BRPI0615578B1 - Escherichia coli - Google Patents

Abstract

microorgamsmo, e, metodos para regular o fluxo metabólico em um microorganismo e para reduzir a produção de metabólitos em excesso em microorganismo a presente invenção refere-se a novas cepas de microorganismos com metabolismo regulado por oxigénio. os microorganismos tem maiores taxas de crescimento e são mais eficientes do que as cepas parentais. os microorganismos podem ser usados para produzir vários produtos de interesse, como proteínas recombinantes, ácidos nucléicos, como dna, aminoácidos e produtos químicos.

Description

“ESCHERICH1A COLE

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

Este pedido reivindica o benefício de pedido provisório US No. 60/715,702, depositado em 8 de setembro de 2005, e pedido internacional PCT/2006/032525 depositado em 18 de agosto de 2006, cujos conteúdos são incorporados aqui por referência.

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a novas cepas de microorganismos e processos de fermentação envolvendo estes microorganismos. Mais especificamente, a presente invenção refere-se a cepas geneticamente modificadas de microorganismos e seu uso para a produção de produtos comerciais como proteínas recombinantes, ácidos nucleicos, aminoácidos e produtos químicos especiais. A presente invenção também refere-se a métodos de preparação de cepas de microorganismos para tais usos.

ANTECEDENTES

Os microorganismos como bactérias são usados extensivamente em processos industriais para a fabricação de biofármacos, componentes de vacina, DNAs plasmídeo, DNAs vacina, e muitos produtos químicos especiais, incluindo aminoácidos. As bactérias usadas em processos industriais são tipicamente cultivadas em meio líquido suplementado com glicose como a fonte de carbono. As quantidades grandes de glicose são requeridas em processos industriais para cultivar bactérias nas densidades elevadas desejadas para maximizar a produtividade volumétrica, para produzir produtos químicos especiais, e para a manutenção das bactérias. As bactérias absorvem e assimilam metabólitos em uma taxa alta. O fluxo de metabólitos pode ser tão alto que ele supera uma ou mais das reações químicas nas vias de carbono central das bactérias como a concentração de alguns metabólitos se eleva. As bactérias dispõe de concentrações elevadas de metabólitos por utilização de uma ou mais vias "superabundantes". E. coli tendem a secretar acetato quando oxigênio se toma escasso durante as fermentações de densidade de células elevada. A causa principal é a necessidade para a célula dispor de elétrons para um receptor diferente de 02. A causa próxima é o acúmulo intracelular de acetil-CoA, um produto de glicólise, que na presença de 02 é normalmente queimado pelo ciclo TC A. No entanto, quando 02 é baixo, o ciclo TC A não pode metabolizar acetil-CoA de modo eficiente, de modo que ele se acumula na célula. O acetil-CoA em excesso é convertido em acetato que é excretado junto com outros ácidos nucleicos para remover os elétrons da célula. Isto provê uma solução metabólica viável mais lenta para E. coli no mundo selvagem, mas em fermentadores industriais à medida que a densidade da célula é dirigida para níveis superiores, o acetato em excesso pode se acumular em níveis tóxicos.

Este problema foi tradicionalmente dirigido pela fermentação em batelada alimentada, em que a fonte de carbono é medida na cultura de modo que o crescimento de células é limitado por deprivação de carbono a níveis comensurados com o 02 disponível. Apesar da medição da fonte de carbono, a utilização de oxigênio eventualmente se toma limitativa em densidades de células elevadas. Nesta situação, o meio do fermentador também se toma heterogêneo devido à falta de uma misturação perfeita, e o nível de 02 varia de lugar a lugar nas bolsas. Apesar do acetato excretado em uma região de 02 baixa pode ser tomado de volta pelas células que são transportadas para regiões com mais 02, isto pode ser metabolicamente Avp»ntna1mpntp à medida rme mais células se acumulam, o nível de acetato inexoravelmente sobre mesmo com a tecnologia de batelada alimentada. A medida que os níveis de ácido orgânico se elevam além da capacidade tampão do meio, pH é mantido por titulação com bases minerais como NaOH, que não somente requerem equipamento adicional e atenção do pessoal da planta, mas também pode aumentar a complexidade da purificação de produto a jusante assim como a carga de sal na corrente de refugo do fermentador. Um regime de fermentação que aumenta a formação de produto específico por minimização do metabolismo de fluxo pode representar uma melhora significante na técnica.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Em várias formas de realização, a presente invenção provê um microorganismo com fluxo metabólico de uma fonte de carbono regulada pelos níveis de oxigênio. O microorganismo pode ser um procarioto, como E. coli, Shigella, Salmonella, Corynebacter, Lactococcus ou Streptomycetes. O microorganismo também pode ser um eucarioto, como uma levedura. A levedura pode ser da espécie Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe ou Pichia. A fonte de carbono pode ser glicose, ffutose, galactose, manose, sacarose, maltose, N-acetilglucosamina, β-glucosídeos, manitol, celobiose, sorbose, glucitol ou galactitol. O microorganismo pode compreender um promotor regulado por oxigênio ligado operativamente a um gene codificando uma proteína de sistema fosfotransferase dependente de fosfoenol piruvato. O microorganismo pode compreender um promotor regulado por oxigênio ligado operativamente a um gene codificando uma proteína de módulo de metabolismo de 0157.H7 sacarose de E. coli. O gene ligado operativamente ao promotor regulado por oxigênio pode codificar uma proteína de fusão. A proteína de fusão pode compreender ubiquitina.

Estas e outras formas de realização da presente invenção são HicraitiHac <.m maiorpç Hí»ta1hf.<; ahaivr» BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Figura 1 mostra o módulo de metabolismo de Θ157.Η7 sacarose de E. coli.

Figura 2 mostra o promotor Kl 2 sodA de tipo selvagem.

Figura 3 mostra o módulo de metabolismo de 0157.H7 sacarose rearranjado.

Figura 4 mostra produtos de amplificação de PCR a) cscA, b) CscKB, e c) esc A e produto recombinante cscKB.

Figura 5 mostra (a) células MG1655 cultivadas em meio M9 contendo 1% sacarose como a única fonte de carbono sem formação de colônia, e (b) MG1 655 sodA pKD46 contendo o operon cscAKB em que os recombinantes são deixados crescer em meio M9 mais 1% sacarose.

Figura 6 mostra uma forma de realização alternativa da invenção em que somente esc A é controlado por oxigênio pelo promotor sodA e um operon (Placp) separado controla cscKB.

Figura 7 mostra produto de amplificação de PCR a) cscKB, e b) fragmento terminador Placop.cscKB.\ Figura 8 mostra uma forma de realização alternativa da invenção em que somente esc A é controlado por oxigênio pelo promotor sodA e um operon separado (cscKp) controla cscKB, Figura 9 mostra os produtos de amplificação de PCR, a) cscProK-B, e b) fragmento cscProK-B cortado como um fragmento Hindlll-Xbal Figura 10 mostra a curva de crescimento de MG 165 5 sodA:.esc em meio MOPS mínimo com 1% sacarose. A área em caixa da curva indica o tempo que a cultura foi cultivada sob condições anaeróbicas Figura 11 mostra a curva de crescimento de MG1655 sodA::csc em meio MOPS mínimo com 0,4% sacarose como a única fonte de carbono c energi? ^dl;:*rníin^c οίητ^Λ ^ meio MOPS» com 0.7% plicose e 0.4% sacarose (quadrados pretos). A área em caixa da curva indica o tempo que a r>- cultura foi cultivada sob condições anaeróbicas.

Figura 12 as contagens de culturas viáveis (painel A) e pH do meio (painel B) para MG 1655 sodA::csc cultivado em meio MOPS mínimo com0,4% sacarose como a única fonte de carbono e energia (diamantes cinza) e meio MOPS com 0,2% glicose e 0,4% sacarose (quadrados pretos). A área cm caixa da curva indica o tempo que a cultura foi cultivada sob condições anaeróbicas.

Figura 13 ilustra a substituição de promotores PTS nativos com o promotor sodA.

Figura 14 ilustra a estratégia de construção recombinante de PTS regulada pelo promotor sodA e os oligonucleotídeos que podem ser usados para amplificação de PCR.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Apesar da presente invenção ser capaz de ser realizada em várias formas, a descrição abaixo de várias formas de realização é feita com a compreensão de que a presente invenção deve ser considerada como uma exemplificação da invenção, e não se destina a limitar a invenção às formas de realização específicas ilustradas. Os cabeçalhos são dados para conveniência apenas e não devem ser construídos como limitando a invenção de algum modo. As formas de realização ilustradas sob qualquer cabeçalho podem ser combinadas com formas de realização ilustradas sob qualquer outro cabeçalho. O uso de valores numéricos nas várias faixas especificadas no pedido, salvo especificado em contrário expressamente, são dados como aproximações como se os valores mínimo e máximo dentro das faixas descritas fossem precedidos pela palavra "cerca de". Deste modo, pequenas variações acima e abaixo das faixas descritas podem ser usadas para obter substanci5*!™'*1'1^ TnpcmnQ revoltados romo valores dentro das faixas. Como usado aqui, os termos "cerca de" e "aproximadamente" quando com referência a um valor numérico devem ter seus significados para o versado como assunto pertinente à técnica. Também, a descrição de faixas se destina como uma faixa contínua incluindo cada valor entre os valores mínimo e máximo dados assim como quaisquer faixas que podem ser assim formadas. Isto inclui faixas que podem ser formadas que de fato incluem ou não incluem um limite superior e/ou inferior finito. Conseqüentemente, o versado na técnica irá notar que muitas destas relações, faixas, e faixas de relações podem ser derivadas de modo não ambíguo dos dados e números apresentados aqui e todos representam formas de realização da presente invenção.

Em uma forma de realização, a presente invenção refere-se a um microorganismo com fluxo metabólico regulado por níveis de oxigênio. Quando o microorganismo está em um meio com níveis abaixo do limiar de oxigênio, o fluxo metabólico é reduzido. Ao reduzir o fluxo metabólico em níveis baixos de oxigênio, o metabolismo superabundante para metabólitos indesejáveis produzidos em meios de oxigênio reduzidos pode ser reduzido. Quando os níveis de oxigênio são aumentados acima de um nível de limiar, o fluxo metabólico pode ser aumentado. Dentro de uma cultura, pode-se ter micro-ambientes com oxigênio suficiente e outros micro-ambientes com oxigênio insuficiente para a síntese de produto eficiente. O microorganismo pode ser capaz de auto-regular o fluxo metabólico sob níveis de oxigênio variados e assim somente consumir substrato sob condições que permitem a formação de produto eficiente.

Ao regular a taxa de metabolismo como uma função de níveis de oxigênio, pode-se ter uma redução na produção de acetato e outros metabólitos superabundantes indesejáveis. Ao permitir aos microorganismos auto-regular o metabolismo, um produto de interesse pode ser produzido com mpirvr pfíripnrin p mpnnr niçtn 1. Microorganismo O microorganismo pode ser derivado de qualquer microorganismo parental. Os microorganismos parentais representativos são disponíveis do American Type Culture Collection. Outros microorganismos representativos são descritos em S.Y. Lee, "High Density Culture of Escherichia coli," Tibtech 14:98-103 (1996). O organismo parental pode ser um eucarioto como uma levedura. Os exemplos representativos de levedura incluem, mas não são limitados a espécies S. cerevisiae S. pombe e Pichia . O organismo parental pode também ser um procarioto, como bactérias, e pode ser um organotrofo quimio-heterotrófico. Os exemplos representativos de bactérias incluem, mas não são limitados a E. coli, Shigella, Salmonella, Corynebacter, Lactococcus e Streptomycetes. O microorganismo pode ser também um microorganismo de genoma reduzido, com uma bactéria de genoma reduzido. Muita da informação genética contida no genoma de um microorganismo pode ser deletada sem afetar de modo prejudicial a produção do metabólito final. Além disso, um microorganismo com um genoma reduzido pode ser vantajoso na produção de muitos produtos de interesse. Por exemplo, um genoma reduzido pode levar à produção de menos produtos nativos ou menores níveis dos mesmos, que pode levar a uma purificação menos complexa de um produto de interesse. Além disso, um microorganismo com um genoma reduzido pode ser menos metabolicamente demandante e assim pode produzir um produto de interesse mais e fiei entemente. As bactérias de genoma reduzido são discutidas em patente US 6 989 265, incorporada aqui por referência. As bactérias de genoma reduzido com produção limitada de proteínas periplásmicas naturais podem ser benéficas para a expressão de proteínas recombinantes no periplasma. Os exemplos de cepas de bactérias de genoma reduzido apropriadas incluem, mas não são limitados a MDS12, MDS13. MDS39, MDS40. MDS41 MDS42. MDS4.T MDS44: MDS45 MDS46 MDS47 MDS48, MDS49, MDS50, MDS51, MDS52, MDS53, MDS54, MDS55, MDS56, MDS57, MDS58, MDS59 e MDS60. O microorganismo de genoma reduzido pode também ser derivado de novo de genes e operons de um ou mais microorganismos. 2. Fluxo metabólico regulado em oxigênio Os níveis de oxigênio podem regular o fluxo metabólico de uma fonte de carbono em um microorganismo. O metabolismo da fonte de carbono pode ser regulado na importação da fonte de carbono. Por exemplo, a expressão de uma proteína envolvida na importação da fonte de carbono pode ser colocada sob o controle de um promotor regulado em oxigênio. O metabolismo de uma fonte de carbono também pode ser regulado na primeira etapa metabólica intracelular usando a fonte de carbono ou qualquer etapa metabólica a seguir, ou uma combinação das mesmas. Por exemplo, a expressão de uma proteína envolvida em glicólise ou em conversão de fonte de carbono em um substrato para glicólise pode ser colocada sob o controle de um promotor regulado em oxigênio, a. Fonte de carbono A fonte de carbono pode ser qualquer fonte de carbono capaz de suportar crescimento e/ou metabolizar o microorganismo, ou nativamente ou por introdução de genes heterólogos ou operons codificando enzimas capazes de metabolizar a fonte de carbono. A fonte de carbono pode ser um monossacarídeo, como glicose, frutose, galactose ou manose. A fonte de carbono também pode ser um dissacarídeo, como sacarose. Outras fontes de carbono incluem, mas não são limitadas a maltose, N-acetilglucosamina, β-glucosídeos, manitol, celobiose, sorbose, glucitol e galactitol.

As bactérias podem tomar uma fonte de carbono via o sistema fosfotransferase dependente de fosfoenol piruvato (PTS). O sistema PTS pode permitir a absorção rápida e eficiente de fontes de carbono exógenas de alta qualidade e podem desempenhar um papel chave na regulação catabólica de metabolismo em muitas bactérias. A expressão de um ou mais componentes de sistema PtS pode estar sob o controle de promotor regulado em oxigênio, que pode reduzir a produção de produtos superabundantes. Uma via de absorção de fonte de carbono alternativa, regulada pela disponibilidade de oxigênio, pode permitir uma divisão mais eficiente de substrato na formação de produto durante todo o curso da fermentação. O sistema PTS um sistema de fosfo-substituição em que a proteína El (codificada por ptsH) transfere o grupo fosfato de fosfoenol piruvato para a proteína HPr (codificado por ptsF) que por sua vez fosforila uma subunidade EIIA específica de carboidrato. (em E. coli a proteína EIIA específica de glicose é codificada pelo gene crr) que pode então interagir com uma proteína ou subunidade associada com membrana do complexo de transporte de carboidrato para internalizar e fosforilar o açúcar cognato. A reação global converte PEP em piruvato enquanto o transporte de um açúcar exógeno para um açúcar-fosfato interno.

Em E. coli, os genes codificando os elementos de PTS comuns, ptsH e ptsl são associados no cromossomo com o gene crr. Todos os três genes são transcritos de um conjunto de promotores encontrados a montante de ptsH. Além disso, um promotor adicional ou par de promotor dentro de ptsl produz um transcrito que inclui somente ptsl. A expressão de alguns dos promotores a montante de ptsH aumenta sob condições anaeróbicas. A expressão aumentada destes genes pode resultar em um nível aumentado de absorção de açúcar e ativação via qualquer um dos sistemas PTS para os quais o açúcar cognato está presente. A transcrição aumentada destes genes pode assim desempenhar um papel na produção de metabólitos superabundantes indesejados porque como oxigênio se toma limitante como um receptor de elétrons para o ciclo TC A, o aumento de expressão dos genes PTS aumenta simultaneamente a capacidade de absorção de açúcar. A substituição de promotores associados com ptsH nativos com nm nromotor regulado em oxigênio pode regular a absorção de açúcar por PTS em um modo dependente de oxigênio, assim assegurando que o consumo de fonte de carbono é acoplado com a presença de oxigênio. Ao controlar a expressão de elementos comuns de um ou mais sistemas PTS na célula, a disponibilidade e/ou utilização de fontes de carbono múltiplas pode ser controlada. Como acima discutido, a absorção e ativação de fontes de carbono pode exceder a capacidade do microorganismo de metabolizar eficientemente os mesmos, resultando em metabólitos superabundantes indesejados. Além disso, a produção de compostos diretamente derivados de PEP, como aromáticos derivados de via de ácido shikímico, pode ser limitada por consumo de PEP para o transporte de açúcar mediado por PTS. 1) Sacarose A sacarose também pode ser usada como uma fonte de carbono para o microorganismo. A sacarose é um dissacarídeo de glicose e frutose. A fim de ser metabolizada, a sacarose pode ser transportada na célula e então dividida nas unidades de monossacarídeos. Tanto glicose como frutose podem então entrar na glicólise como glucose-6- fosfato e frutose-6-fosfato. Vários microorganismos, incluindo a maior parte das cepas de E. coli, são incapazes de crescer em sacarose. No entanto, algumas cepas tem um sistema de gene que permite a absorção e metabolismo de sacarose como a única fonte de carbono. Estes sistemas de genes, ou porções dos mesmos, podem ser adicionados a um microorganismo que permite o uso de sacarose como a fonte de carbono. Os genes podem ser adicionados ao cromossomo do microorganismo, ou podem ser adicionados ao microorganismo em um plasmídeo. Um ou mais dos genes adicionados ao microorganismo podem ser colocados sob o controle de um promotor regulado em oxigênio. Também é contemplado que os sistemas de genes permitindo a absorção e metabolismo de outras fontes de carbono também nodem spr adiVinnarloQ an X microorganismo.

As patentes US 6 365 723 e 6 855 814, incorporadas aqui por referência, descrevem um exemplo representativo de sistema de gene compacto para a absorção e metabolismo de sacarose que permite o uso de sacarose como a única fonte de carbono. O modulo de metabolismo de sacarose 0157:: H7 de E> coli é mostrado na figura 1. O produto de gene cscB transporta sacarose na célula e esc A codifica para sacarose hidrolase (invertase) que divide a sacarose de dissacarídeo em frutose e glicose. O gene cscK, codifica para frutoquinase a primeira enzima de metabolismo glicolítico de frutose. O gene cscK mostra uma elevada similaridade para outras frutoquinases e pode ser redundante para o gene fruK de E. coli K-12, no entanto, as células K-12 de E. coli podem faltar as atividades de sacarose invertase e hidrolase. O produto de gene cscR é um repressor que controla a expressão dos genes do operon 0157:H7 em relação à disponibilidade de sacarose por ligação aos promotores, típicos da família lacI-galR de proteínas repressoras. B. Promotor regulado em oxigênio O fluxo metabólico da fonte de carbono pode ser regulada usando promotores sensíveis a oxigênio ligados operativamente a um gene codificando uma ou mais das proteínas envolvidas em metabolismo da fonte de carbono. Os exemplos representativos de promotores que são ativados na presença de oxigênio são promotores dentro do operon cyo e superóxido dismutase (sodA) que codifica uma enzima que protege a célula contra dano oxidativo. A região cromossômica sodA tipo Kl2 selvagem é mostrada na figura 2.

Ao usar um promotor sensor de oxigênio positivo, níveis de oxigênio suficientemente levados podem induzir a expressão de proteínas que permitem o metabolismo da fonte de carbono enquanto minimizando a nroducão de metaholitos siinerahimdantes on outros snh-nrodntos O temno de i » Λ. A 1 resposta do promotor pode ser aumentado por colocação de proteínas metabólicas citoplásmicas sob o controle do promotor sensível a oxigênio enquanto proteínas não citoplásmicas (por exemplo proteínas de transmembrana) podem ser expressadas constitutivamente ou colocadas sob o controle de promotor diferente. A velocidade em que metabolismo é reduzido sob condições de oxigênio diminuindo pode ser aumentada por aumento da taxa de circulação das proteínas metabólicas. Por exemplo, uma proteína envolvida no metabolismo da fonte de carbono pode ser expressada como proteína de fusão com ubiquitina. A invenção também engloba construções de ácido nucleico compreendendo um promotor regulado em oxigênio ligado operativamente a um gene heterólogo não normalmente sob o controle de um promotor sensível a oxigênio, c. Taxas de crescimento O microorganismo pode ter uma taxa de crescimento aumentada quando cultivado na presença de uma abundância de uma fonte de carbono. Quando cultivado em meio líquido compreendendo de 0% à concentração % tolerada máxima de uma fonte de carbono, o microorganismo pode ter uma taxa de crescimento incluindo, mas não limitada a mais do que cerca de 25% a cerca de 400%, como comparado com o parental do microorganismo. O microorganismo pode ser cultivado em meio compreendendo uma fonte de carbono como um peso/volume de pelo menos cerca de 0,1%, 0, 2%, 0, 3%, 0, 4%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9%, 1%, 1,5, 2%, 2,5, 3%, 3,5%, 4%, 4,5%, 5%, 5,5%, 6%, 6,5%, 7%, 7,5%, 8%, 8,5%, 9%, 9,5% ou 10%. Em tais condições, o microorganismo pode ter uma taxa de crescimento maior do que cerca de 30%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 105%, 110%, 115%, 120%, 125%, 130%, 135%, 140%, 145%, 150%, 155%, 160%, 165%, 170%, 175%, 180%, 185%, 190%, 195%, 200%, 205%, 210%, 215%, 220%, 225%, 230%, 235%, 240%, 245%, 250%, 255%, 960<>/ft ?6s% 970% 97S% 980% 985%^ 9.90%; 295%, 300%, 305%, 310%, 315%, 320%, 325%, 330%, 335%, 340%, 345%, 350%, 355%, 360%, 365%, 370%, 375%, 380%. 385%, 390%, 395%, ου 400% como comparado com um microorganismo parental. d. Fluxo metabólico O microorganismo pode ter melhorado fluxo metabólico quando cultivado na presença de uma abundância de uma fonte de carbono. Quando cultivado em meio líquido compreendendo de 0% até a concentração % máxima tolerada de uma fonte de carbono, o microorganismo pode ter um fluxo metabólico incluindo, mas não limitado de cerca de 5% a cerca de 90% da fonte de carbono sendo dirigida para os produtos desejado. Uma cepa pode ter um fluxo metabólico de cerca de 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% ou 90%.

Em geral, o fluxo de metabólitos através de cada etapa de reação em qualquer via dada depende das taxas relativas da reação dianteira e reações reversas. O fluxo pode se referir à taxa de mudança em concentração de um analito como uma função de tempo e tamanho da amostra. O fluxo metabólico através de qualquer conversão metabólica única pode ser determinado usando metodologias descritas na patente U.S. Nos. 6,764,817 e 6,849,396, cujos conteúdos são incorporados aqui por referência Outras diretrizes sobre fluxo e métodos para sua determinação são dados, por exemplo, por Newsholme, E. A. et al., Biochem. Soc. Symp. 43:183-205 (1978); Newsholme, E. A., et al., Biochem. Soc. Symp. 41:61-110 (1976); e Newsholme, E. A., e Sart, C, Regulation in Metabolism, Chaps. 1 e 3, Wiley-Interscience Press (1973), cujos conteúdos são incorporados aqui por referência. e. Produção Os microorganismos da presente invenção podem ser capazes de produzir metabólitos finais ou outros produtos de interesse em taxas maiores. Quando cultivados em meio líquido compreendendo de 0% à % He concentração tolerada máxima de uma fonte de carbono, o microorganismo pode produzir metabólitos finais ou outros produtos de interesse de cerca de 0,001 g/L a cerca de 100 g/L da fonte de carbono sendo dirigidos para os produtos desejados. Uma cepa pode ter um fluxo metabólico de 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, ou 80%. f. Taxa de produção Em vista da capacidade de controlar o fluxo metabólico, o microorganismo pode produzir várias quantidades do metabólito final, em uma variedade de taxas, e em taxas variáveis de eficiente de utilização de fonte de carbono. As cepas da presente invenção podem produzir o metabólito final a pelo menos os níveis incluindo, mas não limitados a cerca de 10 g/L, 20 g/L, 30 g/L, 40 g/L, 50 g/L, 60 g/L, 70 g/L, 80 g/L, 90 g/L, e 100 g/L. O microorganismo pode produzir o metabólito final a uma taxa incluindo, mas não limitada a pelo menos cerca de 0,50 g/L/h, 0,75 g/L/h, 1,00 g/L/h, 1,25 g/L/h, 1,50 g/L/h, 1,75 g/L/h, 2,00 g/L/h, 2,25 g/L/h, 2,50 g/L/h, 2,75 g/L/h, 3,00 g/L/h, 3,25 g/L/h, 3,50 g/L/h, 3,75 g/L/h, 4,00 g/L/h, 4,25 g/L/h, 4,50 g/L/h, 4,75 g/L/h, e 5,00 g/L/h. O microorganismo pode produzir o metabólito final a uma taxa de eficiência de utilização de fonte de carbono incluindo, mas não limitada a pelo menos cerca de 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, e 75%. 3. Produto de interesse O microorganismo pode ser usado para produzir um produto de interesse em níveis elevados de eficiência em meios com uma abundância de fonte de carbono. O produto de interesse produzido pelo microorganismo pode ser um ou mais de quaisquer produtos incluindo, mas não limitados a produtos químicos, aminoácidos, vitaminas, co-fatores, ácidos nucleico, como DNA, ácidos graxos, fatores de crescimento, proteínas e intermediários dos mesmos. O produto de interesse pode ser um produto aue é natural mente produzido pelo microorganismo. O produto de interesse pode também ser um t * produto não natural que é produzido como um resultado de genes heterólogos sendo adicionados ao microorganismo. O produto de interesse pode estar localizado intracelularmente no microorganismo. O produto de interesse também pode ser secretado no periplasma do microorganismo. O periplasma pode ser benéfico para a produção de proteína porque: (i) a proteína humana recombinante pode ser produzida com o amino-término correto, enquanto os produzidos nocitoplasma podem começar com uma metionína adicional não presente na proteína natural, (ii) muitas proteínas podem duplicar corretamente no espaço periplásmico, (iii) as ligações dissulfeto corretas podem ser formadas no periplasma, (iv o espaço periplásmico pode conter bem menos e em uma quantidade bem maior de proteínas do que o citoplasma, simplificando a purificação (v) onde podem estar menos proteases do que no citoplasma, que pode reduzir a digestão de proteína e perda, e (vi) proteínas expressadas podem ser prontamente liberadas com outras proteínas periplásmicas por especificamente rompendo a membrana externa substancialmente isenta das proteínas citoplásmicas mais abundantes. O produto de interesse também pode ser excretado pela célula nos meios. 4. Fermentação O microorganismo pode ser usado para produzir produtos desejados em fermentações em batelada, onde a quantidade requerida completa da fonte de carbono pode ser adicionada no começo da fermentação. Apesar da capacidade das células modificadas de se adequar ao consumo de fonte de carbono à disponibilidade de oxigênio, as cepas também podem ser usadas para produzir produtos desejados nas fermentações de batelada alimentada. A taxa de alimentação da fonte de carbono pode ser qualquer quantidade até a qual que produz a concentração tolerada máxima mas é preferivelmente a quantidade mínima requerida para manter a tava rle crescimento maximal. As cepas também podem ser usadas para produzir produtos desejados em modos contínuo ou "chemostat" de fermentação, que podem permitir a manutenção de uma maior taxa de diluição. O microorganismo pode ser usado para processos de fermentação em um meio sintético ou natural contendo pelo menos uma fonte de carbono e pelo menos uma fonte de nitrogênio que pode ser usada pela cepa em virtude de seu processamento da via(s) metabólica (s) necessária(s) e como apropriado, sais inorgânicos, fatores de crescimento e outros.

Os exemplos ilustrativos de fontes de nitrogênio apropriadas incluem, mas não são limitadas a: amônia incluindo gás amônia e amônia aquosa, sais de amônio de ácidos inorgânicos ou orgânicos, como cloreto de amônio, fosfato de amônio, sulfato de amônio, e acetato de amônio, e outras substâncias contendo nitrogênio incluindo aminoácidos, extrato de carne, peptona, melaços, licor de milho, hidrolisado de caseína, hidrolisado de bolo de soja e extrato de levedura.

Alguns aminoácidos presentes individualmente em meios de sais mínimos não podem ser usados bem por bactérias como fonte de carbono. Cada espécie de bactéria difere em sua capacidade de usar cada aminoácido natural. Os aminoácidos que não são usados individualmente podem ser usados bem na presença de outros aminoácidos, por exemplo serina pode ser usada como uma fonte de carbono somente se glicina, leucina, isoleucina e valina estiverem presentes. Em meios ricos, como misturas de aminoácidos sintéticos, vários aminoácidos podem ser usados preferivelmente e consumidos antes de outros aminoácidos. Serina, proíina, glicina, aspartato, treonina, glutamato e alanina podem ser completamente removidos de uma mistura dos 16 aminoácidos presentes em casamino ácidos, um constituinte de meio popular, enquanto os outros são usados mais lentamente e incompletamente. Os resultados similares são obtidos em caldo de triptona. Se for deseiável re-usar os aminoácidos acumulados como metabrSlito<; finak então o aminoácido pode ser preferivelmente serina, prolina, glicina, aspartato, treonina. glutamato ου alanina. e o meio pode conter os aminoácidos adicionais necessários para estimular seu uso como uma fonte de carbono. O meio também pode conter um hidrolisado de proteína incluindo, mas não limitado a triptonas, casamino ácidos e hidrolisados de soja. A presente invenção tem múltiplos aspectos, ilustrados pelos seguintes exemplos não limitativos. EXEMPLO 1 Absorção e metabolismo de sacarose regulada em oxigênio Uma cepa de catabolisando sacarose (Suc") de E. coli K-12 foi produzida por substituição do gene sodA nativo com o módulo de metabolismo de sacarose de E. coli 0157: H7 como mostrado na figura 3. Os genes foram rearranjados de sua configuração original dentro do módulo por inversão do gene cscB e colocando o mesmo em linha com cscK. O gene cscR foi omitido porque a região de promotor - operador foi substituída pelo promotor e elementos regulatórios do gene sodA. Deve-se notar que a cepa também deve ter sido produzida sem cscK, porque a atividade do produto de gene é redundante à do gene fruk de E. coli K-12. A cepa também pode ter sido produzida por introdução do módulo de metabolismo de sacarose em um plasmídeo ou no genoma sob o controle de um promotor separado, como sodA.

Os iniciadores 1 (Pl) e 2 (P2) foram projetados para amplificar tanto escK como escB como uma peça de 2,2 Kb única (figura 4b). A seqüência para Pl foi: 5'-CCCACGGAGTGGCTGTGCTGCAACAT GGAGCACTCTGGCTACTGGGTTAAGTCAGATGAATTTAAGGGAA-S' (SEQ ID NO: 1), que tem uma sobreposição de 50 bp com a extremidade 31 do gene cscA e de 20-bp da extremidade 5 ' do gene cscK incluindo a região do sítio de ligação de ribossoma (RBS) do gene cscK. A seqüência para P2 é: 5'-ΟΑΑΑΑ€€ΑΟΑΤΟΑΑΤΤΟΑΑΑΓΟΓΤΓτΤΤΤΤΑΤΤΤΤΤΑΤΓΓτΓτΑΤΓΛΤ TGTTTCTATATTGCTGAAGGTACAG-S' (SEQ ID NO: 2), que tem 50-bp da seqüência de extremidade 3' após a região de terminador sodA e 20-bp da extremidade 3' do gene cscB. Os iniciadores 3 e 4 foram projetados para amplificar esc A (1,4 kb) (Figura 4a) de DNA genômico 0157:H7. A seqüência para P4 é: 5 '-CT GCTT ACGCGGC ATT A AC A AT C GGC CGCCCGACAATACTGGAGATGAATATGACGCAATCTCGATTGCA-S' (SEQ ID NO: 4). que tem 50-bp da seqüência de promotor sodA incluindo o RBS. A seqüência para P3 é 5,-TTAACCCAGTAGCCAGAGTG-S’ (SEQ ID NO: 3), que corresponde à seqüência de extremidade 3' do gene cscA.

No primeiro ciclo de PCR para amplificar esc A ou cscKB, uma reação PCR de 50 μΐ foi realizada em um tubo contendo 100 ng 0157:H7 DNA genômico, 50 pmol de cada iniciador, 0,2 mM de dNTP e 2,5 U de Pfu polimerase. Para a amplificação de esc A, a reação passou por um 1 ciclo de 1 min a 95°C, 25 ciclos de 1 min de desnaturação a 95°C; 15 segundos de anelamento a 55°C; e 4 min de extensão a 72°C, então um ciclo final de 10 min de extensão a 72 °C . Para a amplificação cscKB, a reação passou pelos mesmos ciclos como acima exceto que a temperatura de anelamento foi de 48°C.

No segundo ciclo de reações PRC recombinante, uma quantidade molar igual de produtos cscA e cscKB foram misturados como gabaritos em uma reação de 50 μΐ contendo 50 pmol de cada iniciador, 0,2 mM dNTPs e 2,5 U de Pfu polimerase. A reação passou através de 1 ciclo de 5 min a 95°C, 5 ciclos de 30 segundos de desnaturação a 95°C; 30 segundos de anelamento a 65 °C, e 7,5 min de extensão a 72 °C, então 25 ciclos de 1 min de desnaturação a 95°C; 7,5 min de extensão a 72 °C e um final ciclo de 10 min de extensão a 72 °C . O produto resultante tinha o tamanho esperado de 3,7 kb (Figura 4c).

Os produtos PCR recombinantes continham 50-bp de seqüência de sodA 5', cscA, cscK, cscB, e 50 bp da seqüência de extremidade 3' após o terminador de sodA. Assim, o operon cscAKB de 0157:H7 foi colocado sob o controle do promotor sodA de MG 1655, para produzir MG 1655 sodA.csc. Os produtos PCR foram purificados e usados para a eíetroporação do mutante sodA::Tn5 de MG1 655, contendo o plasmídeo pKD46.As células MG1 655 não podem crescer em meio M9 contendo 1% sacarose como a única fonte de carbono, como mostrado na figura 5a. As células transformadas contendo o operon cscAKB, no entanto foram capazes de crescer no mesmo meio após 2 dias a 30 °C na presença de ampicilina (100 pg/ml concentração final), como mostrado na figura 5B. EXEMPLO 2 Metabolismo de sacarose regulada por oxigênio Invertase pode ser a enzima de "gargalo genético" através da qual o metabolismo de sacarose deve fluir. Como uma enzima citoplásmica, invertase pode mudar mais rapidamente do que uma proteína de membrana. Isto é importante na obtenção de uma rápida parada de função. De fato, a taxa de sua degradação pode s acelerada se necessário por etiquetas de ubiquitina e outras tais modificações. Em contraste, os níveis de cscB devem ser, improvavelmente, rapidamente regulados porque o symporter é uma proteína de membrana. Como resultado, os requerentes produziram a cepa Suc+ mostrada na figura 6. A construção provê um operon separado para controlar independentemente o cscB de symporter de sacarose usando um promotor lac. Como acima, o gene de frutoquinase (cscK) pode ser supérfluo.

Os iniciadores 4 e 5 foram projetados para amplificar cscA (1,4 kg) de DNA genômico 0157: H7. P4 foi o mesmo iniciador do exemplo l.A seqüência para P5 é: 5,-CAAAACCACATCAATTGAAACGCTGTTTTAT TTTTATCGGATCATTGTTTTTAA CCCAGTAGCCAGAGTG-3' (SEQ ID NO: 5). Assim o gene cscA gene é flanqueado por 50-bp de seqüências 5’ e 3’ de sodA (,sodAp-cscA-sodA). Iniciadores K5 e B3 foram projetados para amplificar ambos cscK e cscB em uma peca (2,2 Kb3 (Figura 7a). A seqíiênría para K5 é: S^GTAAGTCAGATGAATTTAAGGGAA-S’ (SEQ ID NO: 6), que inclui a região RBS do gene cscK. A sequência para B3 é: 5'-CT AT ATT GCTG A AGGT AC AGGCG T-3' (SEQ ID NO: 7), que tem 20-bp de extremidade 3' do gene cscB PCR foi realizado para amplificar esc A ou cscKB. Uma reação PCR de 50-ml foi realizada em um tubo contendo 100 ng 0157 DNA genomico, 50 pmol de cada iniciador, 0,2 mM dNTPs e 2,5 U de Pfu polimerase. A reação passou através de 1 ciclo de 1 min a 95°C, 25 ciclos de 1 min de desnaturação a 95°C; 15 segundos de anelamento a 55°C; e 4 min de extensão a 72° C, então um final ciclo de 10 min de extensão a 72 °C.

Quatro microlitros do produto cscKB foram clonados em um vetor pCR-Blunt (Invitrogen) como o sítio EcoRI, para criar pFDl. Assim, o produto cscKB é colocado sob o controle de um promotor Plac indutível. O fragmento Plac- cscKb - terminador de 2,7 kb foi excisado do plasmídeo por digestão Pvull e purificado com gel (figura 7b). Este fragmento foi sub-clonado no sítio Smal de pJW23, que contém um sítio atividade. O novo plasmídeo, chamado pFD6, foi então digerido com Notl, e o fragmento maior recuperado após purificação do gel. Este fragmento, contendo Plac- cscKb -terminador foi re-ligado para gerar pFD7. Os plasmídeos pFD7 e pJW289 foram co-transformados em mutante sodA ::Tn5 de MG1655 ou MDS42 (sem pKD46) para permitir a integração. O plasmídeo pJW289 foi curado depois como descrito previamente. O plasmídeo pKD46 foi introduzido de novo para o hospedeiro curado para recombinação. O produto PCR de sodÂp-cscA-sodAt foi então usado para transformar o novo hospedeiro para permitir a recombinação. As células transformadas foram colocadas em placas de meio M9 contendo 1 % sacarose como a única fonte de carbono. Os transformantes capazes de crescer no meio tem um fenótipo Suc+. EXEMPLO 3 Controle de metabolismo de sacarose por um promotor sensível a oxigênio e absorção de sacarose por repressor de sacarose para bactérias positivas para sacarose O terceiro exemplo conserva o CscR repressor de sacarose para controlar o nível de sacarose na célula em um modo normal para as cepas positivas para sacarose como 0157:H7. Este esquema é equivalente ao transplante do gene cscA da posição normal no operon de sacarose de 0157:H7 no operon sodA. Este método de controle pode ser o mais efetivo na regulação de acetato porque a poça de sacarose será fixada e a única função de controle é o nível de invertase, a enzima de "gargalo genético". O gene cscR é eliminado de seu esquema, o que resulta em transporte constitutivo de atividades de sacarose e ffutoquinase. Como acima, o gene sodA pode ser ou substituído por cscA ou combinado em série com cscA como mostrado na figura 8.

Os Iniciadores 4 e 5 foram projetados para amplificar cscA (1,4 kb) de 0157 DNA genômico. P4 e P5 foram descrito no exemplo 1. Assim, o gene cscA é flanqueado por 50-bp de seqüências 5’ e 3' de sodA. Iniciadores ProK5 e B3 foram projetados para amplificar ambos cscK e cscB em uma peça (2,2 Kb). A seqüência para ProK5 é: 5'-AAGAGGTTTATCACTAACATTTTG TG-3' (SEQ ID NO: 8), que inclui a região de promotor completa do gene cscK. A seqüência para B3 f oi a mesma como descrito acima. PCR foi realizado para amplificar cscProK-B (2,3 kb) (Figura 9a). A reação de PCR de 50-μ1 foi realizada em um tubo contendo 100 ng de DNA genômico 0157, 50 pmol de cada iniciador, 0,2 mM dNTPs e 2,5 U de Pfú polimerase. A reação passou através de 1 ciclo de 1 min a 95 °C, 25 ciclos de 1 min de desnaturação a 95°C; 15 segundos de anelamento a 55°C; e 4 min de extensão a 72° C, então um final ciclo de 30 min de extensão a 72°C.

Quatro microlitros do nroduto esc Prole-fí foram rlonarlo^ em um vetor pCR-Blunt (Invitrogen) para criar pFD8. O fragmento cscProK-B foi cortado como um fragmento IlindYW- Xba\ (2J kb) figura 9b) e sub-clonado em pJW23, que contém um sítio atividade. O novo plasmídeo pFD14 foi então cortado com Not\, e o fragmento maior recuperado após purificação do gei. Este fragmento, contendo o cscProK-B foi re-ligado para produzir PFD15. Os plasmídeos pFD15 e pJW289 foram co-transformados em um mutante sodAwTnS de MG1655 ou MDS42 (sem pKD46) par permitir a integração. Ambos os plasmídeos foram depois curados como descrito previamente. O plasmídeo pKD46 foi então introduzido de novo no hospedeiro curado.

Os produtos PCR de esc A foram então usados para transformar os novos hospedeiros acima para permitir a recombinação. As células transformadas foram colocadas em placas em meio M9 contendo 1% sacarose como a única fonte de carbono. Os transformantes capazes de crescer no meio tem um Suc+ fenótipo. EXEMPLO 4 Crescimento regulado por oxigênio de metabolismo de sacarose O crescimento dependente aeróbico de cepa MG 1655 sodA::csc de exemplo 1 foi examinado usando sacarose como a única fonte de carbono e energia e monitorando o crescimento em todo um ciclo aeróbico -anaeróbico - aeróbico. O ciclo foi iniciado por comutação do fermentador de ar a uma mistura de 95:5 de nitrogênio e dióxido de carbono, e então de volta a ar após um intervalo apropriado em fermentações elevadas ao ar de 500 ml. A figura 10 representa uma curva de crescimento típica da cepa em meio MOPS mínimo com 1% sacarose como a única fonte de carbono e energia. A falta de crescimento sob condições anaeróbicas indica que as células não foram mais capazes de catabolizar sacarose. Em contraste, o crescimento de MG1655 sodA::csc em glicose mais sacarose é relativamente inalterado por mudanças no gás espacial de topo. nnrnne o transporte de glicose e glicólise não são apenas afetados pelo estado aeróbico w~ ou anaeróbico da cultura. A figura 11 mostra os resultados de duas fermentações de reator Airlift, uma realizada em meio MOPS mínimo contendo 0,4% sacarose como a unida fonte de carbono e energia e uma realizada no mesmo meio suplementado com 0,2% glicose, além de 0,4% sacarose como a fonte de carbono e energia. A cepa não cresce em sacarose sob condições anaeróbicas, mas continuou a catabolizar glicose estivesse ou não oxigênio presente. Além dos gráficos de crescimento mostrados na figura 10 e 11 são confirmados pela observação de que as contagens de células viáveis globais não muda em toda a fase anaeróbica na sacarose somente a cultura, enquanto continuaram a aumentar quando a glicose exógena estava presente (mostrado na figura 12 A).

Isto indica que não se tem restrição bioquímica em glicólise e que glicose produzida a partir de sacarose (pela ação dos produtos de gene esc) pode suportar o crescimento anaeróbico se ele ocorreu. A falta de crescimento em sacarose sob condições anaeróbicas é assim devido à falta de transcrição dos genes esc a partir do promotor sodA dependente de oxigênio.

Além disso, os perfis de pH (figura 12B) demonstram que o crescimento em sacarose gera muito pouco ácido, enquanto a cultura contendo tanto sacarose como glicose produz uma quantidade grande de ácido. Isto também suporta a noção que pouco ou nenhum catabolismo de sacarose ocorre durante a fase anaeróbica da fermentação porque a assimilação anaeróbica de glicose é conhecida como gerando grandes quantidade de acetato e formato. A incapacidade da cultura de crescer em sacarose para produzir qualquer ácido durante o curso do deslocamento anaeróbico indica que pouca ou nenhuma glicose é disponível dentro da célula na ausência de oxigênio. EXEMPLO 5 Controle de sistema de carboidratos PTS por um promotor sensível a oxigênio A substituição dos promotores PTS nativos com o promotor sodA é ilustrada nas figuras 13 e 14. A construção desejada é produzida em trés etapas. A primeira etapa envolve a produção de dois produtos PCR separados compartilhando uma única seqüência homóloga com seus alvos cromossômicos em uma extremidade, assim como uma seqüência comum para permitir a fusão dos dois produtos PCR em extremidades opostas. O primeiro dos produtos PCR iniciais inclui 45 bases de seqüência homóloga à extremidade 3' do gene cysK, o gene completo de cloranfenicoi - acetil-transferase (CAT) mais seu promotor assim como uma seqüência de ligador de não codificação para prover homologia para o segundo produto PCR (descrito abaixo). O gene CAT é amplificado do plasmídeo pACYC184 usando um iniciador designado como Oligo 1 com a seqüência 5’- gcattgtttg ccgatctcttcactgagaaagaattgcaacagtaaTTACGCCCCGCCCTGCCACTCATCG -3' (SEQ ID NO: 9), onde a seqüência em letra minúscula é homóloga com a extremidade 3' do cysK e a seqüência em letra maiúscula é homóloga com a extremidade 3' do gene CAT. O segundo oligo nesta reação PCR é designado Oligo 3 com a seqüência 5'- acaaacctgaattttaagtccagtacctaCGACGCACTTTG CGCCGΑΛΤAAATACCTG-3' (SEQ ID NO: 10), onde a seqüência em letra minúscula é a seqüência de não codificação homóloga com o segundo produto PCR e a seqüência em letra maiúscula é homóloga com a extremidade 5' da região do pro CAT. Uma reação de 50 μΐ, PCR é realizada em um tubo contendo 1 ng pACYC184 DNA, 50 pmol de cada iniciador, 0,2 mM dNTPs e 2,5 U de Pfu polimerase. A reação passou através de 1 ciclo de 1 min a 95 °C, 30 ciclos de 1 min de desnaturação a 95°C; 15 segundos de anelamento a 55 °C ; e 2 min de extensão a 72° C, então um ciclo final de 10 min de extensão a 72 °C. O segundo dos produtos de PCR iniciais inclui uma seqüência de não codificação curta para prover homologia para o primeiro produto PPR o promotor sodA dependente de oxigênio intacto e 45 bases de seqüência homóloga à extremidade 5' do gene ptsH. A região de promotor sodA é amplificada do DNA cromossômico de E. coli usando um iniciador designado como Oligo 2 com a seqüência 5’-tgttttggacttaaaattcaggtcatggatAATGCG TCGACTCCTGCAAAACCATACCC T-3', (SEQ ID NO: 11), onde a seqüência em letra minúscula é a seqüência de não codificação homóloga com o primeiro produto PCR e a seqüência em letra maiuscula é homóloga com o lado 5' da região do promotor sodA do cromossomo de E. coli. O segundo oligo desta reação PCr é designado Oligo 4 com a seqüência 5-gggtgtgcagaccgttcggagcggtaatggtaacttcttgctggaaATATTCATCTCCAGTATT GTCGGG-3' (SEQ ID NO: 12), a seqüência em letra minúscula é homóloga com a extremidade 5' de ptsH e a seqüência em letra maiúscula é homóloga com o lado 3' do promotor sodA. Este oligo efetivamente substitui o códon de partida de sodA com o códon de partida de ptsH. Uma reação PCR de 50-μ1 é realizada em um tubo contendo 100 ng DNA MG 1655 de E. coli, 50 pmol de cada iniciador, 0,2 mM dNTPs e 2,5 U de Turbo Pfú. A reação passou através de 1 ciclo de 2 min a 95 °C, 30 ciclos de 1 min de desnaturação a 95 °C ; 15 segundos de anelamento a 55 °C, e 1 min de extensão a 72°C, então um final ciclo de 5 min de extensão a 72°C.

Os produtos PCR de cada reação são recuperados dos géis de agarose e purificados em colunas de purificação Qiagen antes de um segundo ciclo de PCR. Nesta reação, os dois primeiros produtos PCR do ciclo são desnaturados e deixados re-anelar antes da extensão. Uma reação de PCR de 50-μ1 foi realizada em um tubo contendo 5 ng de cada produto PCR de primeiro ciclo purificado, 0,2 mM dNTPs e 2,5 U de Pfú polimerase. A reação passa através de 1 ciclo de 2 min a 95°C, 10 ciclos de 1 min de desnaturação a 95°C; 15 segundos de anelamento a 55°C; e 1 min de extensão a 72°C. Após os primeiros 5 ciclos, 50 pmoles de Oligo 1 e Oligo 4 são íiHir-tnnqHnc rpflrnps f* 3¾ rparrÍPí çnrt r-ontinuadac nnr mai<s 7S rirloR i i j seguido por um ciclo final de 5 min de extensão a 72 °C. O produto PCR do * >' segundo ciclo é purificado usando uma coluna Qiagen e transformado em MG1 655 ou MDS42 contendo pKD46 para permitir a integração. Os integrantes estáveis são isolados como colônias resistentes a cloranfenicol. O plasmídeo pKD46 é curado como descrito previamente. EXEMPLO 6 Crescimento regulado em oxigênio de metabolismo de açúcar A regulação transcripcional do sistema de transporte de carboidrato PTS a partir dos promotores regulados em oxigênio reduz o papel que o sistema PTS desempenha no consumo de açúcar sob condições anaeróbicas. Apesar de glicose ou outros carboidratos poderem ainda ser absorvidos via sistemas não PCTS, as taxas de assimilação são muito reduzidas porque o sistema PTS representa a estratégia de absorção de açúcar de maior velocidade em E. coli. Um benefício adicional de ocasionar a expressão de genes ptsH e ptsl, que desempenham um papel comum em todos os sistemas PTS em E. coli, sob o controle de um promotor regulado em oxigênio mostra um ponto único de regulação para controlar o consumo de todos os açúcares PTS. Por analogia direta com o modelo de sacarose descrito nos exemplos anteriores, o crescimento de cepas de E. coli em outros açúcares pode ser limitado para corresponder mais intimamente com a disponibilidade de oxigênio como um receptor de elétrons terminal assim minimizando a produção de metabólitos em excesso pela célula engenheirada para uma ampla faixa de açúcares PTS.

REIVINDICAÇÕES

Claims (14)

1. Microorganismo, caracterizado pelo fato de ter um fluxo metabólico a partir de uma fonte de carbono regulada por níveis de oxigênio.

2. Microorganismo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o microorganismo é um procarioto.

3. Microorganismo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o procarioto é selecionado dentre o grupo consistindo de E. coli, Shigella, Salmonella, Corynebacter, Lactococcus e Streptomycetes.

4. Microorganismo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o microorganismo é um eucarioto.

5. Microorganismo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o eucarioto é uma levedura.

6. Microorganismo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a levedura é selecionada dentre o grupo consistindo de S. cerevisiae e S. pombe.

7. Microorganismo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a fonte de carbono é selecionada dentre o grupo consistindo de glicose, frutose, galactose, manose, sacarose, maltose, N-acetil glucosamina, β-glucosídeos, manitol, celobiose, sorbose, glucitol e galactitol.

8. Microorganismo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o microorganismo compreende um promotor regulado em oxigênio ligado operativamente a um gene codificando uma proteína de um sistema fosfotransferase dependente de fosfoenol piruvato.

9. Microorganismo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o microorganismo compreende um promotor regulado em oxigênio ligado operativamente a um gene codificando um rnAHiilr» Hp mptahnlicmn Hp «ar.amcí» Ol ^7*H7 Hp P nnli

10. Microorganismo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o gene codifica uma proteína de fusão compreendendo a proteína do sistema fosfotransferase dependente de fosfoenol piruvato e ubiquitina.

11. Microorganismo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o gene codifica uma proteína de fusão compreendendo a proteína de módulo de metabolismo de sacarose 0157:H7 de E. coli e ubiquitina.

12. Método para regular o fluxo metabóiico em um microorganismo caracterizado pelo fato de compreender cultivar o microorganismo da reivindicação 1 sob condições nutrientes apropriadas e concentrações de oxigênio para produzir um fluxo metabóiico desejado.

13. Método para reduzir a produção de metabólitos em excesso em microorganismo, caracterizado pelo fato de que compreende cultivar o microorganismo da reivindicação 1 sob condições nutrientes e sob concentrações de oxigênio abaixo, acima, ou em um nível de limiar de oxigênio, assim alterando o fluxo de carbono através de uma ou mais vias metabólicas que produz os referidos metabólitos em excesso.

14. Microorganismo caracterizado pelo fato de compreender um promotor sensível a oxigênio, referidos promotores capazes de regular o fluxo metabóiico de uma fonte de carbono através de uma ou mais vias metabólicas de referido microorganismo e em que referido promotor sensível a oxigênio é ligado operativamente a um gene heterólogo não naturalmente sob o controle transcripcional de referido promotor sensível a oxigênio.