JP2009507490A

JP2009507490A - 酸素によって調節される微生物

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Publication number: JP2009507490A
Application number: JP2008529998A
Authority: JP
Inventors: フレデリックアール．ブラットナー，; ジョンウォルターキャンベル，; ニアンシャイ，; バフィーシュタール，
Original assignee: スカルブジェノミクス，エルエルシー
Priority date: 2005-09-08
Filing date: 2006-09-08
Publication date: 2009-02-26
Anticipated expiration: 2026-09-08
Also published as: US8900849B2; KR20080055887A; WO2007030790A2; CA2621280A1; KR101313846B1; EP1922404B1; MX297190B; CA2621280C; WO2007030790A3; MX2008003242A; EP1922404A2; WO2007030790A9; US20090053792A1; JP5006325B2

Abstract

本発明は、酸素調節型の代謝を行う微生物の新規株に関する。この微生物は、親微生物よりも高い増殖速度を有し、より効率的である。この微生物は、種々の目的産物（例えば、組換えタンパク質、ＤＮＡのような核酸、アミノ酸および化学物質）を産生するために使用される。本発明は特に、酸素レベルによって調節される、炭素源からの代謝フラックスを有する微生物を提供する。本発明はまた、酸素感受性プロモーターを含む微生物であって、該プロモーターは、該微生物の１以上の代謝経路を通る、炭素源の代謝フラックスを調節することができ、そして該酸素感受性プロモーターは、天然には該酸素感受性プロモーターの転写制御下にはない異種遺伝子に作動可能に連結されている微生物を提供する。

Description

（関連出願への相互参照）
本願は、２００５年９月８日に出願された米国仮特許出願第６０／７１５，７０２号、および２００６年８月１８日に出願された国際特許出願ＰＣＴ／２００６／０３２５２５号の利益を主張する。これらの内容は、本明細書中に参考として援用される。

（発明の分野）
本発明は、微生物の新規株およびこれらの微生物に関する醗酵プロセスに関する。より具体的には、本発明は、遺伝子改変された微生物株と、商業的製品（例えば、組換えタンパク質、核酸、アミノ酸および専門的化学物質）の産生のためのその株の使用に関する。本発明はまた、そのような使用のための微生物株の調製法に関する。

（背景）
細菌のような微生物は、生物製剤、ワクチン構成要素、プラスミドＤＮＡ、ワクチンＤＮＡおよび多くの専門的化学物質（アミノ酸を含む）を製造するために、産業プロセスにおいて広範に使用されている。産業プロセスにおいて使用される細菌は、代表的に、炭素源としてグルコースを補充した液体培地中で増殖する。容量生産性を最大にするため、専門的な化学物質を生産するため、そして細菌の維持のために所望される高密度に細菌を増殖させるために、産業プロセスでは、大量のグルコースが必要とされる。細菌は、代謝産物を高速で取り込み、同化する。代謝産物のフラックスは、特定の代謝産物の濃度が上昇するにつれて、その細菌の中心炭素経路における１以上の生化学反応を圧倒するほどに高いものになり得る。細菌は、１以上の「オーバーフロー」経路を使用することによって、高濃度の代謝産物を蓄積する。

Ｅ．ｃｏｌｉは、高細胞密度醗酵の間に酸素が不十分になると、酢酸塩を分泌する傾向がある。このルートの原因は、細胞の、Ｏ_２以外のアクセプターに電子を蓄積させる必要性である。次の原因は、解糖系の産物であるアセチル−ＣｏＡ（これは、酸素の存在下では通常ＴＣＡサイクルによって燃焼される）の細胞内蓄積である。しかしながら、Ｏ_２が少ない場合には、このＴＣＡサイクルが効率的にアセチル−ＣｏＡを代謝することができず、そのためアセチル−ＣｏＡが細胞内に蓄積する。過剰なアセチル−ＣｏＡは、酢酸塩に変換され、酢酸塩は他の有機酸と一緒に排出され、細胞から電子を奪う。このことは、野生においては、Ｅ．ｃｏｌｉについての生存可能であるが遅い代謝をもたらすが、産業的醗酵においては、細胞密度がより高いレベルに移るにつれ、過剰な酢酸塩は毒性レベルにまで蓄積し得る。

この問題は、回分培養によって伝統的に取り組まれてきた。この回分培養では、炭素源が培地中でメーターで測定され、それによって細胞の増殖を、利用可能なＯ_２と同等のレベルへの炭素枯渇によって制限する。炭素源を測定するにも関わらず、結局、酸素の利用性が、高い細胞密度における制限になる。この状況では、醗酵槽の環境もまた、完全な混合の欠如に起因して不均一になり、そしてＯ_２レベルは、空間中で場所ごとに変動する。低Ｏ_２領域で分泌された酢酸塩はより多くのＯ_２を含む領域に運ばれる細胞によって再吸収されるが、これは代謝的に非効率的であり、最終的に、多くの細胞が蓄積するにつれて、回分培養技術をもってしてもこの酢酸塩レベルは容赦なく上がる。有機酸レベルは培地の緩衝能を超えて上昇するので、ｐＨはＮａＯＨのような無機塩基による滴定によって維持され、このことはさらなる機器およびプラントの職員による注意を必要とするだけではなく、下流の製品精製の複雑性、および醗酵槽の廃棄ストリームにおける塩負荷も上昇させ得る。オーバーフロー代謝を最小化することによって特異的な産物形成を増加させる醗酵レジメンは、当該分野における顕著な改善を担う。

（発明の要旨）
種々の実施形態において、本発明は、酸素レベルによって調節される炭素源由来代謝フラックスを有する微生物を提供する。この微生物は、原核生物（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ、ＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓまたはＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔｅｓ）であり得る。この微生物はまた、真核生物（例えば、酵母）であり得る。この酵母は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、ＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｐｏｍｂｅまたはＰｉｃｈｉａ種であり得る。上記炭素源は、グルコース、フルクトース、ガラクトース、マンノース、スクロース、マルトース、Ｎ−アセチルグルコサミン、β−グルコシド、マンニトール、セルビオース、ソルボース、グルシトール、またはガラクチトールであり得る。

上記微生物は、ホスホエノール依存性ホスホトランスフェラーゼ系のタンパク質をコードする遺伝子に作動可能に連結された酸素調節型プロモーターを含み得る。この微生物は、Ｅ．ｃｏｌｉＯ１５７．Ｈ７のスクロース代謝モジュールのタンパク質をコードするタンパク質に作動可能に連結された酸素調節型プロモーターを含み得る。この酸素調節型プロモーターに作動可能に連結された遺伝子は、融合タンパク質をコードし得る。この融合タンパク質は、ユビキチンを含み得る。

本発明の他の実施形態が、本明細書中以下にさらに詳細に考察される。

（発明の詳細な説明）
本発明は種々の形態において実施されることができ、本開示が本発明の例示であるとみなされるべきであり、本発明を例示される具体的な実施形態に限定することを意図されないという理解の下で、いくつかの実施形態の以下の説明がなされる。表題は例示のためのみに提供され、決して本発明を限定すると解釈されるべきではない。任意の表題の下に例示される実施形態が、任意の他の表題の下に例示される実施形態と組み合わされ得る。

そうでないと明示的に示されない限り、本願において特定される種々の範囲における数値の使用は、その述べられた範囲の最小値および最大値の双方の前に、語「約」が存在するかのように、おおよそとして述べられる。この様式において、その述べられた範囲のわずかに上または下のバリエーションが、その範囲内の値と実質的に同じ結果を達成するために使用され得る。本明細書中で使用される用語「約」および「およそ」は、数値に対して言及された場合、当業者にとって本来の、そして通常の意味を有するべきである。また、範囲の開示は、記載された最小値と最大値との間の全ての値、ならびにそれらによって形成される任意の範囲を含む連続的な範囲であると意図される。これは、有限の上限および／または下限を含んで形成され得る範囲、および含まずに形成され得る範囲を含む。従って、当業者は、多くのそのような割合、範囲および割合の範囲が、本明細書中および本発明の全ての代表的な実施形態に提示されるデータおよび数字から一義的に導かれ得ることを認識する。

１つの実施形態において、本発明は、酸素レベルによって調節される代謝フラックスを有する微生物に関する。この微生物が閾値より下のレベルの酸素環境に存在する場合、代謝フラックスが低減される。低レベルの酸素において代謝フラックスを低減させることによって、低減された酸素の環境において産生される所望されない代謝物に対するオーバーフロー代謝が低減され得る。酸素レベルが閾値レベルを超えて増加すると、代謝フラックスが増加され得る。培養中には、効率的な産物合成のために十分な酸素の微小環境と、不十分な酸素の微小環境とが存在し得る。この微生物は、変動する酸素レベルの下で代謝フラックスを自己調節することができ、それによって効率的な産物形成を可能にする条件下でのみ基質を消費することができる。

酸素レベルの関数として代謝速度を調節することによって、酢酸塩および他の所望されないオーバーフロー代謝物の産生が低減され得る。上記微生物に代謝を自己調節させることによって、目的の産物が、より良い効率で、かつより少ないコストで産生され得る。

（１．微生物）
上記微生物は、任意の親微生物に由来し得る。代表的な親微生物は、ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手可能である。他の代表的な微生物は、Ｓ．Ｙ．Ｌｅｅ，”ＨｉｇｈＤｅｎｓｉｔｙＣｕｌｔｕｒｅｏｆＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ”，Ｔｉｂｔｅｃｈ１４：９８−１０３（１９９６）に記載されている。この親微生物は、酵母のような真核生物であり得る。酵母の代表的な例としては、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓ．ｐｏｍｂｅおよびＰｉｃｈｉａ種が挙げられるが、これらに限定されない。この親微生物は細菌のような原核生物でもあり得、有機栄養生物（ｃｈｅｍｏｈｅｔｅｒｏｔｒｏｐｈｉｃｏｒｇａｎｏｔｒｏｐｈ）であり得る。細菌の代表的な例としては、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ、およびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔｅｓが挙げられるが、これらに限定されない。

上記微生物はまた、減少ゲノム微生物（ｒｅｄｕｃｅｄｇｅｎｏｍｅｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）（例えば、減少ゲノム細菌）でもあり得る。微生物のゲノム中に含まれている多くの遺伝情報が、最終代謝物の産生に不利な影響を及ぼすことなく、欠失され得る。さらに、減少ゲノムを有する微生物は、多くの目的産物の産生において有利であり得る。例えば、減少ゲノムは、より少ないネイティブな産物の産生またはそのレベルの低下につながることがあり、このことは、より複雑でない目的産物の精製につながり得る。さらに、減少ゲノムを有する微生物は、代謝的に要求が少ないことがあり、従って目的産物をより効率的に産生し得る。減少ゲノム細菌は、本明細書中に参考として援用される米国特許第６，９８９，２６５号において考察されている。天然ペリプラズムタンパク質の限定された産生を有する減少ゲノム細菌は、ペリプラズムにおける組換えタンパク質発現のために有益であり得る。適した減少ゲノム細菌株の例としては、ＭＤＳ１２、ＭＤＳ１３、ＭＤＳ３９、ＭＤＳ４０、ＭＤＳ４１、ＭＤＳ４２、ＭＤＳ４３、ＭＤＳ４４、ＭＤＳ４５、ＭＤＳ４６、ＭＤＳ４７、ＭＤＳ４８、ＭＤＳ４９、ＭＤＳ５０、ＭＤＳ５１、ＭＤＳ５２、ＭＤＳ５３、ＭＤＳ５４、ＭＤＳ５５、ＭＤＳ５６、ＭＤＳ５７、ＭＤＳ５８、ＭＤＳ５９およびＭＤＳ６０が挙げられるが、これらに限定されない。これらの減少ゲノム微生物はまた、１またはそれより多くの微生物の遺伝子およびオペロンから新規に導かれ得る。

（２．酸素調節型代謝フラックス）
酸素レベルは、微生物における炭素源の代謝フラックスを調節し得る。炭素源の代謝は、その炭素源の移入（ｉｍｐｏｒｔａｔｉｏｎ）において調節され得る。例えば、その炭素源の移入に関与するタンパク質の発現が、酸素調節型プロモーターの制御下に置かれ得る。

炭素源の代謝はまた、その炭素源を用いる第一の細胞内代謝ステップまたはその後の任意のステップ、あるいはそれらの組み合わせにおいても調節され得る。例えば、解糖に関与するタンパク質、または解糖のための基質へのその炭素源の変換に関与するタンパク質の発現が、酸素調節型プロモーターの制御下に置かれ得る。

（ａ．炭素源）
上記炭素源は、（天然に、またはその炭素源を代謝することができる酵素をコードする異種遺伝子またはオペロンを導入することによってのいずれかで）上記微生物の増殖および／または代謝をサポートすることができる任意の炭素源であり得る。この炭素源は、単糖（例えば、グルコース、フルクトース、ガラクトースまたはマンノース）であり得る。この炭素源はまた、二糖（例えば、スクロース）であり得る。他の炭素源としては、マルトース、Ｎ−アセチルグルコサミン、β−グルコシド、マンニトール、セルビオース、ソルボース、グルシトールおよびガラクチトールが挙げられるが、これらに限定されない。

細菌は、ホスホエノールピルビン酸：炭水化物ホスホエノールトランスフェラーゼ（ＰＴＳ）系を介して炭素源を取り込み得る。このＰＴＳ系は、高品質の外因性炭素源の迅速かつ効率的な取り込みを可能にし得、そして多くの細菌における代謝の異化調節における重要な役割を担っている。このＰＴＳ系の１またはそれより多くの構成要素の発現が、酸素調節型プロモーターの制御下に置かれ得、このことが、オーバーフロー産物の産生を低減させ得る。酸素の利用可能性によって調節される、代替的な炭素源取り込み経路が、醗酵の過程を通した産物形成への基質のより効率的な分配を可能にし得る。

上記ＰＴＳ系は、リン酸によって中継される系（ｐｈｏｓｐｈｏ−ｒｅｌａｙｓｙｓｔｅｍ）を含み、この系では、ＥＩタンパク質（ｐｔｓＨによってコードされている）がホスホエノールピルビン酸のリン酸基をＨｐｒタンパク質（ｐｔｓＩによってコードされている）に転移させ、これが次に炭水化物特異的ＥＩＩＡサブユニット（Ｅ．ｃｏｌｉでは、グルコース特異的ＥＩＩＡタンパク質はｃｒｒ遺伝子によってコードされている）をリン酸化し、これが次いで膜結合型タンパク質または炭水化物輸送複合体と相互作用し得、同族の糖を内在化（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚｅ）またはリン酸化し得る。この全体の反応によって、外因性の糖を内部の糖−リン酸に輸送しながら、ＰＥＰをピルビン酸に変換する。

Ｅ．ｃｏｌｉにおいて、共通のＰＴＳ要素であるｐｔｓＨおよびｐｔｓＩをコードする遺伝子は、ｃｒｒ遺伝子と染色体上でつながっている。３つの遺伝子は全て、ｐｔｓＨの上流に見出されるプロモーターのセットによって転写される。加えて、ｐｔｓＩにおけるさらなるプロモーターまたはプロモーターペアは、ｐｔｓＩのみを誘導する転写を生じさせる。ｐｔｓＨの上流のプロモーターのうちのいくつかの発現が、嫌気条件下で増加する。これらの遺伝子の発現の増加が、糖取り込みの増加および任意のＰＴＳ系（これに対して同族の糖が存在する）による活性化をもたらし得る。酸素がＴＣＡサイクルのための電子アクセプターとして限定要素になるにつれて、ＰＴＳ遺伝子の発現の増加が同時に糖取り込みのキャパシティーを増加させるので、これらの遺伝子の転写の増加は、そのようにして、所望されないオーバーフロー代謝物の産生における役割を果たし得る。ネイティブのｐｔｓＨ結合プロモーターを酸素調節型プロモーターに換えることによって、酸素依存様式でＰＴＳの糖取り込みを調節し得、従って、炭素源の消費が酸素の存在と共役することを確実にする。細胞における１以上のＰＴＳ系の共通要素の発現を制御することによって、多数の炭素源のアベイラビリティーおよび／または利用性が制御され得る。上で考察されたように、炭素源の取り込みおよび活性化は、それらを効率的に代謝するためのその微生物のキャパシティーを超えることができ、所望されないオーバーフロー代謝物の産生をもたらす。さらに、ＰＥＰから直接的に由来する化合物（例えば、シキミ酸経路に由来する芳香族）は、ＰＥＰ媒介性糖輸送のためのＰＥＰの消費によって制限され得る。

（１．スクロース）
スクロースは、上記微生物のための炭素源として使用され得る。スクロースは、グルコースとフルクトースとの二糖である。代謝されるためには、スクロースは、細胞内に輸送され得、次いで単糖単位に分けられ得る。グルコースおよびフルクトースは両方、次いで、グルコース−６−リン酸およびフルクトース−６−リン酸として解糖系に入る。

多数の微生物（Ｅ．ｃｏｌｉのほとんどの株を含む）は、スクロース上で生育することができない。しかしながら、いくつかの株は、単一の炭素源としてのスクロースの取り込みおよび代謝を可能にする遺伝子系を有する。そのような遺伝子系、またはその一部は、上記微生物の染色体に加えられてもよいし、またはプラスミド上でその微生物に加えられてもよい。その微生物に加えられた１つ以上の遺伝子は、酸素調節型プロモーターの制御下に置かれ得る。他の炭素源の取り込みおよび代謝を可能にする遺伝子系もまたその微生物に加えられ得ることもまた、企図される。

米国特許第６，３６５，７２３号および同第６，８５５，８１４号（これらは、本明細書中に参考として援用される）は、スクロースを単一の炭素源として使用することを可能にする、スクロースの取り込みおよび代謝のためのコンパクトな遺伝子系の代表的な例を記載する。Ｅ．ｃｏｌｉＯ１５７：Ｈ７代謝モジュールが、図１に示される。ｃｓｃＢ遺伝子産物は、スクロースを細胞内に輸送し、ｃｓｃＡはスクロース加水分解酵素（インベルターゼ）をコードし、このスクロース加水分解酵素が二糖をフルクトースおよびグルコースに分ける。遺伝子ｃｓｃＫはフルクトキナーゼ（フルクトースの解糖代謝の第一の酵素）をコードする。このｃｓｃＫ遺伝子は、他のフルクトキナーゼと高度の類似性を示し、そしてＥ．ｃｏｌｉＫ−１２のｆｒｕＫ遺伝子とリダンダントであり得るが、しかしながら、Ｅ．ｃｏｌｉＫ−１２細胞はインベルターゼおよびスクロース加水分解活性を欠如し得る。ｃｓｃＲ遺伝子産物は、プロモーターに対して結合することによって、スクロースアベイラビリティーに関連するＯ１５７：Ｈ７の遺伝子の発現を制御するリプレッサーである（ｌａｃＩ−ｇａｌＲファミリーのリプレッサータンパク質の代表的なもの）。

（ｂ．酸素調節型プロモーター）
炭素源からの代謝フラックスは、その炭素源の代謝に関与する１つ以上のタンパク質をコードする遺伝子に作動可能に連結された酸素感受性プロモーターによって調節され得る。酸素の存在下で活性化されるプロモーターの代表的な例は、ｃｙｏオペロンおよび酸化ダメージに対して細胞を保護する酵素をコードするスーパーオキシドジスムターゼ（ｓｏｄＡ）内のプロモーターである。野生型Ｋ１２ｓｏｄＡ染色体領域は、図２に示される。

正の酸素感受性プロモーターを使用することによって、十分に高い酸素レベルが、オーバーフロー代謝物または他の副産物の産生を最小にしながら、炭素源の代謝を可能にするタンパク質の発現を誘導し得る。そのプロモーターの応答時間は、非細胞質タンパク質（例えば、膜貫通タンパク質）を構成的に発現させるか、または異なるプロモーターの制御下に置きながら、細胞質代謝タンパク質を酸素感受性プロモーターの制御下に置くことによって、増加され得る。酸素条件を減少させる下で代謝が低減されるスピードは、その代謝タンパク質の回転率（ｔｕｒｎｏｖｅｒｒａｔｅ）を増加させることによって、増加され得る。例えば、炭素源の代謝に関与するタンパク質は、ユビキチンとの融合タンパク質として発現され得る。本発明はまた、通常は酸素感受性プロモーターの制御下にはない異種遺伝子に作動可能に連結された酸素調節型プロモーターを含む核酸構築物もまた包含する。

（ｃ．増殖速度）
上記微生物は、豊富な炭素源の存在下で増殖される場合、改善された増殖速度を有し得る。０％〜最大許容％濃度の炭素源を含む液体培地内で増殖される場合、その微生物は、その微生物の親と比較した場合、約２５％〜約４００％大きい（しかしこれらに限定されない）増殖速度を有する。この微生物は、ｗ／ｖで、少なくとも約０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、５．５％、６％、６．５％、７％、７．５％、８％、８．５％、９％、９．５％または１０％で、炭素源を含む培地内で増殖され得る。そのような条件では、この微生物は、親微生物と比較して、約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１０５％、１１０％、１１５％、１２０％、１２５％、１３０％、１３５％、１４０％、１４５％、１５０％、１５５％、１６０％、１６５％、１７０％、１８０％、１８５％、１９０％、１９５％、２００％、２０５％、２１０％、２１５％、２２０％、２２５％、２３０％、２３５％、２４０％、２４５％、２５０％、２５５％、２６０％、２６５％、２７０％、２７５％、２８０％、２８５％、２９０％、２９５％、３００％、３０５％、３１０％、３１５％、３２０％、３２５％、３３０％、３３５％、３４０％、３４５％、３５０％、３５５％、３６０％、３６５％、３７０％、３７５％、３８０％、３８５％、３９０％、３９５％、または４００％大きい増殖速度を有し得る。

（ｄ．代謝フラックス）
上記微生物は、豊富な炭素源の存在下で増殖される場合、改善された代謝フラックスを有し得る。０％〜最大許容％濃度の炭素源を含む液体培地内で増殖される場合、その微生物は、所望される産物に関する炭素源の約５％〜約９０％（しかし、これらに限定されない）を含む代謝フラックスを有し得る。株は、約１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％の代謝フラックスを有し得る。

一般的に、任意の所定の経路における各反応ステップを通る代謝のフラックスは、順方向の反応および逆方向の反応の相対速度に依存する。このフラックスは、時間およびサンプルサイズの関数としての、分析物の濃度における変化の速度をいい得る。任意の単一の代謝変換を通る代謝フラックスは、米国特許第６，７６４，８１７号および同第６，８４９，３９６号（これらの内容は、本明細書中に参考として援用される）に記載される方法論を使用して測定され得る。フラックスおよびその測定についてのさらなるガイダンスは、例えば、Ｎｅｗｓｈｏｌｍｅ，Ｅ．Ａ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｓｙｍｐ．４３：１８３−２０５（１９７８）；Ｎｅｗｓｈｏｌｍｅ，Ｅ．Ａ．およびＳａｒｔ．，Ｃ．，ＲｅｇｕｌａｔｉｏｎｉｎＭｅｔａｂｏｌｉｓｍ，Ｃｈａｐｓ．１および３，Ｗｉｌｅｙ−ＩｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅＰｒｅｓｓ（１９７３）（これらの内容は、本明細書中に参考として援用される）によって提供される。

（ｅ．産生）
本発明の微生物は、高速で、最終代謝物または他の目的の産物を産生することができる。０％〜最大許容％濃度の炭素源を含む液体培地内で増殖される場合、その微生物は、所望の産物に関する炭素源の約０．００１ｇ／Ｌ〜約１００ｇ／Ｌの最終代謝物または他の目的の産物を産生し得る。株は、約１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、または８０％の代謝フラックスを有し得る。

（ｆ．産生速度）
代謝のフラックスを制御する能力の観点から、上記微生物は、種々の速度で、そして種々の割合の効率の炭素源利用において、種々の量の最終代謝物を産生し得る。本発明の株は、少なくとも、約１０ｇ／Ｌ、２０ｇ／Ｌ、３０ｇ／Ｌ、４０ｇ／Ｌ、５０ｇ／Ｌ、６０ｇ／Ｌ、７０ｇ／Ｌ、８０ｇ／Ｌ、９０ｇ／Ｌ、または１００ｇ／Ｌを含む（しかし、これらに限定されない）レベルで最終代謝物を産生し得る。

上記微生物は、約０．５０ｇ／Ｌ／ｈｒ、０．７５ｇ／Ｌ／ｈｒ、１．００ｇ／Ｌ／ｈｒ、１．２５ｇ／Ｌ／ｈｒ、１．５０ｇ／Ｌ／ｈｒ、１．７５ｇ／Ｌ／ｈｒ、２．００ｇ／Ｌ／ｈｒ、２．２５ｇ／Ｌ／ｈｒ、２．５０ｇ／Ｌ／ｈｒ、２．７５ｇ／Ｌ／ｈｒ、３．００ｇ／Ｌ／ｈｒ、３．２５ｇ／Ｌ／ｈｒ、３．５０ｇ／Ｌ／ｈｒ、３．７５ｇ／Ｌ／ｈｒ、４．００ｇ／Ｌ／ｈｒ、４．２５ｇ／Ｌ／ｈｒ、４．５０ｇ／Ｌ／ｈｒ、４．７５ｇ／Ｌ／ｈｒ、および５．００ｇ／Ｌ／ｈｒを含む（しかし、これらに限定されない）速度で最終代謝物を産生し得る。

上記微生物は、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、７０％、および７５％を含む（しかし、これらに限定されない）炭素源利用の効率割合において最終代謝物を産生し得る。

（３．目的の産物）
上記微生物は、豊富な炭素源を含む培地において、高レベルの効率で目的の産物を産生するために使用され得る。この微生物によって産生される目的の産物は、化学物質、アミノ酸、ビタミン、補因子、核酸（例えば、ＤＮＡ）、脂肪酸、増殖因子、タンパク質およびそれらの中間体を含む（しかし、これらに限定されない）任意の１またはそれより多い産物であり得る。目的の産物は、その微生物によって天然に産生される産物であり得る。目的の産物はまた、その微生物に異種遺伝子が加えられた結果として産生される非天然産物であり得る。

目的の産物は、上記微生物において細胞内に局在し得る。目的の産物はまた、その微生物のペリプラズムに分泌され得る。このペリプラズムは、タンパク質産生のために有益であり得る。なぜなら、（ｉ）組み換えヒトタンパク質が、正確なアミノ末端で産生され、一方で細胞質に産生されたものは、天然のタンパク質には存在しない追加的なメチオニンで始まり得る；（ｉｉ）多くのタンパク質が、ペリプラズムスペースにおいて正確に折り畳まれ得る；（ｉｉｉ）正確なジスルフィド結合が、ペリプラズムで形成され得る；（ｉｖ）ペリプラズムスペースは、細胞質内よりもずっと少量で、ずっと少ない種のタンパク質しか含まず、このことが精製を簡便にし得る；（ｖ）細胞質よりも少ないプロテアーゼしか存在せず、このことがタンパク質の消化および損失を低減し得る；および（ｖｉ）発現されたタンパク質が、より豊富な細胞質タンパク質を実質的に含まない外膜を特異的に破壊することによって、他のペリプラズムタンパク質と一緒に容易に放出され得る。目的の産物はまた、細胞によって倍地中に排出され得る。

（４．発酵）
上記微生物は、回分培養（必要とされる量の炭素源全てが、発酵の開始時に加えられ得る）において所望の産物を産生させるために使用され得る。改変細胞は、酸素のアベイラビリティーに対して炭素源消費を変更することができるのみではなく、この株はまた、半回分培養において所望の産物を産生するためにも使用され得る。炭素源の供給速度は、最大許容濃度を生じるまでの任意の量であり得るが、しかし好ましくは、最大増殖速度を維持するのに必要とされる最小量である。この株はまた、発酵の継続（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ）様式または「ケモスタット」様式（これらは、より高い希釈率の維持を可能にし得る）において所望の産物を産生し得る。

上記微生物は、必要な代謝経路を所有するために株によって利用される、少なくとも１つの炭素源および少なくとも１つの窒素源および適切な場合は無機塩、増殖因子などを含む合成培地または天然培地における発酵プロセスのために使用され得る。

適した窒素源の例示的な例としては、アンモニア（アンモニアガスおよび水性アンモニアを含む）；無機酸または有機酸のアンモニア塩（例えば、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム）；ならびに他の窒素含有物質（アミノ酸、肉（ｍｅａｔ）抽出物、ペプトン、モラッセ、コーン浸漬液、カゼイン分解物、大豆ケーキ分解物および酵母抽出物を含む）が挙げられるが、これらに限定されない。

無機塩培地中に個々に存在するいくつかのアミノ酸は、炭素源として細菌によって十分には利用され得ない。細菌の各々の種は、各天然アミノ酸の利用能において異なっている。個々に利用されないアミノ酸は、他のアミノ酸の存在下ではよく利用され得る。例えば、セリンは、グリシン、ロイシン、イソロイシンおよびバリンが存在する場合にのみ炭素源として利用され得る。栄養培地（例えば、合成アミノ酸混合物）では、いくつかのアミノ酸が優先的に利用され得、そして他のアミノ酸よりも前に消費され得る。セリン、プロリン、グリシン、アスパラギン酸、スレオニン、グルタミン酸およびアラニンは、一般的な培地構成成分であるカザミノ酸に存在する１６のアミノ酸の混合物から完全に取り出され得るが、他のものはより緩やかに、そして不完全に利用され得る。類似の結果が、とリプトンブロスにおいて得られる。最終代謝物として蓄積したアミノ酸を再利用することが所望される場合は、そのアミノ酸は、好ましくは、セリン、プロリン、グリシン、アスパラギン酸、スレオニン、グルタミン酸またはアラニンであり、その培地は、炭素源としてのそれらの使用を刺激するのに必要とされるさらなるアミノ酸を含有し得る。この培地はまた、とリプトン、カザミノ酸および大豆分解物を含む（しかし、これらに限定されない）、タンパク質分解物を含有し得る。

本発明は、以下の非限定的な実施例によって例示される、複数の局面を有する。

（実施例１酸素調節型スクロース取り込みおよび代謝）
Ｅ．ｃｏｌｉＫ１２のスクロース異化（Ｓｕｃ^＋）株を、ネイティブｓｏｄＡ遺伝子を、図３に示されるようなＥ．ｃｏｌｉＯ１５７：Ｈ７のスクロース代謝モジュールと置き換えることによって作製した。この遺伝子を、ｃｓｃＢ遺伝子を逆向きにし、そしてそれをｃｓｃＫと並べて配置することによって、そのモジュール内でオリジナルの構成から再配列した。プロモーター−オペレーター領域をｓｏｄＡ遺伝子のプロモーターおよび調節エレメントによって置換するために、ｃｓｃＲ遺伝子を削除した。ｃｓｃＫなしでもまた、この株は作製されえることに注意すべきである。なぜなら、その遺伝子産物の活性は、Ｅ．ｃｏｌｉＫ１２のｆｒｕＫ遺伝子のものとリダンダントであるからである。この株はまた、スクロース代謝モジュールを、プラスミド上に、またはｓｏｄＡのような別個のプロモーターの制御下でゲノムに導入することによっても作製され得る。

プライマー１（Ｐ１）およびプライマー２（Ｐ２）を、単一の２．２Ｋｂ片としてｃｓｃＫおよびｃｓｃＢの両方を増幅するために設計した（図４ｂ）。Ｐ１についての配列は：

であり、これはｃｓｃＡ遺伝子の３’末端との５０ｂｐのオーバーラップ、およびｃｓｃＫ遺伝子のリボソーム結合部位（ＲＢＳ）領域を含むｃｓｃＫ遺伝子の５’末端の２０ｂｐと、５０ｂｐのオーバーラップを有する。Ｐ２についての配列は：

であり、これはｓｏｄＡターミネーター領域の後の３’末端配列の５０ｂｐ、およびｃｓｃＢ遺伝子の３’末端の２０ｂｐを有する。プライマー３およびプライマー４を、Ｏ１５７：Ｈ７ゲノムＤＮＡからｃｓｃＡ（１．４ｋｂ）（図４ａ）を増幅するために設計した。Ｐ４についての配列は：

であり、これはＲＢＳを含むｓｏｄＡプロモーター領域の５０ｂｐを有する。Ｐ３についての配列は：

であり、これはｃｓｃＡ遺伝子の３’末端の配列と一致する。

ｃｓｃＡまたはｃｓｃＢを増幅するためのＰＣＲの第１のラウンドにおいて、５０μｌのＰＣＲ反応を、１００ｎｇのＯ１５７：Ｈ７ゲノムＤＮＡ、５０ｐｍｏｌの各プライマー、０．２ｍＭのｄＮＴＰ、および２．５ＵのＰｆｕポリメラーゼを含むチューブにおいて実施した。ｃｓｃＡ増幅については、その反応は、９５℃で１分を１サイクル、９５℃で１分の変性；５５℃で１５秒のアニーリング；および７２℃で４分の伸長を２５サイクル、７２℃で１０分の最終サイクル、で行った。ｃｓｃＫＢ増幅については、この反応は、アニーリング温度が４８℃であったことを除いて同じサイクルで行った。

組換えＰＣＲ反応の第２ラウンドにおいて、等モル量のｃｓｃＡおよびｃｓｃＫＢ産物を、５０ｐｍｏｌの各プライマー、０．２ｍＭのｄＮＴＰおよび２．５ＵのＰｆｕポリメラーゼを含む５０μｌの反応液中で、テンプレートとして混合した。その反応は、９５℃で５分を１サイクル、９５℃で３０秒の変性；６５℃で３０秒のアニーリング；および７２℃で７．５分の伸長を５サイクル、次いで９５℃で１分の変性；７２℃で７．５分の伸長を２５サイクル、７２℃で１０分の最終サイクル、で行った。得られた産物は、３．７ｋｂのサイズであると予想された（図４ｃ）。

組換えＰＣＲ産物は、５０ｂｐのｓｏｄＡ５’配列、ｃｓｃＡ、ｃｓｃＫ、ｃｓｃＢおよびｓｏｄＡターミネーターの後の３’末端配列の５０ｂｐを含んだ。従って、Ｏ１５７：Ｈ７オペロン由来のｃｓｃＡＫＢオペロンは、ＭＧ１６５５のｓｏｄＡプロモーターの制御下に置かれ、ＭＧ１６５５ｓｏｄＡ：ｃｓｃを生じた。そのＰＣＲ産物を精製し、プラスミドｐＫＤ４６を含有する、ＭＧ１６５５のｓｏｄＡ：：Ｔｎ５変異体の電気泳動のために使用した。図５ａに示すように、ＭＧ１６５５細胞は、単一の炭素源として１％スクロースを含むＭ９培地では増殖することができない。しかしながら、上記ｃｓｃＡＫＢオペロンを含有すする形質転換細胞は、図５Ｂに示されるように、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌの最終濃度）の存在下で、３０℃で２日後に同じ培地で増殖することができる。

（実施例２酸素調節型スクロース代謝）
インベルターゼは、スクロース代謝が流れなければならないボトルネックであり得る。細胞質酵素のように、インベルターゼは、膜タンパク質よりもより迅速にターンオーバーすることができる。このことは、機能の高速のシャットダウンを達成するのに重要である。実際に、その変性の速度は、ユビキチンタグによって、または他のそのような改変によって、必要に応じてスピードアップされ得る。対照的に、ｃｓｃＢのレベルは、シンポーター（ｓｙｍｐｏｒｔｅｒ）が膜タンパク質であるため迅速な制御はできそうにない。その結果、本発明者らは、図６に示されるＳｕｃ^＋株を作製した。構築物は、ｌａｃプロモーターを使用してスクロースシンポーターｃｓｃＢを独立して調節するために、別個のオペロンを提供する。前述の通り、フルクトキナーゼ遺伝子（ｃｓｃＫ）は余分であり得る。

プライマー４およびプライマー５を、Ｏ１５７：Ｈ７ゲノムＤＮＡからｃｓｃＡ（１．４ｋｂ）を増幅するために設計した。Ｐ４は、実施例１において説明したものと同じプライマーであった。Ｐ５についての配列は：

であった。従って、ｃｓｃＡ遺伝子は、ｓｏｄＡの５’および３’の５０ｂｐの配列に隣接している（ｓｏｄＡ_ｐ−ｃｓｃＡ−ｓｏｄＡ_ｔ）。プライマーＫ５およびプライマーＢ３を、１つの片（２．２ｋｂ）（図７ａ）としてｃｓｃＫおよびｃｓｃＢの両方を増幅するために設計した。Ｋ５についての配列は：

であり、これはｃｓｃＫ遺伝子のＲＢＳ領域を含む。Ｂ３についての配列は：

であり、これはｃｓｃＢ遺伝子の３’末端の２０ｂｐを有する。

ＰＣＲを、ｃｓｃＡまたはｃｓｃＫＢを増幅するために実施した。５０ｍｌのＰＣＲ反応を、１００ｎｇのＯ１５７ゲノムＤＮＡ、５０ｐｍｏｌの各プライマー、０．２ｍＭのｄＮＴＰ、および２．５ＵのＰｆｕポリメラーゼを含むチューブ中で実施した。その反応は、９５℃で１分を１サイクル、９５℃で１分の変性；５５℃で１５秒のアニーリング；および７２℃で４分の伸長を２５サイクル、次いで７２℃で１０分の伸長の最終サイクル、で行った。

４μｌのｃｓｃＫＢ産物を、ＥｃｏＲＩ部位でｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、ｐＦＤ１を作製した。従って、ｃｓｃＫＢ産物は、誘導性Ｐｌａｃプロモーターの制御下に置かれている。２．７ｋｂのＰｌａｃ−ｃｓｃＫＢ−ターミネーターフラグメントを、そのプラスミドからＰｖｕＩＩ切断によって切り出し、ゲル精製した（図７ｂ）。このフラグメントを、ａｔｔ部位を含むｐＪＷ２３のＳｍａＩ部位にサブクローニングした。この新しいプラスミド（ｐＦＤ６と命名した）を、次いで、ＮｏｔＩで切断し、大きい方のフラグメントをゲル精製後に回収した。Ｐｌａｃ−ｃｓｃＫｂ−ターミネーターを含むこのフラグメントを、再ライゲーションして、ｐＦＤ７を生成した。プラスミドｐＦＤ７およびｐＪＷ２８９を、組み込みを可能にするために、ＭＧ１６５５またはＭＤＳ４２（ｐＫＤ４６を含まない）のｓｏｄＡ：：Ｔｎ５変異体に同時形質転換した。ｐＪＷ２８９プラスミドは、以前に記載されたようにその後除いた。ｐＫＤ４６プラスミドを、組換えのために、その除かれた宿主に再び導入した。

ｓｏｄＡ_ｐ−ｃｓｃＡ−ｓｏｄＡ_ｔのＰＣＲ産物を、次いで、組換えを可能にするために新しい宿主を形質転換するのに使用した。この形質転換された細胞を、単一の炭素源として１％スクロースを含むＭ９培地上にプレーティングした。形質転換体は、その倍地上で増殖することができ、Ｓｕｃ＋表現型を有する。

（実施例３酸素感受性プロモーターによるスクロース代謝の制御、およびスクロース陽性細菌についてのスクロースリプレッサーによるスクロース取り込み）
この第３の実施例は、Ｏ１５７：Ｈ７のようなスクロース陽性株について、正常の様式で、細胞におけるスクロースのレベルを制御するために、スクロースリプレッサーＣｓｃＲを保存する。このスキームは、Ｏ１５７：Ｈ７のスクロースオペロンにおける正常な位置から、ｓｏｄＡオペロン中へ、ｃｓｃＡ遺伝子を配置換えすることと等価である。この制御方法は、酢酸塩を調節するために最も効率的であり得る。なぜなら、スクロースのプールが固定され、唯一の制御する関数がボトルネック酵素であるインベルターゼのレベルであるからである。ｃｓｃＲ遺伝子をこのスキームから排除し、このことはスクロースの構成的輸送およびフルクトキナーゼ活性をもたらす。前述の通り、図８に示されるように、ｓｏｄＡ遺伝子は、ｃｓｃＡによって置換されるか、またはｃｓｃＡと一続きで組み合わされるかのいずれかである。

プライマー４およびプライマー５を、Ｏ１５７ゲノムＤＮＡからｃｓｃＡ（１．４ｋｂ）を増幅するために設計した。Ｐ４およびＰ５は、実施例１において記載した。従って、ｃｓｃＡ遺伝子は、ｓｏｄＡの５’および３’配列の５０ｂｐに隣接する。プライマーＰｒｏＫ５およびＢ３を、１片（２．２ｋｂ）でｃｓｃＫおよびｃｓｃＢを増幅するために設計した。ＰｒｏＫ５についての配列は：

であり、これはｃｓｃＫ遺伝子の完全なプロモーター領域を含む。Ｂ３についての配列は、上で記載したものと同一である。

ＰＣＲを、ｃｓｃＰｒｏＫ−Ｂ（２．３ｋｂ）（図９ａ）を増幅するために実施した。５０μｌのＰＣＲ反応を、１００ｎｇのＯ１５７ゲノムＤＮＡ、５０ｐｍｏｌの各プライマー、０．２ｍＭのｄＮＴＰ、および２．５ＵのＰｆｕポリメラーゼを含むチューブにおいて実施した。その反応は、９５℃で１分を１サイクル、９５℃で１分の変性；５５℃で１５秒のアニーリング；および７２℃で４分の伸長を２５サイクル、次いで７２℃で３０分の伸長の最終サイクル、で行った。

４μｌのｃｓｃＰｒｏＫ−Ｂ産物を、ｐＶＲ−Ｂｌｕｎｔベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、ｐＦＤ８を作製した。このｃｓｃＰｒｏＫ−Ｂフラグメントを、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩフラグメント（２．７ｋｂ）（図９ｂ）として切り出し、ａｔｔ部位を含有するｐＪＷ２３にサブクローニングした。新しいプラスミドｐＦＤ１４を、次いで、ＮｏｔＩで切断し、大きな方のフラグメントをゲル精製後に回収した。ｃｓｃＰｒｏＫ−Ｂ−ターミネーターを含むこのフラグメントを、再ライゲーションして、ｐＦＤ１５を作製した。プラスミドｐＦＤ１５およびｐＪＷ２８９を、組み込みを可能にするために、ＭＧ１６５５またはＭＤＳ４２（ｐＫＤ４６を含まない）のｓｏｄＡ：：Ｔｎ５変異体に同時形質転換した。両方のプラスミドを、以前に記載したように、その後除いた。次いで、プラスミドＫＤ４６をその除いた宿主に再び導入した。

ｃｓｃＡのＰＣＲ産物を、次いで、組換えを可能にするために上述の新しい宿主に形質転換するのに使用した。形質転換された細胞を、単一の炭素源として１％スクロースを含むＭ９培地上にプレーティングした。形質転換体はその培地上で増殖することができ、Ｓｕｃ＋表現型を有する。

（実施例４スクロース代謝の酸素調節型増殖）
実施例１のＭＧ１６５５ｓｏｄＡ：：ｃｓｃ株の好気依存性増殖を、単一の炭素源およびエネルギー源としてスクロースを使用して、好気−嫌気−好気サイクルを通じての増殖をモニタリングして、試験した。このサイクルは、５００ｍｌのエアリフト醗酵において、醗酵槽を、空気から窒素および二酸化炭素の９５：５混合物にスイッチし、次いで適切な間隔の後に空気に戻すことによって開始した。

図１０は、単一の炭素源およびエネルギー源として１％スクロースを含む、最小ＭＯＰＳ培地上の上記株の代表的な増殖曲線を示す。嫌気条件下での増殖の欠如は、その細胞がもはやスクロースを異化することができないことを示す。対照的に、グルコース＋スクロース上でのＭＧ１６５５ｓｏｄＡ：：ｃｓｃの増殖は、ヘッドスペースのガスの変化によって比較的不変である。なぜなら、グルコース輸送および解糖は、培養の好気状態または嫌気状態によってのみ影響されるものではないからである。

図１１は、２つの類似のエアリフト醗酵の結果を示す。一方は、単一の炭素源およびエネルギー源として０．４％のスクロースを含む最小ＭＯＰＳ培地で実施し、一方は炭素源およびエネルギー源として０．４％スクロースに加えて０．２％グルコースを含む同じ培地において実施した。この株は、嫌気条件下ではスクロース上で増殖しなかったが、酸素が存在するかしないかに関わらず、グルコースを異化し続けた。図１０および図１１に示される増殖プロットに加えて、観察によって、全体の生存細胞カウントがスクロースのみの培養における嫌気フェーズを通して変化せず、外因性のグルコースが存在する場合には増加し続けることが確認された（図１２Ａに示す）。このことは、解糖には生化学的な制限は存在せず、スクロースから産生されたグルコース（ｃｓｃ遺伝子産物の作用により）が、それが生じる場合には嫌気増殖をサポートし得ることを示している。従って、嫌気条件下でのスクロース上での増殖の欠如は、酸素依存性ｓｏｄＡプロモーターからのｃｓｃ遺伝子の転写の欠如に起因する。

加えて、ｐＨプロフィール（図１２Ｂ）は、スクロース上での増殖は非常にわずかな酸しか生成しないが、スクロースとグルコースの両方を含む培養では大量の酸が生じることを実証している。グルコースの嫌気同化は大量の酢酸塩およギ酸塩を生成することが公知なので、このこともまた、醗酵の嫌気フェーズの間にスクロース異化がほとんど、または全く起こらないという観念を支持する。スクロースにおいて増殖する培養物が嫌気シフトの過程の間いずれの酸も産生することができないということは、酸素の非存在下では、細胞内でグルコースがほとんど、または全く利用可能でないことを示す。

（実施例５酸素感受性プロモーターによる、ＰＴＳ炭水化物系の制御）
ネイティブのＰＴＳプロモーターのｓｏｄＡプロモーターでの置換を、図１３および図１４に示す。所望される構築物は３工程で作製する。第１の工程は、一端で染色体標的に相同な独特の配列を共有し、対向する端で２つのＰＣＲ産物の融合を可能にするための共通配列を共有する、２つの別個のＰＣＲ産物の産生に関する。第１の最初のＰＣＲ産物は、ｃｙｓＫ遺伝子の３’末端に相同な４５塩基対の配列、完全なクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子（ＣＡＴ）とそのプロモーター、第２のＰＣＲ産物（以下に説明する）に相同性を提供するための非コードリンカー配列を含む。このＣＡＴ遺伝子は、配列

を有する、Ｏｌｉｇｏ１と指定されたプライマーを使用して、プラスミドｐＡＣＹＣ１８４から増幅される。ここで、小文字の配列は、ｃｙｓＫ遺伝子の３’末端に相同であり、大文字の配列は、ＣＡＴ配列の３’末端に相同である。このＰＣＲ反応における第２のオリゴは、配列

を有し、Ｏｌｉｇｏ３と指定されている。ここで、小文字の配列は、第２のＰＣＲ産物と相同な非コード配列であり、大文字の配列はＣＡＴプロモーター領域の５’末端と相同である。５０μｌのＰＣＲ反応を、１ｎｇのｐＡＣＹＣ１８４ＤＮＡ、５０ｐｍｏｌの各プライマー、０．２ｍＭのｄＮＴＰおよび２．５ＵのＰｆｕポリメラーゼを含むチューブにおいて実施する。その反応は、９５℃で１分を１サイクル、９５℃で１分の変性；５５℃で１５秒のアニーリング；および７２℃で２分の伸長を３０サイクル、次いで７２℃で１０分の伸長の最終サイクル、で行った。

第２の最初のＰＣＲ産物は、上記第１のＰＣＲ産物と相同性を提供する短い非コード配列、インタクトの酸素依存性ｓｏｄＡプロモーター、およびｐｔｓＨ遺伝子の５’末端に相同な４５塩基対の配列を含む。このｓｏｄＡプロモーター領域を、配列

を有する、Ｏｌｉｇｏ２と指定されたプライマーを使用して、Ｅ．ｃｏｌｉの染色体ＤＮＡから増幅する。ここで、小文字の配列は、上記第１のＰＣＲ産物に相同な非コード配列であり、大文字の配列は、Ｅ．ｃｏｌｉ染色体のｓｏｄＡプロモーター領域の５’側に相同である。このＰＣＲ反応の第２のオリゴは、配列

を有し、Ｏｌｉｇｏ４と指定されている。小文字の配列は、ｐｔｓＨ遺伝子に相同であり、大文字の配列はｓｏｄＡプロモーターの３’に相同である。このオリゴは、効率的に、ｓｏｄＡの開始コドンをｐｔｓＨの開始コドンで置換する。５０μｌのＰＣＲ反応を、１００ｎｇのＥ．ｃｏｌｉＭＧ１６５５ＤＮＡ、５０ｐｍｏｌの各プライマー、０．２ｍＭのｄＮＴＰおよび２．５ＵのＴｕｒｂｏＰｆｕを含むチューブで実施する。この反応は、９５℃で２分を１サイクル、９５℃で１分の変性；５５℃で１５秒のアニーリング；および７２℃で１分の伸長を３０サイクル、次いで７２℃で５分の伸長の最終サイクル、で行った。

各反応のＰＣＲ産物をアガロースゲルから回収し、第２ラウンドのＰＣＲに先立ってＱｉａｇｅｎ精製カラム上で精製した。この反応において、２つの第１ラウンドのＰＣＲ産物を変性させ、伸長に先立って再アニーリングさせた。５０μｌのＰＣＲ反応を、５ｎｇの精製された第１ラウンドの各ＰＣＲ産物、０．２ｍＭのｄＮＴＰおよび２．５Ｕのｐｆｕポリメラーゼを含むチューブにおいて実施した。この反応は、９５℃で２分を１サイクル、９５℃で１分の変性；５５℃で１５秒のアニーリング；および７２℃で１分の伸長を１０サイクル、で行った。最初の５サイクルの後、５０ｐｍｏｌのＯｌｉｇｏ１およびＯｌｉｇｏ４をその反応に加え、さらに２５サイクルその反応を続け、その後７２℃で５分の伸長の最終サイクルを行った。第２ラウンドのＰＣＲ産物を、Ｑｉａｇｅｎカラムを使用して精製し、組み込みを可能にするために、ＭＧ１６５５またはＭＤＳ４２（ｐＫＤ４６を含む）に形質転換する。安定な組み込み体をクロラムフェニコール耐性コロニーとして単離する。ｐＫＤ４６プラスミドは、以前に記載されたように除く。

（実施例６糖代謝の酸素調節型増殖）
酸素調節型プロモーターによるＰＴＳ炭水化物輸送系の転写調節は、嫌気条件下での糖消費においてＰＴＳ系が果たす役割を低減させる。グルコースまたは他の炭水化物はなお非ＰＴＳ系を介して取り込まれ得るが、吸収の速度は著しく低減される。なぜなら、ＰＴＳ系が、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて最高速度の糖取り込み戦略を担っているからである。Ｅ．ｃｏｌｉでの全てのＰＴＳ系における共通の役割を担っているｐｔｓＨ遺伝子およびｐｔｓＩ遺伝子の発現を酸素調節型プロモーターの制御下に持っていくことのさらなる利点は、全てのＰＴＳ糖の消費を制御するための単一点での調節を可能にすることである。先の実施例において記載されたスクロースモデルと直接的に関連させることによって、他の糖におけるＥ．ｃｏｌｉ株の増殖は、末端の電子アクセプターとしての酸素の利用可能性により密接にマッチするように制限され、それによって、広範な範囲のＰＴＳ糖について、操作された細胞によるいオーバーフロー代謝物の産生を最小化し得る。

図１は、Ｅ．ｃｏｌｉＯ１５７：Ｈ７のスクロース代謝モジュールを示す。図２は、野生型Ｋ１２ｓｏｄＡプロモーターを示す。図３は、ｓｏｄＡプロモーターによって制御される、再配列されたＯ１５７：Ｈ７スクロース代謝モジュールを示す。図４は、ＰＣＲ増幅産物、ａ）ｃｓｃＡ、ｂ）ｃｓｃＫＢ、ならびにｃ）ｃｓｃＡおよびｃｓｃＫＢ組換え産物を示す。図５は、（ａ）コロニーを形成せずに、単一の炭素源として１％スクロースを含むＭ１９培地上で増殖したＭＧ１６５５細胞、および（ｂ）組換え体がＭ９培地＋１％スクロース上で増殖することができる、ｃｓｃＡＫＢオペロンを含むＭＧ１６５５ｓｏｄＡｐＫＤ４６を示す。図６は、ｓｏｄＡプロモーターによってｃｓｃＡのみが酸素による制御され、別のオペロン（Ｐｌａｃ_ｐ）がｃｓｃＫＢを制御する、本発明の代替の実施形態を示す。図７は、ＰＣＲ増幅産物、ａ）ｃｓｃＫＢ、およびｂ）Ｐｌａｃ_ｏｐ−ｃｓｃＫＢ−ターミネーターフラグメントを示す。図８は、ｓｏｄＡプロモーターによってｃｓｃＡのみが酸素による制御され、別のオペロン（ｃｓｃＫ_ｐ）がｃｓｃＫＢを制御する、本発明の代替の実施形態を示す。図９は、ＰＣＲ増幅産物、ａ）ｃｓｃＰｒｏＫ−Ｂ、およびｂ）ＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩフラグメントとして切断されたｃｓｃＰｒｏＫ−Ｂフラグメントを示す。図１０は、１％スクロースを含む最小ＭＯＰＳ培地上でのＭＧ１６５５ｓｏｄＡ：：ｃｓｃの増殖曲線を示す。この曲線の四角で囲んだ領域は、嫌気条件下で培養物が増殖した時間を示す。図１１は、単一の炭素源およびエネルギー源として０．４％スクロースを含む最小ＭＯＰＳ倍地（灰色の菱形）、ならびに０．２％グルコースおよび０．４％スクロースを含むＭＯＰＳ培地（黒四角）上でのＭＧ１６５５ｓｏｄＡ：：ｃｓｃの増殖曲線を示す。この曲線の四角で囲んだ領域は、嫌気条件下で培養物が増殖した時間を示す。図１２は、単一の炭素源およびエネルギー源として０．４％スクロースを含む最小ＭＯＰＳ倍地（灰色の菱形）、ならびに０．２％グルコースおよび０．４％スクロースを含むＭＯＰＳ培地（黒四角）上でのＭＧ１６５５ｓｏｄＡ：：ｃｓｃについての生存細胞計数（パネルＡ）および培地ｐＨ（パネルＢ）を示す。このプロットの四角で囲んだ領域は、嫌気条件下で培養物が増殖した時間を示す。図１３は、ネイティブＰＴＳプロモーターのｓｏｄＡプロモーターでの置換を示す。図１４は、ｓｏｄＡプロモーターによって調節されるＰＴＳおよびＰＣＲ増幅のために使用され得るオリゴヌクレオチドの組換え構築を示す。

Claims

酸素レベルによって調節される、炭素源からの代謝フラックスを有する、微生物。
前記微生物が原核生物である、請求項１に記載の微生物。
前記原核生物が、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ、およびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔｅｓからなる群より選択される、請求項２に記載の微生物。
前記微生物が真核生物である、請求項１に記載の微生物。
前記真核生物が酵母である、請求項４に記載の微生物。
前記酵母が、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよびＳ．ｐｏｍｂｅからなる群より選択される、請求項５に記載の微生物。
前記炭素源が、グルコース、フルクトース、ガラクトース、マンノース、スクロース、マルトース、Ｎ−アセチルグルコサミン、β−グルコシド、マンニトール、セルビオース、ソルボース、グルシトールおよびガラクチトールからなる群より選択される、請求項１に記載の微生物。
前記微生物は、ホスホエノールピルビン酸依存ホスホトランスフェラーゼ系のタンパク質をコードする遺伝子に作動可能に連結された酸素調節型プロモーターを含む、請求項１に記載の微生物。
前記微生物は、Ｅ．ｃｏｌｉＯ１５７．Ｈ７スクロース代謝モジュールをコードする遺伝子に作動可能に連結された酸素調節型プロモーターを含む、請求項１に記載の微生物。
前記遺伝子は、ホスホエノールピルビン酸依存ホスホトランスフェラーゼ系のタンパク質とユビキチンとを含む融合タンパク質をコードする、請求項８に記載の微生物。
前記遺伝子は、Ｅ．ｃｏｌｉＯ１５７．Ｈ７スクロース代謝モジュールのタンパク質とユビキチンとを含む融合タンパク質をコードする、請求項９に記載の微生物。
微生物における代謝フラックスを調節する方法であって、請求項１に記載の微生物を、所望の代謝フラックスを生じるのに適した栄養条件および酸素濃度の下で培養する工程を包含する、方法。
微生物におけるオーバーフロー代謝産物の産生を減少させる方法であって、該方法は、請求項１に記載の微生物を、栄養条件下、および酸素の閾値レベルより下、閾値レベルより上、または閾値レベルの酸素濃度下で培養し、それによって該オーバーフロー代謝産物を産生する１以上の代謝経路を通る炭素の流れを変える工程を包含する、方法。
酸素感受性プロモーターを含む微生物であって、該プロモーターは、該微生物の１以上の代謝経路を通る、炭素源の代謝フラックスを調節することができ、そして該酸素感受性プロモーターは、天然には該酸素感受性プロモーターの転写制御下にはない異種遺伝子に作動可能に連結されている、微生物。