BR102020000177A2

BR102020000177A2 - Método para produzir l-triptofano, método para produzir um micro-organismo que produz l-triptofano por transformação, micro-organismo que produz l-triptofano e seu uso

Info

Publication number: BR102020000177A2
Application number: BR102020000177-9A
Authority: BR
Inventors: Dr. Mechthild Rieping; Silke Jerrentrup; Dr. Nicole Dusch
Original assignee: Evonik Operations Gmbh
Priority date: 2019-01-07
Filing date: 2020-01-03
Publication date: 2020-12-15
Also published as: US20200216867A1

Abstract

método para produzir l- triptofano, método para produzir um micro-organismo que produz l-triptofano por transformação, micro-organismo que produz l-triptofano e seu uso. a invenção fornece um método para produzir l-triptofano, em que o método compreende cultivar um micro-organismo que produz l-triptofano que pertence à família enterobacteriaceae em um meio de fermentação; em que o micro-organismo que produz l-triptofano foi modificado intensificando-se o nível de expressão do gene mdfa ou por intensificação do nível de expressão de um alelo mdfa.

Description

MÉTODO PARA PRODUZIR L-TRIPTOFANO, MÉTODO PARA PRODUZIR UM MICRO-ORGANISMO QUE PRODUZ L-TRIPTOFANO POR TRANSFORMAÇÃO, MICRO-ORGANISMO QUE PRODUZ L-TRIPTOFANO E SEU USO

CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção refere-se a um método novo para a produção fermentativo de L-triptofano com o uso de um micro-organismo modificado da família Enterobacteriaceae, em que o nível de expressão do gene mdfA é intensificado.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] L-triptofano é usado na medicina humana e na indústria farmacêutica, na indústria alimentícia e em nutrição animal.

[003] L-triptofano pode ser produzido por fermentação de cepas de Enterobacteriaceae, especialmente Escherichia coli (E. coli) e Serratia marcescens. Devido à grande significância, o trabalho é constantemente feito na melhora de métodos de produção.

[004] As melhoras metodológicas podem se referir a medidas em relação à tecnologia de fermentação, como, por exemplo, fornecimento de agitação e oxigênio, ou a composição dos meios de nutriente, como, por exemplo, seleção do açúcar usado ou da concentração de açúcar durante a fermentação, ou o acúmulo para a formar de produto, por exemplo, por meio de uma cromatografia de troca iônica, ou as propriedades de desempenho intrínsecas do micro-organismo em si.

[005] Em cepas de tipo selvagem, os mecanismos reguladores estritos impedem produtos metabólicos, como aminoácidos, de serem produzidos em excesso em relação ao necessário pelas ditas cepas e de serem liberados no meio. A construção de cepas que produzem aminoácido em excesso necessita, portanto, de um ponto de vista do fabricante, que essas regulações metabólicas sejam superadas.

[006] Os métodos de mutagênese, seleção e escolha de mutantes são usados para remover os ditos mecanismos de controle que melhoram as propriedades de desempenho desses micro-organismos.

[007] Devido à complexidade da via de biossíntese de L-aminoácidos aromáticos, como L-triptofano e devido à interconexão do mesmo com muitas outras vias metabólicas na célula, nem sempre é possível para prever cujas variações genéticas ou modificações de uma cepa podem alcançar uma produção melhorada de L-triptofano.

[008] O transportador multifármaco MdfA é conhecido como uma bomba de efluxo acionada pela força motora de próton (Lewinson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (4) 1.667 a 1.672). Sua função adicional como um antiportador Na+/H+ e seu envolvimento na produção e acúmulo de aminoácidos, como L-lisina, L-arginina, L-treonina ou L-histidina, foi relatado no documento n° WO 2007/069782 A1. No mesmo, uma bactéria da família Enterobacteriaceae com nível de expressão aumentado de um gene selecionado a partir do grupo que consiste em nhaA, nhaB, nhaR, chaA, mdfA e combinações dos mesmos é revelada.

[009] Entretanto, o documento n° WO 2007/069782 A1 não se pronuncia a respeito da influência de um nível de expressão de mdfA intensificado em produtividade de L-triptofano.

[010] Em vista do supracitado, houve uma necessidade restante de otimizar adicional e especialmente aquelas cepas da família Enterobacteriaceae que é adequada para produzir L-triptofano, e fornecer métodos melhorados para a produção fermentativa de L-triptofano, com o uso desses micro-organismos da família Enterobacteriaceae. Adicionalmente, foi particularmente desejável estabelecer técnicas novas que possibilitam a modulação do nível de expressão de genes envolvidas em processos de transporte de compostos aromáticos, como toxicidade causada por (até mesmo baixas quantidades de) derivados de aminoácido aromático e intermediários necessita de sistemas de transporte eficazes. Entretanto, os níveis de expressão de gene devem ser adaptados às necessidades específicas da abundância de proteínas transportadoras na membrana celular sem afetar o ajuste celular e capacidades de produção gerais.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[011] A presente invenção fornece um método para produzir L-triptofano, em que o método compreende cultivar um micro-organismo que produz L-triptofano que pertence à família Enterobacteriaceae em um meio de fermentação; em que o microorganismo que produz L-triptofano foi modificado intensificando-se o nível de expressão do gene mdfA ou por intensificação do nível de expressão de um alelo mdfA.

[012] Adicionalmente, a presente invenção se refere a um método para produzir um micro-organismo que produz L-triptofano por transformação, transdução ou conjugação, em que a transformação, transdução ou conjugação é feita com o uso de um vetor que compreende

a) uma sequência de polinucleotídeo que compreende a sequência de nucleotídeo da SEQ ID NO.: 1;
b) um polinucleotídeo que hibridiza com uma fita complementar da SEQ ID NO.: 1 sob condições estringentes;
c) uma forma polimórfica ou mutante de ocorrência natural de um polinucleotídeo de acordo com a) ou b);
d) um polinucleotídeo que tem uma identidade de sequência de pelo menos 80% da sequência de nucleotídeo da SEQ ID NO.: 1;
e) um polinucleotídeo incluindo substituições, deleções, inserções ou adições de 1 a 60 nucleotídeos em relação à sequência de nucleotídeo da SEQ ID NO.:1;
f) um polinucleotídeo que codifica uma proteína que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO.: 2;
g) um polinucleotídeo que codifica uma proteína que compreende uma sequência de aminoácidos que inclui substituição, deleção, inserção ou adição de 1 a 20 aminoácidos na SEQ ID NO.: 2;

e que compreende um promotor que regula a expressão de polinucleotídeos a) a g).

[013] Além disso, a invenção fornece um micro-organismo que produz L- triptofano da família Enterobacteriaceae, em que o micro-organismo foi modificado intensificando-se o nível de expressão do gene mdfA ou intensificando-se o nível de expressão de um alelo mdfA.

[014] Finalmente, a invenção é direcionada ao uso do micro-organismo supracitado para produzir L-triptofano ou, alternativamente, para produzir um aditivo alimentício que contém L-triptofano.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[015] No trabalho de formar a base da presente invenção, foi surpreendentemente constatado que a produtividade de L-triptofano em uma cepa que produz L-triptofano da família Enterobacteriaceae pode ser significativamente aumentada modulando-se o nível de expressão do gene mdfA ou modulando-se o nível de expressão de um alelo mdfA, respectivamente de maneira apropriada.

[016] Mais especificamente, a presente invenção fornece um método para produzir L-triptofano, em que o método compreende cultivar um micro-organismo que produz L-triptofano que pertence à família Enterobacteriaceae em um meio de fermentação; em que o micro-organismo que produz L-triptofano foi modificado intensificando-se o nível de expressão do gene mdfA ou por intensificação do nível de expressão de um alelo mdfA.

[017] Por questões de clareza e completude, a região de codificação do gene mdfA é representada na SEQ ID NO.: 1. A sequência de aminoácidos de MdfA é representada na SEQ ID NO.: 2.

[018] Um alelo é uma variante de um dado gene.

[019] O alelo mdfA de acordo com a presente invenção pode ser um polinucleotídeo selecionado a partir do grupo que consiste em:

a) uma sequência de polinucleotídeo que compreende a sequência de nucleotídeo da SEQ ID NO.: 1;
b) um polinucleotídeo que hibridiza com uma fita complementar da SEQ ID NO.: 1 sob condições estringentes;
c) uma forma polimórfica ou mutante de ocorrência natural de um polinucleotídeo de acordo com a) ou b);
d) um polinucleotídeo que tem uma identidade de sequência de pelo menos 80%, pelo menos 85%, ou pelo menos 90%, preferencialmente pelo menos 95% da sequência de nucleotídeo da SEQ ID NO.: 1;
e) um polinucleotídeo incluindo substituições, deleções, inserções ou adições de 1 a 60 nucleotídeos em relação à sequência de nucleotídeo da SEQ ID NO.: 1;
f) um polinucleotídeo que codifica uma proteína que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO.: 2;
g) um polinucleotídeo que codifica uma proteína que compreende uma sequência de aminoácidos que inclui substituição, deleção, inserção ou adição de 1 a 20 aminoácidos na SEQ ID NO.: 2.

[020] Os termos "que intensifica” ou "intensificado” ou "superexpresso” ou "nível de expressão aumentado”, "nível de expressão intensificado” ou "superexpressão” são usados de modo intercambiável nesse texto e têm significado similar. Estes termos, nesse contexto, descrevem o aumento na atividade intracelular de uma atividade enzimática que é codificada pelo DNA correspondente, por exemplo, aumentando-se o número de cópias do gene, com o uso de um promotor mais forte ou com o uso de um alelo com atividade aumentada e possivelmente combinando-se essas medidas.

[021] O nível de expressão do gene mdfA ou do alelo mdfA pode ser intensificado aumentando-se o número de cópia do gene ou alelo em pelo menos 1.

[022] Para aumentar o nível de expressão de um gene/alelo, as cópias de genes/alelos são preferencialmente adicionadas de modo cromossômico. De modo cromossômico, podem haver uma ou diversas cópias extras no genoma que podem ser introduzidas por métodos de recombinação conhecidos pelo indivíduo versado na técnica. Os genes extracromossômicos podem ser portados por tipos diferentes de plasmídeos ou cromossomos artificiais bacterianos que diferem em relação à sua origem de replicação e, desse modo, seu número de cópia na célula. Os mesmos podem estar presentes como 1 a 5 cópias, em torno de 20 ou até 500 cópias, correspondentes a plasmídeos de número de cópia baixo com replicação estreita, plasmídeos de número de cópia baixo, ou plasmídeos de número de cópia alto.

[023] O número de cópia do gene mdfA ou do alelo mdfA pode ser aumentado em pelo menos 1 integrando-se o gene ao cromossomo do micro-organismo.

[024] O nível de expressão do gene mdfA ou do alelo mdfA também pode ser intensificado modificando-se a sequência reguladora de expressão do gene. Conforme indicado antes, o gene mdfA ou alelo mdfA pode ser combinado com um promotor mais forte. Esses promotores podem ser induzíveis; os mesmos podem ser homólogos ou heterólogos. O indivíduo versado na técnica sabe quais promotores são os mais convenientes.

[025] Quando os genes são organizados em um operon, é possível intensificar seu nível de expressão adicionando-se uma cópia suplementar desses genes sob o controle de um promotor único. A expressão também pode ser intensificada substituindo-se o promotor de tipo selvagem cromossômico com um promotor artificial mais forte do que o promotor de tipo selvagem. O especialista no campo sabe como determinar a força de promotor.

[026] Os micro-organismos de acordo com a presente invenção e usados no método de acordo com a presente invenção, respectivamente, são representativos da família Enterobacteriaceae, selecionada a partir dos gêneros Escherichia, Erwinia e Providencia. O gênero Escherichia é preferencial. A espécie Escherichia coli deve ser mencionada em particular. Preferencialmente, um micro-organismo que tem uma expressão aumentada do operon Trp é usado.

[027] Os inventores constataram surpreendentemente que uma produtividade de L-triptofano particularmente forte pode ser alcançada em uma cepa de produção de L-triptofano dos Enterobacteriaceae, em particular, de Escherichia coli, caso o gene mdfA ou o alelo mdfA seja integrado em loci cromossômicos ou extracromossômicos específicos. Mais especificamente, os inventores constataram que, com o uso dos loci cromossômicos ou extracromossômicos específicos para a integração de mdfA possibilita a modulação do nível de expressão de mdfA de maneira que melhora a capacidade de produção fermentativa de L-triptofano quando concentrações comercialmente relevantes se acumulam no caldo de fermentação.

[028] Conforme usado no contexto da presente invenção, o termo "modulação de nível de expressão” se refere a definir um nível de expressão equilibrado que leva a um rendimento otimizado do produto de aminoácido (L-triptofano).

[029] A expressão de um gene integrado estável é fortemente influenciada por sequências reguladoras no ambiente cromossômico do sítio de integração, por exemplo, efeitos combinados do códon de iniciação e as regiões de flanqueamento foram descritas (Stenstrom et al., Gene 273(2):259 a 265 (2001); Hui et al., EMBO Journal 3(3):623 a 629 (1984)).

[030] Em uma modalidade, uma cópia do gene mdfA ou do alelo mdfA com sinais de expressão nativos é integrada no lócus mtr cromossômico, em que o gene mtr é deletado simultaneamente. Preferencialmente, o promotor mtr permanece intacto, conforme indicado na SEQ ID NO.: 25, isto é, as regiões de flanqueamento regulam provavelmente a expressão do gene mdfA ou do alelo mdfA.

[031] Além de ou como alternativa ao acima, uma cópia do gene mdfA ou do alelo mdfA pode ser integrada no lócus de aroP cromossômico, em que o gene aroP é deletado simultaneamente. Preferencialmente, o promotor aroP permanece intacto, isto é, as regiões de flanqueamento regulam provavelmente a expressão do gene mdfA ou do alelo mdfA.

[032] Consequentemente, o nível de expressão de mdfA pode ser adaptado para as necessidades específicas da abundância de proteínas MdfA na membrana celular usando-se loci de integração diferentes, devido ao fato de que as sequências reguladoras das regiões de flanqueamento podem ter impacto.

[033] Os micro-organismos de acordo com a invenção e usados no método da presente invenção, respectivamente, podem ser produzidos com o uso dos métodos descritos acima para transformação, transdução ou conjugação. Preferencialmente, a transformação, transdução ou conjugação é feita com o uso de um vetor que compreende

a) uma sequência de polinucleotídeo que compreende a sequência de nucleotídeo da SEQ ID NO.: 1;
b) um polinucleotídeo que hibridiza com uma fita complementar da SEQ ID NO.: 1 sob condições estringentes;
c) uma forma polimórfica ou mutante de ocorrência natural de um polinucleotídeo de acordo com a) ou b);
d) um polinucleotídeo que tem uma identidade de sequência de pelo menos 80%, pelo menos 85%, ou pelo menos 90%, preferencialmente pelo menos 95% da sequência de nucleotídeo da SEQ ID NO.: 1;
e) um polinucleotídeo incluindo substituições, deleções, inserções ou adições de 1 a 60 nucleotídeos em relação à sequência de nucleotídeo da SEQ ID NO.: 1;
f) um polinucleotídeo que codifica uma proteína que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO.: 2;
g) um polinucleotídeo que codifica uma proteína que compreende uma sequência de aminoácidos que inclui substituição, deleção, inserção ou adição de 1 a 20 aminoácidos na SEQ ID NO.: 2;

[034] Para produzir as cepas inventivas da família Enterobacteriaceae, a preferência é dada com o uso de cepas (cepas iniciais ou cepas parentais) que já tem a capacidade de enriquecer L-triptofano na célula e/ou de secretar a mesma no meio de nutriente que circunda a célula ou acumula a mesma no caldo de fermentação. A expressão “produzir’ também pode ser usada para isso.

[035] Mais particularmente, as cepas usadas para as medidas da invenção têm a capacidade para enriquecer ou de acumular na célula e/ou no meio de nutriente ou o caldo de fermentação ≥ (pelo menos) 0,25 g/l, ≥ 0,5 g/l, ≥ 1,0 g/l, ≥ 1,5 g/l, ≥ 2,0 g/l, ≥ 4 g/l, ≥ 10 g/l, ≥ 20 g/l, ≥ 30 g/l ou ≥ 50 g/l de L-triptofano, em ≤ (no máximo) 120 horas, ≤ 96 horas, ≤ 48 horas, ≤ 36 horas, ≤ 24 horas ou ≤ 12 horas. Aqui, as cepas podem ser cepas que foram produzidas por mutagênese e seleção, por técnicas de DNA recombinantes ou por uma combinação de ambos os métodos.

[036] Os micro-organismos preferencialmente recombinantes que contêm a sequência de nucleotídeo de acordo com a presente invenção podem produzir L-triptofano, a partir de glicose, sacarose, lactose, frutose, maltose, melaço, possivelmente amido, possivelmente celulose ou de glicerol e etanol, também possivelmente a partir de misturas.

[037] Os exemplos de cepas do gênero Escherichia, em particular, da espécie Escherichia coli, que são adequados para a cepa parental e produzem ou secretam L-triptofano são:

- Escherichia coli SV164(pGH5) (documento n° WO 94/08031)
- E. coli AGX17(pGX44) (NRRL B-12263) (documento n° US 4.371.614)
- E. coli AGX6(pGX50)aroP (NRRL B-12264) (documento n° US 4.371.614)
- Escherichia coli AGX17/pGX50,pACKG4-pps (documento n° WO 97/08333)
- Escherichia coli ATCC 31743 (documento n° CA 1182409)
- E. coli C534/pD2310,pDM136 (ATCC 39795) (documento n° WO8 7/01130)
- Escherichia coli JB102/p5LRPS2 (documento n° US 5.939.295).

[038] Cepas que produzem L-triptofano ou que secretam L-triptofano da família Enterobacteriaceae têm, preferencialmente, inter alia, um ou mais dos recursos genéticos ou fenotípicos selecionados a partir do grupo que consiste em: resistência a 5-metil-DL-triptofano, resistência a 5-fluoro-triptofano, resistência a 4-metil-DL-triptofano, resistência a 6-metil-DL-triptofano, resistência a 4-fluoro-triptofano, resistência a 6-fluoro-triptofano, resistência a antranilato, resistência a triptazano, resistência a indol, resistência a ácido indolacrílico, necessidade por fenilalanina, necessidade por tirosina, possivelmente capacidade para utilização de sacarose, intensificação do operon de triptofano, preferencialmente antranilato sintase, preferencialmente a forma resistente à retroalimentação, uma triptofanil-tRNA sintase parcialmente defeituosa, uma ingestão de triptofano atenuada, uma triptofanase defeituosa, proteínas repressoras desativadas, intensificação de biossíntese de serina, intensificação de síntese de fofenolpiruvato, intensificação de síntese de D-eritrose 4-fosfato, intensificação de síntese de 3-desoxi-D-arabino-heptulosonato 7-fosfato (DHAP), intensificação de biossíntese de corismato.

[039] Adicionalmente, para a produção de L-triptofano com cepas da família Enterobacteriaceae, pode ser vantajoso intensificar adicionalmente uma ou mais enzimas das vias de biossíntese conhecidas ou enzimas de metabolismo anapletórico ou enzimas para a produção de fosfato de dinucleotídeo de nicotinamida adenina reduzidas ou enzimas de glicólise ou enzimas PTS ou enzimas de metabolismo de enxofre. O uso de genes endógenos é geralmente preferencial.

[040] Adicionalmente, para a produção de L-triptofano, pode ser vantajoso desligar adicionalmente as reações secundárias indesejáveis (Nakayama: "Breeding of Amino Acid Producing Microorganisms”, em: Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic Press, Londres, RU, 1982).

[041] De acordo com o supracitado, a presente invenção fornece adicionalmente um micro-organismo que produz L-triptofano da família Enterobacteriaceae, em que o micro-organismo foi modificado intensificando-se o nível de expressão do gene mdfA ou intensificando-se o nível de expressão de um alelo mdfA.

[042] E m uma modalidade, o alelo mdfA é um polinucleotídeo selecionado a partir do grupo que consiste em:

[043] Para intensificar a expressão de mdfA, o gene/alelo mdfA é preferencialmente integrado ao lócus mtr cromossômico. Em uma modalidade específica, uma cópia do gene mdfA ou do alelo mdfA é integrada no lócus mtr com deleção simultânea do gene mtr. Opcionalmente, o ambiente cromossômico do lócus mtr permanece intacto e regula a expressão do gene mdfA ou do alelo mdfA integrado ao lócus mtr.

[044] O micro-organismo supracitado que produz L-triptofano pode ser usado para produzir L-triptofano ou, alternativamente, para produzir um aditivo alimentício que contém L-triptofano.

[045] Os micro-organismos, de acordo com a invenção e usados no método de acordo com a presente invenção, são respectivamente cultivados no processo de batelada, no processo alimentado por batelada, no processo alimentado por batelada repetido ou em um processo contínuo (documento n° DE102004028859.3 ou n° US 5.763.230). As vistas gerais de tais processo estão disponíveis no livro de Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik [Bioprocess technology 1. Introduction to bioprocess technology] (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) ou no livro de Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen [Bioreactors and peripheral devices] (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)).

[046] No caso de um processo de batelada, todos os materiais iniciais, com algumas exceções, como oxigênio e agente de correção de pH, por exemplo, são inicialmente carregados na forma de uma batelada e o micro-organismo é cultivado no meio obtido.

[047] No caso de um processo alimentado por batelada, o micro-organismo é inicialmente cultivado por meio de um processo de batelada (fase de batelada). Isso é seguido adicionando-se o mesmo à cultura de maneira contínua ou descontínua um material inicial essencial para a produção do produto, adicionalmente, múltiplos materiais iniciais, se necessário (fase de alimentação).

[048] No caso de um processo alimentado por batelada repetido, o que é envolvido é um processo alimentado por batelada em que, após a completação de fermentação, uma porção do caldo de fermentação obtido serve como uma inoculação para começar um processo alimentado por batelada repetido fresco. Esse ciclo pode ser repetido múltiplas vezes se necessário. Os processos alimentados por batelada repetidos são, por exemplo, descritos no documento n° WO 02/18543 e WO 05/014843.

[049] No caso de um processo contínuo, uma batelada ou processo alimentado por batelada é seguido adicionando-se continuamente um ou mais, possivelmente todos, materiais iniciais à cultura e removendo-se simultaneamente o caldo de fermentação. Os processos contínuos são, por exemplo, descritos nos relatórios descritivos das patentes n° US 5.763.230, WO 05/014840, WO 05/014841 e WO 05/014842. O meio de cultura deve satisfazer as demandas das cepas particulares de maneira adequada. Os meios de cultura de micro-organismos diferentes são descritos no livro "Manual of Methods for General Bacteriology” do American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981). Os termos meio de cultura, meio de fermentação e meio de nutrientes ou meio são intercambiáveis.

[050] Em geral, um meio de cultura contém, inter alia, uma ou mais fontes de carbono, fontes de nitrogênio e fontes de fósforo.

[051] É possível usar, como fonte de carbono, açúcares e carboidratos, como, por exemplo, glicose, sacarose, lactose, frutose, maltose, melaço, amido e possivelmente celulose, óleos e gorduras como, por exemplo, óleo de soja, óleo de girassol, óleo de amendoim e gordura de coco, ácidos graxos, como, por exemplo, ácido palmítico, ácido esteárico e ácido linoleico, álcoois, como, por exemplo, glicerol e etanol e ácidos orgânicos como, por exemplo, ácido acético. Essas substâncias podem ser usadas individualmente ou como uma mistura.

[052] É possível usar, como fonte de nitrogênio, compostos que contêm nitrogênio orgânico, como peptonas, extrato de levedura, extrato de carne, extrato de malte, licor de milho, farinha de soja e ureia, ou compostos inorgânicos, como sulfato de amônio, cloreto de amônio, fosfato de amônio, carbonato de amônio e nitrato de amônio. As fontes de nitrogênio podem ser usadas individualmente ou como uma mistura.

[053] É possível usar, como fonte de fósforo, ácido fosfórico, di-hidrogenofosfato de potássio ou hidrogenofosfato de dipotássio ou os sais que contêm sódio correspondentes.

[054] Adicionalmente, o meio de cultura deve conter sais de metais, como sulfato de magnésio ou sulfato de ferro, por exemplo, que são necessários para crescimento. Finalmente, as substâncias de crescimento essenciais, como aminoácidos e vitaminas, podem ser usadas além das substâncias mencionadas acima. Ademais, os precursores adequados podem ser adicionados ao meio de cultura. Os materiais iniciais supracitados podem ser adicionados à cultura na forma de uma batelada única ou serem apropriadamente alimentados durante o cultivo.

[055] A fermentação é geralmente executada a um pH de 5,5 a 9,0, mais particularmente de 6,0 a 8,0.

[056] Para controlar o pH da cultura, o uso apropriado é feito de compostos básicos, como hidróxido de sódio, hidróxido de potássio, amônia ou amônia aquosa ou compostos ácidos, como ácido fosfórico ou ácido sulfúrico. Para controlar a evolução de espuma, é possível usar antiespumas, como, por exemplo, ésteres de poliglicol de ácido graxo. Para manter a estabilidade de plasmídeos, é possível adicionar ao meio substâncias seletivas adequadas, por exemplo, antibióticos. Para manter condições aeróbicas, oxigênio ou misturas de gás oxigênio, como, por exemplo, ar ser introduzido na cultura.

[057] A temperatura da cultura é normalmente de 25 °C a 45 °C e preferencialmente de 30 °C a 40 °C. A atividade dos micro-organismos leva a um enriquecimento ou acúmulo de L-triptofano no caldo de fermentação ou cultura. A cultura é continuada até um máximo de L-triptofano tenha se formado. Esse alvo é normalmente alcançado em 10 horas a 160 horas. Em processos contínuos, os tempos de cultivo mais longos são possíveis.

[058] Um caldo de fermentação ou caldo de cultura é entendido como um meio de fermentação em que um micro-organismo foi cultivado por um certo tempo e a uma certa temperatura. Na completação da fermentação, o caldo de fermentação resultante compreende consequentemente a) a biomassa (= massa de célula) do micro-organismo que surge como resultado da propagação das células do microorganismo, b) o L-aminoácido (L-triptofano) formado durante a fermentação, c) os subprodutos orgânicos formados durante a fermentação e d) os constituintes do meio/meios de fermentação usados ou dos materiais iniciais que não são consumidos pela fermentação, como, por exemplo, vitaminas, como tiamina ou sais, como sulfato de magnésio.

[059] O caldo de cultura ou caldo de fermentação produzido pode ser, então, coletado e o L-triptofano ou o produto que contém L-triptofano pode ser obtido ou isolado. Em uma variante de método, o caldo de fermentação é concentrado, se necessário, e, então, o L-triptofano é purificado ou é isolado em uma forma pura ou virtualmente pura. Os métodos típicos para purificar L-aminoácidos, como L-triptofano são cromatografia de troca iônica, cristalização, métodos de extração e tratamento com carbono ativado. O que é obtido como resultado é L-triptofano grandemente puro que tem um teor de ≥ 90% em peso, ≥ 95% em peso, ≥ 96% em peso, ≥ 97% em peso, ≥ 98% em peso ou ≥ 99% em peso.

[060] Em outra variante de método, é possível, de modo semelhante, produzir um produto do caldo de fermentação produzido, removendo-se a biomassa de bactéria presente no caldo de fermentação a uma extensão completa (100%) ou a uma extensão virtualmente completa, isto é, mais do que ou maior do que (>) 90%, >95%, >97%, >99%, e deixando-se no produto os constituintes restantes do caldo de fermentação a uma grande extensão, isto é, a uma extensão de 30% a 100%, 40% a 100%, 50% a 100%, 60% a 100%, 70% a 100%, 80% a 100%, ou 90% a 100%, preferencialmente maior do que ou igual a (≥) 50%, ≥60%, ≥70%, ≥80%, ≥90% ou ≥95%, ou até mesmo a uma extensão completa (100%).

[061] A biomassa é removida ou separada usando-se os métodos de separação, como, por exemplo, centrifugação, filtração, decantação, floculação ou uma combinação dos mesmos. O caldo obtido é, então, espessado ou concentrado com o uso de métodos conhecidos, como, por exemplo, com o auxílio de um evaporador giratório, evaporador de filme fino, evaporador de filme descendente, por osmose reversa, por nanofiltração ou uma combinação dos mesmos.

[062] Esse caldo concentrado é, então, acumulado por métodos de secagem por congelamento, de secagem por aspersão, de granulação por aspersão ou por outros processos para gerar um pó fino preferencialmente de fluxo livre. Esse pó fino de fluxo livre pode ser, por sua vez, convertido em compactação adequada ou processos de granulação em um produto grosso, altamente de fluxo livre, armazenável e substancialmente livre de poeira. Aqui, a água é removida ao todo a uma extensão de mais do que 90%, e de modo que o teor de água no produto seja menos do que 10% em peso, menos do que 5% em peso, menos do que 4% em peso ou menos do que 3% em peso.

[063] A análise de L-triptofano para determinar a concentração em uma ou mais vezes durante a fermentação pode ser efetuada separando-se o L-triptofano por meio de cromatografia de troca iônica, preferencialmente cromatografia de troca catiônica, com derivação pós-coluna subsequente com o uso de ninidrina, conforme descrito em Spackman et al. (Analytical Chemistry 30: 1.190 a 1.206 (1958)). Também é possível empregar ortoftalaldeído em vez de ninidrina para derivação pós-coluna. Um artigo de vista geral sobre cromatografia de troca iônica pode ser encontrado em Pickering (LC·GC (Magazine of Chromatographic Science) 7(6), 484 a 487 (1989)).

[064] De modo semelhante, é possível executar uma derivação pré-coluna, por exemplo, com o uso de ortoftalaldeído ou isotiocianato de fenila, e para fracionar os derivados de aminoácido resultantes por cromatografia de fase reversa (RP), preferencialmente na forma de cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC). Tal método é, por exemplo, descrito em Lindroth et al. (Analytical Chemistry 51: 1.167 a 1.174 (1979)). A detecção é executada fotometricamente (absorção, fluorescência).

[065] O processo e o micro-organismo de acordo com a invenção são usados para preparar de modo fermentativo o L-triptofano.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
Figura 1: Mapa do vetor pKO3DaroP de substituição que contém fragmento de deleção DaroP
Figura 2: Mapa do vetor pKO3DaroP::mdfA de substituição que contém o gene mdfA
Figura 3: Mapa do vetor pKO3Dmtr de substituição que contém fragmento de deleção Dmtr
Figura 4: Mapa do vetor pKO3Dmtr::mdfA de substituição que contém o gene mdfA
Figura 5: Mapa do plasmídeo pMU91

[066] Os comprimentos especificados devem ser entendidos como aproximações. Os significados das abreviações e designações usadas são conforme o seguinte:

• CmR: Gene de resistência a cloranfenicol
• sacB: gene sacB de Bacillus subtilis
• RepA: Região de replicação sensível à temperatura do plasmídeo pSC101
• pdhR': Parte da região de codificação do gene pdhR
• mdfA: Região de codificação do gene mdfA
• 'ampE: Parte da região de codificação do gene ampE
• 'yhbW: Parte da região de codificação do gene yhbW
• 'deaD: Parte da região de codificação do gene deaD
• pSC101: Fragmento de plasmídeo pSC101
• serA: Região de codificação do gene serA que codifica D-3-fosfoglicerato desidrogenase
• trpE476DCBA: Parte do operon de triptofano trpLEDCBA com alelo trpE476
• tetA: Gene resistência à tetraciclina

[067] Os significados das abreviações para as enzimas de restrição são conforme o seguinte

• SalI: Endonuclease de restrição de Streptomyces albus G
• HindIII: Endonuclease de restrição de Haemophilus influenzae Rd
• XhoI: Endonuclease de restrição de Xanthomonas holcicola

[068] Os detalhes adicionais podem ser encontrados nos exemplos.

[069] A seguir, a invenção é ilustrada por exemplos não limitantes e modalidades exemplificativas.

EXEMPLOS

[070] Meios mínimos (M9) e completos (LB) usados para Escherichia coli são descritos por J.H. Miller (A Short Course in Bacterial Genetics (1992), Cold Spring Harbor Laboratory Press). O isolamento de DNA de plasmídeo de Escherichia coli e todas as técnicas para digestão de restrição, ligação, tratamento de Klenow e tratamento de fosfatase alcalina são executados de acordo com Sambrook et al. (Molecular Cloning - A Laboratory Manual (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press). A menos que descrito de outro modo, a transformação de Escherichia coli é executada de acordo com Chung et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, EUA (1989) 86: 2.172 a 2.175).

[071] A menos que descrito de outro modo, a temperatura de incubação na produção de cepas e transformantes é 37 °C.

EXEMPLO 1 CONSTRUÇÃO DO VETOR DE SUBSTITUIÇÃO pKO3DaroP

[072] Os flancos de deleção para a deleção de aroP são amplificados com o uso da reação em cadeia da polimerase (PCR) e o fragmento de deleção foram produzidos por PCR de sobreposição. Continuando a partir da sequência de nucleotídeo do gene aroP em E. coli K-12 MG1655 (número de acesso NC_000913.3, região: 120178121551, Blattner et al. (Science 277: 1.453 a 1.462 (1997)) e das regiões de flanqueamento, os iniciadores de PCR são sintetizados (Eurofins Genomics GmbH (Ebersberg, Alemanha)). Os iniciadores são projetados de modo que um gene aroP inteiro seja deletado.
PROJETO DE INICIADOR E PCR DOS DOIS FLANCOS
FLANCO 1
aroP-up1 5” GATCTGAGCTCTAGACCTGGCGACGAAGCAACAAG 3”
XbaI SEQ ID NO.: 3
aroP-up6 5” GCGTTGGTGTAATCGCGAACCTCGTGCGGTGGTTGTT 3” NruI SEQ ID NO.: 4

[073] O DNA de E. coli MG1655 cromossômico usado para a PCR é isolado com o uso do Kit QIAGEN DNeasy Blood & Tissue (QIAGEN GmbH, Hilden, Alemanha) de acordo com as informações do fabricante. Com o uso dos iniciadores específicos “aroP-up1” e “aroP-up6”, a amplificação de PCR é executada sob condições de PCR padrão (Innis et al.: PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, 1990, Academic Press) com o uso da DNA Polimerase Phusion (Thermo Fisher Scientific, Wattham, MA USA) com DNA de MG1655 como modelo para amplificar o fragmento “aroP-Flank1” (comprimento: 775 bp). Por meio dos iniciadores, um sítio de restrição Nrul e um Xbal são inseridos no produto de PCR.
FLANCO 2
aroP-down2 5” GATCTATCTAGACTGTTACGCGCATTGCAGG 3”
Xbal SEQ ID NO.: 5
aroP-down3 5” ACCGCACGAGGTTCGCGATTACACCAACGCCCCGTAAATCG 3”
NruI SEQ ID NO.: 6

[074] Com o uso dos dois iniciadores “aroP-down2” e “aroP-down3”, a PCR é executada com DNA de MG1655 como modelo para amplificar o fragmento “aroP-Flank2” (comprimento: 717 bp). Por meio dos iniciadores, um sítio de restrição Nrul e um Xbal são inseridos no produto de PCR.

FUSÃO DOS DOIS FLANCOS POR PCR DE SOBREPOSIÇÃO

[075] Os dois flancos são usados juntos por meio de suas regiões de sobreposição por meio de um PCR de sobreposição com o uso dos dois iniciadores externos “aroP-up1” e “aroP-down2”. O produto resultante “aroP-Del-Fragmento” tem um comprimento de 1.462 bp. As sequências de reconhecimento para a enzima de restrição XbaI são em ambas as extremidades.

CLONAGEM DO INSERTO EM pKO3

[076] O produto de fusão acima é purificado com o uso do Kit de Purificação de PCR Qiaquick (QIAGEN GmbH, Hilden, Alemanha) e, então, digerido com o uso de XbaI. Isso gera “extremidades fixas” de XbaI. O material digerido é purificado novamente com o uso do Kit de Purificação de PCR Qiaquick, e isso também resulta nas sequências de corte curto sendo removidas.

[077] O vetor pKO3 é cortado de modo semelhante com o uso de XbaI e simultaneamente desfosforilado com o uso de fosfatase alcalina. Após isso, o material digerido é purificado com o uso do Kit de Purificação de PCR Qiaquick, e isso também resulta no fragmento curto entre os sítios de XbaI removidos. O produto de restrição tem, de modo semelhante, “extremidades fixas” XbaI. Os mesmos são não fosforilados, o que impede uma autoligação do plasmídeo.

[078] A ligação é executada usando-se T4 ligase para ligar o vetor e inserto na razão molar de 1:3. As células quimicamente competentes da cepa de clonagem E. coli NEB5alpha são transformadas com o uso de 1 μl da reação de ligação e espalhados em ágar LB que contém cloranfenicol 20 mg/l. As placas são incubadas a 30 °C por 40 h.

VERIFICAÇÃO DOS CLONES DE PLASMÍDEO

[079] A clonagem bem-sucedida é verificada por clivagem do plasmídeo pKO3DaroP com o uso da enzima de restrição Aval.

[080] 10 colônias são coletadas e cultivadas de um dia para o outro 30 °C/180 rpm em 10 ml de LB+cloranfenicol 20 mg/l em cada caso.

[081] No dia seguinte, 2 ml das culturas são centrifugados em cada caso e minipreparações são preparadas a partir dos péletes.

[082] Os produtos de ligação podem conter o inserto em duas orientações. Uma restrição AvaI permite testar o inserto assim como determinar a orientação:

• Inserto na orientação s: Fragmentos 148 bp, 1.447 bp e 5.494 bp
• Inserto na orientação as: Fragmentos 1.351 bp, 1.447 bp e 4291 bp
• Vetor vazio pKO3: Fragmentos 1.043 bp e 5.263 bp

[083] Os 10 clones de plasmídeo são cortados com o uso de AvaI e os produtos são separados em um gel de TAE agarose 0,8%. Um clone de plasmídeo que contém o inserto em orientação “s” foi selecionado e chamado “pKO3DaroP”.

[084] O inserto do dito clone é sequenciado com o uso dos iniciadores “pKO3-L” e “pKO3-R”.
pKO3-L 5” AGGGCAGGGTCGTTAAATAGC 3” SEQ ID NO.: 7
pKO3-R 5” TTAATGCGCCGCTACAGGGCG 3” SEQ ID NO.: 8

[085] A sequência de DNA do fragmento amplificado “DaroP” é determinado usando-se os iniciadores “pKO3-L” e “pKO3-R” (Eurofins Genomics GmbH (Ebersberg, Alemanha)). A sequência esperada do fragmento foi confirmada e o fragmento clonado é descrito na SEQ ID NO.:9.

[086] O vetor de substituição resultante pKO3DaroP é representado na Figura 1.

EXEMPLO 2 CONSTRUÇÃO DO VETOR DE SUBSTITUIÇÃO pKO3Dmtr

[087] Os flancos de deleção para a deleção de mtr são amplificados com o uso da reação em cadeia da polimerase (PCR) e o fragmento de deleção foram produzidos por PCR de sobreposição. Continuando a partir da sequência de nucleotídeo do gene mtr em E. coli K-12 MG1655 (número de acesso NC_000913.3, região: 33045733305817, Blattner et al. (Science 277: 1.453 a 1.462 (1997)) e das regiões de flanqueamento, os iniciadores de PCR são sintetizados (Eurofins Genomics GmbH (Ebersberg, Alemanha)). Os iniciadores são projetados de modo que um gene mtr inteiro seja deletado.
PROJETO DE INICIADOR E PCR DOS DOIS FLANCOS
FLANCO 1
mtr-del-Xba-1 5” TTGAGAACCGCGAGCGTCGTCTG 3”
SEQ ID NO.:10
mtr-del-Xba-2 5” TCTAGATTCGCGAGGGCTTCTCTCCAGTGAAA 3”
XbaI NruI SEQ ID NO.: 11

[088] O DNA de E. coli MG1655 cromossômico usado para a PCR é isolado com o uso do Kit QIAGEN DNeasy Blood & Tissue (QIAGEN GmbH, Hilden, Alemanha) de acordo com as informações do fabricante. Com o uso dos dois iniciadores específicos “mtr-del-Xba-1” e "mtr-del-Xba-2”, PCR é executada sob condições de PCR padrão (Innis et al.: PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, 1990, Academic Press) com o uso da DNA Polimerase Phusion (Thermo Fisher Scientific, Wattham, MA USA) com DNA de MG1655 como modelo para amplificar o fragmento “mtr-Flank1” (comprimento: 1009 bp). Por meio dos iniciadores, um sítio de restrição Nrul e um Xbal são inseridos no produto de PCR.
FLANCO 2
mtr-del-Xba-3 5” AAGCCCTCGCGAATCTAGAGTAATCAGCGGTGCCTTATC 3”
NruI XbaI SEQ ID NO.: 12
mtr-del-Xba-4 5” GCTGGCAGAACACCACAATATG 3”
SEQ ID NO.: 13

[089] Com o uso dos dois iniciadores “mtr-del-Xba-3” e “mtr-del-Xba-4”, a PCR é executada com DNA de MG1655 como modelo para amplificar o fragmento “mtr-Flank2” (comprimento: 1.014 bp). Por meio dos iniciadores, um sítio de restrição Nrul e um Xbal são inseridos no produto de PCR.

FUSÃO DOS DOIS FLANCOS POR PCR DE SOBREPOSIÇÃO

[090] Os dois flancos são usados juntos por meio de suas regiões de sobreposição por meio de um PCR de sobreposição com o uso dos dois iniciadores externos “mtr-del-Xba-1” e “mtr-del-Xba-4”. O produto resultante “mtr-del-Fragmento” tem um comprimento de 2.004 bp.

CLONAGEM DO INSERTO EM pKO3

[091] De acordo com as informações do fabricante, o “mtr-del-Fragmento” amplificado é ligado ao vetor pCR-Blunt II-TOPO (Kit Zero Blunt TOPO PCR Cloning, Thermo Fisher Scientific, Wattham, MA USA) e transformado em E. coli TOP10. As células que contêm um plasmídeo são selecionadas em ágar LB que contém canamicina 50 μg/ml. Após o isolamento do DNA de plasmídeo, a clonagem bem -sucedida é verificada por clivagem do plasmídeo com o uso da enzima de restrição HincII e separação dos produtos em um gel de TAE agarose 0,8%. O vetor clonado de modo bem-sucedido é chamado “pCRBl-mtr-del”.

[092] O vetor é, então, clivado com o uso das enzimas de restrição NotI e SpeI e o mtr-del-Fragmento é resolvido em um gel de TAE agarose 0,8%. Isso é seguido pelo isolamento do fragmento do gel com o uso do Kit de Extração QIAquick Gel (QIAGEN GmbH, Hilden, Alemanha) e clonagem do vetor de substituição pKO3 (Link et al, 1997, J. Bacteriol., 179, 20, 6.228 a 6.237).

[093] O vetor pKO3 é cortado com o uso de NotI e XbaI. Após isso, o material digerido é purificado com o uso do Kit de Purificação de PCR Qiaquick (QIAGEN GmbH, Hilden, Alemanha).

[094] A ligação é executada usando-se T4 ligase para ligar o vetor e inserto na razão molar de 1:3. As células quimicamente competentes da cepa de clonagem E. coli NEB5alpha são transformadas com o uso de 1 μl da reação de ligação e espalhados em ágar LB que contém cloranfenicol 20 mg/l. As placas são incubadas a 30 °C por 40 h.

Verificação dos clones de plasmídeo

[095] A clonagem bem-sucedida é verificada por clivagem do plasmídeo pKO3Dmtr com o uso da enzima de restrição HincII.

[096] Os clones corretos têm o seguinte padrão de clivagem:

• mtr-del de inserto: Fragmentos 822 bp, 1251 bp, 1.611 bp e 4.020 bp
• Vetor vazio pKO3: Fragmentos 822 bp, 1617 bp e 3232 bp

[097] 10 colônias são coletadas e cultivadas de um dia para o outro 30 °C/180 rpm em 10 ml de LB+cloranfenicol 20 mg/l em cada caso.

[098] No dia seguinte, 2 ml das culturas são centrifugados em cada caso e minipreparações são preparadas a partir dos péletes.

[099] Os 10 clones de plasmídeo são cortados com o uso de HincII e os produtos são separados em um gel de TAE agarose 0,8%. Um clone de plasmídeo que contém o inserto correto foi selecionado e chamado “pKO3Dmtr”.

[0100] O inserto do dito clone é sequenciado com o uso dos iniciadores “pKO3-L” e “pKO3-R”.
pKO3-L 5” AGGGCAGGGTCGTTAAATAGC 3” SEQ ID NO.: 7
pKO3-R 5” TTAATGCGCCGCTACAGGGCG 3” SEQ ID NO.: 8

[0101] A sequência de DNA do fragmento amplificado “Dmtr” é determinado usando-se os iniciadores “pKO3-L” e “pKO3-R” (Eurofins Genomics GmbH (Ebersberg, Alemanha)). A sequência esperada do fragmento foi confirmada e o fragmento clonado é descrito na SEQ ID NO.: 14.

[0102] O vetor de substituição resultante pKO3Dmtr é representado na Figura 3.

EXEMPLO 3 CONSTRUÇÃO DA SUBSTITUIÇÃO DOS VETORES DE SUBSTITUIÇÃO pKO3DaroP::mdfA E pKO3Dmtr::mdfA 3.1 CONSTRUÇÃO DO VETOR pB-mdfA

[0103] O alelo mdfA é amplificado com o uso da reação em cadeia da polimerase (PCR). Continuando a partir da sequência de nucleotídeo do gene mdfA em E. coli K12 MG1655 (número de acesso NC_000913.3, região: 883673-884905, Blattner et al. (Science 277: 1.453 a 1.462 (1997)), os iniciadores de PCR são sintetizados (Eurofins Genomics GmbH (Ebersberg, Alemanha)).
PROJETO DE INICIADOR E PCR DA REGIÃO DE GENE mdfA
cmr-for: 5” CGTCGCGATACAGGCAAGTCGTTGAG 3” SEQ ID NO.: 15 NruI
cmr-rev: 5” CCTCGCGACAGATTGACGACCATCAC 3” SEQ ID NO.: 16 NruI

[0104] O DNA de E. coli MG1655 cromossômico usado para a PCR é isolado com o uso do Kit QIAGEN DNeasy Blood & Tissue (QIAGEN GmbH, Hilden, Alemanha) de acordo com as informações do fabricante. Com o uso dos dois iniciadores específicos “crmr-for” e "cmr-rev”, PCR é executada sob condições de PCR padrão (Innis et al.: PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, 1990, Academic Press) com o uso da DNA Polimerase Phusion (Thermo Fisher Scientific, Wattham, MA USA) com DNA de MG1655 como modelo para amplificar o fragmento “mdfA-Inserto” (comprimento: 1.562 bp), descrito na SEQ ID NO.: 19. Por meio dos iniciadores, um sítio de restrição Nrul é inserido no produto de PCR.

CLONAGEM DO INSERTO EM pCR-BLUNT II

[0105] De acordo com as informações do fabricante, o fragmento amplificado “mdfA-Inserto” é ligado ao vetor pCR-Blunt II-TOPO (Kit Zero Blunt TOPO PCR Cloning, Thermo Fisher Scientific, Wattham, MA USA) e transformado em E. coli TOP10. As células que contêm um plasmídeo são selecionadas em ágar LB que contém canamicina 50 μg/ml. Após o isolamento do DNA de plasmídeo, a clonagem bem-sucedida é verificada por clivagem do plasmídeo com o uso da enzima de restrição SphI e separação dos produtos em um gel de TAE agarose 0,8%.

[0106] Os produtos de ligação podem conter o inserto em duas orientações. Uma restrição SphI permite testar o inserto assim como determinar a orientação:

• Inserto na orientação s: Fragmentos 1.351 bp, 1385 bp e 2345 bp
• Inserto na orientação as: Fragmentos 305 bp, 1385 bp e 3391 bp
• Vetor vazio pCR-Blunt II: Fragmentos 1385 bp e 2134 bp

[0107] Os clones de plasmídeo são cortados com o uso de SphI e os produtos são separados em um gel de TAE agarose 0,8%. Um clone de plasmídeo que contém o inserto em orientação “as” foi selecionado e chamado “pB-mdfA”.

[0108] O inserto do dito clone é sequenciado com o uso dos iniciadores “M13uni(-21)” e “M13rev(-29)”.
M13uni(-21) 5” TGTAAAACGACGGCCAGT 3” SEQ ID NO.: 17
M13rev(-29) 5” CAGGAAACAGCTATGACC 3” SEQ ID NO.: 18

[0109] A sequência de DNA do fragmento amplificado “mdfA” é determinado usando-se os iniciadores “M13uni(-21)” e “M13rev(-29)” (Eurofins Genomics GmbH (Ebersberg, Alemanha)). A sequência esperada do fragmento foi confirmada.

3.2 CONSTRUÇÃO DO VETOR pKO3DaroP::mdfA

[0110] O vetor pB-mdfA é clivado com o uso da enzima de restrição NruI e o fragmento mdfA é resolvido em um gel de TAE agarose 0,8%. Isso é seguido pelo isolamento do fragmento do gel com o uso do Kit de Extração QIAquick Gel (QIAGEN GmbH, Hilden, Alemanha) e clonagem do vetor de substituição pKO3DaroP que foi gerado.

[0111] O vetor pKO3DaroP é cortado com o uso de Nrul e simultaneamente desfosforilado com o uso de fosfatase alcalina. Essa clivagem preserva a região promotora de aroP que ainda está presente. Após isso, o material digerido é purificado com o uso do Kit de Purificação de PCR Qiaquick (QIAGEN GmbH, Hilden, Alemanha).

[0112] A ligação é executada usando-se T4 ligase para ligar o vetor e inserto na razão molar de 1:3. As células quimicamente competentes da cepa de clonagem E. coli NEB5alpha são transformadas com o uso de 1 μl da reação de ligação e espalhados em ágar LB que contém cloranfenicol 20 mg/l. As placas são incubadas a 30 °C por 40 h.

VERIFICAÇÃO DOS CLONES DE PLASMÍDEO

[0113] A clonagem bem-sucedida é verificada por clivagem do plasmídeo pKO3DaroP::mdfA com o uso da enzima de restrição Asel.

[0114] 10 colônias são coletadas e cultivadas de um dia para o outro 30 °C/180 rpm em 10 ml de LB+cloranfenicol 20 mg/l em cada caso.

[0115] No dia seguinte, 2 ml das culturas são centrifugados em cada caso e minipreparações são preparadas a partir dos péletes.

[0116] Os produtos de ligação podem conter o inserto em duas orientações. Uma restrição Asel permite testar o inserto assim como determinar a orientação:

• Inserto na orientação s: Fragmentos 1603 bp e 7038 bp
• Inserto na orientação as: Fragmentos 101 bp e 8540 bp

[0117] Os 10 clones de plasmídeo são cortados com o uso de Asel e os produtos são separados em um gel de TAE agarose 0,8%. Um clone de plasmídeo que contém o inserto em orientação “s” foi selecionado e chamado “pKO3DaroP::mdfA”.

[0118] O inserto do dito clone é sequenciado com o uso dos iniciadores “pKO3-L”, “pKO3-R”, “cmr-for” e “cmr-rev”.
pKO3-L 5” AGGGCAGGGTCGTTAAATAGC 3” SEQ ID NO.: 7
pKO3-R 5” TTAATGCGCCGCTACAGGGCG 3” SEQ ID NO.:8
cmr-for 5” TACAGGCAAGTCGTTGAG 3” SEQ ID NO.:15
cmr-rev 5” CAGATTGACGACCATCAC 3” SEQ ID NO.:16

[0119] A sequência de DNA do inserto “DaroP::mdfA” é determinado usando-se os iniciadores “pKO3-L”, “pKO3-R”, “cmr-for” e “cmr-rev” (Eurofins Genomics GmbH (Ebersberg, Alemanha)). A sequência esperada do fragmento foi confirmada e o fragmento clonado é descrito na SEQ ID NO.: 20.

[0120] O vetor de substituição resultante pKO3DaroP::mdfA é representado na Figura 2.

3.3 CONSTRUÇÃO DO VETOR pKO3Dmtr::mdfA

[0121] O vetor pB-mdfA é clivado com o uso da enzima de restrição NruI e o fragmento mdfA é resolvido em um gel de TAE agarose 0,8%. Isso é seguido pelo isolamento do fragmento do gel com o uso do Kit de Extração QIAquick Gel (QIAGEN GmbH, Hilden, Alemanha) e clonagem do vetor de substituição pKO3Dmtr que foi gerado.

[0122] O vetor pKO3Dmtr é cortado com o uso de Nrul e simultaneamente desfosforilado com o uso de fosfatase alcalina. Essa clivagem preserva a região promotora de mtr que ainda está presente. Após isso, o material digerido é purificado com o uso do Kit de Purificação de PCR Qiaquick (QIAGEN GmbH, Hilden, Alemanha).

[0123] A ligação é executada usando-se T4 ligase para ligar o vetor e inserto na razão molar de 1:3. As células quimicamente competentes da cepa de clonagem E. coli NEB5alpha são transformadas com o uso de 1 μl da reação de ligação e espalhados em ágar LB que contém cloranfenicol 20 mg/l. As placas são incubadas a 30 °C por 40 h.

VERIFICAÇÃO DOS CLONES DE PLASMÍDEO

[0124] A clonagem bem-sucedida é verificada por clivagem do plasmídeo pKO3Dmtr::mdfA com o uso da enzima de restrição HinclI.

[0125] 10 colônias são coletadas e cultivadas de um dia para o outro 30 °C/180 rpm em 10 ml de LB+cloranfenicol 20 mg/l em cada caso.

[0126] No dia seguinte, 2 ml das culturas são centrifugados em cada caso e minipreparações são preparadas a partir dos péletes.

[0127] Os produtos de ligação podem conter o inserto em duas orientações. Uma restrição HinclI permite testar o inserto assim como determinar a orientação:

• Inserto na orientação s: Fragmentos 354 bp, 822 bp, 1613 bp, 2449 bp e 4025 bp
• Inserto na orientação as: Fragmentos 822 bp, 1181 bp, 1613 bp, 1622 bp e 4025 bp

[0128] Os 10 clones de plasmídeo são cortados com o uso de HincII e os produtos são separados em um gel de TAE agarose 0,8%. Um clone de plasmídeo que contém o inserto em orientação “s” foi selecionado e chamado “pKO3Dmtr::mdfA”.

[0129] O inserto do dito clone é sequenciado com o uso dos iniciadores “pKO3-L”, “pKO3-R”, “cmr-for” e “cmr-rev”.
pKO3-L 5” AGGGCAGGGTCGTTAAATAGC 3” SEQ ID NO.: 7
pKO3-R 5” TTAATGCGCCGCTACAGGGCG 3” SEQ ID NO.: 8
cmr-for 5” TACAGGCAAGTCGTTGAG 3” SEQ ID NO.: 15
cmr-rev 5” CAGATTGACGACCATCAC 3” SEQ ID NO.: 16

[0130] A sequência de DNA do inserto “Dmtr::mdfA” é determinado usando-se os iniciadores “pKO3-L”, “pKO3-R”, “cmr-for” e “cmr-rev” (Eurofins Genomics GmbH (Ebersberg, Alemanha)). A sequência esperada do fragmento foi confirmada e o fragmento clonado é descrito na SEQ ID NO.: 21.

[0131] O vetor de substituição resultante pKO3Dmtr::mdfA é representado na Figura 4.

EXEMPLO 4 SUBSTITUIÇÃO DO ALELO aroP DE CEPA DM2186 PELOS FRAGMENTOS DE DELEÇÃO DaroP E DaroP::mdfA

[0132] A cepa de E.coli DM2186/pMU91 que produz L-triptofano é um derivado trpS+ obtenível por transdução de P1 da cepa K-12 de Escherichia coli JP6015/pMU91 descrita no relatório descritivo da patente n° US-A-5,756,345. pMU91 é um plasmídeo derivado de pSC101 (Cohen et al., Journal of Bacteriology 132: 734 a 737 (1977)), que porta TetR, trpE476DCBA e serA+. JP6015/pMU91 é depositado como DSM 10123 em Instituto Leibniz DSMZ - German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ, Braunschweig, Alemanha) de acordo com o tratado de Budapeste. DM2186 é depositado em 22 de novembro de 2018 como DSM 32961 em Instituto Leibniz DSMZ - German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ, Braunschweig, Alemanha) de acordo com o tratado de Budapeste.

[0133] No alelo aroP cromossômico da cepa DM2186, há uma mutação de deslocamento de quadro.

[0134] A substituição do alelo aroP cromossômico pelo construto de deleção codificado por plasmídeo foi executada transformando-se DM2186 com o plasmídeo pKO3DaroP. A substituição de gene é feita com o uso do método de seleção descrito por Link et al. (Journal of Bacteriology 179: 6.228 a 6.237 (1997)) e foi verificada por sequenciamento.

[0135] Após a substituição ter sido executada, o que está presente em DM2186 é a forma do alelo aroP deletado que é descrita na SEQ ID NO.:22 (sequenciamento por Eurofins Genomics GmbH (Ebersberg, Alemanha)). A cepa obtida é denominada DM2186DaroP.

[0136] Expressão aumentada do gene mdfA na cepa de E. coli DM2186/pMU91 integrada no lócus aroP

[0137] A substituição do alelo aroP cromossômico pelo alelo mdfA codificado por plasmídeo com deleção simultânea do gene aroP, a região promotora de aroP preservada, foi executada transformando-se DM2186 com o plasmídeo pKO3DaroP::mdfA. A substituição de gene é feita com o uso do método de seleção descrito por Link et al. (Journal of Bacteriology 179: 6.228 a 6.237 (1997)) e foi verificada por sequenciamento.

[0138] Após a substituição ter sido executada, o que está presente em DM2186 é a forma do gene mdfA, conforme descrito na SEQ ID NO.: 23, integrada no lócus aroP com deleção simultânea do alelo aroP (sequenciamento por Eurofins Genomics GmbH (Ebersberg, Alemanha)). A cepa obtida é denominada DM2186DaroP::mdfA.

[0139] O plasmídeo pMU91 que é descrito no relatório descritivo de patente n° USA-5,756,345 e que porta as informações genéticas para produção de triptofano foi isolado da cepa JP6015/pMU91. O plasmídeo é representado na Figura 5. As cepas DM2186DaroP e DM2186DaroP::mdfA foram, cada uma, transformadas com esse plasmídeo. Os respectivos transformantes são denominados DM2186DaroP/pMU91 e DM2186DaroP::mdfA/pMU91.

EXEMPLO 5 SUBSTITUIÇÃO DO ALELO MTR DE CEPA DM2186 PELOS FRAGMENTOS DE DELEÇÃO Dmtr e Dmtr::mdfA

[0140] A cepa de E.coli DM2186/pMU91 que produz L-triptofano é um derivado trpS+ obtenível por transdução de P1 da cepa K-12 de Escherichia coli JP6015/pMU91 descrita no relatório descritivo da patente n° US-A-5,756,345. pMU91 é um plasmídeo derivado de pSC101 (Cohen et al., Journal of Bacteriology 132: 734 a 737 (1977)), que porta TetR, trpE476DCBA e serA+. JP6015/pMU91 é depositado como DSM 10123 em Instituto Leibniz DSMZ - German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ, Braunschweig, Alemanha) de acordo com o tratado de Budapeste. DM2186 é depositado em 22 de novembro de 2018 como DSM 32961 em Instituto Leibniz DSMZ - German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ, Braunschweig, Alemanha) de acordo com o tratado de Budapeste.

[0141] No alelo mtr cromossômico da cepa DM2186, há uma mutação de deslocamento de quadro.

[0142] A substituição do alelo mtr cromossômico pelo construto de deleção codificado por plasmídeo foi executada transformando-se DM2186 com o plasmídeo pKO3Dmtr. A substituição de gene é feita com o uso do método de seleção descrito por Link et al. (Journal of Bacteriology 179: 6.228 a 6.237 (1997)) e foi verificada por sequenciamento.

[0143] Após a substituição ter sido executada, o que é presente em DM2186 é a forma do alelo mtr deletado que é descrita na SEQ ID NO.: 24 (sequenciamento por Eurofins Genomics GmbH (Ebersberg, Alemanha)). A cepa obtida é denominada DM2186Dmtr.

[0144] Expressão aumentada do gene mdfA na cepa de E. coli DM2186/pMU91 integrada no lócus mtr

[0145] A substituição do alelo mtr cromossômico pelo alelo mdfA codificado por plasmídeo com deleção simultânea do gene mtr, a região promotora de mtr preservada, foi executada transformando-se DM2186 com o plasmídeo pKO3Dmtr::mdfA. A substituição de gene é feita com o uso do método de seleção descrito por Link et al. (Journal of Bacteriology 179: 6.228 a 6.237 (1997)) e foi verificada por sequenciamento.

[0146] Após a substituição ter sido executada, o que está presente em DM2186 é a forma do gene mdfA, conforme descrito na SEQ ID NO.: 25, integrada no lócus mtr com deleção simultânea do alelo mtr (sequenciamento por Eurofins Genomics GmbH (Ebersberg, Alemanha)). A cepa obtida é denominada DM2186Dmtr::mdfA.

[0147] O plasmídeo pMU91 que é descrito no relatório descritivo de patente n° USA-5,756,345 e que porta as informações genéticas para produção de triptofano foi isolado da cepa JP6015/pMU91. O plasmídeo é representado na Figura 5. As cepas DM2186Dmtr e DM2186Dmtr::mdfA foram, cada uma, transformadas com esse plasmídeo. Os respectivos transformantes são denominados DM2186Dmtr/pMU91 e DM2186Dmtr::mdfA/pMU91.

EXEMPLO 6 PRODUÇÃO DE L-TRIPTOFANO COM O USO DAS CEPAS DM2186DaroP/pMU91, DM2186DaroP::mdfA/pMU91, DM2186Dmtr/pMU91 E DM2186Dmtr::mdfA/pMU91

[0148] Para testar o efeito de uma cópia adicional do gene mdfA expressado a partir de várias sequências reguladoras em dois ambientes cromossômicos diferentes DM2186DaroP/pMU91, DM2186DaroP::mdfA/pMU91, DM2186Dmtr/pMU91, DM2186Dmtr::mdfA/pMU91 e DM2186/pMU91 foram adicionalmente propagados a 30 °C em meio LB que tem a seguinte composição: Bacto triptona 10 g/l, extrato de levedura 5 g/l, NaCl 10 g/l (ajuste de pH a 7,5 com o uso de NaOH), glicose 2 g/l, ágar 20 g/l e tetraciclina 5 mg/l. A formação de L-triptofano é verificada em culturas de batelada de 10 ml contidas em frascos cônicos de 100 ml. Para esse fim, 10 ml de meio de pré-cultura da seguinte composição são inoculados, e incubados a 30 °C e 180 rpm por 16 horas em uma incubadora padrão Infors HT Multitron de Infors AG (Bottmingen, Suíça): extrato de levedura 1 g/l, tampão MOPS 100 ml/l (10x), glucose 10 g/l, tiamina 0,1 mg/l e tetraciclina 5 mg/l.

[0149] O tampão MOPS 10x é preparado a partir das soluções A e B, de acordo com as Tabelas 1 a 3; dois volumes de solução A são adicionados de modo asséptico a três volumes de solução B.

[0150] 100 μΙ da dita pré-cultura são, em cada caso, inoculados em 10 ml de meio de produção PM3P de acordo com a Tabela 4 e incubados a 33 °C e 180 rpm por 44 horas em uma incubadora padrão Infors HT Multitron de Infors AG (Bottmingen, Suíça). Após a incubação, a densidade óptica (OD) da suspensão de cultura é determinada com o uso de um fotômetro Nanocolor 400D de Macherey-Nagel GmbH & Co. KG (Düren, Alemanha) em um comprimento de onda de medição de 660 nm.

[0151] Após isso, a concentração de L-triptofano formada no sobrenadante de cultura filtrado de modo estéril é determinado por HPLC de fase reversa, por exemplo, conforme descrito em Lindroth et al. (Analytical Chemistry (1979) 51: 1.167 a 1.174).

[0152] A Tabela 5 mostra o resultado do experimento.

[0153] Conforme derivável a partir disso, a intensificação do gene mdfA aumenta o rendimento de L-triptofano. Entretanto, o nível de expressão de mdfA - e, assim, o rendimento de L-triptofano - é fortemente influenciado escolhendo-se o lócus de integração e o ambiente cromossômico do gene ou alelo mdfA integrado.

[0154] A integração de mdfA ao lócus aroP cromossômico leva a um leve aumento em produtividade de L-triptofano, enquanto a integração do mdfA ao lócus cromossômico mtr leva a um forte aumento em produtividade de L-triptofano, isto é, o ambiente cromossômico regula a expressão de mdfA. O efeito positivo em síntese de L-triptofano é muito mais pronunciado em DM2186Dmtr::mdfA/pMU91 em comparação com a integração de mdfA no lócus de gene aroP. Obviamente, a criação de um nível de expressão definido da cópia adicional do gene mdfA em um lócus de gene específico é mais importante para produção de L-triptofano do que a intensificação geral de expressão por aumento de número de cópia de gene. Especialmente, os níveis de expressão de proteínas de membrana, como proteínas de transporte e exportadores de aminoácido, devem ser modulados de maneira apropriada, sem afetar o ajuste celular e as capacidades de produção quando concentrações relevantes comerciais se acumulam no caldo de fermentação.

Claims

Método para produzir L-triptofano, em que o método compreende o cultivo de um L-triptofano que produz o micro-organismo que pertence à família Enterobacteriaceae em um meio de fermentação;
sendo que o método é caracterizado por o micro-organismo que produz L-triptofano ter sido modificado intensificando-se o nível de expressão do gene mdfA ou intensificando-se o nível de expressão de um alelo mdfA.
Método, de acordo com a reivindicação 1, sendo que o método é caracterizado por o alelo mdfA ser um polinucleotídeo selecionado a partir do grupo que consiste em:
- a) uma sequência de polinucleotídeo que compreende a sequência de nucleotídeo da SEQ ID NO.: 1;
- b) um polinucleotídeo que hibridiza com uma fita complementar da SEQ ID NO.: 1 sob condições estringentes;
- c) uma forma polimórfica ou mutante de ocorrência natural de um polinucleotídeo de acordo com a) ou b);
- d) um polinucleotídeo que tem uma identidade de sequência de pelo menos 80% da sequência de nucleotídeo da SEQ ID NO.: 1;
- e) um polinucleotídeo incluindo substituições, deleções, inserções ou adições de 1 a 60 nucleotídeos em relação à sequência de nucleotídeo da SEQ ID NO.: 1;
- f) um polinucleotídeo que codifica uma proteína que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO.: 2;
- g) um polinucleotídeo que codifica uma proteína que compreende uma sequência de aminoácidos que inclui substituição, deleção, inserção ou adição de 1 a 20 aminoácidos na SEQ ID NO.: 2.
Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado por, no micro-organismo que produz L-triptofano, o nível de expressão do gene mdfA ou do alelo mdfA ser intensificado por aumento do número de cópia do gene mdfA ou do alelo mdfA em pelo menos 1.
Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, sendo que o método é caracterizado por, no micro-organismo que produz L-triptofano, o número de cópia do gene mdfA ou do alelo mdfA ser aumentado em pelo menos 1 integrando-se o gene no cromossomo do micro-organismo.
Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, sendo que o método é caracterizado por, no micro-organismo que produz L-triptofano, o nível de expressão do gene mdfA ou do alelo mdfA ser intensificado modificando-se a sequência reguladora de expressão do gene.
Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, sendo que o método é caracterizado por o nível de expressão do gene mdfA ou do alelo mdfA ser intensificado com o uso de um promotor induzível.
Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, sendo que o método é caracterizado por uma cópia do gene mdfA ou do alelo mdfA ser integrada no lócus mtr com deleção simultânea do gene mtr.
Método, de acordo com a reivindicação 7, sendo que o método é caracterizado por o ambiente cromossômico do lócus mtr regular a expressão do gene mdfA ou o alelo mdfA integrado no lócus mtr.
Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, sendo que o método é caracterizado por o micro-organismo que produz L-triptofano ser selecionado a partir dos gêneros Escherichia, Erwina e Providencia.
Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, sendo que o método é caracterizado por o micro-organismo que produz L-triptofano ser Escherichia coli.
Método para produzir um micro-organismo que produz L-triptofano por transformação, transdução ou conjugação, sendo que o método é caracterizado por a transformação, transdução ou conjugação ser feita com o uso de um vetor que compreende
- a) uma sequência de polinucleotídeo que compreende a sequência de nucleotídeo da SEQ ID NO.: 1;
- b) um polinucleotídeo que hibridiza com uma fita complementar da SEQ ID NO.: 1 sob condições estringentes;
- c) uma forma polimórfica ou mutante de ocorrência natural de um polinucleotídeo de acordo com a) ou b);
- d) um polinucleotídeo que tem uma identidade de sequência de pelo menos 80% da sequência de nucleotídeo da SEQ ID NO.: 1;
- e) um polinucleotídeo incluindo substituições, deleções, inserções ou adições de 1 a 60 nucleotídeos em relação à sequência de nucleotídeo da SEQ ID NO.:1;
- f) um polinucleotídeo que codifica uma proteína que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO.: 2;
- g) um polinucleotídeo que codifica uma proteína que compreende uma sequência de aminoácidos que inclui substituição, deleção, inserção ou adição de 1 a 20 aminoácidos na SEQ ID NO.: 2;
e que compreende um promotor que regula a expressão de polinucleotídeos a) a g).
Micro-organismo que produz L-triptofano da família Enterobacteriaceae, sendo que o micro-organismo é caracterizado por o microorganismo ter sido modificado intensificando-se o nível de expressão do gene mdfA ou intensificando-se o nível de expressão de um alelo mdfA.
Micro-organismo que produz L-triptofano, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por o alelo mdfA ser um polinucleotídeo selecionado a partir do grupo que consiste em:
- a) uma sequência de polinucleotídeo que compreende a sequência de nucleotídeo da SEQ ID NO.: 1;
- b) um polinucleotídeo que hibridiza com uma fita complementar da SEQ ID NO.: 1 sob condições estringentes;
- c) uma forma polimórfica ou mutante de ocorrência natural de um polinucleotídeo de acordo com a) ou b);
- d) um polinucleotídeo que tem uma identidade de sequência de pelo menos 80% da sequência de nucleotídeo da SEQ ID NO.: 1;
- e) um polinucleotídeo incluindo substituições, deleções, inserções ou adições de 1 a 60 nucleotídeos em relação à sequência de nucleotídeo da SEQ ID NO.: 1;
- f) um polinucleotídeo que codifica uma proteína que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO.: 2;
- g) um polinucleotídeo que codifica uma proteína que compreende uma sequência de aminoácidos que inclui substituição, deleção, inserção ou adição de 1 a 20 aminoácidos na SEQ ID NO.: 2.
Micro-organismo que produz L-triptofano, de acordo com a reivindicação 12 ou 13, caracterizado por uma cópia do gene mdfA ou do alelo mdfA ser integrada ao lócus mtr com deleção simultânea do gene mtr, e opcionalmente em que o ambiente cromossômico do lócus mtr regula a expressão do gene mdfA ou do alelo mdfA integrado ao lócus mtr.
Uso do micro-organismo que produz L-triptofano, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 14, caracterizado por ser para produzir L-triptofano ou, alternativamente, para produzir um aditivo alimentício que contém L-triptofano.