BRPI0615578A2 - microorganismo, e, métodos para regular o fluxo metabólico em um microorganismo e para reduzir a produção de metabólitos em excesso em microorganismo - Google Patents

Abstract

MICROORGAMSMO, E, METODOS PARA REGULAR O FLUXO METABóLICO EM UM MICROORGANISMO E PARA REDUZIR A PRODUçãO DE METABóLITOS EM EXCESSO EM MICROORGANISMO A presente invenção refere-se a novas cepas de microorganismos com metabolismo regulado por oxigénio. Os microorganismos tem maiores taxas de crescimento e são mais eficientes do que as cepas parentais. Os microorganismos podem ser usados para produzir vários produtos de interesse, como proteínas recombinantes, ácidos nucléicos, como DNA, aminoácidos e produtos químicos.

Description

"MICROORGANISMO, Ε, MÉTODOS PARA REGULAR O FLUXOMETABÓLICO EM UM MICROORGANISMO E PARA REDUZIR APRODUÇÃO DE METABÓLITOS EM EXCESSO EMMICROORGANISMO"

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

Este pedido reivindica o benefício de pedido provisório USNo. 60/715,702, depositado em 8 de setembro de 2005, e pedido internacionalPCT/2006/032525 depositado em 18 de agosto de 2006, cujos conteúdos sãoincorporados aqui por referência.

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a novas cepas demicroorganismos e processos de fermentação envolvendo estesmicroorganismos. Mais especificamente, a presente invenção refere-se acepas geneticamente modificadas de microorganismos e seu uso para aprodução de produtos comerciais como proteínas recombinantes, ácidosnucleicos, aminoácidos e produtos químicos especiais. A presente invençãotambém refere-se a métodos de preparação de cepas de microorganismos paratais usos.

ANTECEDENTES

Os microorganismos como bactérias são usadosextensivamente em processos industriais para a fabricação de biofármacos,componentes de vacina, DNAs plasmídeo, DNAs vacina, e muitos produtosquímicos especiais, incluindo aminoácidos. As bactérias usadas em processosindustriais são tipicamente cultivadas em meio líquido suplementado comglicose como a fonte de carbono. As quantidades grandes de glicose sãorequeridas em processos industriais para cultivar bactérias nas densidadeselevadas desejadas para maximizar a produtividade volumétrica, paraproduzir produtos químicos especiais, e para a manutenção das bactérias. Asbactérias absorvem e assimilam metabólitos em uma taxa alta. O fluxo demetabólitos pode ser tão alto que ele supera uma ou mais das reaçõesquímicas nas vias de carbono central das bactérias como a concentração dealguns metabólitos se eleva. As bactérias dispõe de concentrações elevadas demetabólitos por utilização de uma ou mais vias "superabundantes".

E. coli tendem a secretar acetato quando oxigênio se tornaescasso durante as fermentações de densidade de células elevada. A causaprincipal é a necessidade para a célula dispor de elétrons para um receptordiferente de O2. A causa próxima é o acúmulo intracelular de acetil-CoA, umproduto de glicólise, que na presença de O2 é normalmente queimado pelociclo TCA. No entanto, quando O2 é baixo, o ciclo TCA não pode metabolizaracetil-CoA de modo eficiente, de modo que ele se acumula na célula. Oacetil-CoA em excesso é convertido em acetato que é excretado junto comoutros ácidos nucleicos para remover os elétrons da célula. Isto provê umasolução metabólica viável mais lenta para E. coli no mundo selvagem, masem fermentadores industriais à medida que a densidade da célula é dirigidapara níveis superiores, o acetato em excesso pode se acumular em níveistóxicos.

Este problema foi tradicionalmente dirigido pela fermentaçãoem batelada alimentada, em que a fonte de carbono é medida na cultura demodo que o crescimento de células é limitado por deprivação de carbono aníveis comensurados com o O2 disponível. Apesar da medição da fonte decarbono, a utilização de oxigênio eventualmente se torna limitativa emdensidades de células elevadas. Nesta situação, o meio do fermentadortambém se torna heterogêneo devido à falta de uma misturação perfeita, e onível de O2 varia de lugar a lugar nas bolsas. Apesar do acetato excretado emuma região de O2 baixa pode ser tomado de volta pelas células que sãotransportadas para regiões com mais O2, isto pode ser metabolicamenteineficiente e, eventualmente, à medida que mais células se acumulam, o nívelde acetato inexoravelmente sobre mesmo com a tecnologia de bateladaalimentada. À medida que os níveis de ácido orgânico se elevam além dacapacidade tampão do meio, pH é mantido por titulação com bases mineraiscomo NaOH, que não somente requerem equipamento adicional e atenção dopessoal da planta, mas também pode aumentar a complexidade da purificaçãode produto a jusante assim como a carga de sal na corrente de refugo dofermentador. Um regime de fermentação que aumenta a formação de produtoespecífico por minimização do metabolismo de fluxo pode representar umamelhora significante na técnica.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Em várias formas de realização, a presente invenção provê ummicroorganismo com fluxo metabólico de uma fonte de carbono reguladapelos níveis de oxigênio. O microorganismo podè ser um procarioto, como E.coli, Shigella, Salmonella, Corynebacter, Lactococcus ou Streptomyeetes. Omicroorganismo também pode ser um eucarioto, como uma levedura. Alevedura pode ser da espécie Saccharomyees eerevisiae,Schizosaceharomyees pombe ou Piehia. A fonte de carbono pode ser glicose,frutose, galactose, manose, sacarose, maltose, N-acetilglucosamina, β-glucosídeos, manitol, celobiose, sorbose, glucitol ou galactitol.

O microorganismo pode compreender um promotor reguladopor oxigênio ligado operativãmente a um gene codificando uma proteína desistema fosfotransferase dependente de fosfoenol piruvato. O microorganismopode compreender um promotor regulado por oxigênio ligado operativamentea um gene codificando uma proteína de módulo de metabolismo de 0157.H7sacarose de E. coli. O gene ligado operativamente ao promotor regulado poroxigênio pode codificar uma proteína de fusão. A proteína de fusão podecompreender ubiquitina.

Estas e outras formas de realização da presente invenção sãodiscutidas em maiores detalhes abaixo.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOSFigura 1 mostra o módulo de metabolismo de 0157.H7sacarose de E. coli.

Figura 2 mostra o promotor Kl2 sodA de tipo selvagem.

Figura 3 mostra o módulo de metabolismo de 0157.H7sacarose rearranjado.

Figura 4 mostra produtos de amplificação de PCR a) csc A, b)CscKB, e c) cscA e produto recombinante cscKB.

Figura 5 mostra (a) células MG1655 cultivadas em meio M9contendo 1% sacarose como a única fonte de carbono sem formação decolônia, e (b) MGl 655 sodA pKD46 contendo o operon cscAKB em que osrecombinantes são deixados crescer em meio M9 mais 1% sacarose.

Figura 6 mostra uma forma de realização alternativa dainvenção em que somente cscA é controlado por oxigênio pelo promotor sodAe um operon (Placp) separado controla cscKB.

Figura 7 mostra produto de amplificação de PCR a) cscKB, eb) fragmento terminador Placop.cscKB.\

Figura 8 mostra uma forma de realização alternativa dainvenção em que somente cscA é controlado por oxigênio pelo promotor sodAe um operon separado (cscKp) controla cscKB.

Figura 9 mostra os produtos de amplificação de PCR5 a)cscProK-B, e b) fragmento cscProK-B cortado como um fragmento HindUl-Xbal.

Figura 10 mostra a curva de crescimento de MG1655sodA: csc em meio MOPS mínimo com 1% sacarose. A área em caixa dacurva indica o tempo que a cultura foi cultivada sob condições anaeróbicas

Figura 11 mostra a curva de crescimento de MG165 5sodA::csc em meio MOPS mínimo com 0,4% sacarose como a única fonte decarbono e energia (diamantes cinza) e meio MOPS com 0,2% glicose e 0,4%sacarose (quadrados pretos). A área em caixa da curva indica o tempo que acultura foi cultivada sob condições anaeróbicas.

Figura 12 as contagens de culturas viáveis (painel A) e pH domeio (painel B) para MGl655 sodA::csc cultivado em meio MOPS mínimocom0,4% sacarose como a única fonte de carbono e energia (diamantes cinza)e meio MOPS com 0,2% glicose e 0,4% sacarose (quadrados pretos). A áreaem caixa da curva indica o tempo que a cultura foi cultivada sob condiçõesanaeróbicas.

Figura 13 ilustra a substituição de promotores PTS nativoscom o promotor sodA.

Figura 14 ilustra a estratégia de construção recombinante dePTS regulada pelo promotor sodA e os oligonucleotídeos que podem serusados para amplificação de PCR.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Apesar da presente invenção ser capaz de ser realizada emvárias formas, a descrição abaixo de várias formas de realização é feita com acompreensão de que a presente invenção deve ser considerada como umaexemplificação da invenção, e não se destina a limitar a invenção às formasde realização específicas ilustradas. Os cabeçalhos são dados paraconveniência apenas e não devem ser construídos como limitando a invençãode algum modo. As formas de realização ilustradas sob qualquer cabeçalhopodem ser combinadas com formas de realização ilustradas sob qualqueroutro cabeçalho.

O uso de valores numéricos nas várias faixas especificadas nopedido, salvo especificado em contrário expressamente, são dados comoaproximações como se os valores mínimo e máximo dentro das faixasdescritas fossem precedidos pela palavra "cerca de". Deste modo, pequenasvariações acima e abaixo das faixas descritas podem ser usadas para obtersubstancialmente os mesmos resultados como valores dentro das faixas.

Como usado aqui, os termos "cerca de" e "aproximadamente" quando comreferência a um valor numérico devem ter seus significados para o versadocomo assunto pertinente à técnica. Também, a descrição de faixas se destinacomo uma faixa contínua incluindo cada valor entre os valores mínimo emáximo dados assim como quaisquer faixas que podem ser assim formadas.

Isto inclui faixas que podem ser formadas que de fato incluem ou não incluemum limite superior e/ou inferior finito. Conseqüentemente, o versado natécnica irá notar que muitas destas relações, faixas, e faixas de relaçõespodem ser derivadas de modo não ambíguo dos dados e númerosapresentados aqui e todos representam formas de realização da presenteinvenção.

Em uma forma de realização, a presente invenção refere-se aum microorganismo com fluxo metabólico regulado por níveis de oxigênio.Quando o microorganismo está em um meio com níveis abaixo do limiar deoxigênio, o fluxo metabólico é reduzido. Ao reduzir o fluxo metabólico emníveis baixos de oxigênio, o metabolismo superabundante para metabólitosindesejáveis produzidos em meios de oxigênio reduzidos pode ser reduzido.Quando os níveis de oxigênio são aumentados acima de um nível de limiar, ofluxo metabólico pode ser aumentado. Dentro de uma cultura, pode-se termicro-ambientes com oxigênio suficiente e outros micro-ambientes comoxigênio insuficiente para a síntese de produto eficiente. O microorganismopode ser capaz de auto-regular o fluxo metabólico sob níveis de oxigêniovariados e assim somente consumir substrato sob condições que permitem aformação de produto eficiente.

Ao regular a taxa de metabolismo como uma função de níveisde oxigênio, pode-se ter uma redução na produção de acetato e outrosmetabólitos superabundantes indesejáveis. Ao permitir aos microorganismosauto-regular o metabolismo, um produto de interesse pode ser produzido commaior eficiência e menor custo.

1. MicroorganismoO microorganismo pode ser derivado de qualquermicroorganismo parental. Os microorganismos parentais representativos sãodisponíveis do American Type Culture Collection. Outros microorganismosrepresentativos são descritos em S.Y. Lee, "High Density Culture ofEscherichia coli," Tibtech 14:98-103 (1996). O organismo parental pode serum eucarioto como uma levedura. Os exemplos representativos de leveduraincluem, mas não são limitados a espécies S. cerevisiae S. pombe e Pichia. Oorganismo parental pode também ser um procarioto, como bactérias, e podeser um organotrofo quimio-heterotrófico. Os exemplos representativos debactérias incluem, mas não são limitados a E. coli, Shigella, Salmonella,Corynebacter, Lactoeoceus e Streptomyeetes.

O microorganismo pode ser também um microorganismo degenoma reduzido, com uma bactéria de genoma reduzido. Muita dainformação genética contida no genoma de um microorganismo pode serdeletada sem afetar de modo prejudicial a produção do metabólito final. Alémdisso, um microorganismo com um genoma reduzido pode ser vantajoso naprodução de muitos produtos de interesse. Por exemplo, um genoma reduzidopode levar à produção de menos produtos nativos ou menores níveis dosmesmos, que pode levar a uma purificação menos complexa de um produto deinteresse. Além disso, um microorganismo com um genoma reduzido pode sermenos metabolicamente demandante e assim pode produzir um produto deinteresse mais eficientemente. As bactérias de genoma reduzido são discutidasem patente US 6 989 265, incorporada aqui por referência. As bactérias degenoma reduzido com produção limitada de proteínas periplásmicas naturaispodem ser benéficas para a expressão de proteínas recombinantes noperiplasma. Os exemplos de cepas de bactérias de genoma reduzidoapropriadas incluem, mas não são limitados a MDS12, MDS13. MDS39,MDS40, MDS41 MDS42, MDS43, MDS44, MDS45, MDS46, MDS47,MDS48, MDS49, MDS50, MDS51, MDS52, MDS53, MDS54, MDS55,MDS56, MDS57, MDS58, MDS59 e MDS60. O microorganismo de genomareduzido pode também ser derivado de novo de genes e operons de um oumais microorganismos.

2. Fluxo metabólico regulado em oxigênio

Os níveis de oxigênio podem regular o fluxo metabólico deuma fonte de carbono em um microorganismo. O metabolismo da fonte decarbono pode ser regulado na importação da fonte de carbono. Por exemplo, aexpressão de uma proteína envolvida na importação da fonte de carbono podeser colocada sob o controle de um promotor regulado em oxigênio.

O metabolismo de uma fonte de carbono também pode serregulado na primeira etapa metabólica intracelular usando a fonte de carbonoou qualquer etapa metabólica a seguir, ou uma combinação das mesmas. Porexemplo, a expressão de uma proteína envolvida em glicólise ou emconversão de fonte de carbono em um substrato para glicólise pode sercolocada sob o controle de um promotor regulado em oxigênio,

a. Fonte de carbono

A fonte de carbono pode ser qualquer fonte de carbono capazde suportar crescimento e/ou metabolizar o microorganismo, ou nativamenteou por introdução de genes heterólogos ou operons codificando enzimascapazes de metabolizar a fonte de carbono. A fonte de carbono pode ser ummonossacarídeo, como glicose, frutose, galactose ou manose. A fonte decarbono também pode ser um dissacarídeo, como sacarose. Outras fontes decarbono incluem, mas não são limitadas a maltose, N-acetilglucosamina, β-glucosídeos, manitol, celobiose, sorbose, glucitol e galactitol.

As bactérias podem tomar uma fonte de carbono via o sistemafosfotransferase dependente de fosfoenol piruvato (PTS). O sistema PTS podepermitir a absorção rápida e eficiente de fontes de carbono exógenas de altaqualidade e podem desempenhar um papel chave na regulação catabólica demetabolismo em muitas bactérias. A expressão de um ou mais componentesde sistema PtS pode estar sob o controle de promotor regulado em oxigênio,que pode reduzir a produção de produtos superabundantes. Uma via deabsorção de fonte de carbono alternativa, regulada pela disponibilidade deoxigênio, pode permitir uma divisão mais eficiente de substrato na formaçãode produto durante todo o curso da fermentação.

O sistema PTS um sistema de fosfo-substituição em que aproteína El (codificada por ptsH) transfere o grupo fosfato de fosfoenolpiruvato para a proteína HPr (codificado por ptsl) que por sua vez fosforilauma subunidade EIIA específica de carboidrato. (em E. coli a proteína EIIAespecífica de glicose é codificada pelo gene crr) que pode então interagir comuma proteína ou subunidade associada com membrana do complexo detransporte de carboidrato para internalizar e fosforilar o açúcar cognato. Areação global converte PEP em piruvato enquanto o transporte de um açúcarexógeno para um açúcar-fosfato interno.

Em E. coli, os genes codificando os elementos de PTScomuns, ptsH e ptsl são associados no cromossomo com o gene crr. Todos ostrês genes são transcritos de um conjunto de promotores encontrados amontante de ptsH. Além disso, um promotor adicional ou par de promotordentro de ptsl produz um transcrito que inclui somente ptsl. A expressão dealguns dos promotores a montante de ptsH aumenta sob condiçõesanaeróbicas. A expressão aumentada destes genes pode resultar em um nívelaumentado de absorção de açúcar e ativação via qualquer um dos sistemasPTS para os quais o açúcar cognato está presente. A transcrição aumentadadestes genes pode assim desempenhar um papel na produção de metabólitossuperabundantes indesejados porque como oxigênio se torna limitante comoum receptor de elétrons para o ciclo TCA, o aumento de expressão dos genesPTS aumenta simultaneamente a capacidade de absorção de açúcar. Asubstituição de promotores associados com ptsH nativos com um promotorregulado em oxigênio pode regular a absorção de açúcar por PTS em ummodo dependente de oxigênio, assim assegurando que o consumo de fonte decarbono é acoplado com a presença de oxigênio. Ao controlar a expressão deelementos comuns de um ou mais sistemas PTS na célula, a disponibilidadee/ou utilização de fontes de carbono múltiplas pode ser controlada. Comoacima discutido, a absorção e ativação de fontes de carbono pode exceder acapacidade do microorganismo de metabolizar eficientemente os mesmos,resultando em metabólitos superabundantes indesejados. Além disso, aprodução de compostos diretamente derivados de PEP, como aromáticosderivados de via de ácido shikímico, pode ser limitada por consumo de PEPpara o transporte de açúcar mediado por PTS.

1) Sacarose

A sacarose também pode ser usada como uma fonte decarbono para o microorganismo. A sacarose é um dissacarídeo de glicose efrutose. A fim de ser metabolizada, a sacarose pode ser transportada na célulae então dividida nas unidades de monossacarídeos. Tanto glicose comofrutose podem então entrar na glicólise como glucose-6- fosfato e frutose-6-fosfato.

Vários microorganismos, incluindo a maior parte das cepas deE. coli, são incapazes de crescer em sacarose. No entanto, algumas cepas temum sistema de gene que permite a absorção e metabolismo de sacarose comoa única fonte de carbono. Estes sistemas de genes, ou porções dos mesmos,podem ser adicionados a um microorganismo que permite o uso de sacarosecomo a fonte de carbono. Os genes podem ser adicionados ao cromossomo domicroorganismo, ou podem ser adicionados ao microorganismo em umplasmídeo. Um ou mais dos genes adicionados ao microorganismo podem sercolocados sob o controle de um promotor regulado em oxigênio. Também écontemplado que os sistemas de genes permitindo a absorção e metabolismode outras fontes de carbono também podem ser adicionados aomicroorganismo.As patentes US 6 365 723 e 6 855 814, incorporadas aqui porreferência, descrevem um exemplo representativo de sistema de genecompacto para a absorção e metabolismo de sacarose que permite o uso desacarose como a única fonte de carbono. O modulo de metabolismo desacarose 0157:: H7 de E. coli é mostrado na figura 1. O produto de gene cscBtransporta sacarose na célula e cscA codifica para sacarose hidrolase(invertase) que divide a sacarose de dissacarídeo em frutose e glicose. O genecscK, codifica para frutoquinase a primeira enzima de metabolismo glicolíticode frutose. O gene cscK mostra uma elevada similaridade para outrasfrutoquinases e pode ser redundante para o gene fruK de E. coli K-12, noentanto, as células K-12 de E. coli podem faltar as atividades de sacaroseinvertase e hidrolase. O produto de gene cscR é um repressor que controla aexpressão dos genes do operon 0157:H7 em relação à disponibilidade desacarose por ligação aos promotores, típicos da família lacI-galR de proteínasrepressoras.

B. Promotor regulado em oxigênio

O fluxo metabólico da fonte de carbono pode ser reguladausando promotores sensíveis a oxigênio ligados operativamente a um genecodificando uma ou mais das proteínas envolvidas em metabolismo da fontede carbono. Os exemplos representativos de promotores que são ativados napresença de oxigênio são promotores dentro do operon cyo e superóxidodismutase (sodA) que codifica uma enzima que protege a célula contra danooxidativo. A região cromossômica sodA tipo Kl2 selvagem é mostrada nafigura 2.

Ao usar um promotor sensor de oxigênio positivo, níveis deoxigênio suficientemente levados podem induzir a expressão de proteínas quepermitem o metabolismo da fonte de carbono enquanto minimizando aprodução de metabólitos superabundantes ou outros sub-produtos. O tempo deresposta do promotor pode ser aumentado por colocação de proteínasmetabólicas citoplásmicas sob o controle do promotor sensível a oxigênioenquanto proteínas não citoplásmicas (por exemplo proteínas detransmembrana) podem ser expressadas constitutivamente ou colocadas sob ocontrole de promotor diferente. A velocidade em que metabolismo é reduzidosob condições de oxigênio diminuindo pode ser aumentada por aumento dataxa de circulação das proteínas metabólicas. Por exemplo, uma proteínaenvolvida no metabolismo da fonte de carbono pode ser expressada comoproteína de fusão com ubiquitina. A invenção também engloba construções deácido nucleico compreendendo um promotor regulado em oxigênio ligadooperativamente a um gene heterólogo não normalmente sob o controle de umpromotor sensível a oxigênio.

c. Taxas de crescimento

O microorganismo pode ter uma taxa de crescimentoaumentada quando cultivado na presença de uma abundância de uma fonte decarbono. Quando cultivado em meio líquido compreendendo de 0% àconcentração % tolerada máxima de uma fonte de carbono, o microorganismopode ter uma taxa de crescimento incluindo, mas não limitada a mais do quecerca de 25% a cerca de 400%, como comparado com o parental domicroorganismo. O microorganismo pode ser cultivado em meiocompreendendo uma fonte de carbono como um peso/volume de pelo menoscerca de 0,1%, 0, 2%, 0, 3%, 0, 4%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9%, 1%, 1,5,2%, 2,5, 3%, 3,5%, 4%, 4,5%, 5%, 5,5%, 6%, 6,5%, 7%, 7,5%, 8%, 8,5%,9%, 9,5% ou 10%. Em tais condições, o microorganismo pode ter uma taxade crescimento maior do que cerca de 30%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%,70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 105%, 110%, 115%, 120%, 125%,130%, 135%, 140%, 145%, 150%, 155%, 160%, 165%, 170%, 175%, 180%,185%, 190%, 195%, 200%, 205%, 210%, 215%, 220%, 225%, 230%, 235%,240%, 245%, 250%, 255%, 260%, 265%, 270%, 275%, 280%, 285%, 290%,295%, 300%, 305%, 310%, 315%, 320%, 325%, 330%, 335%, 340%, 345%,350%, 355%, 360%, 365%, 370%, 375%, 380%, 385%, 390%, 395%, ou400% como comparado com um microorganismo parental.

d. Fluxo metabólico

O microorganismo pode ter melhorado fluxo metabólicoquando cultivado na presença de uma abundância de uma fonte de carbono.Quando cultivado em meio líquido compreendendo de 0% até a concentração% máxima tolerada de uma fonte de carbono, o microorganismo pode ter umfluxo metabólico incluindo, mas não limitado de cerca de 5% a cerca de 90%da fonte de carbono sendo dirigida para os produtos desejado. Uma cepa podeter um fluxo metabólico de cerca de 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%,50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% ou 90%.

Em geral, o fluxo de metabólitos através de cada etapa dereação em qualquer via dada depende das taxas relativas da reação dianteira ereações reversas. O fluxo pode se referir à taxa de mudança em concentraçãode um analito como uma função de tempo e tamanho da amostra. O fluxometabólico através de qualquer conversão metabólica única pode serdeterminado usando metodologias descritas na patente U.S. Nos. 6,764,817 e6,849,396, cujos conteúdos são incorporados aqui por referência Outrasdiretrizes sobre fluxo e métodos para sua determinação são dados, porexemplo, por Newsholme, E. A. et al., Biochem. Soe. Symp. 43:183-205(1978); Newsholme, Ε. A., et al., Biochem. Soe. Symp. 41:61-110 (1976); eNewsholme, Ε. A., e Sart, C, Regulation in Metabolism, Chaps. 1 e 3, Wiley-Interscience Press (1973), cujos conteúdos são incorporados aqui porreferência.

e. Produção

Os microorganismos da presente invenção podem ser capazesde produzir metabólitos finais ou outros produtos de interesse em taxasmaiores. Quando cultivados em meio líquido compreendendo de 0% à % deconcentração tolerada máxima de uma fonte de carbono, o microorganismopode produzir metabólitos finais ou outros produtos de interesse de cerca de0,001 g/L a cerca de 100 g/L da fonte de carbono sendo dirigidos para osprodutos desejados. Uma cepa pode ter um fluxo metabólico de 35%, 40%,45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, ou 80%.

f. Taxa de produção

Em vista da capacidade de controlar o fluxo metabólico, omicroorganismo pode produzir várias quantidades do metabólito final, emuma variedade de taxas, e em taxas variáveis de eficiente de utilização defonte de carbono. As cepas da presente invenção podem produzir o metabólitofinal a pelo menos os níveis incluindo, mas não limitados a cerca de 10 g/L,20 g/L, 30 g/L, 40 g/L, 50 g/L, 60 g/L, 70 g/L, 80 g/L, 90 g/L, e 100 g/L.

O microorganismo pode produzir o metabólito final a uma taxaincluindo, mas não limitada a pelo menos cerca de 0,50 g/L/h, 0,75 g/L/h,1,00 g/L/h, 1,25 g/L/h, 1,50 g/L/h, 1,75 g/L/h, 2,00 g/L/h, 2,25 g/L/h, 2,50g/L/h, 2,75 g/L/h, 3,00 g/L/h, 3,25 g/L/h, 3,50 g/L/h, 3,75 g/L/h, 4,00 g/L/h,4,25 g/L/h, 4,50 g/L/h, 4,75 g/L/h, e 5,00 g/L/h.

O microorganismo pode produzir o metabólito final a uma taxade eficiência de utilização de fonte de carbono incluindo, mas não limitada apelo menos cerca de 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%,55%, 60%, 65%, 70%, e 75%.

3. Produto de interesse

O microorganismo pode ser usado para produzir um produtode interesse em níveis elevados de eficiência em meios com uma abundânciade fonte de carbono. O produto de interesse produzido pelo microorganismopode ser um ou mais de quaisquer produtos incluindo, mas não limitados aprodutos químicos, aminoácidos, vitaminas, co-fatores, ácidos nucleico, comoDNA, ácidos graxos, fatores de crescimento, proteínas e intermediários dosmesmos. O produto de interesse pode ser um produto que é naturalmenteproduzido pelo microorganismo. O produto de interesse pode também ser umproduto não natural que é produzido como um resultado de genes heterólogossendo adicionados ao microorganismo.

O produto de interesse pode estar localizado intracelularmenteno microorganismo. O produto de interesse também pode ser secretado noperiplasma do microorganismo. O periplasma pode ser benéfico para aprodução de proteína porque: (i) a proteína humana recombinante pode serproduzida com o amino-término correto, enquanto os produzidosnocitoplasma podem começar com uma metionina adicional não presente naproteína natural, (ii) muitas proteínas podem duplicar corretamente no espaçoperiplásmico, (iii) as ligações dissulfeto corretas podem ser formadas noperiplasma, (iv o espaço periplásmico pode conter bem menos e em umaquantidade bem maior de proteínas do que o citoplasma, simplificando apurificação (v) onde podem estar menos proteases do que no citoplasma, quepode reduzir a digestão de proteína e perda, e (vi) proteínas expressadaspodem ser prontamente liberadas com outras proteínas periplásmicas porespecificamente rompendo a membrana externa substancialmente isenta dasproteínas citoplásmicas mais abundantes. O produto de interesse tambémpode ser excretado pela célula nos meios.

4. Fermentação

O microorganismo pode ser usado para produzir produtosdesejados em fermentações em batelada, onde a quantidade requeridacompleta da fonte de carbono pode ser adicionada no começo da fermentação.Apesar da capacidade das células modificadas de se adequar ao consumo defonte de carbono à disponibilidade de oxigênio, as cepas também podem serusadas para produzir produtos desejados nas fermentações de bateladaalimentada. A taxa de alimentação da fonte de carbono pode ser qualquerquantidade até a qual que produz a concentração tolerada máxima mas épreferivelmente a quantidade mínima requerida para manter a taxa decrescimento maximal. As cepas também podem ser usadas para produzirprodutos desejados em modos contínuo ou "chemostat" de fermentação, quepodem permitir a manutenção de uma maior taxa de diluição.

O microorganismo pode ser usado para processos defermentação em um meio sintético ou natural contendo pelo menos uma fontede carbono e pelo menos uma fonte de nitrogênio que pode ser usada pelacepa em virtude de seu processamento da via(s) metabólica (s) necessária(s) ecomo apropriado, sais inorgânicos, fatores de crescimento e outros.

Os exemplos ilustrativos de fontes de nitrogênio apropriadasincluem, mas não são limitadas a: amônia incluindo gás amônia e amôniaaquosa, sais de amônio de ácidos inorgânicos ou orgânicos, como cloreto deamônio, fosfato de amônio, sulfato de amônio, e acetato de amônio, e outrassubstâncias contendo nitrogênio incluindo aminoácidos, extrato de carne,peptona, melaços, licor de milho, hidrolisado de caseína, hidrolisado de bolode soja e extrato de levedura.

Alguns aminoácidos presentes individualmente em meios desais mínimos não podem ser usados bem por bactérias como fonte de carbono.Cada espécie de bactéria difere em sua capacidade de usar cada aminoácidonatural. Os aminoácidos que não são usados individualmente podem serusados bem na presença de outros aminoácidos, por exemplo serina pode serusada como uma fonte de carbono somente se glicina, leucina, isoleucina evalina estiverem presentes. Em meios ricos, como misturas de aminoácidossintéticos, vários aminoácidos podem ser usados preferivelmente econsumidos antes de outros aminoácidos. Serina, prolina, glicina, aspartato,treonina, glutamato e alanina podem ser completamente removidos de umamistura dos 16 aminoácidos presentes em casamino ácidos, um constituinte demeio popular, enquanto os outros são usados mais lentamente eincompletamente. Os resultados similares são obtidos em caldo de triptona. Sefor desejável re-usar os aminoácidos acumulados como metabólitos finais,então o aminoácido pode ser preferivelmente serina, prolina, glicina,aspartato, treonina, glutamato ou alanina, e o meio pode conter osaminoácidos adicionais necessários para estimular seu uso como uma fonte decarbono. O meio também pode conter um hidrolisado de proteína incluindo,mas não limitado a triptonas, casamino ácidos e hidrolisados de soja.

A presente invenção tem múltiplos aspectos, ilustrados pelosseguintes exemplos não limitativos.

EXEMPLO 1

Absorção e metabolismo de sacarose regulada em oxigênio

Uma cepa de catabolisando sacarose (Suc+) de E. coli K-12 foiproduzida por substituição do gene sodA nativo com o módulo demetabolismo de sacarose de E. coli Ol57: H7 como mostrado na figura 3. Osgenes foram rearranjados de sua configuração original dentro do módulo porinversão do gene cscB e colocando o mesmo em linha com cscK. O gene cscRfoi omitido porque a região de promotor - operador foi substituída pelopromotor e elementos regulatórios do gene sodA. Deve-se notar que a cepatambém deve ter sido produzida sem cscK, porque a atividade do produto degene é redundante à do gene fruk de E. coli K-12. A cepa também pode tersido produzida por introdução do módulo de metabolismo de sacarose em umplasmídeo ou no genoma sob o controle de um promotor separado, comosodA.

Os iniciadores 1 (Pl) e 2 (P2) foram projetados para amplificartanto escK como escB como uma peça de 2,2 Kb única (figura 4b). Aseqüência para Pl foi: 5 '-CCC ACGGAGTGGCTGTGCTGC AAC ATGGAGCACTCTGGCTACTGGGTTAAGTCAGATGAATTT AAGGGAA-S'(SEQ ID NO: 1), que tem uma sobreposição de 50 bp com a extremidade 31do gene cscA e de 20-bp da extremidade 5 ' do gene cscK incluindo a regiãodo sítio de ligação de ribossoma (RBS) do gene cscK. A seqüência para P2 é:5'-CAAAACCACATCAATTGAAACGCTGTTTTATTTTTATCGGATCATTGTTTCTATATTGCTGAAGGTACAG-S' (SEQ ID NO: 2), que tem 50-bpda seqüência de extremidade 3' após a região de terminador sodA e 20-bp daextremidade 3' do gene cscB. Os iniciadores 3 e 4 foram projetados paraamplificar cscA (1,4 kb) (Figura 4a) de DNA genômico 0157:H7. Aseqüência para P4 é: 5 '-CTGCTT ACGCGGC ATTAAC AATCGGCCGCCCGACAATACTGGAGATGAAT ATGACGC AATCTCGATTGCA-S'(SEQ ID NO: 4), que tem 50-bp da seqüência de promotor sodA incluindo oRBS. A seqüência para P3 é 5-TTAACCCAGTAGCCAGAGTG-S' (SEQ IDNO: 3), que corresponde à seqüência de extremidade 3' do gene cscA.

No primeiro ciclo de PCR para amplificar cscA ou cscKB, umareação PCR de 50 μΐ foi realizada em um tubo contendo 100 ng 0157:H7DNA genômico, 50 pmol de cada iniciador, 0,2 mM de dNTP e 2,5 U de Pfupolimerase. Para a amplificação de cscA, a reação passou por um 1 ciclo de 1min a 95°C, 25 ciclos de 1 min de desnaturação a 95°C; 15 segundos deanelamento a 55°C; e 4 min de extensão a 72°C, então um ciclo final de 10min de extensão a 72 0C . Para a amplificação cscKB, a reação passou pelosmesmos ciclos como acima exceto que a temperatura de anelamento foi de48°C.

No segundo ciclo de reações PRC recombinante, umaquantidade molar igual de produtos cscA e cscKB foram misturados comogabaritos em uma reação de 50 μΐ contendo 50 pmol de cada iniciador, 0,2mM dNTPs e 2,5 U de Pfu polimerase. A reação passou através de 1 ciclo de5 min a 95°C, 5 ciclos de 30 segundos de desnaturação a 95°C; 30 segundosde anelamento a 65 0C, e 7,5 min de extensão a 72 0C, então 25 ciclos de 1min de desnaturação a 95°C; 7,5 min de extensão a 72 0C e um final ciclo de10 min de extensão a 72 0C . O produto resultante tinha o tamanho esperadode 3,7 kb (Figura 4c).

Os produtos PCR recombinantes continham 50-bp deseqüência de sodA 5', cscA, cscK, cscB, e 50 bp da seqüência de extremidade3' após o terminador de sodA. Assim, o operon cscAKB de 0157:H7 foicolocado sob o controle do promotor sodA de MG1655, para produzirMG1655 sodA.csc. Os produtos PCR foram purificados e usados para aeletroporação do mutante sodA::Tn5 de MGl 655, contendo o plasmídeopKD46.As células MGl 655 não podem crescer em meio M9 contendo 1%sacarose como a única fonte de carbono, como mostrado na figura 5a. Ascélulas transformadas contendo o operon cscAKB, no entanto foram capazesde crescer no mesmo meio após 2 dias a 30 0C na presença de ampicilina (100μm concentração final), como mostrado na figura 5B.

EXEMPLO 2

Metabolismo de sacarose regulada por oxigênioInvertase pode ser a enzima de "gargalo genético" através daqual o metabolismo de sacarose deve fluir. Como uma enzima citoplásmica,invertase pode mudar mais rapidamente do que uma proteína de membrana.Isto é importante na obtenção de uma rápida parada de função. De fato, a taxade sua degradação pode s acelerada se necessário por etiquetas de ubiquitina eoutras tais modificações. Em contraste, os níveis de cscB devem ser,improvavelmente, rapidamente regulados porque o symporter é uma proteínade membrana. Como resultado, os requerentes produziram a cepa Suc+mostrada na figura 6. A construção provê um operon separado para controlarindependentemente o cscB de symporter de sacarose usando um promotor lac.

Como acima, o gene de frutoquinase (cscK) pode ser supérfluo.Os iniciadores 4 e 5 foram projetados para amplificar cscA (1,4kg) de DNA genômico 0157: H7. P4 foi o mesmo iniciador do exemplo l.Aseqüência para P5 é: 5'-CAAAACCACATCAATTGAAACGCTGTTTTATTTTTATCGGATCATTGTTTTTAA CCCAGTAGCCAGAGTG-3' (SEQ IDNO: 5). Assim o gene cscA gene é flanqueado por 50-bp de seqüências 5' e 3'de sodA (sodAp-cscA-sodA). Iniciadores K5 e B3 foram projetados paraamplificar ambos cscK e cscB em uma peça (2,2 Kb) (Figura 7a). A seqüênciapara k5 é: Si-Gtaagtcagatgaatttaagggaa-S' (seq id no: 6),que inclui a região RBS do gene cscK. A seqüência para B3 é: 5'-CTATATTGCTGAAGGTACAGGCG T-3' (SEQ ID NO: 7), que tem 20-bpde extremidade 3' do gene cscB

PCR foi realizado para amplificar esc A ou cscKB. Uma reaçãoPCR de 50-ml foi realizada em um tubo contendo 100 ng 0157 DNAgenômico, 50 pmol de cada iniciador, 0,2 mM dNTPs e 2,5 U de Pfupolimerase. A reação passou através de 1 ciclo de 1 min a 95°C, 25 ciclos de1 min de desnaturação a 950C; 15 segundos de anelamento a 55°C; e 4 min deextensão a 72° C, então um final ciclo de 10 min de extensão a 72 0C.

Quatro microlitros do produto cscKB foram clonados em umvetor pCR-Blunt (Invitrogen) como o sítio EcoRI, para criar pFDl. Assim, oproduto cscKB é colocado sob o controle de um promotor Plac indutível. Ofragmento Plac- cscKb - terminador de 2,7 kb foi excisado do plasmídeo pordigestão PvwII e purificado com gel (figura 7b). Este fragmento foi sub-clonado no sítio Smal de pJW23, que contém um sítio atividade. O novoplasmídeo, chamado pFD6, foi então digerido com NotI, e o fragmento maiorrecuperado após purificação do gel. Este fragmento, contendo Plac- cscKb -terminador foi re-ligado para gerar pFD7. Os plasmídeos pFD7 e pJW289foram co-transformados em mutante sodA ::Tn5 de MG1655 ou MDS42 (sempKD46) para permitir a integração. O plasmídeo pJW289 foi curado depoiscomo descrito previamente. O plasmídeo pKD46 foi introduzido de novo parao hospedeiro curado para recombinação.

O produto PCR de sodAp-cscA-sodAt foi então usado paratransformar o novo hospedeiro para permitir a recombinação. As célulastransformadas foram colocadas em placas de meio M9 contendo 1% sacarosecomo a única fonte de carbono. Os transformantes capazes de crescer no meiotem um fenótipo Suc+.

EXEMPLO 3

Controle de metabolismo de sacarose por um promotor sensível aoxigênio e absorção de sacarose por repressor de sacarose para bactériaspositivas para sacarose

O terceiro exemplo conserva o CscR repressor de sacarosepara controlar o nível de sacarose na célula em um modo normal para as cepaspositivas para sacarose como 0157:H7. Este esquema é equivalente aotransplante do gene cscA da posição normal no operon de sacarose de0157:H7 no operon sodA. Este método de controle pode ser o mais efetivo naregulação de acetato porque a poça de sacarose será fixada e a única funçãode controle é o nível de invertase, a enzima de "gargalo genético". O genecscR é eliminado de seu esquema, o que resulta em transporte constitutivo deatividades de sacarose e frutoquinase. Como acima, o gene sodA pode ser ousubstituído por cscA ou combinado em série com cscA como mostrado nafigura 8.

Os Iniciadores 4 e 5 foram projetados para amplificar cscA(1,4 kb) de 0157 DNA genômico. P4 e P5 foram descrito no exemplo 1.Assim, o gene cscA é flanqueado por 50-bp de seqüências 5' e 3' de sodA.Iniciadores ProK5 e B3 foram projetados para amplificar ambos cscK e cscBem uma peça (2,2 Kb). A seqüência para ProK5 é: 5-AAGAGGTTTATCACTAACATTTTG TG-3' (SEQ ID NO: 8), que inclui aregião de promotor completa do gene cscK. A seqüência para B3 f oi a mesmacomo descrito acima.

PCR foi realizado para amplificar cscProK-B (2,3 kb) (Figura9a). A reação de PCR de 50-μ1 foi realizada em um tubo contendo 100 ng deDNA genômico 0157, 50 pmol de cada iniciador, 0,2 raM dNTPs e 2,5 U dePfu polimerase. A reação passou através de 1 ciclo de 1 min a 95 0C, 25 ciclosde 1 min de desnaturação a 95°C; 15 segundos de anelamento a 55°C; e 4 minde extensão a 72° C, então um final ciclo de 30 min de extensão a 72°C.

Quatro microlitros do produto cscProk-B foram clonados emum vetor pCR-Blunt (Invitrogen) para criar pFD8. O fragmento cscProK-Bfoi cortado como um fragmento Hindlll- Xbal (2,7 kb) figura 9b) e sub-clonado em pJW23, que contém um sítio atividade. O novo plasmídeo pFD14foi então cortado com Notl, e o fragmento maior recuperado após purificaçãodo gel. Este fragmento, contendo o cscProK-B foi re-ligado para produzirPFDl5. Os plasmídeos pFD15 e pJW289 foram co-transformados em ummutante sodA::Tn5 de MGl655 ou MDS42 (sem pKD46) par permitir aintegração. Ambos os plasmídeos foram depois curados como descritopreviamente. O plasmídeo pKD46 foi então introduzido de novo nohospedeiro curado.

Os produtos PCR de cscA foram então usados para transformaros novos hospedeiros acima para permitir a recombinação. As célulastransformadas foram colocadas em placas em meio M9 contendo 1% sacarosecomo a única fonte de carbono. Os transformantes capazes de crescer no meiotem um Suc+ fenótipo.

EXEMPLO 4

Crescimento regulado por oxigênio de metabolismo de sacarose

O crescimento dependente aeróbico de cepa MGl 655sodAv.csc de exemplo 1 foi examinado usando sacarose como a única fonte decarbono e energia e monitorando o crescimento em todo um ciclo aeróbico -anaeróbico - aeróbico. O ciclo foi iniciado por comutação do fermentador dear a uma mistura de 95:5 de nitrogênio e dióxido de carbono, e então de voltaa ar após um intervalo apropriado em fermentações elevadas ao ar de 500 ml.

A figura 10 representa uma curva de crescimento típica dacepa em meio MOPS mínimo com 1% sacarose como a única fonte decarbono e energia. A falta de crescimento sob condições anaeróbicas indicaque as células não foram mais capazes de catabolizar sacarose. Em contraste,o crescimento de MG1655 sodAv.csc em glicose mais sacarose érelativamente inalterado por mudanças no gás espacial de topo, porque otransporte de glicose e glicólise não são apenas afetados pelo estado aeróbicoou anaeróbico da cultura.

A figura 11 mostra os resultados de duas fermentações dereator Airlift, uma realizada em meio MOPS mínimo contendo 0,4% sacarosecomo a unida fonte de carbono e energia e uma realizada no mesmo meiosuplementado com 0,2% glicose, além de 0,4% sacarose como a fonte decarbono e energia. A cepa não cresce em sacarose sob condições anaeróbicas,mas continuou a catabolizar glicose estivesse ou não oxigênio presente. Alémdos gráficos de crescimento mostrados na figura 10 e 11 são confirmados pelaobservação de que as contagens de células viáveis globais não muda em todaa fase anaeróbica na sacarose somente a cultura, enquanto continuaram aaumentar quando a glicose exógena estava presente (mostrado na figura 12A).Isto indica que não se tem restrição bioquímica em glicólise e que glicoseproduzida a partir de sacarose (pela ação dos produtos de gene csc) podesuportar o crescimento anaeróbico se ele ocorreu. A falta de crescimento emsacarose sob condições anaeróbicas é assim devido à falta de transcrição dosgenes csc a partir do promotor sodA dependente de oxigênio.

Além disso, os perfis de pH (figura 12B) demonstram que ocrescimento em sacarose gera muito pouco ácido, enquanto a culturacontendo tanto sacarose como glicose produz uma quantidade grande deácido. Isto também suporta a noção que pouco ou nenhum catabolismo desacarose ocorre durante a fase anaeróbica da fermentação porque aassimilação anaeróbica de glicose é conhecida como gerando grandesquantidade de acetato e formato. A incapacidade da cultura de crescer emsacarose para produzir qualquer ácido durante o curso do deslocamentoanaeróbico indica que pouca ou nenhuma glicose é disponível dentro dacélula na ausência de oxigênio.

EXEMPLO 5

Controle de sistema de carboidratos PTS por um promotor sensível aoxigênioA substituição dos promotores PTS nativos com o promotorsodA é ilustrada nas figuras 13 e 14. A construção desejada é produzida emtrês etapas. A primeira etapa envolve a produção de dois produtos PCRseparados compartilhando uma única seqüência homóloga com seus alvoscromossômicos em uma extremidade, assim como uma seqüência comumpara permitir a fusão dos dois produtos PCR em extremidades opostas. Oprimeiro dos produtos PCR iniciais inclui 45 bases de seqüência homóloga àextremidade 3' do gene cysK, o gene completo de cloranfenicol - acetil-transferase (CAT) mais seu promotor assim como uma seqüência de ligadorde não codificação para prover homologia para o segundo produto PCR(descrito abaixo). O gene CAT é amplificado do plasmídeo pACYC184usando um iniciador designado como Oligo 1 com a seqüência 5- gcattgtttgccgatctcttcactgagaaagaattgcaacagtaaTTACGCCCCGCCCTGCCACTCATCG

-3(SEQ ID NO: 9), onde a seqüência em letra minúscula é homóloga com aextremidade 3' do cysK e a seqüência em letra maiúscula é homóloga com aextremidade 3' do gene CAT. O segundo oligo nesta reação PCR é designadoOligo 3 com a seqüência 5'- acaaacctgaattttaagtccagtacctaCGACGCACTTTGCGCCGAATAAATACCTG-31 (SEQ ID NO: 10), onde a seqüência em letraminúscula é a seqüência de não codificação homóloga com o segundo produtoPCR e a seqüência em letra maiúscula é homóloga com a extremidade 5' daregião dó pro CAT. Uma reação de 50 μΙ. PCR é realizada em um tubocontendo 1 ng pACYC184 DNA, 50 pmol de cada iniciador, 0,2 mM dNTPs e2,5 U de Pfu polimerase. A reação passou através de 1 ciclo de 1 min a 95°C ,ciclos de 1 min de desnaturação a 95°C; 15 segundos de anelamento a 55°C;e 2 min de extensão a 72° C, então um ciclo final de 10 min de extensão a 72°C .

O segundo dos produtos de PCR iniciais inclui uma seqüênciade não codificação curta para prover homologia para o primeiro produto PCR,o promotor sodA dependente de oxigênio intacto e 45 bases de seqüênciahomóloga à extremidade 5' do gene ptsH. A região de promotor sodA éamplificada do DNA cromossômico de E. coli usando um iniciador designadocomo Oligo 2 com a seqüência 5'-tgttttggacttaaaattcaggtcatggatAATGCGTCGACTCCTGCAAAACCATACCC T-3', (SEQ ID NO: 11), onde aseqüência em letra minúscula é a seqüência de não codificação homóloga como primeiro produto PCR e a seqüência em letra maiúscula é homóloga com olado 5' da região do promotor sodA do cromossomo de E. coli. O segundooligo desta reação PCr é designado Oligo 4 com a seqüência 5'-gggtgtgcagaccgttcggagcggtaatggtaacttcttgctggaaATATTCATCTCCAGTATTGTCGGG-3' (SEQ ID NO: 12), a seqüência em letra minúscula é homólogacom a extremidade 5' de ptsH e a seqüência em letra maiúscula é homólogacom o lado 3' do promotor sodA. Este oligo efetivamente substitui o códon departida de sodA com o códon de partida de ptsH. Uma reação PCR de 50-μ1 érealizada em um tubo contendo 100 ng DNA MGl 655 de E. coli, 50 pmol decada iniciador, 0,2 mM dNTPs e 2,5 U de Turbo Pfu. A reação passou atravésde 1 ciclo de 2 min a 95 0C, 30 ciclos de 1 min de desnaturação a 95 0C ; 15segundos de anelamento a 55 0C, e 1 min de extensão a 12°C, então um finalciclo de 5 min de extensão a 72°C.

Os produtos PCR de cada reação são recuperados dos géis deagarose e purificados em colunas de purificação Qiagen antes de um segundociclo de PCR. Nesta reação, os dois primeiros produtos PCR do ciclo sãodesnaturados e deixados re-anelar antes da extensão. Uma reação de PCR de50-μ1 foi realizada em um tubo contendo 5 ng de cada produto PCR deprimeiro ciclo purificado, 0,2 mM dNTPs e 2,5 U de Pfu polimerase. Areação passa através de 1 ciclo de 2 min a 95°C, 10 ciclos de 1 min dedesnaturação a 950C; 15 segundos de anelamento a 55°C; e 1 min de extensãoa Il0C. Após os primeiros 5 ciclos, 50 pmoles de Oligo 1 e Oligo 4 sãoadicionados às reações e as reações são continuadas por mais 25 ciclos,seguido por um ciclo final de 5 min de extensão a 72 0C. O produto PCR dosegundo ciclo é purificado usando uma coluna Qiagen e transformado emMGl 655 ou MDS42 contendo pKD46 para permitir a integração. Osintegrantes estáveis são isolados como colônias resistentes a cloranfenicol. Oplasmídeo pKD46 é curado como descrito previamente.

EXEMPLO 6

Crescimento regulado em oxigênio de metabolismo de açúcar

A regulação transcripcional do sistema de transporte decarboidrato PTS a partir dos promotores regulados em oxigênio reduz o papelque o sistema PTS desempenha no consumo de açúcar sob condiçõesanaeróbicas. Apesar de glicose ou outros carboidratos poderem ainda serabsorvidos via sistemas não PCTS, as taxas de assimilação são muitoreduzidas porque o sistema PTS representa a estratégia de absorção de açúcarde maior velocidade em E. coli. Um benefício adicional de ocasionar aexpressão de genes ptsH e ptsl, que desempenham um papel comum em todosos sistemas PTS em E. coli, sob o controle de um promotor regulado emoxigênio mostra um ponto único de regulação para controlar o consumo detodos os açúcares PTS. Por analogia direta com o modelo de sacarose descritonos exemplos anteriores, o crescimento de cepas de E. coli em outros açúcarespode ser limitado para corresponder mais intimamente com a disponibilidadede oxigênio como um receptor de elétrons terminal assim minimizando aprodução de metabólitos em excesso pela célula engenheirada para umaampla faixa de açúcares PTS.LISTAGEM DAS SEQÜÊNCIAS

<110> Scarab Genomics LIjC

<120> Microorganismos reguladores de Oxigênio

<130> 02730.0015.OOPCOO

<150> US 60/715,702

<151> 2005-09-08

cl50> PCT/US2006/032525

<151> 2006-08-18

<160> 12

< 17 0 > Patentln Versão 3.2

<210> 1

<211> 70

<212> DNA

<213 > Artificial

<220>

<223> Inlclador Sintético

<400> 1

cccacggagt ggctgtgctg caacatggag cactctggct actgggttaa gtcagatgaatttaagggaa

<210> 2

<211> 70

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

< 2 2 3 > Iniclador Sintético

<400> 2

caaaaccaca tcaattgaaa cgctgtttta tttttatcgg atcattgttt ctatattgctgaaggtacag

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

c220>

c 2 2 3 > Iniclador Sintético

c400> 3

ttaacccagt agccagagtg<210> 4

<211> 70

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Iniciador Sintético

<400> 4

ctgcttacgc ggcattaaca atcggccgcc cgacaatact ggagatgaat atgacgcaatctcgattgca

<210> 5

<211> 70

<212» DNA

<213 > Artificial

<220>

<223> iniciador Sintético

<400> 5

caaaaccaca tcaattgaaa cgctgtttta tttttatcgg atcattgttt ttaacccagt 60agccagagtg 70

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> iniciador Sintético

<400> 6

gtaagtcaga tgaatttaag ggaa

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Iniciador Sintético

<400> 7

ctatattgct gaaggtacag gcgt

<210> 8

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial<220>

<223> Inlclador Sintético

<400> 8

aagaggttta tcactaacat tttgtg

<210> 9

<211> 70

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Inlciador Sintético

<400> 9

gcattgtttg ccgatctctt cactgagaaa gaattgcaac agtaattacg ccccgccctgccactcatcg

<210> 10<211> 58<212> DNA<213> Artificial

<220>

<223 > inlciador Sintético

<400> 10

acaaacctga attttaagtc cagtacctac gacgcacttt gcgccgaata aatacctg

<210> 11

<211> 60

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

< 2 2 3 > Iniciador Sintético

<400> 11

tgttttggac ttaaaattca ggtcatggat aatgcgtcga ctcctgcaaa accataccct

<210> 12

<211> 71

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Inlclador Sintético

<4 00> 12

gggtgtgcag accgttcgga gcggtaatgg taacttcttg ctggaacata ttcatctccagtattgtcgg g

Claims (14)

1. Microorganismo, caracterizado pelo fato de ter um fluxometabólico a partir de uma fonte de carbono regulada por níveis de oxigênio.

2. Microorganismo de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que o microorganismo é um procarioto.

3. Microorganismo de acordo com a reivindicação 2,caracterizado pelo fato de que o procarioto é selecionado dentre o grupoconsistindo de E. coli, Shigella, Salmonella, Corynebacter, Lactococcus eStreptomyeetes.

4. Microorganismo de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que o microorganismo é um eucarioto.

5. Microorganismo de acordo com a reivindicação 4,caracterizado pelo fato de que o eucarioto é uma levedura.

6. Microorganismo de acordo com a reivindicação 5,caracterizado pelo fato de que a levedura é selecionada dentre o grupoconsistindo de S. eerevisiae e S. pombe.

7. Microorganismo de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que a fonte de carbono é selecionada dentre o grupoconsistindo de glicose, frutose, galactose, manose, sacarose, maltose, N-acetilglucosamina, β-glucosídeos, manitol, celobiose, sorbose, glucitol e galactitol.

8. Microorganismo de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que o microorganismo compreende um promotorregulado em oxigênio ligado operativamente a um gene codificando umaproteína de um sistema fosfotransferase dependente de fosfoenol piruvato.

9. Microorganismo de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que o microorganismo compreende um promotorregulado em oxigênio ligado operativamente a um gene codificando ummódulo de metabolismo de sacarose 0157:H7 de E. coli.

10. Microorganismo de acordo com a reivindicação 8,caracterizado pelo fato de que o gene codifica uma proteína de fusãocompreendendo a proteína do sistema fosfotransferase dependente defosfoenol piruvato e ubiquitina.

11. Microorganismo de acordo com a reivindicação 9,caracterizado pelo fato de que o gene codifica uma proteína de fusãocompreendendo a proteína de módulo de metabolismo de sacarose 0157:H7de E. coli e ubiquitina.

12. Método para regular o fluxo metabólico em ummicroorganismo caracterizado pelo fato de compreender cultivar omicroorganismo da reivindicação 1 sob condições nutrientes apropriadas econcentrações de oxigênio para produzir um fluxo metabólico desejado.

13. Método para reduzir a produção de metabólitos em excessoem microorganismo, caracterizado pelo fato de que compreende cultivar omicroorganismo da reivindicação 1 sob condições nutrientes e sobconcentrações de oxigênio abaixo, acima, ou em um nível de limiar deoxigênio, assim alterando o fluxo de carbono através de uma ou mais viasmetabólicas que produz os referidos metabólitos em excesso.

14. Microorganismo caracterizado pelo fato de compreenderum promotor sensível a oxigênio, referidos promotores capazes de regular ofluxo metabólico de uma fonte de carbono através de uma ou mais viasmetabólicas de referido microorganismo e em que referido promotor sensívela oxigênio é ligado operativamente a um gene heterólogo não naturalmentesob o controle transcripcional de referido promotor sensível a oxigênio.