CN1441055A

CN1441055A - 一种生产l－精氨酸的菌株及其诱变方法与利用该菌株生产l－精氨酸的方法

Info

Publication number: CN1441055A
Application number: CN 03112896
Authority: CN
Inventors: 陶文沂; 许正宏; 熊筱晶; 窦文芳; 史劲松
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2003-02-25
Filing date: 2003-02-25
Publication date: 2003-09-10
Anticipated expiration: 2023-02-25
Also published as: CN1169946C

Abstract

一种生产L－精氨酸的菌株及其诱变方法与利用该菌株生产L－精氨酸的方法，涉及L－精氨酸的发酵法生产。本发明采用本实验室筛选并保藏的钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)SYA5(组氨酸缺陷型，磺胺胍抗性)为亲株，按常规方法进行物理化学诱变处理，并经多重结构类似物抗性筛选，得到突变株SDNN403(组氨酸缺陷型，磺胺胍抗性，D－精氨酸抗性，高精氨酸抗性，甲基半胱氨酸抗性)，在优化条件下培养生产L－精氨酸，产酸水平达到30－35g/l。本发明菌株具有遗传稳定性好，产量性状稳定，L－精氨酸产量保持较高的水平，且产生的杂酸少，工艺放大较为容易，适合于工业化生产。

Description

一种生产L-精氨酸的菌株及其诱变方法与利用该菌株生产L-精氨酸的方法

技术领域

一种生产L-精氨酸的菌株及其诱变方法与利用该菌株生产L-精氨酸的方法，本发明涉及以葡萄糖、硫酸铵为主要原料，利用钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)突变株发酵生产L-精氨酸的方法。

背景技术

L-精氨酸是人体和动物的一种半必需氨基酸，具有重要的生化和生理学意义，因此被广泛应用于食品和医药工业中，尤其在医药工业领域，其作为提高人体免疫力，防治心血管疾病以及增强男性精子活性等治疗用药已受到人们的关注。

L-精氨酸的制备方法有提取法(中国专利CN1161959)和发酵法，提取法操作费时，收率低，环境污染严重，不适于大规模生产。发酵法生产L-精氨酸，有采用棒杆菌或短杆菌属的微生物，如谷氨酸棒杆菌或黄色短杆菌，经过诱变，筛选精氨酸结构类似物突变株，以解除精氨酸作为产物的反馈抑制和阻遏，提高L-精氨酸的产量。关于选择精氨酸结构类似物的方法，例如：培养有2-噻唑基氨基丙酸抗性的L-精氨酸生产菌的方法(日本专利JP60083593)；培养有半胱氨酸或半胱氨酸类似物抗性的L-精氨酸生产菌的方法(美国专利US5034319)。上述方法采用的诱变方法及结构类似物往往比较单一，容易造成高产L-精氨酸的突变株遗传稳定性差，在大生产中产生回复突变，从而造成L-精氨酸产量性状下降。发酵法生产L-精氨酸，也有采用大肠杆菌或谷氨酸棒杆菌通过基因改造，导入关键酶的基因或增加关键酶的拷贝数，从而提高获得的重组菌的L-精氨酸的产量(中国专利CN1276421和美国专利US4430430)，但上述方法所获的重组菌株的外源质粒很容易在生产中丢失或者需要加入一定的选择性压力，使得采用这类重组菌来生产L-精氨酸时很难进行工艺放大，难以实现产业化。

从工业化角度看，要求生产L-精氨酸的菌株遗传稳定性好，且产生的杂酸少，L-精氨酸产量达一定水平，工艺放大较为容易，这样才能适合于工业化生产。

发明内容

本发明的目的在于提供一种生产L-精氨酸的菌株及其诱变方法与利用该菌株生产L-精氨酸的方法，其中包括筛选具有多重结构类似物抗性的突变株以及在适宜条件下培养该突变菌株大量生产L-精氨酸。

在本发明中，用于筛选的出发菌株为实验室筛选的钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)SYA5；用于筛选的抗性标记药物有磺胺胍、D-精氨酸、高精氨酸和甲基半胱氨酸。

本发明所述的一种生产L-精氨酸的菌株，该菌株为钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)SDNN403，已保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.0890。

该菌株具有以下遗传特性：组氨酸缺陷型，磺胺胍抗性，D-精氨酸抗性，高精氨酸抗性，甲基半胱氨酸抗性，且磺胺胍抗性浓度为1mg/ml～5mg/ml，D-精氨酸抗性、高精氨酸抗性、甲基半胱氨酸抗性浓度分别为15mg/ml～25mg/ml。

用于本发明的L-精氨酸生产菌株可以这样得到：出发菌株进行多重物理、化学因子逐级诱变，并经多重结构类似物抗性筛选获得。选用紫外线，硫酸二乙酯和N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(简称亚硝基胍，下同)多次诱变处理，将诱变后的微生物涂布在含一定量磺胺胍、D-精氨酸、高精氨酸和甲基半胱氨酸的基础琼脂筛选培养基上，挑出在此培养基上生长的菌落进行摇瓶筛选。突变菌株诱变谱系见附图1。

该菌株的诱变方法：

(1)出发菌株：钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)SYA5(组氨酸缺陷型，磺胺胍抗性)。

(2)逐级诱变

紫外线诱变，得诱变菌株SUV67-18(组氨酸缺陷型，磺胺胍抗性)；

硫酸二乙酯诱变，得诱变菌株SUD18-80(组氨酸缺陷型，磺胺胍抗性，D-精氨酸抗性)；

再经硫酸二乙酯诱变，得诱变菌株SD100-28(组氨酸缺陷型，磺胺胍抗性，D-精氨酸抗性)；

亚硝基胍诱变，得诱变菌株SDN28(组氨酸缺陷型，磺胺胍抗性，D-精氨酸抗性，高精氨酸抗性)；

再经亚硝基胍诱变，得诱变菌株SDNN403(组氨酸缺陷型，磺胺胍抗性，D-精氨酸抗性，高精氨酸抗性，甲基半胱氨酸抗性)。

(3)培养和结构类似物抗性筛选

种子培养

种子培养基：葡萄糖30-50g/l，玉米浆10-20g/l，(NH₄)₂SO₄ 5-20g/l，KH₂PO₄ 1-5g/l，MgSO₄·7H₂O 0.5-2g/l，尿素1.5-5g/l，pH7.0～7.2，121℃灭菌20分钟。

种子培养时装液量为30ml/250ml三角瓶，培养温度为30℃-35℃，摇瓶转速为90-120转/分。

筛选培养

筛选培养基：葡萄糖10-30g/l，(NH₄)₂SO₄ 3-15g/l，KH₂PO₄ 1-5g/l，MgSO₄·7H₂O 0.5-2g/l，FeSO₄·7H₂O 0.02-0.15g/l，MnSO₄·H₂O 0.02-0.15g/l，生物素30-50μg/l，硫胺素200-250μg/l，组氨酸500-1000μg/l，磺胺胍1-5mg/ml、D-精氨酸、高精氨酸和甲基半胱氨酸各15-25mg/ml，琼脂20g/l，PH7.0～7.2，121℃灭菌20分钟。

筛选培养条件为30℃-35℃培养1-5天。

利用该菌株生产L-精氨酸的方法：

发酵培养基：葡萄糖100～120g/l，玉米浆5～15g/l，(NH₄)₂SO₄ 40～60g/l，KH₂PO₄ 1.0～2.0g/l，MgSO₄·7H₂O 0.5～1.0g/l，FeSO₄·7H₂O 0.01～0.05g/l，MnSO₄·H₂O 0.01～0.05g/l，L-组氨酸0.5-1mg/l，生物素0.08-0.15mg/l，CaCO₃ 30g/l，初始PH7.0～7.2。

按照本发明，可以用通风发酵的方式培养合适的微生物进行L-精氨酸的生产。作为培养基需要有适当的碳源、氮源、无机物及所需的痕量其它营养物质和无机盐。将菌株以10～15％(W/W)接种量转接到发酵培养基中，培养在通气条件下进行，如摇瓶培养和搅拌式发酵罐通风培养，培养温度30℃～35℃左右，摇床转速90～120转/分，培养pH6-8范围内，pH值中性左右。可选用碳酸钙、氨、无机酸碱溶液调节pH值。通常培养3～5天后，L-精氨酸在发酵液中积累。

本发明的有益效果是采用了本实验室筛选得到的钝齿棒杆菌SYA5为亲株，按常规方法进行物理、化学诱变处理和结构类似物抗性筛选，得到突变株钝齿棒杆菌SDNN403，该突变株具有以下遗传特性：组氨酸缺陷型，磺胺胍抗性，D-精氨酸抗性，高精氨酸抗性，甲基半胱氨酸抗性，且磺胺胍抗性浓度为1mg/ml～5mg/ml，D-精氨酸抗性、高精氨酸抗性、甲基半胱氨酸抗性浓度分别为15mg/ml～25mg/ml。

在优化条件下发酵生产L-精氨酸，产酸水平达到30～35g/L。现有技术提供筛选的结构类似物多比较单一，而本发明提供筛选的结构类似物呈现多样性，这样就大大提高了高产L-精氨酸突变株的遗传稳定性。本发明菌株具有遗传稳定性好、产量性状稳定，L-精氨酸产量保持较高水平，且产生的杂酸少，工艺放大较为容易，适合于工业化生产。

附图说明

图1为生产L-精氨酸菌株的诱变谱系图。

具体实施方式

实施例1

制备对磺胺胍、D-精氨酸、高精氨酸和甲基半胱氨酸有抗性的突变株及发酵生产L-精氨酸。

将出发菌株SYA5经紫外诱变、硫酸二乙酯诱变后获得SD100-28菌株，继续进行亚硝基胍诱变，将SD100-28菌株接入种子培养基，培养到对数生长中后期再以50％的接种量转接到新鲜种子培养基中培养5小时使细胞达到同步培养。将培养液无菌离心，收集菌体，用0.1mol/l，pH6.0的磷酸缓冲液洗涤2～3次，转入带玻璃珠的三角烧瓶中打散，得菌悬液，细胞浓度控制在10⁸个/ml左右。称取少量亚硝基胍溶解在少量丙酮中，再加入磷酸缓冲液，制成浓度为1.0mg/ml的亚硝基胍溶液。取2mL的菌悬液中加入2mL亚硝基胍溶液，30℃振荡反应30分钟，诱变结束后快速离心终止反应，用0.1mol/lpH6.0的磷酸缓冲液洗涤2～3次，加入新鲜的种子培养基中进行后培养8小时。最后取培养液按梯度稀释涂布筛选培养基平板，31℃恒温培养3-5天后挑选大菌落在发酵培养基中进行摇瓶筛选。

种子培养基组成为：

葡萄糖30g/l，玉米浆20g/l，(NH₄)₂SO₄ 20g/l，KH₂PO₄ 1g/l，MgSO₄·7H₂O 0.5g/l，尿素1.5g/l，pH7.0～7.2，121℃灭菌20分钟，装液量30ml/250ml。

筛选培养基组成为：

葡萄糖10g/l，(NH₄)₂SO₄ 3g/l，KH₂PO₄ 1g/l，MgSO₄·7H₂O 0.5g/l，FeSO₄·7H₂O 0.02g/l，MnSO₄·H₂O 0.02g/l，生物素30μg/l，硫胺素200μg/l，组氨酸500μg/l，磺胺胍1.2mg/ml、D-精氨酸、高精氨酸和甲基半胱氨酸各15mg/ml，琼脂20g/l，pH7.0～7.2，121℃灭菌20分钟。

发酵培养基组成为：

葡萄糖120g/l，硫酸铵50g/l，玉米浆12g/l，KH₂PO₄ 1g/l，MgSO₄·7H₂O 0.6g/l，FeSO₄·7H₂O 0.01g/l，MnSO₄·H₂O 0.01g/l，L-组氨酸0.5mg/l，生物素0.08mg/l，CaCO₃ 30g/l，初始pH7.0-7.2。

用以下方法比较突变株与母株的L-精氨酸的发酵生产能力。

将突变株与母株分别接种到种子培养基中，在31℃下96转/分摇瓶培养16小时，将形成的种子培养物以10％的接种量接入发酵培养基中，在31℃下摇瓶培养96小时。

培养结束后，用氨基酸色谱仪测定所发酵培养基中积累的L-精氨酸的量，结果见表1。

表1

突变菌株编号 L-精氨酸产量

(g/l)

SYA5 4.5

SUV67-18 6.2

SUD18-80 8.1

SD100-28 9.6

SDN28 15.0

SDNN403 32.8

Claims

1.一种生产L-精氨酸的菌株，其特征是该菌株为钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)SDNN403，L-精氨酸菌种保藏号为CGMCCNo.0890，该菌株具有以下遗传特性：组氨酸缺陷型，磺胺胍抗性，D-精氨酸抗性，高精氨酸抗性，甲基半胱氨酸抗性。

2.根据权利要求1所述的菌株，其特征是磺胺胍抗性浓度为1mg/ml～5mg/ml，D-精氨酸、高精氨酸、甲基半胱氨酸抗性浓度分别为15mg/ml～25mg/ml。

3.根据权利要求1、2所述菌株的诱变方法，其特征是出发菌株经紫外、硫酸二乙酯、N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍逐级诱变，并经磺胺胍抗性，D-精氨酸抗性，高精氨酸抗性，甲基半胱氨酸抗性筛选获得，筛选培养基为：葡萄糖10g/l，(NH₄)₂SO₄ 3g/l，KH₂PO₄ 1g/l，MgSO₄·7H₂O 0.5g/l，FeSO₄·7H₂O 0.02g/l，MnSO₄·H₂O 0.02g/l，生物素30μg/l，硫胺素200μg/l，组氨酸500μg/l，磺胺胍1.2mg/ml、D-精氨酸、高精氨酸和甲基半胱氨酸各15mg/ml，琼脂20g/l，pH7.0～7.2，121℃灭菌20分钟。

4.一种利用权利要求1或2所述菌株生产L-精氨酸的方法，其特征是发酵培养基为：葡萄糖100～120g/l，玉米浆5～15g/l，(NH₄)₂SO₄ 40～60g/l，KH₂PO₄ 1.0～2.0g/l，MgSO₄·7H₂O 0.5～1.0g/l，FeSO₄·7H₂O 0.01～0.05g/l，MnSO₄·H₂O 0.01～0.05g/l，L-组氨酸0.5-1mg/l，生物素0.08-0.15mg/l，CaCO₃ 30g/l，初始pH7.0-7.2，将菌株以10～15％(w/w)接种量转接到发酵培养基中，在通气条件下，以摇瓶培养或搅拌式发酵罐通风培养，pH6～8；培养温度30～35℃，培养时间为72～120小时，摇床转速90～120转/分钟，L-精氨酸在发酵液中积累。