CN105274129B - 一种信号肽及其在利用淀粉产l-精氨酸重组菌中的应用 - Google Patents
一种信号肽及其在利用淀粉产l-精氨酸重组菌中的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN105274129B CN105274129B CN201510817023.6A CN201510817023A CN105274129B CN 105274129 B CN105274129 B CN 105274129B CN 201510817023 A CN201510817023 A CN 201510817023A CN 105274129 B CN105274129 B CN 105274129B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- signal peptide
- arginine
- alpha
- amylase
- starch
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
一种信号肽及其在利用淀粉产L‑精氨酸重组菌中的应用，属于基因工程和酶工程领域。本发明通过分子克隆技术和基因工程技术将来源Streptomyces kathirae CCTCC M 2012432不带自身信号肽的α‑淀粉酶与不同微生物来源的Sec和Tat两个主要分泌途径的十二条信号肽分别融合，在高产L‑精氨酸菌种中表达，筛选出一条高效分泌α‑淀粉酶的信号肽SEQ ID N0.1。首次报道，以该信号肽介导分泌α‑淀粉酶的重组钝齿棒状杆菌CGMCC No.0890/pMSPamy能利用廉价淀粉发酵生产L‑精氨酸，最优碳源添加条件下5L发酵罐上产量为48g/L。
Description
技术领域
利用一种信号肽使重组菌高效分泌特定酶代谢廉价碳源进行氨基酸生产的方法和高效生产某种蛋白的方法，属于基因工程、蛋白质与酶工程和代谢工程领域。
背景技术
淀粉，作为微生物工业碳源的主要来源，一般需要经过液化和糖化两个阶段才能为微生物所利用。能直接利用淀粉作为碳源的微生物主要有链霉菌属、解淀粉芽孢杆菌及各种霉菌，而大部分用于生产的菌种无法直接利用淀粉作为碳源。现国内外已有报道，改造酿酒酵母直接以淀粉为碳源生产乙醇，导入α-淀粉酶基因使谷氨酸棒状杆菌利用可溶性生产L-赖氨酸的相关报道。
发明人前期工作已获得通过相关基因工程和代谢工程技术改造的高产L-精氨酸的菌种：钝齿棒状杆菌CGMCC NO.0890(已在专利CN03112896.3中公开)。
发明人获得的高产L-精氨酸的菌种只能以葡萄糖为主要碳源发酵生产L-精氨酸，不能直接利用淀粉作为主要碳源。
L-精氨酸作为半必需氨基酸，在医药工业，保健品、食品等领域皆有广泛的应用。通过基因工程和代谢工程技术进一步改造高产L-精氨酸菌种，使其能利用淀粉作为碳源发酵生产L-精氨酸。对简化L-精氨酸生产工艺、节约生产成本有一定的参考应用价值。
发明内容
本发明通过基因工程技术将去除自身信号肽的α-淀粉酶基因与来源谷氨酸棒状杆菌和枯草芽孢杆菌的Sec和Tat两个主要分泌途径的十二条信号肽分别融合，并比对α-淀粉酶在L-精氨酸高产菌种中的分泌效果，得到β-甘露聚糖基因的信号肽——MannaseSignal Peptide(MSP)为分泌胞外酶效果较好的一种新发现信号肽。
所述MSP核苷酸序列是SEQ ID N0.1所示的序列。
本发明在已有高产L-精氨酸菌种的基础上，通过基因工程技术将β-甘露聚糖基因的信号肽融合到去掉自身信号肽的α-淀粉酶基因，构建表达载体导入到L-精氨酸高产菌中，并成功表达。使其能以可溶性淀粉和葡萄糖作为混合碳源进行L-精氨酸发酵。
所述高产L-精氨酸菌种为本研究室前期构建的钝齿棒状杆菌CGMCC NO.0890。
本发明构建的重组菌钝齿棒状杆菌CGMCC NO.0890/pMSPamy经优化在50g/L可溶性淀粉和100g/L葡萄糖做为混合碳源的5L发酵罐中发酵96h，L-精氨酸产量为48±0.7g/L，其中发酵液α-淀粉酶的酶活为2126±12.4U/mL。
所述的技术方案：
1.根据NCBI上公布的相关基因序列设计信号肽和目的基因融合引物。
2.重组菌的构建
从相关菌种中抽提染色体DNA为模板，根据预先设计好的引物、PCR扩增条件和扩增体系进行PCR。采用凝胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化和回收，琼脂糖核酸凝胶电泳检验回收产物的浓度。用相同的限制性内切酶对相关表达载体和纯化后的PCR产物进行双酶切，琼脂糖核酸凝胶电泳检测酶切产物并用凝胶回收试剂盒对其回收，并用超微量分光光度计检测其浓度。将酶切后的载体和PCR产物按一定比例混合，在T4DNA连接酶的作用下过夜连接。将连接产物用CaCl2转化法转入E.coli BL21，获得含重组质粒的E.coli BL21。提取质粒，通过单双酶切及PCR验证后用电转化方法将重组质粒导入相关菌种中。最后，将含15％甘油的重组菌液保存-70℃冰箱。
3.重组菌的产酸培养
将重组菌接种于新鲜的LB+0.5％Glucose液体培养基中进行活化，接种量为1％。次日以1％转接于发酵培养基中(底物为可溶性淀粉和葡萄糖混合)，0.8mM IPTG诱导表达，生长后期收集发酵液利用氨基酸自动分析仪测定其氨基酸含量(L-精氨酸及相关氨基酸等)。发酵培养基具备微生物生长所需的营养成分，并通过相关优化。
4.重组菌的产酶培养
将重组菌接种于新鲜的LB+0.5％Glucose液体培养基中进行活化，接种量为1％。次日以1％转接于发酵培养基中(底物为葡萄糖)，0.8mM IPTG诱导表达，生长后期收集发酵液测其酶活和蛋白含量。
具体实施方式
实施例1：信号肽引物与α-淀粉酶串联的引物设计
根据NCBI上公布的相关基因序列和α-amyase基因序列设计信号肽和基因串联的大片段引物。
P1:pMSPamyHindIIIF
5’-CCAAGCTTATGTTCAAGAAGCACACCATCTCCCTGCTGATCATCTTCCTGCTGGCTTCCGCTGTTCTGGCTAAGCCAATCGAGGCTGCCCCGCCCGGGGCGAAGGAC-3’
P2:pMSPamyBamHIR
5’-CGCGGATCCTTAGTTGCGCCAGGTGTCGTTGA-3
实施例2：α-淀粉酶基因的信号肽替换及其克隆
[1]从Streptomyces kathirae CCTCC M 2012432提取染色体作为模板DNA。
[2]根据NCBI网站上公布的α-淀粉酶基因序列设计信号肽和基因串联的PCR引物。以Streptomyces kathirae CCTCC M 2012432的基因组为模板利用大片段引物PCR，得到带有经密码优化的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示Mannase signal peptide(简称MSP)信号肽的α-淀粉酶基因。PCR扩增体系(50μL)：模板1μL，上下游引物各0.5μL，dNTP Mix 4μL，10×Ex Taq Buffer 5μL，灭菌ddH2O 38.5μL，Ex Taq DNA聚合酶0.5μL。PCR反应条件：94℃预变性，5min，一个循环；94℃变性，30s，56℃退火，30s，72℃延伸，1min30s，30个循环；72℃，10min，一个循环；4℃，10min，一个循环(其中退火温度和延伸时间根据不同引物和基因进行相对的调节)。采用凝胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化和回收，电泳检验回收产物的浓度。回收产物存放在1.5mL的离心管中，-20℃冰箱保存备用。
实施例3：重组质粒pXMJ19-MSPamy的构建
[1]构建重组质粒pMD18-T-MSPamy，导入E.coliJM109。将[2]中PCR回收的产物与克隆载体pMD18-T连接，连接体系为solution I 5μL，目的基因4.8μL，pMD18-T质粒0.2μL，16℃过夜连接。连接接产物转化E.coilJM109，涂布于含100ug/mL氨苄青霉素的LB平板，经37℃培养过夜，挑取单菌落到含100ug/mL氨苄青霉素的10mL液体LB培养基中，37℃摇床过夜培养后提取质粒，命名为pMD18-T-MSPamy，经PCR和酶切验证连接成功后，将菌液加入甘油于-70℃冰箱保藏。
[2]将[1]中提取的pMD18-T-MSPamy质粒与表达载体pXMJ19分别进行HindIII与BamHI的双酶切,利用凝胶回收试剂盒回收后进行连接，获得重组质粒pXMJ19-MSPamy。上述重组质粒都通过PCR和酶切验证。
实施例4：重组质粒pXMJ19-MSPamy电转化至钝齿棒状杆菌CGMCC NO.0890
挑取钝齿棒状杆菌CGMCC NO.0890接种于10mL LB液体培养基摇瓶中，30℃摇床培养过夜，取100μL过夜培养的菌液，接种于50mL的感受态培养基中，30℃摇床培养4h至OD562nm＝0.9左右，用无菌管离心去上清，再用10％的甘油悬浮菌体并离心，重复此步骤3次。最后分装于1.5mL的离心管，加入3uL重组质粒，于电压1800V，50mS条件下电转化。迅速向将电转化完成的菌体中加入800uL的新鲜LBG培养基(0.5％酵母提取物，1％蛋白胨，1％NaCl，0.5％葡萄糖)，并放置46℃的水浴锅中静置6min，之后在30℃摇床培养3h左右，离心涂布于含氯霉素抗性的平板。在30℃的恒温培养箱培养64h，挑取菌落形态正常的单克隆并进行培养。将培养后的单克隆进行质粒提取，酶切验证和PCR验证，得到阳性的重组菌株，并保藏于-70℃冰箱。
实施例5：重组钝齿棒状杆菌CGMCC NO.0890/pMSPamy分泌的α-淀粉酶酶活测定
发酵液于4℃、8000r/min冷冻离心20min，取上清液即为粗酶液，采用Bernfeld改良法。在比色管中加入1mL 2％淀粉溶液及1mL 0.1mol/L、pH6.0柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，加入一定稀释倍数的酶液1mL，于40℃反应30min，加入2mL DNS试剂，沸水浴3min，待冷却后用水定容至25mL，在540nm下测定吸光值.以蒸馏水代替酶液为空白调零管，以发酵液代替酶液直接加DNS为对照组，每个样品都设定对照组以消除发酵液中的还原糖影响.酶活定义：在上述条件下单位体积酶液水解淀粉产生等价于1μmol麦芽糖的还原糖所需的酶量为1U。
实施例6：重组钝齿棒状杆菌CGMCC NO.0890/pMSPamy的发酵培养
将重组钝齿棒状杆菌CGMCC NO.0890/pMSPamy种子液接种至淀粉培养基，在30℃，600r/min培养条件下进行发酵培养，96h L-精氨酸的产量为48±0.7g/L，发酵液中α-淀粉酶的酶活为2126±12.4U/mL。
淀粉培养基(g/L)：
可溶性淀粉50，葡萄糖100，酵母粉8，(NH4)2SO420，K2HPO41.5，MgSO4·7H2O0.5，FeSO4·7H2O0.02，MnSO4·H2O0.02，CaCO330。PH 7.0～7.2。
对照组：
(1)采用类似的方法，仅仅是将核苷酸序列如SEQ ID NO:1的信号肽，替换成β-甘露聚糖酶基因自身原有的信号肽(核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示)，发酵显示：L-精氨酸的产量为36±2.7g/L，发酵液中α-淀粉酶的酶活为1650±4.9U/mL
(2)采用类似的方法，仅仅是将核苷酸序列如SEQ ID NO:1的信号肽，替换成如：谷氨酸棒状杆菌来源的表层蛋白信号肽PS(核苷酸序列为ATGTTTAACAACCGTATCCGCACTGCAGCTCTCGCTGGTGCAATCGCAATCTCCACCGCAGCTTCTGGCGTAGCTATCCCAGCATTCGCTCAGGAGACCACT)或者是枯草芽孢杆菌来源的α-淀粉酶信号肽AE(核苷酸序列为ATGTTTGCAAAACGATTCAAAACCTCTTTACTGCCGTTATTCGCTGGATTTTTATTGCTGTTTCATTTGGTTCTGGCAGGACCG)，发酵显示：L-精氨酸的产量分别为32±1.3g/L和31±1.0g/L，发酵液中α-淀粉酶的酶活分别为1367±2.7U/mL和1032±5.6U/mL。
实施例7：重组钝齿棒状杆菌CGMCC NO.0890/pMSPamy发酵L-精氨酸测定
发酵液中的L-精氨酸含量通过坂口试剂法初测。将发酵上清液稀释500倍，取1mL放入比色管中，加入4mL 0.375mol/L NaOH溶液，再加入1mL显色剂摇匀后30℃水浴20分钟，用分光光度计在520nm处测定每管吸光值，根据标准曲线计算发酵液中L-精氨酸含量。再经氨基酸自动分析仪准确测定。
虽然本发明已以较佳实施例(以MSP信号肽和钝齿棒状杆菌CGMCC NO.0890为例)公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (4)
1.一种信号肽在提高微生物利用淀粉合成产物上的应用方法，其特征在于，所述方法是将一种高效分泌信号肽与α-淀粉酶基因融合，然后将融合片段连接 到表达载体上并转化到宿主微生物内得到重组微生物，利用重组微生物在以 淀粉为碳源的培养基中发酵生产产物；
所述信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述α-淀粉酶基因来源于Streptomyces kathirae CCTCC M 2012432；所述产物为L-精氨酸；所述微生物为钝齿棒状杆菌；所述表达载体为pXMJ19。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述培养基中以50g/L可溶性淀 粉和100g/L葡萄糖做为混合碳源。
3.一种重组钝齿棒状杆菌，其特征在于，所述重组钝齿棒状杆菌表达与SEQ ID NO:1的信号肽融合的α-淀粉酶基因；所述信号肽与α-淀粉酶基因融合后，连接到表达载体上并转化到宿主菌内；所述α-淀粉酶基因来源于Streptomyces kathirae CCTCC M 2012432。
4.据权利要求3所述的重组钝齿棒状杆菌，其特征在于，所述表达载体为pXMJ19。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510817023.6A CN105274129B (zh) | 2015-11-23 | 2015-11-23 | 一种信号肽及其在利用淀粉产l-精氨酸重组菌中的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510817023.6A CN105274129B (zh) | 2015-11-23 | 2015-11-23 | 一种信号肽及其在利用淀粉产l-精氨酸重组菌中的应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN105274129A CN105274129A (zh) | 2016-01-27 |
| CN105274129B true CN105274129B (zh) | 2019-01-04 |
Family
ID=55143962
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201510817023.6A Active CN105274129B (zh) | 2015-11-23 | 2015-11-23 | 一种信号肽及其在利用淀粉产l-精氨酸重组菌中的应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN105274129B (zh) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105238824B (zh) * | 2015-11-23 | 2021-02-19 | 江南大学 | 一种信号肽及其在利用淀粉产l-谷氨酸重组菌中的应用 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1441055A (zh) * | 2003-02-25 | 2003-09-10 | 江南大学 | 一种生产l－精氨酸的菌株及其诱变方法与利用该菌株生产l－精氨酸的方法 |
-
2015
- 2015-11-23 CN CN201510817023.6A patent/CN105274129B/zh active Active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1441055A (zh) * | 2003-02-25 | 2003-09-10 | 江南大学 | 一种生产l－精氨酸的菌株及其诱变方法与利用该菌株生产l－精氨酸的方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 信号肽对浸麻类芽孢杆菌α-环糊精葡萄糖基转移酶在大肠杆菌中胞外表达的影响;李彬等;《工业微生物》;20110630;第41卷(第3期);摘要、讨论 |
| 具有α-淀粉酶分泌活性以及低双乙酰产量的啤酒酵母工;张峰等;《生物工程学报》;20080525;第24卷(第5期);摘要，第1.2、2.5节，讨论部分 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN105274129A (zh) | 2016-01-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN110066777B (zh) | 一种内切菊粉酶及其在生产低聚果糖中的应用 | |
| CN110055204B (zh) | 一种敲除spoⅡQ和pcf基因提高地衣芽孢杆菌发酵产酶的方法及应用 | |
| CN109679887A (zh) | 一种利用高效分泌表达的双酶融合酶耦合发酵生产海藻糖的方法 | |
| CN109943546B (zh) | 一种谷氨酰胺转氨酶突变体及其制备方法和应用 | |
| US10351816B2 (en) | Signal peptide, L-glutamic acid synthesized using konjac flour and methods of using same | |
| CN102676480A (zh) | 一种应用自诱导培养基和双温度调控策略生产胞外普鲁兰酶的方法 | |
| CN106754985A (zh) | 编码丙谷二肽生物合成酶的基因及其应用 | |
| CN103834629A (zh) | 一种重组高温普鲁兰酶及其制备方法 | |
| CN104789539A (zh) | 一种海藻糖合酶的突变体及其制备方法和应用 | |
| CN102260694B (zh) | 耐酸中温α-淀粉酶及其制备方法 | |
| US10329592B2 (en) | Signal peptide, L-glutamic acid synthesized using konjac flour and methods of using same | |
| CN105950579B (zh) | 一种无信号肽胞外生产淀粉分支酶的方法 | |
| CN104212757A (zh) | 利用大肠杆菌产γ-谷氨酰甲胺合成酶高效生产L-茶氨酸的方法 | |
| CN116157530A (zh) | 使用温度变化的芽孢杆菌工业发酵工艺 | |
| CN109022396A (zh) | 一种酶活提高的α-淀粉酶突变体及其应用 | |
| CN108641992A (zh) | 高温产核黄素的工程菌及其构建方法与应用 | |
| CN105274129B (zh) | 一种信号肽及其在利用淀粉产l-精氨酸重组菌中的应用 | |
| CN105296523A (zh) | 一种信号肽及其在利用淀粉产γ-氨基丁酸重组菌中的应用 | |
| CN108102996A (zh) | 一种在枯草芽孢杆菌中高效表达麦芽糖淀粉酶的方法 | |
| WO2021077581A1 (zh) | 发酵生产硫酸软骨素的酵母工程菌及其应用 | |
| CN105238811A (zh) | 一种信号肽及其在利用魔芋粉产l-精氨酸重组菌中的应用 | |
| CN108949784A (zh) | 芽孢形成相关基因sigmaF在产酶中的应用 | |
| CN105505977A (zh) | 一种信号肽及其在利用魔芋粉产l-谷氨酸重组菌中的应用 | |
| CN105112348B (zh) | 一种高产普鲁兰酶的重组短小芽孢杆菌及其应用 | |
| KR20230042509A (ko) | 공급 속도 이동을 이용한 바실러스의 산업적 발효 방법 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |