UTR, 전사 개시 및 종결 부위, 및 발현 작제물의 성질, 복제의 기원, 통합 부위 등을 포함한다. 바람직하게는, 핵산 작제물 및/또는 발현 벡터는 5'-UTR 및 RBS 를 포함한다. 바람직하게는, 5'-UTR 은 aprE, grpE, ctoG, SP82, gsiB, cryIIa 및 ribG 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 유전자의 대조군 서열로부터 선택된다.

그러나, 발현 작제물은 또한 관심 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 포함할 것이다. 본 명세서에서 언급되는 "관심 단백질" 은 바실러스 숙주 세포에서 생산되도록 의도된 임의의 단백질, 펩티드 또는 이의 단편을 의미한다. 따라서, 단백질은 폴리펩티드, 펩티드, 이의 단편을 비롯하여 융합 단백질 등을 포괄한다.

바람직하게, 관심 단백질은 효소이다. 특정 구현예에서, 효소는 옥시도리덕타제 (EC 1), 트랜스페라제 (EC 2), 히드롤라제 (EC 3), 리아제 (EC 4), 이소머라제 (EC 5), 또는 리가아제 (EC 6) 로 분류된다 (EC-numbering according to Enzyme Nomenclature, Recommendations (1992) of the Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology including its supplements published 1993-1999). 바람직한 구현예에서, 관심 단백질은 세제에서 사용하기에 적합한 효소이다.

더욱 바람직하게, 효소는 히드롤라제 (EC 3), 더욱 더 바람직하게, 또는 글리코시다제 (EC 3.2), 더 더욱 바람직하게는 글리코시다제 (EC 3.2) 이다. 특히 바람직한 효소는 아밀라제 (특히, 알파-아밀라제 (EC 3.2.1.1)), 셀룰라제 (EC 3.2.1.4), 락타제 (EC 3.2.1.108), 만나나제 (EC 3.2.1.25), 리파제 (EC 3.1.1.3), 파이타제 (EC 3.1.3.8), 및 뉴클레아제 (EC 3.1.11 내지 EC 3.1.31) 로 이루어진 군으로부터 선택되는 효소이고; 특히, 아밀라제, 리파제, 만난나제, 파이타제, 자일라나제, 포스파타제, 글루코아밀라제, 뉴클레아제, 및 셀룰라제로 이루어진 군으로부터 선택되는 효소, 바람직하게, 아밀라제 또는 만난나제이다. 더 더욱 바람직하게는 효소는 만난나제 및 아밀라아제로부터 선택되는 글리코시다제 (EC 3.2) 이다.

바람직하게는, 관심 단백질은 발효 배지 내로 분비된다. 발효 배지 내로의 관심 단백질의 분비는 전형적으로 발효 배지로부터 관심 단백질의 용이한 분리를 허용한다. 발효 배지 내로 관심 단백질의 분비를 위해, 핵산 작제물은 발효 배지 내로 관심 단백질의 분비를 지시하는 신호 펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 다양한 신호 펩티드는 해당 기술 분야에 알려져 있다. 바람직한 신호 펩티드는 바실러스 서브틸리스로부터의 AprE 단백질의 신호 펩티드 또는 바실러스 서브틸리스로부터의 YvcE 단백질로부터의 신호 펩티드로 이루어진 군으로부터 선택된다.

발효 배지 내로 바실러스 세포로부터, 아밀라아제와 같은 효소 분비에 특히 적합한 것은, 바실러스 서브틸리스로부터의 AprE 단백질의 신호 펩티드 또는 바실러스 서브틸리스로부터의 YvcE 단백질로부터의 신호 펩티드이다. YvcE 신호 펩티드가 아밀라아제를 비롯한 매우 다양한 상이한 효소를 분비하기에 적합하기 때문에, 이 신호 펩티드는 바람직하게는 본원에 기재된 발효 공정과 함께 사용될 수 있다.

발현 조절 서열, 관심 단백질을 인코딩하는 핵산 서열 및/또는 상기 언급된 추가 요소 각각은 바실러스 숙주 세포로부터 유래될 수 있거나 또는 또다른 종으로부터 유래될 수 있는, 즉 상기 바실러스 숙주 세포에 대하여 이종성인 것으로 이해될 것이다.

또한, 발현 작제물은 관심 유전자 및 발현 조절 서열 및/또는 바실러스 숙주 세포의 게놈에 고유한, 즉 내인성으로 존재하는 앞서 명시된 바와 같은 추가의 요소의 배열일 수 있다. 게다가, 용어는 또한 예를 들어, 게놈 편집 및/또는 돌연변이유발 기술에 의해 유전적으로 조작된 상기 천연 발현 작제물을 포함한다.

발현 작제물은 또한 외인성으로 도입된 발현 작제물일 수 있다. 외인성으로 도입된 발현 작제물에서, 발현 조절 서열, 관심 단백질을 인코딩하는 유전자 및/또는 추가 요소는 숙주 세포에 대해 고유의 것일 수 있거나 또는 다른 종으로부터 유래될 수 있는, 즉 바실러스 숙주 세포에 대하여 이종성일 수 있다. 바실러스 숙주 세포 내로 발현 작제물의 도입은 본 발명에 따라 그 중에서도 잘 알려진 형질전환, 형질감염, 형질도입, 및 접합 기술 등을 포함하는 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 달성될 수 있다. 바람직하게는, 외인성으로 도입된 발현 작제물은 벡터, 바람직하게는 발현 벡터에 포함된다. 발현 벡터는, 바람직하게는, 바실러스 숙주 세포의 염색체 DNA 외부에 위치될 수 있고, 즉 하나 이상의 카피로, 에피좀적으로 존재할 수 있다. 그러나, 발현 벡터는 또한 바람직하게는 하나 이상의 카피로 바실러스 세포의 염색체 DNA 내에 통합될 수 있다. 발현 벡터는 선형 또는 원형일 수 있다. 바람직하게는, 발현 벡터는 바이러스 벡터 또는 플라스미드이다.

자율 복제의 경우, 발현 벡터는 해당 숙주 세포에서 벡터가 자율적으로 복제할 수 있게 하는 복제 기점을 추가로 포함할 수 있다. 박테리아의 복제 기점은 바실러스에서 복제를 허용하는 플라스미드 pUB110, pC194, pTB19, pAMß1, 및 pTA1060 (Janniere, L., Bruand, C., and Ehrlich, S.D. (1990). Structurally stable Bacillus subtilis cloning vectors. Gene 87, 53-6; Ehrlich, S.D., Bruand, C., Sozhamannan, S., Dabert, P., Gros, M.F., Janniere, L., and Gruss, A. (1991). Plasmid replication and structural stability in Bacillus subtilis. Res. Microbiol. 142, 869-873), 및 pE194 (Dempsey, L.A. and Dubnau, D.A. (1989). Localization of the replication origin of plasmid pE194. J. Bacteriol. 171, 2866-2869) 의 복제 기점을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 복제 기점은 숙주 세포에서 그 기능을 온도에 민감하게 만드는 돌연변이를 갖는 것일 수 있다 (예를 들어, Ehrlich, 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75:1433-1436 참조). 그러나, 발현 벡터는 바람직하게는 형질전환된 바실러스 숙주 세포의 용이한 선택을 허용하는 하나 이상의 선별가능한 마커를 함유한다. 선별가능한 마커는 생성물을 인코딩하는 유전자로서, 살생물제 내성, 중금속에 대한 내성, 영양요구성에 대한 자가양양 등을 제공한다. 박테리아 선별가능한 마커는 바실러스 서브틸리스 또는 바실러스 리케니포르미스로부터의 dal 유전자, 또는 암피실린, 카나마이신, 에리트로마이신, 클로람페니콜 또는 테트라사이클린 저항성과 같은 항생제 저항성을 부여하는 마커를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 또한, 선별은 예를 들어 WO9109129 호에 기재된 바와 같이 공동-형질전환에 의해 달성될 수 있으며, 여기서 선별가능한 마커는 별개의 벡터 상에 있다.

본 발명의 방법은, 추가로 바실러스 숙주 세포의 성장 및 관심 단백질의 발현에 도움이 되는 조건 하에서 상기 발효 배지에서 바실러스 숙주 세포를 제 1 배양 단계 동안 배양하는 단계로서, 바실러스 숙주 세포의 배양은 적어도 하나의 공급 용액의 첨가를 포함하고, 제 1 배양 단계 동안 배양은 제 1 온도에서 수행되는 단계를 포함한다.

본원에서 용어 "제 1 배양 단계" 는 제 1 온도에서 배양이 수행되는 제 1 기간을 의미한다. 상기 기간은 배양물의 파라미터, 예를 들어, 박테리아 성장 속도, 탄소 공급원 소비 속도, 발효 배지에 제공된 탄소 공급원의 양 등에 따라 미리 결정되거나 가변적일 수 있다. 상기 적어도 하나의 공급 용액은 증가하는 속도, 바람직하게는 지수적으로 증가하는 속도로 탄소 공급원을 제공할 것이다. 바람직하게는, 상기 적어도 하나의 공급 용액은 발효, 전형적으로 제 1 배양 단계 및/또는 제 2 배양 단계 동안 탄수화물을 포함하는 1차 탄소 공급원을 제공한다. 더욱 바람직하게는, 1차 탄소 공급원은 글루코스이다. 상기 기간은 배양물의 파라미터, 예를 들어, 박테리아 성장 속도, 탄소 공급원 소비 속도, 발효 배지에 제공된 탄소 공급원의 양 등에 따라 미리 결정되거나 가변적일 수 있다. 바람직하게는, 상기 제 1 배양 단계는 적어도 약 3 시간 내지 약 48 시간, 바람직하게는 약 22 시간 동안 수행된다. 대안적으로, 이는 미리 결정된 총 양의 탄소 공급원이 적어도 하나의 공급 용액에 의해 제공될 때까지 수행될 수 있다. 바람직하게는, 적어도 하나의 공급 용액은 적어도 약 0.13h^-1 의 지수 인자 및 적어도 하나의 탄소 공급원의 리터 및 시간 당 적어도 약 1 g 의 시작량으로 지수적으로 증가하는 속도로 탄소 공급원을 제공한다. 추가로 바람직하게는, 제 1 배양 단계 동안, 단계 b) 에서 초기에 존재하는 바실러스 숙주 세포 배양물 kg 당 상기 적어도 하나의 탄소 공급원의 적어도 약 50 g 이상의 총량을 첨가한다. 더 자세한 내용은 하기 첨부된 실시예에서 확인된다. 제 1 배양 기간의 시간 기간을 어떻게 정해야 하는지 당업자는 잘 알고 있다. 상기 제 1 배양 단계에서 바실러스 숙주 세포는 바실러스 숙주 세포의 성장 및 관심 단백질의 발현을 허용하는 조건 하에서 배양된다.

본원에서 사용되는 용어 "발효 배지" 는 세포의 성장을 지지할 수 있는 하나 이상의 화학 화합물을 포함하는 수계 용액을 의미한다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 발효 배지는 복합 발효 배지 또는 화학적으로 규정된 발효 배지이다.

본원에서 사용되는 바와 같은 복합 발효 배지는 복합 영양소 공급원을 발효 배지의 0.5 내지 30% (w/v) 의 양으로 포함하는 발효 배지를 의미한다. 복합 영양소 공급원은 화학적으로 규정되지 않은 화합물, 즉 그들의 화학식에 의해 알려지지 않은 화합물로 구성되는 영양소 공급원이며, 바람직하게는 규정되지 않은 유기 질소- 및/또는 탄소-함유 화합물을 포함한다. 이와 대조적으로, "화학적으로 규정된 영양소 공급원" (예를 들어, "화학적으로 규정된 탄소 공급원" 또는 "화학적으로 규정된 질소 공급원") 은 화학적으로 규정된 화합물로 구성된 영양소 공급원에 사용되는 것으로 이해된다. 화학적으로 규정된 성분은 이의 화학식으로 알려진 성분이다. 복합 질소 공급원은 바람직하게는 유기 질소 함유 화합물, 예를 들어, 알려지지 않은 조성을 갖는 단백질 및/또는 아미노산을 포함하는, 하나 이상의 화학적으로 규정되지 않은 질소 함유 화합물, 즉, 그들의 화학식에 의해 알려지지 않은 질소 함유 화합물로 구성되는 영양소 공급원이다. 복합 탄소 공급원은 바람직하게는 유기 탄소 함유 화합물, 예를 들어, 알려지지 않은 조성을 갖는 탄수화물을 포함하는, 하나 이상의 화학적으로 규정되지 않은 탄소 함유 화합물, 즉, 그들의 화학식에 의해 알려지지 않은 탄소 함유 화합물로 구성되는 탄소 공급원이다. 복합 영양소 공급원은 상이한 복합 영양소 공급원의 혼합물일 수 있음은 당업자에게 명백하다. 따라서, 복합 질소 공급원은 복합 탄소 공급원을 포함할 수 있고 그 반대도 가능하며, 복합 질소 공급원은 탄소 공급원으로서 기능하고 그 반대도 가능한 방식으로 세포에 의해 대사될 수 있다.

바람직하게는, 복합 영양소 공급원은 복합 질소 공급원이다. 질소의 복합 공급원은 단백질-함유 물질, 예컨대 미생물, 동물 또는 식물 세포로부터의 추출물, 예를 들어, 식물 단백질 조제물, 대두 가루, 옥수수 가루, 완두콩 가루, 옥수수 글루텐, 면 가루, 땅콩 가루, 감자 가루, 고기, 카세인, 젤라틴, 유청, 어분, 효모 단백질, 효모 추출물, 트립톤, 펩톤, 박토-트립톤, 박토-펩톤, 미생물 세포, 식물, 고기 또는 동물 사체 처리 폐기물, 및 이의 조합을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일 구현예에서, 복합 질소 공급원은 식물 단백질, 바람직하게는, 감자 단백질, 대두 단백질, 옥수수 단백질, 땅콩, 면 단백질, 및/또는 완두콩 단백질, 카세인, 트립톤, 펩톤 및 효모 추출물 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

바람직하게는, 발효 배지는 또한 규정된 배지 성분을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 발효 배지는 또한 규정된 질소 공급원을 포함한다. 무기 질소 공급원의 예는 암모늄, 니트레이트 및 니트라이트, 및 이들의 조합물이다. 바람직한 구현예에서, 발효 배지는 질소 공급원을 포함하고, 질소 공급원은 복합 또는 규정된 질소 공급원 또는 이의 조합이다. 일 구현예에서, 규정된 질소 공급원은 암모니아, 암모늄, 암모늄 염, (예를 들어, 암모늄 클로라이드, 암모늄 나이트레이트, 암모늄 포스페이트, 암모늄 술페이트, 암모늄 아세테이트), 우레아, 나이트레이트, 나이트레이트 염, 나이트라이트, 및 아미노산, 바람직하게는 글루타메이트, 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

바람직하게는, 복합 영양소 공급원은 발효 배지의 2 내지 15% (v/w) 의 양으로 있다. 또다른 구현예에서, 복합 영양소 공급원은 발효 배지의 3 내지 10% (v/w) 의 양으로 있다.

또한 바람직하게는, 복합 발효 배지는 탄소 공급원을 더 포함할 수 있다. 탄소 공급원은 바람직하게는, 복합 또는 규정된 탄소 공급원 또는 이의 조합이다. 바람직하게는, 복합 영양소 공급원은 탄수화물 공급원을 포함한다. 다양한 당 및 당-함유 물질이 탄소의 적합한 공급원이고, 당은 상이한 중합 단계로 존재할 수 있다. 본 발명에서 사용되는 바람직한 복합 탄소 공급원은 당밀, 옥수수 침지액, 사탕수수당, 덱스트린, 전분, 전분 가수분해물, 및 셀룰로스 가수분해물, 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직한 규정된 탄소 공급원은 탄수화물, 유기산, 및 알코올, 바람직하게는, 포도당, 프룩토스, 갈락토스, 자일로스, 아라비노스, 수크로스, 말토스, 락토스, 아세트산, 프로피온산, 락트산, 포름산, 말산, 시트르산, 푸마르산, 글리세롤, 이노시톨, 만니톨 및 솔비톨, 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직하게는, 규정된 탄소 공급원은 20% 이하, 바람직하게는 10% 이하, 더욱 바람직하게는 5% 이하의 불순물을 포함할 수 있는, 시럽의 형태로 제공된다. 일 구현예에서, 탄소 공급원은 사탕무 시럽, 사탕수수 시럽, 옥수수 시럽, 바람직하게는, 고 프룩토스 옥수수 시럽이다. 또다른 구현예에서, 복합 탄소 공급원은 당밀, 옥수수 침지액, 덱스트린, 및 전분, 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 규정된 탄소 공급원은 글루코스, 프룩토스, 갈락토스, 자일로스, 아라비노스, 수크로스, 말토스, 덱스트린, 락토스, 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

바람직하게는, 발효 배지는 복합 질소 및 복합 탄소 공급원을 포함하는 복합 배지이다. 더욱 바람직하게는, 발효 배지는 복합 질소 및 탄소 공급원을 포함하는 복합 배지이고, 복합 질소 공급원은 WO 2004/003216에 기술된 바와 같이 부분적으로 가수분해될 수 있다.

그러나, 발효 배지는 전형적으로 또한 본원의 다른 곳에서 추가로 기재된 바와 같이 수소 공급원, 산소 공급원, 황 공급원, 인 공급원, 마그네슘 공급원, 나트륨 공급원, 칼륨 공급원, 미량 원소 공급원, 및 비타민 공급원을 포함할 수 있다.

또다른 구현예에서, 발효 배지는 화학적으로 규정된 발효 배지일 수 있다. 화학적으로 규정된 발효 배지는 공지된 농도로 화학적으로 규정된 성분으로 본질적으로 구성된 발효 배지이다. 화학적으로 규정된 성분은 이의 화학식으로 알려진 성분이다. 화학적으로 규정된 성분으로 본질적으로 구성된 발효 배지는 복합 영양소 공급원, 특히 복합 탄소 및/또는 복합 질소 공급원을 함유하지 않는, 즉 화학적으로 규정되지 않은 조성을 갖는 복합 원료를 함유하지 않는 배지를 포함한다. 화학적으로 규정된 성분으로 본질적으로 구성된 발효 배지는 본질적으로 적은 양의 복합 영양소 공급원, 예를 들어, 하기 규정된 양의 복합 질소 및/또는 탄소 공급원을 포함하는 배지를 더 포함할 수 있으며, 이는 전형적으로 바실러스 숙주 세포의 성장을 유지하고/하거나 충분한 양의 바이오매스의 형성을 보장하기에 충분하지 않다.

이와 관련하여, 복합 원료는, 예를 들어, 복합 이종중합성 화합물 중에서 많은 상이한 화합물을 포함하고 있고, 계절적 변동 및 지리적 기원의 차이에 의해 다양한 조성을 가지고 있다는 사실로 인해 화학적으로 규정되지 않은 조성을 갖는다. 발효에서 복합 탄소 및/또는 질소 공급원으로서 기능하는 복합 원료의 전형적인 예는 대두박, 목화씨박, 옥수수 침지액, 효모 추출물, 카제인 가수분해물, 당밀 등이다. 본질적으로 소량의 복합 탄소 및/또는 질소 공급원이 본 발명에 따른 화학적으로 규정된 발효 배지 내에, 예를 들어 주 발효를 위한 접종원으로부터의 이월로서 존재할 수 있다. 주 발효를 위한 접종원은 화학적으로 규정된 배지에서의 발효에 의해 반드시 수득되는 것은 아니다. 가장 빈번하게는, 접종원으로부터의 이월은 주 발효의 화학적으로 규정된 발효 배지 내의 소량의 복합 질소 공급원의 존재를 통해 검출가능할 것이다. 복합 탄소 및/또는 질소 공급원과 같은 소량의 복합 배지 성분이 또한 소량의 이들 복합 성분을 발효 배지에 첨가함으로써 발효 배지 내로 도입될 수 있다. 예를 들어, 바이오매스의 형성을 가속화하기 위해, 즉 미생물의 성장 속도를 증가시키기 위해, 및/또는 내부 pH 제어를 용이하게 하기 위해, 주 발효를 위한 접종원의 발효 공정에서 복합 탄소 및/또는 질소 공급원을 사용하는 것이 유리할 수 있다. 동일한 이유로, 주 발효의 초기 단계에 본질적으로 소량의 복합 탄소 및/또는 질소 공급원, 예를 들어 효모 추출물을 첨가하는 것이 유리할 수 있으며, 특히 발효 공정의 초기 단계에서 바이오매스 형성을 가속화시킬 수 있다. 본 발명에 따른 발효 공정에서 화학적으로 규정된 발효 배지에 첨가될 수 있는 본질적으로 적은 양의 복합 영양소 공급원은 발효 공정에서 첨가되는, 각각의 영양소의 총량의 최대 10% 의 양인 것으로 정의된다. 특히, 화학적으로 규정된 발효 배지에 첨가될 수 있는 본질적으로 적은 양의 복합 탄소 및/또는 질소 공급원은 발효 공정에서 첨가되는, 탄소의 총량의 최대 10% 를 초래하는 복합 탄소 공급원의 양 및/또는 질소의 총량의 최대 10% 를 초래하는 복합 질소 공급원의 양, 바람직하게는 탄소의 총량의 최대 5% 를 초래하는 복합 탄소 공급원의 양 및/또는 질소의 총량의 최대 5% 를 초래하는 복합 질소 공급원의 양, 더욱 바람직하게는 발효 공정에서 첨가되는, 탄소의 총량의 최대 1% 를 초래하는 복합 탄소 공급원의 양 및/또는 질소의 총량의 최대 1% 를 초래하는 복합 질소 공급원의 양인 것으로 정의된다. 바람직하게는, 발효 공정에서 첨가되는 탄소의 총량의 최대 10% 및/또는 질소의 총량의 최대 10%, 바람직하게는 탄소의 총량의 최대 5% 의 양 및/또는 질소의 총량의 최대 5% 의 양, 더욱 바람직하게는 탄소의 총량의 최대 1% 의 양 및/또는 질소의 총량의 최대 1% 의 양은 접종원으로부터 이월을 통해 첨가된다. 가장 바람직하게는, 복합 탄소 및/또는 복합 질소 공급원은 발효 공정에서 발효 배지에 첨가되지 않는다.

본원에서 예를 들어, 화학적으로 규정된 탄소 공급원 또는 화학적으로 규정된 질소 공급원으로 언급되는 화학적으로 규정된 영양소 공급원은 화학적으로 규정된 화합물로 구성된 영양소 공급원에 사용되는 것으로 이해된다.

화학적으로 규정된 발효 배지에서 미생물을 배양하는 것은, 화학적으로 규정된 수소 공급원, 화학적으로 규정된 산소 공급원, 화학적으로 규정된 탄소 공급원, 화학적으로 규정된 질소 공급원, 화학적으로 규정된 황 공급원, 화학적으로 규정된 인 공급원, 화학적으로 규정된 마그네슘 공급원, 화학적으로 규정된 나트륨 공급원, 화학적으로 규정된 칼륨 공급원, 화학적으로 규정된 미량 원소 공급원, 및 화학적으로 규정된 비타민 공급원으로 이루어진 군으로부터 선택된 다양한 화학적으로 규정된 영양소 공급원을 함유하는 배지에서 세포가 배양될 것을 요구한다. 바람직하게는, 화학적으로 규정된 탄소 공급원은 탄수화물, 유기산, 탄화수소, 알코올 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직한 탄수화물은 글루코스, 프룩토스, 갈락토스, 자일로스, 아라비노스, 수크로스, 말토스, 말토트리오스, 락토스, 덱스트린, 말토덱스트린, 전분 및 이눌린, 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직한 알코올은 글리세롤, 메탄올 및 에탄올, 이노시톨, 만니톨 및 소르비톨 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직한 유기산은 아세트산, 프로피온산, 락트산, 포름산, 말산, 시트르산, 푸마르산 및 고급 알칸산 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직하게는, 화학적으로 규정된 탄소 공급원은 글루코스 또는 수크로스를 포함한다. 더욱 바람직하게는, 화학적으로 규정된 탄소 공급원은 글루코스를 포함하고, 더 더욱 바람직하게는 화학적으로 규정된 탄소 공급원의 우세한 양이 글루코스로서 제공된다.

가장 바람직하게는, 화학적으로 규정된 탄소 공급원은 글루코스이다. 본원의 다른 곳에 나타낸 바와 같이, 글루코스는 바람직한 1 차 탄소 공급원일 수 있다. 화학적으로 규정된 탄소 공급원은 시럽의 형태, 바람직하게는 글루코스 시럽으로서 제공될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 본원에서 이해되는 바와 같이, 본원에서 지칭되는 글루코스는 글루코스 시럽을 포함할 것이다. 글루코스 시럽은 높은 당 농도를 갖는 점성의 당 용액이다. 글루코스 시럽의 당은 주로 글루코스이고, 미미한 정도로 또한 시럽의 품질 등급에 따라 다양한 농도로의 말토오스 및 말토트리오스이다. 바람직하게는, 글루코스, 말토오스 및 말토트리오스 이외에, 시럽은 10% 이하, 바람직하게는 5% 이하, 더욱 바람직하게는 3% 이하의 불순물을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 글루코스 시럽은 옥수수로부터 유래한다.

화학적으로 규정된 질소 공급원은 바람직하게는 우레아, 암모니아, 니트레이트, 니트레이트 염, 니트라이트, 염화암모늄, 황산암모늄, 아세트산암모늄, 인산암모늄 및 질산암모늄과 같은 암모늄염, 및 글루타메이트 또는 리신과 같은 아미노산 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 더욱 바람직하게는, 화학적으로 규정된 질소 공급원은 암모니아, 황산암모늄 및 인산암모늄으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 가장 바람직하게는, 화학적으로 규정된 질소 공급원은 암모니아이다. 화학적으로 규정된 질소 공급원으로서 암모니아의 사용은 암모니아가 추가적으로 pH 조절제로서 기능할 수 있다는 장점을 갖는다.

추가의 화합물이 하기에 기재된 바와 같이 복합 및 화학적으로 규정된 발효 배지 중에 첨가될 수 있다.

산소는 일반적으로 교반 및/또는 가스공급에 의한 발효 배지의 통기에 의해 세포의 배양 동안 제공된다. 수소는 일반적으로 수성 발효 배지 내의 물의 존재로 인해 제공된다. 그러나, 수소 및 산소가 또한 탄소 및/또는 질소 공급원 내에 함유되고, 그러한 방식으로 제공될 수 있다.

마그네슘은 바람직하게는 염화마그네슘, 황산마그네슘, 질산마그네슘, 인산마그네슘 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 마그네슘 염, 또는 수산화마그네슘, 또는 하나 이상의 마그네슘 염 및 수산화마그네슘의 조합에 의해 발효 배지에 제공될 수 있다.

나트륨은 바람직하게는 염화나트륨, 질산나트륨, 황산나트륨, 인산나트륨, 수산화나트륨, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 나트륨 염에 의해 발효 배지에 첨가될 수 있다.

칼슘은 바람직하게는 황산칼슘, 염화칼슘, 질산칼슘, 인산칼슘, 수산화칼슘, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 칼슘 염에 의해 발효 배지에 첨가될 수 있다.

칼륨은 바람직하게는 염화칼륨, 질산칼륨, 황산칼륨, 인산칼륨, 수산화칼륨, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 칼륨 염에 의해 화학적으로 규종된 형태로 발효 배지에 첨가될 수 있다.

인은 바람직하게는 인산칼륨, 인산나트륨, 인산마그네슘, 인산, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 인을 포함하는 염에 의해 발효 배지에 첨가될 수 있다. 바람직하게는, 적어도 1 g 의 인이 초기 발효 배지 리터 당 첨가된다.

황은 바람직하게는 황산칼륨, 황산나트륨, 황산마그네슘, 황산, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 황을 포함하는 염에 의해 발효 배지에 첨가될 수 있다.

바람직하게는, 발효 배지 및/또는 초기 발효 배지는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함한다:

발효 배지 리터 당 0.1 내지 50 g 질소;

발효 배지 리터 당 1 내지 6 g 인;

발효 배지 리터 당 0.15 내지 2 g 황;

발효 배지 리터 당 0.4 내지 8 g 칼륨;

발효 배지 리터 당 0.01 내지 2 g 나트륨;

발효 배지 리터 당 0.01 내지 3 g 칼슘; 및

발효 배지 리터 당 0.1 내지 10 g 마그네슘;

전형적으로, 공급 용액은 상기 열거된 상기 그룹의 하나 이상의 화합물에서, 발효 배지 및/또는 초기 발효 배지와 상이하다. 더 더욱 전형적으로, 공급 용액은 상기 열거된 상기 그룹의 하나 이상의 화합물의 양으로, 발효 배지 및/또는 초기 발효 배지와 상이하다.

하나 이상의 미량 원소 이온은 발효 배지에, 바람직하게는 각각 10 mmol/L 미만의 초기 발효 배지의 양으로 첨가될 수 있다. 이들 미량 원소 이온은 철, 구리, 망간, 아연, 코발트, 니켈, 몰리브덴, 셀레늄, 및 붕소 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직하게는, 미량 원소 이온 철, 구리, 망간, 아연, 코발트, 니켈, 및 몰리브덴이 발효 배지에 첨가된다. 바람직하게는, 하나 이상의 미량 원소 이온은 철의 초기 배지 리터 당 50 μmol 내지 5 mmol, 초기 배지 구리의 리터 당 40 μmol 내지 4 mmol, 초기 배지 망간의 리터 당 30 μmol 내지 3 mmol, 초기 배지 아연의 리터 당 20 μmol 내지 2 mmol, 초기 배지 코발트의 리터 당 1 μmol 내지 100 μmol, 초기 배지 니켈의 리터 당 2 μmol 내지 200 μmol, 및 초기 배지 몰리브덴의 리터 당 0.3 μmol 내지 30 μmol, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 양으로 발효 배지에 첨가된다. 각각의 미량 원소를 첨가하기 위하여 바람직하게는 클로라이드, 포스페이트, 술페이트, 니트레이트, 시트레이트 및 아세테이트 염으로 이루어진 군으로부터 하나 이상을 사용할 수 있다.

발효 배지에 임의로 포함될 수 있는 화합물은 킬레이트제, 예컨대 시트르산, MGDA, NTA, 또는 GLDA, 및 완충제, 예컨대 모노- 및 디칼륨 포스페이트, 칼슘 카르보네이트 등이다. 완충제는 바람직하게는 외부 pH 조절 없이 공정을 처리할 때 첨가된다. 또한, 발효 공정 전 및/또는 중에 소포제가 투여될 수 있다.

비타민은 구조적으로 무관한 유기 화합물의 그룹을 의미하며, 이들은 세포의 정상적인 대사를 위해 필요하다. 세포는 필요한 비타민을 합성하는 능력이 매우 다양한 것으로 알려져 있다. 비타민을 합성할 수 없는 바실러스 세포의 발효 배지에는 상기 비타민을 첨가해야 한다. 비타민은 티아민, 리보플라빈, 피리독살, 니코틴산 또는 니코틴아미드, 판토텐산, 시아노코발라민, 엽산, 비오틴, 리포산, 퓨린, 피리미딘, 이노시톨, 콜린 및 헤민의 군으로부터 선택될 수 있다.

바람직하게는, 발효 배지는 또한 세포의 선별가능 마커가 내성을 제공하는, 선별제, 예를 들어, 항생제, 예컨대 암피실린, 테트라사이클린, 카나마이신, 하이그로마이신, 블레오마이신, 클로람페니콜, 스트렙토마이신 또는 플레오마이신을 포함한다.

배지에 첨가되는 필요한 화합물의 양은 주로 발효 공정에서 형성될 바이오매스의 양에 의존할 것이다. 형성된 바이오매스의 양은 광범위하게 다양할 수 있으며, 전형적으로 바이오매스의 양은 발효 브로스의 리터 당 건조 세포 질량의 약 10 내지 약 150 그램이다. 보통, 단백질 생산을 위해, 발효 브로스의 리터 당 건조 세포 질량의 약 10 g 보다 낮은 양의 바이오매스를 생산하는 발효는 산업적으로 관련성이 없는 것으로 간주된다.

규정된 배지의 각 성분의 최적량 뿐만 아니라 어떤 화합물이 필수적이고 어떤 화합물이 필수적이지 않은지는 배지에서 발효에 적용되는 바실러스 세포의 유형, 바이오매스의 양 및 형성될 생성물에 따라 달라질 것이다. 전형적으로, 미생물 세포의 성장에 필요한 배지 성분의 양은 발효에 사용되는 탄소 공급원의 양과 관련하여, 전형적으로 주요 탄소 공급원과 관련하여 결정될 수 있는데, 이는 형성된 바이오매스의 양이 일차적으로 사용되는 탄소 공급원의 양에 의해 결정될 것이기 때문이다.

특히 바람직한 발효 배지는 또한 하기 실시예에 기재되어 있다.

바람직하게는, 발효 배지는 접종된 미생물 세포와 상이한, 발효 과정 중 미생물의 성장을 방지 또는 감소시키기 위해 사용 전에 멸균된다. 멸균은 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 비제한적으로 오토클레이빙 또는 멸균 여과로 수행될 수 있다. 일부 또는 모든 배지 성분은 멸균 처리 동안 배지 성분의 상호작용을 피하거나 또는 멸균 조건 하에서 배지 성분의 분해를 피하기 위해 다른 배지 성분과 별도로 멸균될 수 있다.

"바실러스 숙주 세포의 성장 및 관심 단백질의 발현에 도움이 되는 조건" 이란 구는 배양에 사용되는 온도 또는 발효 배지 이외의 조건을 의미한다. 이러한 조건은 배양 동안의 pH, 진탕 또는 교반에 의한 배양물의 물리적 이동 및/또는 배양물에 적용되는 대기 조건을 포함한다.

배양 중에 발효 배지의 pH 는 조절되거나 유지될 수 있다. 바람직하게는, 접종 전 배지의 pH 가 조정된다. 발효 배지에 대해 예상되는 바람직한 pH 값은 약 pH 6.6 내지 약 pH 9 의 범위, 바람직하게는 약 pH 6.6 내지 약 pH 8.5 의 범위, 더욱 바람직하게는 약 pH 6.8 내지 약 pH 8.5 의 범위, 가장 바람직하게는 약 pH 6.8 내지 약 pH 8.0 의 범위이다. 예로서, 바실러스 세포 숙주 세포 배양물에 대해, pH 는 바람직하게는 약 pH 6.8, 약 pH 7.0, 약 pH 7.2, 약 pH 7.4, 또는 약 pH 7.6 으로 또는 그 이상으로 조정된다. 바람직하게는, 바실러스 숙주 세포 배양물의 배양 동안 발효 배지의 pH 는 약 pH 6.8 내지 약 pH 9, 바람직하게는 약 pH 6.8 내지 약 pH 8.5, 더욱 바람직하게는 약 pH 7.0 내지 약 pH 8.5, 가장 바람직하게는 약 pH 7.2 내지 약 pH 8.0 의 범위 내의 PH 로 조정된다.

물리적 이동은 발효 배지의 교반 및/또는 진탕에 의해 적용될 수 있다. 바람직하게는, 상기 발효 배지의 교반은 약 50 내지 약 2000 rpm, 바람직하게는 약 50 내지 약 1600 rpm, 더욱 바람직하게는 약 800 내지 약 1400 rpm, 더욱 바람직하게는 약 50 내지 약 200 rpm 으로 수행된다.

교반 이외에, 산소 및/또는 다른 가스가 적절한 대기 조건을 조정함으로써 배양물에 적용될 수 있다. 바람직하게는, 산소는 0 내지 3 bar 의 공기 또는 산소로 공급된다.

또한, 바실러스 숙주 세포의 배양을 위한 적합한 생물반응기 또는 용기의 선택을 포함하는 추가 조건은 당업계에 잘 알려져 있으며, 당업자에 의해 더 이상의 어려움 없이 제조될 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "공급 용액" 은 초기 발효 배지에 바실러스 숙주 세포를 접종한 후, 발효 배지에 첨가되는 용액을 의미한다. 초기 발효 배지는 전형적으로 바실러스 숙주 세포로의 접종 시에 발효조에 존재하는 발효 배지를 의미한다. 공급 용액은 상기 세포의 성장을 지지하는 화합물을 포함한다. 발효 배지와 비교하여, 공급 용액은 하나 이상의 화합물에 대해 풍부할 수 있다.

예를 들어, 배양이 공급-배치 모드로 실행될 때 사용되는 공급 배지 또는 공급 용액은 임의의 상기 언급된 배지 성분 또는 이들의 조합일 수 있다. 공급 용액으로서 제공되는 화합물의 적어도 일부는 상기 화합물의 공급 전에 발효 배지 내에 특정 정도로 이미 존재할 수 있는 것으로 이해된다. . 바람직하게는, 상기 공급 용액은 전형적으로 제 1 배양 단계 및/또는 제 2 배양 단계에서 적어도 하나의 탄수화물을 포함하는 1차 탄소 공급원을 제공한다. 더욱 바람직하게는, 공급 용액에 포함된 탄수화물은 숙주 세포에 의해 소비되거나 대사되는 탄소의 주요 공급원을 나타낸다. 더 더욱 바람직하게는, 공급 용액은 화학적으로 규정된 탄소 공급원, 바람직하게는 글루코스를 포함한다. 더 더욱 바람직하게는, 공급 용액은 40% 내지 60% 글루코스, 바람직하게는 42% 내지 58% 글루코스, 더욱 바람직하게는 45% 내지 55% 글루코스, 더 더욱 바람직하게는 47% 내지 52% 글루코스 및 가장 바람직하게는 50% 글루코스를 포함한다. 더 더욱 바람직하게는, 글루코스는 공급 용액 및/또는 발효 배지 내에 존재하는 주요 탄소 공급원이다. 전형적으로, 동일한 공급 용액이 공급배치 모드로 작동하는 시드 발효기 및 생산 생물반응기에 사용될 수 있다. 공급배치 모드로 작동하는 시드 발효기에 사용되는 공급 용액은 생산 생물반응기에 사용되는 공급 용액과 상이할 수 있다. 그러나, 공급배치 모드에서 시드 발효기 실행을 위해 사용되는 공급 용액 및 생산 생물반응기에서 사용되는 공급 용액은 동일한 농도의 글루코스를 가질 수 있지만, 생산 생물반응기에서 사용되는 공급 용액은 공급배치 모드에서 시드 발효기 실행을 위해 사용되는 공급 용액에 존재하지 않는 염을 포함한다.

다양한 공급 프로파일은 해당 기술 분야에 알려져 있다. 공급 용액은 발효 공정 동안 연속적으로 또는 불연속적으로 첨가될 수 있다. 공급 용액의 불연속적인 첨가는 발효 공정 동안 단일 볼루스로서 한번 또는 상이하거나 동일한 부피로 여러 번 발생할 수 있다. 공급 용액의 연속적인 첨가는 발효 공정 동안 동일하거나 또는 다양한 속도 (즉, 시간당 부피) 로 발생할 수 있다. 또한, 연속 및 불연속 공급 프로파일의 조합이 발효 공정 동안 적용될 수 있다. 공급 용액으로서 제공되는 발효 배지의 성분은 하나의 공급 용액 또는 상이한 공급 용액으로서 첨가될 수 있다. 하나 이상의 공급 용액이 적용되는 경우, 공급 용액은 전술한 바와 같이 동일하거나 상이한 공급 프로파일을 가질 수 있다.

특히 바람직한 공급 용액은 또한 하기 실시예에 기재되어 있다.

본원에서 용어 "제 1 온도" 는 제 1 배양 단계 동안 바실러스 숙주 세포 배양물을 배양하는데 사용되는 온도를 의미한다. 제 1 온도는 제 1 배양 단계 동안 일정하게 적용되는 것으로 이해될 것이다. 또한, 제 1 온도는 바실러스 숙주 세포의 성장 및 관심 단백질의 발현을 허용하는 온도일 것이다. 바람직하게는, 상기 제 1 온도는 약 28℃ 내지 약 32℃, 약 29℃ 내지 약 31℃ 의 범위 내이고, 바람직하게는 약 30℃ 이다.

본 발명의 방법은 추가로, 바실러스 숙주 세포의 성장 및 관심 단백질의 발현에 도움이 되는 조건 하에서 이전 단계에서 수득된 바실러스 숙주 세포 배양물을 제 2 배양 단계 동안 배양하는 단계로서, 배양은 적어도 하나의 공급 용액의 첨가를 포함하고, 제 2 배양 단계 동안 배양은 제 2 온도에서 수행되고, 상기 제 2 온도는 제 1 온도보다 높은 단계를 포함한다.

본원에서 용어 "제 2 배양 단계" 는 제 2 온도에서 배양이 수행되는 제 2 기간을 의미한다. 상기 기간은 배양물의 파라미터, 예를 들어, 박테리아 성장 속도, 탄소 공급원 소비 속도, 발효 배지에 제공된 탄소 공급원의 양 등에 따라 미리 결정되거나 가변적일 수 있다. 상기 적어도 하나의 공급 용액은 일정한 속도로, 감소하는 속도로 또는 제 1 배양 단계 동안 적용되는 속도보다 증가하는 속도로 탄소 공급원을 제공할 것이다. 그러나, 상기 일정한 속도 또는 상기 감소하는 속도의 시작 속도 또는 단계 (b) 에서의 속도 미만으로 증가하는 상기 속도의 시작 속도는 제 1 배양 단계의 최대 속도 미만이다. 바람직하게는, 본원에서 언급된 바와 같은 공급 용액에 의해 제공되는 탄소 공급원의 속도의 증가 정도는 개별 또는 일정하게 적용된 공급 용액 양을 비교하고, 예를 들어 상기 증가에 대한 인자를 결정함으로써 결정될 수 있다. 공급 용액에 의해 제공되는 탄소 공급원에 대하여 제 1 및 제 2 배양 단계의 증가 인자를 비교하여, 상기 탄소 공급원이 제 1 배양 단계보다 덜 증가하는 속도로 제 2 배양 단계에서 공급되는지 여부를 판단할 수 있다. 상기 제 2 기간은 배양물의 파라미터, 예를 들어, 박테리아 성장 속도, 탄소 공급원 소비 속도, 발효 배지에 제공된 탄소 공급원의 양 등에 따라 미리 결정되거나 가변적일 수 있다. 제 2 배양 단계에서, 적어도 하나의 공급 용액이 일정한 속도로 탄소 공급원을 제공할 때 바실러스 숙주 세포 배양물의 일정한 성장이 있을 것이다. 바람직하게는, 상기 제 2 배양 단계는 적어도 약 3h 내지 약 120h, 적어도 약 3h 내지 약 96h, 적어도 약 40h 내지 약 120h, 또는 바람직하게는 적어도 약 40h 내지 약 96h 의 시간 동안 수행된다. 제 2 배양 기간의 시간 기간을 어떻게 정해야 하는지 당업자는 잘 알고 있다. 바람직하게는, 적어도 하나의 공급 용액은 일정한 속도에서 탄소 공급원을 제공하고, 이것은 바람직하게는 제 1 배양 단계에서 적용되는 적어도 하나의 탄소 공급원에 대한 최대 공급 속도의 약 70% 내지 약 20% 의 범위 내, 바람직하게는 약 50% 내지 약 30% 의 범위 내, 더욱 바람직하게는 약 35% 이다. 상기 제 2 배양 단계에서 바실러스 숙주 세포는 바실러스 숙주 세포의 성장 및 관심 단백질의 발현을 허용하는 조건 하에서 배양된다.

본원에서 용어 "제 2 온도" 는 제 2 배양 단계 동안 바실러스 숙주 세포 배양물을 배양하는데 사용되는 온도를 의미한다. 제 2 온도는 제 2 배양 단계 동안 일정하게 적용되는 것으로 이해될 것이다. 또한, 제 2 온도는 바실러스 숙주 세포의 성장 및 관심 단백질의 발현을 허용하는 온도일 것이다. 바람직하게는, 상기 제 2 온도는 약 33℃ 내지 약 37℃, 약 34℃ 내지 약 36℃ 의 범위 내인, 또는 바람직하게는 약 35℃ 이다.

상기 제 2 온도는 제 1 온도보다 높을 수 있다. 바람직하게는, 상기 제 1 및 상기 제 2 온도는 약 3℃ 내지 약 7℃, 약 4℃ 내지 약 6℃, 또는 바람직하게는 약 5℃ 만큼 상이하다.

바람직하게는, 제 1 배양 단계의 제 2 배양 단계 viz-a-viz 에서의 온도 증가는 관심 단백질의 수율을 증가시킨다. 더욱 바람직하게는, 상기 제 1 및 제 2 온도가 동일한, 본 발명에 따른 방법을 수행함으로써 수득된 대조군에 비해 단계 c) 후에 수득된 관심 단백질의 수율이 유의하게 증가된다. 더욱 바람직하게는, 상기 수율은 적어도 40%, 적어도 60%, 적어도 80%, 적어도 100%, 적어도 200%, 적어도 300% 또는 적어도 400% 증가된다.

수율의 증가는 관심 단백질의 특이적 정량을 허용하는 임의의 기술에 의해 관심 단백질에 의존하여 결정될 수 있다. 일부 기술은 본 명세서의 다른 곳에서 지칭된다. 본원에서 언급되는 바와 같이, 상기 증가는 대조군과 비교하여 증가이다. 대조군은 바람직하게는, 본 발명의 방법의 단계를 갖는 방법에 의해 배양된 바실러스 숙주 세포 배양물이며, 상기 제 1 및 상기 제 2 온도는 동일하며, 즉 단계 b) 와 단계 c) 사이에 온도 증가가 없는 방법이다. 따라서, 수율 증가를 결정하기 위해, 본 발명의 방법에 따라 배양된 바실러스 숙주 세포 배양물 및 대조군 바실러스 숙주 세포 배양물에서 관심 단백질의 양을 결정한다. 두 결정된 양은 수율 증가를 계산하기 위해 서로 비교된다. 이러한 수율의 증가가 통계적으로 유의한지 여부는 당업자에게 잘 알려진 다양한 통계 시험에 의해 결정될 수 있다. 전형적인 시험은 Student's t-시험 또는 Mann-Whitney U 시험이다.

제 2 배양 단계가 완료된 후, 즉 단계 c) 후에, 바실러스 숙주 세포 배양물을 추가로 처리할 수 있다. 바람직하게는, 관심 단백질은 상기 바실러스 숙주 세포 배양물로부터 수득된다. 더욱 바람직하게는, 관심 단백질은 정제에 의해 바실러스 숙주 세포 배양물로부터 수득된다.

관심 단백질의 성질에 따라, 적합한 기술이 선택될 수 있다. 예를 들어, 관심 단백질이 발효 브로스 내로 분비되면, 바실러스 세포는 배양액으로부터 분리될 수 있고 관심 단백질은 발효 브로스의 액체 부분으로부터 정제될 수 있다. 관심 단백질이 세포 단백질인 경우, 즉 바실러스 숙주 세포 내에 존재하는 경우, 이는 발효 브로스로부터 바실러스 숙주 세포를 분리하고, 후속적으로 상기 숙주 세포를 용해시키고, 배양물의 용해된 바실러스 숙주 세포로부터 관심 단백질을 정제함으로써 정제될 수 있다. 대안적으로, 단계 c) 이후의 배양물에 존재하는 바실러스 숙주 세포는 용해될 수 있고, 관심 단백질은 발효 브로스에서 용해된 바실러스 숙주 세포로부터 정제될 수 있다.

관심 단백질의 정제는 선택된 기술에 의존할 수 있으며, 물리적 분리, 예컨대 원심분리, 증발, 동결-건조, 여과 (특히, 한외여과) 전기영동 (분취용 SDS PAGE 또는 등전 포커싱 전기영동), 초음파 및/또는 압력, 또는 화학적 처리, 예컨대 화학적 침전, 결정화, 추출 및/또는 효소 처리 단계를 포함한다. 크로마토그래피 (예를 들어, 이온 교환, 소수성, 크로마토포커싱, 및 크기 배제 크로마토그래피) 가 또한 적용될 수 있다. 항체-기반 친화성 크로마토그래피 또는 정제 태그를 사용하는 기술을 포함하는 친화성 크로마토그래피가 또한 사용될 수 있다. 적합한 기술은 당업계에 잘 알려져 있으며, 당업자가 관심 있는 단백질에 따라 추가 어려움 없이 적용할 수 있다.

더욱이, 본 발명의 방법은 또한 전술한 바와 같이 정제된 관심 단백질의 처리를 포함하는 추가의 처리를 포함할 수 있다. 이러한 처리는 관심 단백질에 대한 소포제 또는 안정화제의 첨가와 같은 정제를 개선하는 화학적 및/또는 물리적 처리를 포함할 수 있다. 본 발명의 방법은 또한 관심 단백질, 특히 캡슐, 과립, 분말, 액체 등을 포함하는 상업적 제품 또는 물품을 수득하기 위한 제조 단계를 포함할 수 있다.

바람직하게는, 본 발명의 방법은 관심 단백질을 포함하는 정제된 또는 부분 정제된 조성물의 제조에 사용될 수 있다. 더욱 바람직하게, 본 발명의 방법은 정제된 또는 부분 정제된 형태의 관심 단백질을 제공한다.

유리하게는, 본 발명의 기초가 되는 실험에서, 관심 단백질의 제조를 위한 바실러스 숙주 세포를 배양할 때, 제 2 단계 동안 증가된 배양 온도를 사용하는 2 단계 배양은 상기 배양된 바실러스 세포에서 관심 단백질의 생산을 증가시키는 것으로 밝혀졌다. 특히, 상기 제 1 및 상기 제 2 배양 단계 사이의 약 5℃ 의 온도 이동이 온도 이동을 받지 않은 대조군 배양물과 비교하여 바실러스 숙주 세포에 의해 제조된 관심 단백질의 수율을 유의적으로 그리고 전형적으로 바실러스 세포 및 관심 단백질에 의존적으로 적어도 40% 내지 적어도 400% 의 범위로 증가시킬 수 있는 것으로 밝혀졌다. 온도 이동에 의해 달성되는 이러한 효과는 배양된 바실러스 숙주 세포에서의 유전자 발현에 대한 일반적인 효과일 것이며, 특정 발현 제어 서열의 사용에 독립적일 것이다. 따라서, 본 발명 덕에, 관심 단백질의 미생물 생산을 목적으로 하는 발효 공정에서의 수율을 범용적인 배양 방법에 의해서 증가시킬 수 있다. 상기 방법은 기존의 생산 방식에 용이하게 포함될 수 있고, 단지 단일 파라미터, 즉 배양 중에 적용되는 온도를 변화시키는 것을 요구한다.

앞서의 용어의 설명 및 해석은 하기 본원에 기재되는 구현예에 준용된다.

하기 구현예는 본 발명의 방법의 바람직한 구현예이다.

본 발명의 방법의 바람직한 구현예에서, 상기 방법은 단계 (c) 후에 수득된 바실러스 숙주 세포 배양물로부터 관심 단백질을 수득하는 단계를 추가로 포함한다.

본 발명의 방법의 추가의 바람직한 구현예에서, 상기 제 1 배양 단계는 적어도 약 3h 내지 약 48h 의 시간 동안 수행된다.

본 발명의 방법의 바람직한 구현예에서, 제 1 배양 단계 동안, 적어도 하나의 공급 용액은 증가하는 속도, 바람직하게는 지수적으로 증가하는 속도로 탄소 공급원을 제공한다. 바람직하게는, 제 1 배양 단계 동안, 적어도 하나의 공급 용액은 적어도 약 0.13h^-1 의 지수 인자 및 적어도 하나의 탄소 공급원의 적어도 약 1 g 의 시작량으로 지수적으로 증가하는 속도로 탄소 공급원을 제공한다.

본 발명의 방법의 바람직한 구현예에서, 상기 제 1 배양 동안, 단계 b) 에서 초기에 존재하는 바실러스 숙주 세포 배양물 kg 당 상기 적어도 하나의 탄소 공급원의 적어도 약 50 g 의 총량을 첨가한다.

본 발명의 방법의 추가의 바람직한 구현예에서, 상기 제 2 배양 단계는 적어도 약 3h 내지 약 120h, 적어도 약 3h 내지 약 96h, 적어도 약 40h 내지 약 120h, 또는 바람직하게는 적어도 약 40h 내지 약 96h 의 시간 동안 수행된다.

본 발명의 방법의 더욱 바람직한 구현예에서, 제 2 배양 단계 동안 적어도 하나의 공급 용액은 일정한 속도, 감소하는 속도 또는 단계 (b) 에서의 속도 미만으로 증가하는 속도로 탄소 공급원을 제공하고, 상기 일정한 속도 또는 상기 감소하는 속도의 시작 속도 또는 단계 (b) 에서의 속도 미만으로 증가하는 상기 속도의 시작 속도는 제 1 배양 단계의 최대 속도 미만이다.

본 발명의 방법의 바람직한 구현예에서, 단계 (c) 에서의 상기 적어도 하나의 공급 용액은 일정한 속도로 상기 탄소 공급원을 제공한다. 바람직하게는, 상기 일정한 속도는 제 1 배양 단계의 공급 속도의 최대 속도 미만이다. 더욱 바람직하게는, 상기 일정한 속도는 제 1 배양 단계에서 적용된 적어도 하나의 탄소 공급원에 대한 최대 공급 속도의 약 70% 내지 약 20% 의 범위 내, 바람직하게는 약 50% 내지 약 30% 의 범위 내, 더욱 바람직하게는 약 35% 내에 있다.

본 발명의 방법의 바람직한 구현예에서, 상기 제 1 및 상기 제 2 온도는 약 3℃ 내지 약 7℃, 약 4℃ 내지 약 6℃, 또는 바람직하게는 약 5℃ 만큼 상이하다.

본 발명의 방법의 바람직한 구현예에서, 상기 제 1 온도는 약 28℃ 내지 약 32℃, 약 29℃ 내지 약 31℃ 의 범위 내이고, 또는 바람직하게는 약 30℃ 이다.

본 발명의 방법의 추가의 바람직한 구현예에서, 상기 제 2 온도는 약 33℃ 내지 약 37℃, 약 34℃ 내지 약 36℃ 의 범위 내이고, 또는 바람직하게는 약 35℃ 이다.

본 발명의 방법의 추가의 바람직한 구현예에서, 상기 제 1 및 제 2 온도가 동일한, 본 발명에 따른 방법을 수행함으로써 수득된 대조군에 비해 단계 c) 후에 수득된 관심 단백질의 수율이 유의하게 증가된다. 더욱 바람직하게는, 상기 수율은 적어도 40%, 적어도 60%, 적어도 80%, 적어도 100%, 적어도 200%, 적어도 300% 또는 적어도 400% 증가된다.

본 발명의 방법의 바람직한 구현예에서, 상기 바실러스는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다: 바실러스 리체니포르미스 (Bacillus licheniformis), 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis), 바실러스 알칼로필러스 (Bacillus alkalophilus), 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 (Bacillus amyloliquefaciens), 바실러스 브레비스 (Bacillus brevis), 바실러스 서큘란스 (Bacillus circulans), 바실러스 클라우시 (Bacillus clausii), 바실러스 코아굴란스 (Bacillus coagulans), 바실러스 피르무스 (Bacillus firmus), 바실러스 자우투스 (Bacillus jautus), 바실러스 렌투스 (Bacillus lentus), 바실러스 메가테리움 (Bacillus megaterium), 바실러스 푸밀러스 (Bacillus pumilus), 바실러스 스테아로테르모필러스 (Bacillus stearothermophilus), 바실러스 투린지엔시스 (Bacillus thuringiensis) 및 바실러스 벨레젠시스 (Bacillus velezensis). 더욱 바람직하게는, 상기 바실러스는 바실러스 리체니포르미스, 바실러스 푸밀러스, 또는 바실러스 서브틸리스이고, 더욱 더 바람직한 바실러스는 바실러스 리체니포르미스 또는 바실러스 서브틸리스이며, 더욱 더 바람직하게는 바실러스 리체니포르미스이다.

더 더욱 바람직한 구현예에서, 숙주 세포는 종 바실러스 리체니포르미스, 예컨대 바실러스 리체니포르미스 균주 ATCC 14580 의 숙주 세포 (이것은 DSM 13 과 동일함, Veith et al. "The complete genome sequence of Bacillus licheniformis DSM 13, an organism with great industrial potential." J. Mol. Microbiol. Biotechnol. (2004) 7:204-211 참조) 에 속한다. 대안적으로, 숙주 세포는 바실러스 리케니포르미스 균주 ATCC 53926 의 숙주 세포일 수 있다. 대안적으로, 숙주 세포는 바실러스 리케니포르미스 균주 ATCC 31972 의 숙주 세포일 수 있다. 대안적으로, 숙주 세포는 바실러스 리케니포르미스 균주 ATCC 53757 의 숙주 세포일 수 있다. 대안적으로, 숙주 세포는 바실러스 리케니포르미스 균주 ATCC 53926 의 숙주 세포일 수 있다. 대안적으로, 숙주 세포는 바실러스 리케니포르미스 균주 ATCC 55768 의 숙주 세포일 수 있다. 대안적으로, 숙주 세포는 바실러스 리케니포르미스 균주 DSM 394 의 숙주 세포일 수 있다. 대안적으로, 숙주 세포는 바실러스 리케니포르미스 균주 DSM 641 의 숙주 세포일 수 있다. 대안적으로, 숙주 세포는 바실러스 리케니포르미스 균주 DSM 1913 의 숙주 세포일 수 있다. 대안적으로, 숙주 세포는 바실러스 리케니포르미스 균주 DSM 11259 의 숙주 세포일 수 있다. 대안적으로, 숙주 세포는 바실러스 리케니포르미스 균주 DSM 26543 의 숙주 세포일 수 있다.

본 발명의 방법의 추가의 바람직한 구현예에서, 관심 단백질을 인코딩하는 유전자를 위한 상기 발현 작제물이 유전자 변형에 의해 바실러스 숙주 세포 내로 도입된다. 바람직하게는, 상기 발현 작제물은 하나 이상의 이종 핵산을 포함한다. 더욱 바람직하게는, 상기 발현 작제물은 벡터, 바람직하게는 발현 벡터에 포함된다.

본 발명의 방법의 또다른 바람직한 구현예에서, 상기 발현 작제물은 상기 바실러스 숙주 세포에 내인적으로 존재하는 핵산 서열을 포함한다. 바람직하게는, 발현 작제물은 바실러스 숙주 세포의 게놈에 포함된다. 더욱 바람직하게는, 게놈 내에 존재하는 상기 발현 작제물은 유전자 변형되었다.

본 발명의 방법의 또다른 바람직한 구현예에서, 상기 발현 작제물은 상기 바실러스 숙주 세포에서 관심 단백질을 인코딩하는 유전자의 발현을 조절하는 발현 조절 서열, 예를 들어 프로모터를 포함한다.

본 발명의 방법의 또다른 바람직한 구현예에서, 발현 작제물은 발현 조절 서열, 예를 들어 프로모터에 작동가능하게 연결된 관심 단백질을 인코딩하는 적어도 핵산 서열을 포함한다. 바람직하게는, 상기 발현 조절 서열은 온도-둔감성 프로모터이다. 바람직하게는, 상기 프로모터는 유도인자-비의존성 프로모터, 또는 바람직하게는, 구성적으로 활성인 프로모터이다. 더욱 바람직하게는, 상기 프로모터는 veg 프로모터, lepA 프로모터, serA 프로모터, ymdA 프로모터, fba 프로모터, aprE 프로모터, amyQ 프로모터, amyL 프로모터, 박테리오파지 SPO1 프로모터 및 cryIIIA 프로모터 또는 이러한 프로모터의 조합 및/또는 이들의 활성 단편 또는 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된다.

바람직한 구현예에서, 유도인자-독립적 프로모터는 aprE 프로모터이다.

본 발명의 방법의 바람직한 구현예에서, 상기 발효 배지는 화학적으로 규정된 발효 배지이다.

본 발명의 방법의 바람직한 구현예에서, 상기 발효 배지는 미리-규정된 양으로 마크로요소 및 미량 요소를 포함한다.

본 발명의 방법의 추가의 바람직한 구현예에서, 상기 적어도 하나의 공급 용액은 바람직하게는 탄수화물을 포함하는, 적어도 하나의 화학적으로 규정된 탄소 공급원을 제공하며; 더욱 바람직하게는 탄수화물은 글루코오스이다.

본 발명의 방법의 추가의 바람직한 구현예에서, 관심 단백질은 발효 배지 내로 분비된다.

본 발명의 방법의 추가의 바람직한 구현예에서, 상기 관심 단백질은 효소이다. 바람직하게, 상기 효소는 히드롤라제 (EC 3), 바람직하게, 또는 글리코시다제 (EC 3.2) 이다. 더욱 바람직하게는, 효소는 아밀라아제, 특히 알파-아밀라아제 (EC 3.2.1.1), 셀룰라아제 (EC 3.2.1.4), 락타아제 (EC 3.2.1.108), 만난나제 (EC 3.2.1.25), 리파아제 (EC 3.1.1.3), 피타아제 (EC 3.1.3.8), 및 뉴클레아제 (EC 3.1.11 내지 EC 3.1.31) 로 이루어진 군으로부터 선택된다. 더 더욱 바람직하게는 효소는 만난나제 및 아밀라아제로부터 선택되는 글리코시다제 (EC 3.2) 이다.

본 발명은 또한, 상기 본 발명의 방법에 따라 바실러스 숙주 세포를 배양하는 단계 및 배양된 바실러스 숙주 세포로부터 관심 단백질을 수득하는 추가의 단계를 포함하는 관심 단백질의 제조 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 본 발명 중 임의의 하나의 방법에 의해 수득가능한 바실러스 숙주 세포 배양물에 관한 것이다. 바실러스 숙주 세포 배양물은 본 발명의 방법에 의해 생산되는 관심 단백질을 바람직하게는 증가된 양으로 포함하는 것으로 이해될 것이다.

본 발명은 또한 본 발명의 방법에 의해 수득가능한 관심 단백질을 포함하는 조성물에 관한 것이다.

본 명세서에 전체적으로 인용된 모든 참고문헌은 구체적으로 언급된 본 명세서 내용 및 본 명세서 내용과 관련하여 본원에 참고로 포함된다.

도 1: 바실러스 리체니포르미스의 공급-배치 발효로부터의 아밀라아제의 상대 수율은 30℃ 및 35℃ 의 일정한 온도 대 30℃ 에서 35℃ 로의 발효 동안의 이동 온도이다. 제시되는 것은 2 가지 예시된 공급-배치 발효 아밀라아제 1 (A) 및 아밀라아제 2 (B) 이다.
도 2: 상대 효소 수율은 일정한 온도에서 그리고 온도 이동을 사용하여 공급-배치 발효로부터 산출된다. (A) 30℃ 의 일정한 온도에서의 바실러스 서브틸리스의 공급-배치 발효로부터의 아밀라아제 1 의 상대 수율 대 30℃ 에서 35℃ 로의 발효 동안의 이동 온도. (B) 30℃ 의 일정한 온도에서의 바실러스 리체니포르미스의 공급-배치 발효로부터의 만난나제의 상대 수율 대 30℃ 에서 35℃ 로의 발효 동안의 이동 온도.
도 3: 특정 기질 흡수 속도 qs 의 감소와 온도 이동을 조합하여 30℃ 에서 35℃ 로의 온도 이동 시점의 최적화. (A) 는 공급 시간에 따른 글루코스 공급 속도를 나타낸다. 총 공급 시간은 70 시간 (100% 에 해당) 이었다. (B) 는 첨가된 글루코스의 상대적인 양에 대한 글루코스 공급 속도를 도시한다. (C) 는 첨가된 글루코스의 상대적인 양에 대한 글루코스 공급 속도 (qs) 를 도시한다. (D) 는 온도 이동 전에 첨가된 총 글루코스의 양에 따른 아밀라아제 수율을 도시한다. 화살표는 온도 이동과 이송 속도 이동의 조합을 나타내는 막대를 나타낸다.

본 발명은 작업예에 의해 이하 자세히 설명될 것이다. 어떤일이 있어도, 이들 작업예는 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.

실시예 1: 발효 동안 온도의 이동은 바실러스 리체니포미스에서 아밀라아제 생산을 증가시킨다

달리 명시하지 않으면, 하기 실험은 미생물의 배양에 의한 화학적 화합물의 발효적 생산 및 유전자 조작에서 사용되는 표준 장비, 방법, 화학물, 및 생화학물을 적용하여 수행되었다. 또한 Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold 20 Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) and Chmiel et al. (Bioprocesstechnik 1. Einfuehrung in die Bioverfahrenstechnik, Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991) 를 참고한다.

알파-아밀라아제 활성은 기질 에틸리덴-4-니트로페닐-α-D-말토헵타오사이드 (EPS) 를 사용하는 방법으로 측정하였다. D-말토헵타오사이드는 엔도-아밀라아제에 의해 절단될 수 있는 차단된 올리고사카라이드이다. 절단 후, 알파-글루코시다아제는 황색 색상을 갖는 PNP 분자를 유리시키고, 따라서 405nm 에서 가시적 분광광도계로 측정할 수 있다. EPS 기질 및 알파-글루코시다아제를 함유하는 키트는 Roche Costum Biotech (카탈로그 번호 10880078t3) 로부터 입수가능하고, Lorentz K. et al. (2000), Clin. Chem., 46/5: 644 - 649 에 기재되어 있다. 시간 의존성 흡수-곡선의 기울기는 주어진 조건 세트 하에서 해당 알파-아밀라아제의 특정 활성 (mg 효소 당 활성) 에 정비례한다.

표 1 및 표 2 에 열거된 성분을 제공하는 화학적으로 규정된 발효 배지를 사용하여 아밀라아제 1 또는 아밀라아제 2 를 발현하는 바실러스 리체니포르미스 균주를 발효 공정에서 배양하였다.

표 1: 발효 공정에서 제공된 거대원소

화합물 화학식 초기 질량 당 첨가됨 [g/kg]

시트르산 일수화물 C₆H₈O₇*H₂O 11.2

칼슘 Ca 0.3

나트륨 Na 1.6

칼륨 P 4.0

마그네슘 Mg 0.4

술페이트 SO₄ 2.9

암모늄 NH₄ 0.3

포스페이트 PO₄ 15.8

표 2: 발효 공정에서 제공된 미량 원소

화합물 기호 초기 질량 당 첨가됨 [μmol/kg]

망간 Mn 240

아연 Zn 175

구리 Cu 320

코발트 Co 11

니켈 Ni 3

몰리브덴 Mo 20

철 Fe 385

발효는 8 g/L 글루코스를 함유하는 배지로 시작하였다. 50% 글루코스를 함유하는 용액이 공급 용액으로서 사용되었다. pH 는 암모니아를 사용하여 발효 동안 조정되었다.

배양물 pH 의 증가에 의해 지시되는 8 g/l 글루코스의 초기 양의 고갈시에 공급물을 개시하고, kg 초기 발효 부피 당 200 g 초과의 글루코스가 생물반응기에 첨가될 때까지 글루코스를 첨가하였다. 글루코스 공급 전략은 0.13h^-1 의 지수 인자를 갖는 초기 지수 공급 단계 및 L 초기 부피 및 시간 당 1 g 의 글루코스의 출발 값으로 이루어졌으며, 여기서 28% 의 총 글루코스가 생물반응기에 첨가되었다. 이어서, 최대 글루코스 공급 속도의 35% 에 상응하는 속도를 갖는 일정한 글루코스 공급의 제 2 단계를 수행하였다. 이 제 2 단계에서 나머지 글루코오스 (총 글루코오스의 72%) 를 첨가하였다. pH 를 NH₄OH 의 첨가에 의해 7.0 이상으로 유지시켰다.

배양 온도를 30℃ 또는 35℃ 에서 일정하게 유지시켜 각각, 아밀라아제 1 에 대해 100% 및 229%, 아밀라아제 2 에 대해 100% 및 143% 의 상대적 아밀라아제 수율을 얻었다. 30℃ 의 낮은 온도에서 발효를 시작한 후, 지수 공급 단계의 종료 후 온도를 35℃ 로 증가시키면, 아밀라아제 1 과 아밀라아제 2 에 대해 각각 451% 와 723% 로 수율이 증가하였다. 따라서, 낮은 온도에서 높은 온도로 발효 중에 온도 이동을 수행하는 것이 낮은 (30℃) 또는 높은 (35℃) 온도에서 일정하게 유지하는 발효에 비해 생산성을 크게 증가시킨다. 결과는 도 1 에 도시한다.

실시예 2: 발효 동안 온도의 이동은 바실러스 서브틸리스에서 아밀라아제 생산을 증가시킨다

효소 활성은 실시예 1 에 기술된 대로 측정하였다. 아밀라아제 1 을 발현하는 바실러스 서브틸리스 균주를 실시예 1 에 기재된 바와 같이 탄소 공급원으로서 글루코스를 사용한 공급-배치 발효로 미네랄 염 배지에서 성장시켰다.

배양 온도를 30℃ 로 일정하게 유지하거나 발효를 30℃ 에서 시작한 후 지수 공급 단계의 종료 후 온도를 35℃ 로 높였다. 낮은 설정점에서 높은 설정점으로 발효 중에 온도 이동을 수행하는 것이 온도가 30℃ 에서 일정하게 유지하는 발효에 비해 생산성을 크게 증가시킨다 (49% 증가). 결과를 도 2 (A) 에 제시한다.

실시예 3: 발효 동안 온도의 이동은 바실러스 리체니포미스에서 만난나제 생산을 증가시킨다

WO2021/058453 (Seq ID No:1) 에 기재된 만난나제 분자를 바실러스 리체니포르미스에서 발현시켰다. 바실러스 리체니포르미스 균주를 이후 실시예 1 에 기재된 바와 같이 탄소 공급원으로서 글루코스를 사용한 공급-배치 발효로 미네랄 염 배지에서 성장시켰다. 배양 온도를 30℃ 로 일정하게 유지하거나 발효를 30℃ 에서 시작한 후 지수 공급 단계의 종료 후 온도를 35℃ 로 높였다. 만난나제 역가는 당업자에게 공지된 표준 시험 절차에 따라 CE-SDS 전기영동에 의한 발효 과정에 걸쳐 배양 샘플로부터 결정하였다.

낮은 설정점에서 높은 설정점으로 발효 중에 온도 이동을 수행하는 것이 온도가 30℃ 에서 일정하게 유지하는 발효에 비해 생산성을 크게 증가시킨다 (33% 증가). 결과를 도 2 (B) 에 제시한다.

실시예 4: 특정 기질 흡수 속도 q_s 의 감소와 온도 이동을 조합하면 아밀라아제 수율이 증가한다

효소 활성은 실시예 1 에 기술된 대로 측정하였다. 아밀라아제 1 를 발현하는 바실러스 리체니포르미스 균주를 실시예 1 에 기재된 바와 같이 탄소 공급원으로서 글루코스를 사용한 공급-배치 발효로 미네랄 염 배지에서 성장시켰다.

글루코스 공급 시작 후, 상이한 양의 글루코스를 첨가한 후 30℃ 에서 35℃ 로의 온도 이동을 수행하였다 (0% = 공급 시작). 글루코스의 총량의 28% 를 첨가한 후, 공급 프로파일을 지수 프로파일로부터 일정한 공급물로 이동시켜서, 배양 동안 관찰된 최대값의 35% 로 특이적 기질 흡수율 q_s [그램 세포 및 시간 당 글루코스 그램] 를 감소시켰다.

최대 아밀라아제 수율은 일정한 일정한 공급 속도로의 전환과 동시에 온도의 이동 (발효 과정 동안 첨가된 글루코스의 총량의 첨가된 글루코스의 28%), 즉 이의 최대값의 35% 로의 특이적 기질 흡수 속도의 감소로 이동시킴으로써 달성되었다. q_s 의 감소 전 또는 후에 온도 이동을 수행하는 것은 더 낮은 생성물 역가를 초래하였다. 그 결과, 배양 온도와 q_s 를 동시에 이동시킴으로써 시너지 효과를 달성하였다. 결과는 도 3 에 도시하였다.

Claims (17)

1. 하기 단계:
   (a) 발효 배지에 관심 단백질을 인코딩하는 유전자에 대한 발현 작제물을 포함하는 바실러스 숙주 세포를 접종하는 단계;
   (b) 바실러스 숙주 세포의 성장 및 관심 단백질의 발현에 도움이 되는 조건 하에서 상기 발효 배지에서 바실러스 숙주 세포를 제 1 배양 단계 동안 배양하는 단계로서, 바실러스 숙주 세포의 배양은 적어도 하나의 공급 용액의 첨가를 포함하고, 제 1 배양 단계 동안 배양은 제 1 온도에서 수행되는 단계; 및
   (c) 바실러스 숙주 세포의 성장 및 관심 단백질의 발현에 도움이 되는 조건 하에서 단계 (b) 에서 수득된 바실러스 숙주 세포 배양물을 제 2 배양 단계 동안 배양하는 단계로서, 배양은 적어도 하나의 공급 용액의 첨가를 포함하고, 제 2 배양 단계 동안 배양은 제 2 온도에서 수행되고, 상기 제 2 온도는 제 1 온도보다 높은 단계
   를 포함하는 바실러스 숙주 세포의 배양 방법.
2. 제 1 항에 있어서, 단계 (c) 후에 수득된 바실러스 숙주 세포 배양물로부터 관심 단백질을 수득하는 단계를 추가로 포함하는 바실러스 숙주 세포의 배양 방법.
3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 관심 단백질이 효소인 바실러스 숙주 세포의 배양 방법.
4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 발현 작제물이 프로모터; 바람직하게는 유도인자-비의존성 또는 구성적으로 활성인 프로모터에 작동가능하게 연결된 관심 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 바실러스 숙주 세포의 배양 방법.
5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제 1 배양 단계는 적어도 약 3h 내지 약 48h 의 시간 동안 수행되는 바실러스 숙주 세포의 배양 방법.
6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 제 1 배양 단계 동안, 적어도 하나의 공급 용액이 탄소 공급원을 증가하는 속도로 제공하는 바실러스 숙주 세포의 배양 방법.
7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제 2 배양 단계는 적어도 약 3h 내지 약 96h 의 시간 동안 수행되는 바실러스 숙주 세포의 배양 방법.
8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 제 2 배양 단계 동안 적어도 하나의 공급 용액은 일정한 속도, 감소하는 속도 또는 단계 (b) 에서의 속도 미만으로 증가하는 속도로 탄소 공급원을 제공하고, 상기 일정한 속도 또는 상기 감소하는 속도의 시작 속도 또는 단계 (b) 에서의 속도 미만으로 증가하는 상기 속도의 시작 속도는 제 1 배양 단계의 최대 속도 미만인 바실러스 숙주 세포의 배양 방법.
9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제 1 및 상기 제 2 온도는 약 3℃ 내지 약 7℃, 약 4℃ 내지 약 6℃, 또는 바람직하게는 약 5℃ 만큼 상이한 바실러스 숙주 세포의 배양 방법.
10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제 1 온도는 약 28℃ 내지 약 32℃, 약 29℃ 내지 약 31℃ 의 범위 내인, 또는 바람직하게는 약 30℃ 인 바실러스 숙주 세포의 배양 방법.
11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제 2 온도는 약 33℃ 내지 약 37℃, 약 34℃ 내지 약 36℃ 의 범위 내인, 또는 바람직하게는 약 35℃ 인 바실러스 숙주 세포의 배양 방법.
12. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제 1 및 제 2 온도가 동일한, 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 따른 방법을 수행함으로써 수득된 대조군에 비해 단계 c) 후에 수득된 관심 단백질의 수율이 유의하게 증가되는 바실러스 숙주 세포의 배양 방법.
13. 제 12 항에 있어서, 상기 수율은 적어도 40%, 적어도 60%, 적어도 80%, 적어도 100%, 적어도 200%, 적어도 300% 또는 적어도 400% 증가되는 바실러스 숙주 세포의 배양 방법.
14. 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바실러스가: 바실러스 리체니포르미스 (Bacillus licheniformis), 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis), 바실러스 알칼로필러스 (Bacillus alkalophilus), 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 (Bacillus amyloliquefaciens), 바실러스 브레비스 (Bacillus brevis), 바실러스 서큘란스 (Bacillus circulans), 바실러스 클라우시 (Bacillus clausii), 바실러스 코아굴란스 (Bacillus coagulans), 바실러스 피르무스 (Bacillus firmus), 바실러스 자우투스 (Bacillus jautus), 바실러스 렌투스 (Bacillus lentus), 바실러스 메가테리움 (Bacillus megaterium), 바실러스 푸밀러스 (Bacillus pumilus), 바실러스 스테아로테르모필러스 (Bacillus stearothermophilus), 바실러스 투린지엔시스 (Bacillus thuringiensis) 및 바실러스 벨레젠시스 (Bacillus velezensis) 로 이루어진 군으로부터 선택되는 바실러스 숙주 세포의 배양 방법.
15. 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서, 관심 단백질을 인코딩하는 유전자를 위한 상기 발현 작제물이 유전자 변형에 의해 바실러스 숙주 세포 내로 도입되는 바실러스 숙주 세포의 배양 방법.
16. 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 공급 용액이 적어도 하나의 탄소 공급원, 바람직하게는 글루코오스를 포함하는 바실러스 숙주 세포의 배양 방법.
17. 제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항의 방법에 의해 수득가능한 바실러스 숙주 세포 배양물.

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