MX2008003242A - Microorganismos regulados con oxig - Google Patents

Abstract

La presente invención se relaciona a cepas novedosas de microorganismos con metabolismo regulado por oxígeno. Los microorganismos tienen tasas de crecimiento más elevadas y son más eficientes que las cepas parenterales. Los microorganismos pueden utilizarse para producir una variedad de productos de interés, tales como proteínas recombinantes,ácidos nucleicos, tales como ADN, aminoácidos y químic

Description

MICROORGANISMOS REGULADOS CON OXIGENO REFERENCIA CRUZADA CON LAS SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reclama el beneficio de la Solicitud Provisional Norteamericana No. 60/715,702, presentada el 8 de septiembre de 2005, y la Solicitud Internacional PCT/2006/032525 presentada el 18 de agosto de 2005, los contenidos de las cuales se incorporan en la presente para referencia .

CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona ' a cepas novedosas de microorganismos y procesos de fermentación que implican estos microorganismos. Más específicamente, la presente invención se relaciona a cepas genéticamente modificadas de microorganismos y el uso de las mismas para la producción de productos comerciales, tales como proteínas recombinantes, ácidos nucleicos, aminoácidos y químicos especializados. La presente invención se relaciona también a métodos para preparar cepas de microorganismos para tales usos .

ANTECEDENTES Los microorganismos, tales como bacterias se utilizan ampliamente en procesos industriales para fabricar biofarmacéuticos, componentes para vacunas, ADNs de plásmidos, ADNs de vacunas y muchos químicos especializados, incluyendo aminoácidos. Las bacterias utilizadas en procesos industriales se desarrollan típicamente en un medio líquido suplementado con glucosa como | una fuente de carbono. Grandes cantidades de glucosa se requieren en procesos industriales para desarrollar bacterias a las densidades elevadas deseadas para maximizar la productividad volumétrica, para producir químicos especializados y para el mantenimiento de bacterias. Las bacterias absorben y asimilan metabolitos en un índice alto. El flujo de metabolitos puede ser tan alto que abruma una o más de las reacciones bioquímicas en las trayectorias de carbono central de las bacterias cuando se eleva la concentración de ciertos metabolitos. Las bacterias dispuestas de las concentraciones elevadas de metabolitos utilizando una o más trayectorias de "sobreflujo". E. coli tiende a secretar acetato cuando el oxígeno llega a escasear durante fermentaciones de densidad de célula elevada. La causa de fondo es la necesidad para la célula que dispone de electrones a un aceptor diferente de 02. La próxima causa es la acumulación intracelular de acetil-CoA, un producto de glicólisis, el cual en la presencia de 02 se quema normalmente por el ciclo de TCA. Sin embargo, cuando 02 es bajo, el ciclo de TCA no puede metabolizar acetil-CoA eficientemente, lo que se acumula en la célula. El exceso de acetil -CoA se convierte a acetato el cual se excreta junto con otros ácidos orgánicos para remover electrones a partir de la célula. Esto proporciona una viable, pero lenta solución metabólica para E. coli en tipo silvestre, pero en fermentadores industriales como densidad celular se conduce a niveles más elevados, puede acumular acetato en exceso a niveles tóxicos . Este problema se ha dirigido tradicionalmente por fermentación de proceso en lotes en donde la fuente de carbono se mide en el cultivo de manera que el desarrollo de la célula se limita por supresión de carbono a niveles equiparables con el 02 disponible. A pesar de medir la fuente de carbono, la utilización de oxígeno llega eventualmente a ser limitante a densidad de células elevadas. En esta situación, el ambiente del fermentador también llega a ser heterogéneo debido a la falta de mezclado perfecto, y el nivel de 0 varía de lugar a lugar en las cavidades. Aunque el acetato excretado en una región de 02 bajo puede respaldarse por células que se transportan a regiones con más 02, esto puede ser metabólicamente ineficiente y, eventualmente, cuando se acumulan más células, el nivel de acetato asciende inexorablemente incluso con tecnología de proceso en lotes. Cuando los niveles de ácido orgánico se elevan más allá de la capacidad de tamponación del medio, el pH se mantiene por titulación con bases minerales tales como NaOH las cuales no sólo requieren equipo y atención adicional del personal de planta, sino puede también incrementar la complejidad de la purificación del producto corriente abajo así como la sal quemada en la corriente de desperdicios del fermentador. Un régimen de fermentación que incrementa la formación específica del producto al reducir el desbordamiento del metabolismo representaría una mejora notable a la técnica.

COMPENDIO DE LA INVENCIÓN En varias modalidades, la presente invención proporciona un microorganismo con flujo metabólico a partir de una fuente de carbono regulada por niveles de oxígeno. El microorganismo puede ser un procariote, tal como E. coli , Shigella, Salmonella , Corynebacter, Lactococcus o Strepto ycetes . El microorganismo puede también ser un eucariote, tal como una levadura. La levadura puede ser especies Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharo yces pombe o Pichia . La fuente de carbono puede ser glucosa, fructosa, galactosa, mañosa, sacarosa, maltosa, N"-acetilglucosamina, ß-glucósidos, manitol, celobiosa, sorbosa, glucitol o galactitol . El microorganismo puede comprender un promotor regulado por oxígeno unido operativamente a un gen que codifica una proteína de un sistema de fosfotransferasa dependiente de piruvato de fosfoenol . El microorganismo puede comprender un promotor regulado por oxígeno unido operativamente a un gen que codifica una proteína del módulo de metabolismo de sacarosa de E. coli 0157. H7. El gen unido operativamente al promotor regulado por oxígeno puede codificar una proteína de fusión. La proteína de fusión puede comprender ubiquitina. Éstas y otras modalidades de la presente invención se discuten en detalle adicional posteriormente, BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 muestra el módulo de metabolismo de sacarosa de E. coli 0157 :H7. La Figura 2 muestra el promotor K12 sodA de tipo silvestre. La Figura 3 muestra el módulo de metabolismo de sacarosa 0157 :H7 reconfigurado y controlado por el promotor sodA . La Figura 4 muestra productos de amplificación de PCR, a) cscA, b) cscKB y c ) cscA y el producto recombinante cscKB . La Figura 5 muestra (a) células MG1655 desarrolladas en 1% de sacarosa que contiene un medio M9 como la única fuente de carbono sin formación de colonias, y (b) MG1655 sodA pKD46 que contiene el operón cscAKB en donde los recombinantes fueron capaces de desarrollarse en un medio M9 más 1% de sacarosa. La Figura 6 muestra una modalidad alternativa de la invención en donde sólo cscA se controla por oxígeno por el promotor sodA y un operón separado {Placp) controla cscKB . La Figura 7 muestra productos de amplificación de PCR, a) cscKB y b) un fragmento terminador Placop.cscKB. La Figura 8 muestra una modalidad alternativa de la invención en donde sólo cscA se controla por oxígeno por el promotor sodA y un operón separado { cscKp) controla cscKB. La Figura 9 muestra productos de amplificación de PCR, a) cscProK-B y b) un corte del fragmento cscProK-B como un fragmento HindIII-Xbal . La Figura 10 muestra la curva de crecimiento de MG1655 so?LA::csc en un medio MOPS mínimo con 1% de sacarosa. El área en el recuadro de la curva indica el tiempo en que el cultivo se desarrolló bajo condiciones anaeróbicas. La Figura 11 muestra la curva de crecimiento de MG1655 sodA : : csc en un medio MOPS mínimo con 0.4% de sacarosa como la única fuente de carbono y de energía (diamantes grises) y un medio MOPS con 0.2% de glucosa y 0.4% de sacarosa (cuadros negros) . El área en recuadro de la curva indica el tiempo en que el cultivo se desarrolló bajo condiciones anaeróbicas. La Figura 12 muestra los conteos celulares viables (Panel A) y pH medio (Panel B) para MG1655 sodA : : csc desarrollado en un medio MOPS mínimo con 0.4% de sacarosa como la única fuente de carbono y energía (diamantes grises) y un medio MOPS con 0.2% de glucosa y 0.4% de sacarosa (cuadros negros) . El área en el recuadro de las gráficas indica el tiempo en que el cultivo se desarrolló bajo condiciones anaeróbicas. La Figura 13 ilustra el reemplazo de promotores de PTS nativos con el promotor sodA . La Figura 14 ilustra la estrategia para la construcción recombinante de PTS regulada por el promotor sodA y los oligonucleótidos que pueden utilizarse para amplificación de PCR.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Aunque la presente invención es capaz de manifestarse en varias formas, la descripción posterior de varias modalidades se hace con el entendimiento de que la presente descripción va a considerarse como una ej emplificacíón de la invención, y no se pretende para limitar la invención a las modalidades específicas ilustradas. Se proporcionan encabezados para conveniencia únicamente y no para ser interpretados para limitar la invención de ninguna forma. Modalidades ilustradas bajo cualquier encabezado pueden combinarse con las modalidades ilustradas bajo cualquier otro encabezado. El uso de valores numéricos en los diversos intervalos especificados en esta solicitud, a menos que se indique expresamente de otro modo, se establece como aproximaciones como si los valores mínimo y máximo dentro de los intervalos establecidos estuvieran precedidos por la palabra "aproximadamente" . De esta manera, variaciones ligeras sobre y debajo de los intervalos establecidos pueden utilizarse para lograr sustancialmente los mismos resultados como valores dentro de los intervalos. Como se utiliza en la presente, los términos "alrededor" y "aproximadamente" cuando se refieren a un valor numérico tendrán sus significados simples y ordinarios para un experto en la técnica pertinente en cuestión. También, la descripción de intervalos se pretende como un intervalo continuo que incluye cada valor entre los valores mínimos y máximos descritos así como cualesquiera intervalos que pueden formarse por consiguiente. Esto incluye intervalos que pueden formarse que incluyen o no un límite superior y/o inferior finito. Por consiguiente, la persona experimentada apreciará que muchas relaciones, intervalos, e intervalos de relaciones pueden derivarse en forma ambigua de los datos y números presentados en la presente y todos representan modalidades de la presente invención. En una modalidad, la presente invención se relaciona a un microorganismo con flujo metabólico regulado por niveles de oxígeno. Cuando el microorganismo está en un ambiente con niveles debajo del umbral de oxígeno, el flujo metabólico se reduce. Al reducir el flujo metabólico a niveles bajos de oxígeno, puede reducirse el metabolismo de sobreflujo a metabolitos indeseables producidos en ambientes de oxígeno reducidos. Cuando los niveles de oxígeno se incrementan arriba de un nivel de umbral, el flujo metabólico puede incrementarse. Dentro de un cultivo, puede haber microambientes con suficiente oxígeno y otros microambientes con insuficiente oxígeno para síntesis de producto eficiente. El microorganismo puede ser capaz de auto-regular el flujo metabólico bajo niveles de oxígeno variables y de este modo sólo consume sustrato bajo condiciones que permiten la formación eficiente del producto. Al regular la tasa de metabolismo como una función de niveles de oxígeno, puede haber una reducción en la producción de acetato y otros metabolitos de sobre flujo indeseables. Al permitir al microorganismo auto-regular el metabolismo un producto de interés puede producirse con mayor eficiencia y menor costo. 1. Microorganismo El microorganismo puede derivarse de cualquier microorganismo progenitor. Microorganismos progenitores representativos están disponibles de the American Type Culture Collection. Otros microorganismos representativos se describen en S.Y. Lee, "High Densi ty Cul ture of Escherichia coli" , Tibtech 14:98-103 (1996). El organismo progenitor puede ser un eucariote, tal como una levadura. Ejemplos representativos de levadura incluyen, pero no se limitan a especies S . cerevi siae, S . pombe y Pichia . El organismo progenitor puede también ser un procariote, tal como una bacteria y puede ser un organótrofo quimioheterotrófico. Ejemplos representativos de bacterias incluyen, pero no se limitan a E. coli , Shigella, Sal onella, Corynebacter, Lactococcus y Streptomycetes . El microorganismo puede ser también un microorganismo de genoma reducido, tal como una bacteria de genoma reducido. Mucha de la información genética contenida dentro del genoma de un microorganismo puede eliminarse sin afectar perjudicialmente la producción del metabolito final. Además, un microorganismo con un genoma reducido puede ser ventajoso en la producción de muchos productos de interés. Por ejemplo, un genoma reducido puede conducir a la producción de productos menos nativos o niveles inferiores de los mismos, lo cual puede conducir a purificación menos compleja de un producto de interés. Además, un microorganismo con un genoma reducido puede ser menos metabólicamente demandante y así puede producir un producto de interés más eficientemente. Se discuten bacterias reducidas del genoma en la Patente Norteamericana No. 6,989,265, la cual se incorpora en la presente para referencia. Una bacteria de genoma reducida con producción limitada de proteínas periplásmicas naturales puede ser benéfica para expresar proteínas recombinantes en el periplasma. Ejemplos de cepas de bacterias de genoma reducida adecuada incluyen, pero no se limitan a MDS12, MDS13, MDS39, MDS40, MDS41, MDS42, MDS43, MDS44, MDS45, MDS46, MDS47, MDS48, MDS49, MDS50, MDS51, MDS52, MDS53, MDS54 , MDS55, MDS56, MDS57, MDS58, MDS59 Y MDS60. El microorganismo de genoma reducido puede también derivarse de novo de genes y operones a partir de uno o más microorganismos . 2. Flujo Metabólico Regulado por Oxígeno Los niveles de oxígeno pueden regular el flujo metabólico de una fuente de carbono en un microorganismo. El metabolismo de una fuente de carbono puede regularse en la importación de la fuente de carbono. Por ejemplo, la expresión de una proteína implicada en la importación de la fuente de carbono puede colocarse bajo el control de un promotor regulado por oxígeno. El metabolismo de una fuente de carbono puede también regularse a la primera etapa metabólica intracelular que utiliza la fuente de carbono o cualquier etapa metabólica más adelante, o una combinación de la misma. Por ejemplo, la expresión de una proteína implicada en glicólisis o en la conversión de la fuente de carbono en un sustrato para glicólisis puede colocarse bajo el control de un promotor regulado por oxígeno. a. Fuente de Carbono La fuente de carbono puede ser cualquier fuente de carbono capaz de respaldar el crecimiento y/o metabolización del microorganismo, ya sea en forma nativa o introduciendo genes heterólogos u operones que codifican enzimas capaces de metabolizar la fuente de carbono. La fuente de carbono puede ser un monosacárido, tal como glucosa, fructosa, galactosa o mañosa. La fuente de carbono puede ser también un disacárido tal como sacarosa. Otras fuentes de carbono incluyen, pero no se limitan a maltosa, N-acetilglucosamina, ß-glucósidos, manitol, celobiosa, sorbosa, glucitol y galactitol. Las bacterias pueden absorber una fuente de carbono mediante el sistema de fosfoenolpiruvato : carbohidrato fosfotransferasa (PTS) . El sistema de PTS puede permitir la incorporación rápida y eficiente de fuentes de carbono exógenas de alta calidad y pueden jugar un papel clave en la regulación catabólica de metabolismo en muchas bacterias. La expresión de uno o más componentes del sistema de PTS puede estar bajo control de un promotor regulado por oxígeno, la cual puede reducir la producción de productos de sobreflujo. Una trayectoria de incorporación de fuente de carbono alternativa, regulada por la disponibilidad de oxígeno puede permitir la división más eficiente de sustrato en la formación del producto a través del curso de una fermentación. El sistema de PTS comprende un sistema de fosfo-relevador en el cual la proteína El (codificada por ptsH) transfiere el grupo fosfato de fosfoenolpiruvato a la proteína Hpr (codificada por ptsl) , la cual a su vez fosforila una subunidad EIIA específica de carbohidrato (en E. colí la proteína EIIA específica de glucosa se codifica por el gen crr) , la cual puede interactuar entonces con una proteína asociada de membrana o subunidad del complejo de transporte de carbohidrato para internalizar y fosforilar el azúcar cognado. La reacción total convierte PEP a piruvato mientras transporta un azúcar exógeno a un fosfato de azúcar interno . En E. coli , los genes que codifican los elementos de PTS comunes, ptsH y ptsl se asocian en el cromosoma con el gen crr. Todos los tres genes se transcriben a partir de un conjunto de promotores encontrados corriente arriba de ptsH. Además, un promotor adicional o par promotor dentro de ptsl produce una transcripción que incluye sólo ptsl . La expresión de algunos de los promotores corriente arriba de ptsH incrementa bajo condiciones anaeróbicas. La expresión incrementada de estos genes puede resultar en un nivel incrementado de incorporación y activación de azúcar mediante cualquiera de los sistemas de PTS para los cuales se presenta un azúcar cognado. La transcripción incrementada de estos genes puede por lo tanto jugar un papel en la producción de metabolitos de sobreflujo indeseados, ya que cuando el oxígeno llega a ser limitante como un aceptor de electrón para el ciclo de TCA, la expresión incrementada de los genes de PTS incrementa simultáneamente la capacidad de incorporación de azúcar. Al reemplazar los promotores asociados con ptsH nativo con un promotor regulado por oxígeno puede regular la incorporación de azúcar de PTS en una manera dependiente de oxígeno, asegurando así que el consumo de la fuente de carbono se acopla a la presencia de oxígeno. Al controlar la expresión de los elementos comunes de uno o más sistemas de PTS en la célula, la disponibilidad y/o utilización de múltiples fuentes de carbono pueden controlarse. Como se discute anteriormente, la incorporación y activación de fuentes de carbono puede exceder la capacidad del microorganismo para metabolizarlos eficientemente, resultando en la producción de metabolitos de sobreflujo indeseado. Además, la producción de compuestos directamente derivados de PEP, tales como aromáticos derivados de la trayectoria del ácido shikímico, puede limitarse por el consumo de PEP para transporte de azúcar mediado por PTS. 1) Sacarosa La sacarosa puede también utilizarse como una fuente de carbono para el microorganismo. La sacarosa es un disacárido de glucosa y fructosa. Con el fin de metabolizarse, la sacarosa puede transportarse dentro de la célula y luego dividirse en las unidades de monosacárido . Tanto la glucosa como la fructosa pueden registrar glicólisis como glucosa-6-fosfato y fructosa-6-fosfato . Un número de microorganismo, incluyendo la mayoría de las cepas de E. coli , son incapaces de desarrollarse en la sacarosa. Sin embargo, algunas cepas tienen un sistema de gen que permite la incorporación y el metabolismo de sacarosa como la única fuente de carbono. Tales sistemas genéticos, o porciones de los mismos, pueden agregarse a un microorganismo para permitir el uso de sacarosa como una fuente de carbono. Los genes pueden agregarse al cromosoma del microorganismo, o pueden agregarse al microorganismo en un plásmido. Uno o más de los genes agregados al microorganismo pueden colocarse bajo el control de un promotor regulado por oxígeno. Se contempla también que los sistemas genéticos que permiten la incorporación y el metabolismo de otras fuentes de carbono pueden agregarse también al microorganismo. Las Patentes Norteamericanas Nos. 6,365,723 y 6,855,814, las cuales se incorporan en la presente para referencia, describen un ejemplo representativo del sistema genético compacto para la incorporación y metabolismo de sacarosa que permite el uso de sacarosa como la única fuente de carbono. El módulo de metabolismo de sacarosa de E . coli 0157 :H7 se muestra en la Figura 1. El producto genético cscB transporta sacarosa dentro de la célula y cscA codifica para sacarosa hidrolasa (invertasa) , la cual divide el disacárido sacarosa en fructosa y glucosa. El gen cscK, codifica para fructocinasa la primera enzima de metabolismo glicolítico de fructosa. El gen cscK muestra alta similaridad a otras fructocinasas, y pueden ser redundantes al gen fruK de E. coli K-12; sin embargo, las células de K-12 de E . coli pueden carecer de actividades de invertasa y sacarosa hidrolasa. El producto genético cscR es un represor que controla la expresión de genes del operón 0157 :H7 en relación a la disponibilidad de sacarosa enlazando a los promotores, típicos de la familia lacI-galR de proteínas represoras. b. Promotor Regulado por Oxígeno El flujo metabólico a partir de la fuente de carbono puede regularse ' utilizando promotores sensibles a oxígenos operativos unidos a un gen que codifica una o más de las proteínas implicadas en el metabolismo de la fuente de carbono. Ejemplos representativos de promotores que se activan en la presencia de oxígeno son promotores dentro del operón cyo y superóxido dismutasa (sodA) , los cuales codifican una enzima que protege la célula contra daño oxidativo. La región cromosoma K12 sodA de tipo silvestre se muestra en la Figura 2. Al utilizar un promotor positivo sensible a oxígeno, niveles de oxígeno suficientemente elevados pueden inducir expresión de proteínas que permiten metabolismo de la fuente de carbono mientras se minimiza la producción de metabolitos de sobreflujo u otros sub-productos. El tiempo de respuesta del promotor puede incrementarse al colocar proteínas metabólicas citoplásmicas bajo el control del promotor sensible a oxígeno, aunque proteínas no citoplásmicas (por ejemplo, proteínas de transmembrana) pueden expresarse o colocarse constitutivamente bajo control de diferente promotor. La velocidad a la cual se reduce el metabolismo bajo condiciones de oxígeno decrecientes puede incrementarse al incrementar la tasa de rotación de las proteínas metabólicas. Por ejemplo, una proteína implicada en el metabolismo de la fuente de carbono puede expresarse como una proteína de fusión con ubiquitina. La invención también abarca construcciones de ácido nucleico que comprende un promotor regulado por oxígeno unido opera ivamente a un gen heterólogo bajo control no normalmente de un promotor sensible por oxígeno. c. Tasas de Crecimiento El microorganismo puede tener una tasa de crecimiento mejorado cuando se desarrolla en la presencia de una abundancia de una fuente de carbono. Cuando se desarrolla en un medio líquido que comprende de 0% a la concentración de % tolerada máxima de una fuente de carbono el microorganismo puede tener una tasa de crecimiento incluyendo, pero sin limitarse a, más de aproximadamente 25% a aproximadamente 400% cuando se compara al progenitor del microorganismo. El microorganismo puede desarrollarse en un medio que comprende una fuente de carbono a un p/v de al menos aproximadamente 0.1%, 0.2%, 0.3%, 0.4%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9%, 1%, 1.5, 2%, 2.5, 3%, 3.5%, 4%, 4.5%, 5%, 5.5%, 6%, 6.5%, 7%, 7.5%, 8%, 8.5%, 9%, 9.5% ó 10%. En tales condiciones, el microorganismo puede tener una tasa de crecimiento mayor de aproximadamente 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 105%, 110%, 115%, 120%, 125%, 130%, 135%, 140%, 145%, 150%, 155%, 160%, 165%, 170%, 175%, 180%, 185% 190%, 195%, 200%, 205%, 210%, 215%, 220%, 225%, 230%, 235% 240%, 245%, 250%, 255%, 260%, 265%, 270%, 275%, 280%, 285% 290%, 295%, 300%, 305%, 310%, 315%, 320%, 325%, 330%, 335% 340%, 345%, 350%, 355%, 360% 365%, 370%, 375%, 380%, 385%, 390%, 395% ó 400% cuando se compara a un microorganismo paternal . d. Flujo Metabólico El microorganismo puede tener flujo metabólico mejorado cuando se desarrolla en la presencia de una abundancia de una fuente de carbono. Cuando se desarrolla en un medio líquido que comprende de 0% a la concentración de % tolerada máxima de una fuente de carbono, el microorganismo puede tener un flujo metabólico incluyendo, pero sin limitarse a, de aproximadamente 5% a aproximadamente 90% de la fuente de carbono que se dirige a los productos deseados. Una cepa puede tener un flujo metabólico de aproximadamente 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% ó 90%. En general, el flujo de metabolitos mediante cada etapa de reacción en cualquier trayectoria dada depende de las tasas relativas de la reacción delantera y reacciones inversas. El flujo puede referirse a la tasa de cambio en concentración de un analito como una función de tiempo y el tamaño de muestra. El flujo metabólico mediante cualquier conversión metabólico sencillo puede determinarse utilizando metodologías descritas en las Patentes Norteamericanas Nos. 6,764,817 y 6,849,396, los contenidos los cuales se incorporan en la presente para referencia. Se proporciona la guía adicional en flujo y métodos para su determinación, por ejemplo, por Newsholme, E.A. et al., Biochem. Soc . Symp. 43:183-205 (1978). Newsholme, E. A., et al., Biochem . Soc.

Symp. 41:61-110 (1976); y Newsholme, E. A., y Sart, C, Regulation in Metaboli sm, Capítulos 1 y 3, Wiley-Interscience Press (1973), los contenidos de las cuales se incorporan en la presente para referencia. e. Producción Los microorganismos de la presente invención pueden ser capaces de producir metabolitos finales u otros productos de interés a tasas más elevadas. Cuando se desarrollan en un medio líquido que comprende de 0% a la concentración en % tolerada máxima de una fuente de carbono, el microorganismo puede producir metabolitos finales u otros productos de interés de aproximadamente 0.001 g/L a aproximadamente 100 g/L de la fuente de carbono que se dirige a los productos deseados. Una cepa puede tener un flujo metabólico de aproximadamente 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75% u 80%. f. Tasa de Producción En vista de la capacidad para controlar el flujo del metabolismo, el microorganismo puede producir una variedad de cantidades del metabolito final, en una variedad de tasas, y en tasas variables de eficiencia de utilización de la fuente de carbono. Las cepas de la presente invención pueden producir el metabolito final al menos a niveles que incluyen, pero no se limitan a aproximadamente 10 g/L, 20 g/L, 30 g/L, 40 g/L, 50 g/L, 60 g/L, 70 g/L, 80 g/L, 90 g/L y 100 g/L. El microorganismo . puede producir el metabolito final en una tasa que incluye, pero no se limita al menos a aproximadamente 0.50 g/L/hora, 0.75 g/L/hora, 1.00 g/L/hora, 1.25 g/L/hora, 1.50 g/L/hora, 1.75 g/L/hora, 2.00 g/L/hora, 2.25 g/L/hora, 2.50 g/L/hora, 2.75 g/L/hora, 3.00 g/L/hora, 3.25 g/L/hora, 3.50 g/L/hora, 3.75 g/L/hora, 4.00 g/L/hora, 4.25 g/L/hora, 4.50 g/L/hora, 4.75 g/L/hora y 5.00 g/L/hora. El microorganismo puede producir el metabolito final en una tasa de eficiencia de utilización de fuente de carbono incluyendo, pero sin limitarse al menos a aproximadamente 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% y 75%. 3. Producto de Interés El microorganismo puede utilizarse para producir un producto de interés en niveles elevados de eficiencia en un medio con una abundancia de una fuente de carbono. El producto de interés producido por el microorganismo puede ser uno o más de cualesquiera de los productos incluyendo, pero sin limitarse a, químicos, aminoácidos, ' vitaminas, co-factores, ácidos nucleicos, tales como ADN, ácidos grasos, factores de crecimiento, proteínas e intermediarios de los mismos. El producto de interés puede ser un producto que se produce naturalmente por el microorganismo. El producto de interés puede también ser un producto no natural que se produce como un resultado de genes heterólogos que se agregan al microorganismo. El producto de interés puede ubicarse intracelularmente en el microorganismo. El producto de interés puede secretarse también en el periplasma del microorganismo. El periplasma puede ser benéfico para producción de proteínas, porque: (i) la proteína humana recombinante puede producirse con el término amino correcto, mientras que aquellos producidos en el citoplasma puede comenzar con una metionina adicional no presente en la proteína natural; (ii) muchas proteínas pueden plegarse correctamente en el espacio periplásmico (iii) los enlaces disulfuro correctos pueden formarse en el periplasma; (iv) el espacio periplásmico puede contener mucho menos y muy pocas proteínas que el citoplasma, simplificando la purificación (v) puede haber menos proteasas que en el citoplasma, el cual puede reducir la digestión y perdida de proteína; y (vi) proteínas expresadas pueden liberarse fácilmente con otras proteínas periplásmicas interrumpiendo específicamente las membranas externas, sustancialmente libres de las proteínas citoplásmicas más abundantes. El producto de interés puede también excretarse por la célula dentro del medio. 4. Fermentación El microorganismo puede utilizarse para producir productos deseados en fermentaciones en lote, en donde la cantidad requerida completa de la fuente de carbono puede agregarse en el comienzo de la fermentación. Sin resistir la capacidad de las células modificadas para ajustar el consumo de fuentes de carbono a la disponibilidad del oxígeno, las cepas pueden utilizarse también para producir productos deseados en fermentaciones de proceso en lotes. La tasa de alimentación de la fuente de carbono puede ser cualquier cantidad la cual produce la concentración tolerada máxima, pero es de preferencia la cantidad mínima requerida para mantener la tasa de crecimiento máxima. Las cepas pueden también utilizarse para producir productos deseados en modos continuos o de "quimiostato" de fermentación, los cuales pueden permitir el mantenimiento de una tasa de dilución más elevada . El microorganismo puede utilizarse para procesos de fermentación en un medio sintético o natural que contiene al menos una fuente de carbono y al menos una fuente de nitrógeno que puede utilizarse por la cepa en virtud de que posee la o las trayectorias metabólicas necesarias y, como es apropiado, sales inorgánicas, factores de crecimiento y similares.

Ejemplos ilustrativos de fuentes de nitrógeno adecuadas incluyen, pero no se limitan a: amoniaco, incluyendo gas de amoniaco y amoníaco acuoso; sales de amonio de ácidos inorgánicos u orgánicos, tales como cloruro de amonio, fosfato de amonio, sulfato de amonio y acetato de amonio; y otras sustancias que contienen nitrógeno, incluyendo aminoácidos, extracto de carne, peptona, molasas, licor de maíz macerado, hidrolisato de caseína, hidrolisato de torta de soya y extracto de levadura. Algunos aminoácidos presentes individualmente en un medio salino mínimo no pueden utilizarse bien por bacterias como fuentes de carbono. Cada especie de bacteria difiere en su capacidad para utilizar cada aminoácido natural. Los aminoácidos que no se utilizan individualmente pueden utilizarse bien en la presencia de otros aminoácidos, por ejemplo la serina pueden utilizarse como una fuente de carbono únicamente si la glicina, leucina, isoleucina y valina se presentan. En un medio rico, tales mezclas de aminoácido sintético, varios aminoácidos pueden utilizarse de preferencia y se consumen antes que otros aminoácidos. La serina, prolina, glicina, aspartato, treonina, glutamato y alanita pueden removerse completamente de una mezcla de 16 aminoácidos presentes en casaminoácidos, un constituyente de un medio popular, mientras los otros se utilizan más lenta e incompletamente. Resultados similares se obtienen en caldo de triptona. Si es deseable para re-utilizar aminoácidos acumulados como metabolitos finales, luego el aminoácido puede ser de preferencia serina, prolina, glicina, aspartato, tretonina, glutamato o alanina, y el medio puede contener los aminoácidos adicionales necesarios para estimular su uso como una fuente de carbono. El medio puede contener también un hidrolisato de proteínas incluyendo, pero sin limitarse a triptonas, casaminoácidos e hidrolisatos de soya. La presente invención tiene aspectos múltiples, ilustrados por los siguientes ejemplos no limitantes.

EJEMPLO 1 Incorporación y Metabolismo de Sacarosa Regulada por Oxígeno La cepa que cataboliza sacarosa (Suc+) de E. coli K-12 se produjo reemplazando el gen sodA nativo con el módulo de metabolismo de sacarosa de E. coli 0157 :H7 como se muestra en la Figura 3. Los genes se re-configuran a partir de su configuración original dentro del módulo invirtiendo el gen cscB y colocándolo en línea con cscK. El gen cscR se omitió debido a que la región de promotor-operador se reemplazó por los elementos promotores y reguladores del gen sodA . Se debe observar que la cepa podría también haber sido producida sin cscK, ya que la actividad del producto genético es redundante a aquel del gen fruK de E. coli K-12. La cepa podría también haber sido producida introduciendo el módulo de metabolismo de sacarosa en un plásmido o dentro del genoma bajo control de un promotor separado, tal como sodA . Los cebadores 1 (Pl) y 2 (P2) se diseñaron para amplificar tanto cscK y cscB como una pieza de 2.2 Kb sencilla (Figura 4b) . La secuencia para Pl fue: 5'-CCCACGGAGTGGCTGTGCTGCAACATGGAGCACTCTGGCTACTGGGTTAAGTCAGATGAAT TTAAGGGAA-3' (SEQ ID NO. 1), la cual tiene un traslape de 50 pb con el extremo 3' del gen cscA y 20 pb del extremo 5' del gen cscK incluyendo la región del sitio de enlace de ribosoma (RBS) del gen cscK. La secuencia para P2 es: 5'-CAAAACCACATCAATTGAAACGCTGTTTTATTTTATCGGATCATTGTTTCTATATTGCTGA AGGTACAG-3' (SEQ ID NO: 2), la cual tiene 50 pb de la secuencia extremo 3 ' después de la región terminador so A y 20 pb del extremo 3' del gen cscB . Los cebadores 3 y 4 se diseñaron para amplificar cscA (1.4 kb) (Figura 4a) de ADN genómico 0157 :H7. La secuencia para P4 es: 5'-CTGCTTACGCGGCATTAACAATCGGCCGCCCGACAATACTGGAGATGAATATGACGCAATC TCGATTGCA-3' (SEQ ID NO: 4), la cual tiene 50 pb de la secuencia promotora sodA incluyendo el RBS . La secuencia para P3 es: 5' -TTAACCCAGTAGCCAGAGTC-3' (SEQ ID NO: 3), la cual equivale la secuencia de extremo 3' del gen cscA . En el primer ciclo de PCR para amplificar cscA o cscKB, se llevó a cabo una reacción de PCR de 50 µl en un tubo que contiene 100 ng del ADN genómico de 0157 :H7, 50 pmoles de cada cebador, 0.2 mM de dNTPs, y 2.5 U pf pfu polimerasa. Para la amplificación de cscA, la reacción pasó de 1 ciclo de 1 minutos a 95°C, 25 ciclos de 1 minutos de desnaturalización a 95°C; 15 segundos de recocido a 55°C, y 4 minutos de extensión a 72 °C, luego un ciclo final de 10 minutos de extensión a 72 °C. Para la amplificación de cscKB, la reacción pasó el mismo ciclo como en lo anterior excepto la temperatura de recocido fue 48°C. En el segundo ciclo de reacciones de PCR recombinantes, una cantidad molar igual de productos de cscA y cscKB se mezclaron como plantillas en una reacción de 50 µl que contiene 50 pmoles de cada cebador, 0.2 mM de dNTPs, y 2.5 U de Pfu polimerasa. La reacción pasó de 1 ciclo de 5 minutos a 95°C, 5 ciclos de 30 segundos de desnaturalización a 95°C, 30 segundos de recocido a 65°C; y 7.5 minutos de extensión a 72 °C, luego 25 ciclos de 1 minuto de desnaturalización a 95°C; 7.5 minutos de extensión a 72°C y un ciclo final de 10 minutos de extensión a 72 °C. El producto resultante fue el tamaño esperado de 3.7 kb (Figura 4c) . Los productos de PCR recombinantes contuvieron 50 pb de secuencia sodA 5', cscA, cscK, cscB y 50 pb de la secuencia de extremo 3' después del terminador sodA . De este modo, el operón cscAKB a partir de 0157 :H7 se colocó bajo control del promotor sodA de MG1655, para producir MG1655 sodA : esc . Los productos de PCR se purificaron y utilizaron para electroporación del mutante sodA.-:Tn5 de MG1655, conteniendo el plásmido pKD46. Las células MG1655 no pueden desarrollar un medio M9 conteniendo 1% de sacarosa como la única fuente de carbono, como se muestra en la Figura 5a. Las células transformadas que contienen el operón cscAKB, sin embargo, fueron capaces de desarrollarse en el mismo medio después de 2 días a 30°C en la presencia de ampicilina (100 µg/ml de concentración final) como se muestra en la Figura 5B.

EJEMPLO 2 Metabolismo de Sacarosa Regulado por Oxígeno La invertasa puede ser el cuello de botella a través del cual el metabolismo de sacarosa debe fluir. Como una enzima citoplásmica, la invertasa puede invertirse más rápidamente que una proteína de membrana. Esto es importante para lograr una desconexión rápida de función. De hecho, la tasa de su degradación puede acelerarse si es necesario por etiquetas de ubiquitina y otras modificaciones. En contraste, los niveles de cscB son poco probables para regularse rápidamente ya que el symporter es una proteína de membrana. Como un resultado, se produjo la cepa Suc+ mostrada en la Figura 6. La construcción proporciona un operón separado para controlar independientemente el symporter cscB de sacarosa utilizando un promotor lac . Como en lo anterior, el gen de fructocinasa (csafC) puede ser innecesario.

Los cebadores 4 y 5 se diseñaron para amplificar cscA (1.4 kb) de ADN genómico 0157 :H7. P4 fue el mismo cebador descrito en el Ejemplo 1. La secuencia para P5 es: 5 ' -CAAAACCACATCAATTGAAACGCTGTTTTATTTTTATCGGATCATTGTTTTTAACCCA GTAGCCAGAGTG-3' (SEQ ID NO: 5) . De este modo, el gen cscA se flanquea por 50 pb de secuencias 5' y 3' de sodA { sodAp- cscA-sodAt) . Los cebadores K5 y B3 se diseñaron para amplificar tanto cscK como cscB en una pieza (2.2 kb) (Figura 7a) . La secuencia para K5 es: 5 ' -GTAAGTCAGATGAATTTAAGGGAA-3 ' (SEQ ID NO: 6) , la cual incluye la región RBS del gen cscK. La secuencia para B3 es: 5 ' -CTATATTGCTGAAGGTACAGGCGT-3 ' (SEQ ID NO: 7) , la cual tiene 20 pb del extremo 3' del gen cscB. La PCR se lleva a cabo para amplificar cscA o cscKB . Una reacción de PCR de 50 mi se llevó a cabo en un tubo que contiene 100 ng de ADN genómico 0157, 50 pmoles de cada cebador, 0.2 mM de dNTPs y 2.5 U de Pfu polimerasa. La reacción pasó de 1 ciclo de 1 minutos a 95°C, 25 ciclos de 1 minuto de desnaturalización a 95°C; 15 segundos de recocido a 55°C, y 4 minutos de extensión a 72°C, luego un ciclo final de 10 minutos de extensión a 72°C. Cuatro microlitros del producto cscKB se clonó en un vector pCR-Blunt (Invitrogen) en el sitio EcoRI para crear pFDl . De este modo, el producto cscKB se colocó bajo el control de un promotor Plac inducible. El fragmento terminador Plac-cscKB de 2.7 kb se removió del plásmido por digestión PvuII y se purificó en gel (Figura 7b) . Este fragmento se sub-clonó en el sitio S al de pJ 23, el cual contiene un sitio att. El nuevo plásmido, nombrado pFD6 , se digirió entonces con No ti , y el fragmento más grande se recuperó después de la purificación del gel. Este fragmento, que contiene el terminador Plac-cscKB se volvió a ligar para generar pFD7. Los plásmidos pFD7 y pJW289 se co-transformaron en un mutante sodA : :Tn5 de MG1655 o MDS42 (sin pKD46) para permitir la integración. El plásmido pJ 289 se curó después como se describe previamente. El plásmido pKD46 se introdujo de nuevo al huésped curado para recombinación. El producto PCR de sodAp- cscA-sodAt se utilizó entonces para transformar el nuevo huésped para permitir la recombinación. Las células transformadas se colocaron en placas en un medio M9 que contiene 1% de sacarosa como una fuente única de carbono. Las transformantes capaces de desarrollarse en el medio tienen un fenotipo Suc+.

EJEMPLO 3 Control de Metabolismo de Sacarosa por un Promotor Sensible a Oxígeno y la Incorporación de Sacarosa por un Represor de Sacarosa para Bacterias Positivas de Sacarosa El tercer ejemplo preserva el represor de sacarosa CscR para controlar el nivel de sacarosa en la célula en una forma normal para cepas positivas de sacarosa tales como 0157 :H7. Este esquema es equivalente a trasplantar el gen cscA a partir de la posición normal en el operón de sacarosa de 0157 :H7 en el operón sodA . Este método de control puede ser el más efectivo en regular acetato debido a que el grupo de sacarosa se fijará y la única función controladora es el nivel de invertasa, la enzima de cuello de botella. El gen cscR se elimina a partir de este esquema, lo cual resulta en el transporte constitutivo de sacarosa y actividades de fructocinasa . Como en lo anterior, el gen sodA puede reemplazarse ya sea por cscA o combinarse en serie con cscA como se muestra en la Figura 8. Los cebadores 4 y 5 se diseñaron para amplificar cscA (1.4 kb) del ADN genómico 0157. P4 y P5 se describieron en el Ejemplo 1. De este modo, el gen cscA se flanquea por 50 pb de secuencias 5' y 3' de sodA . Los cebadores ProK5 y B3 se diseñaron para amplificar tanto cscK como cscB en una pieza (2.2 kb) . La secuencia para ProK5 es: 5'-AAGAGGTTTATCACTAACATTTTGTG-3' (SEQ ID NO: 8), la cual incluye la región promotora completa del gen cscK. La secuencia para B3 fue la misma como se describe anteriormente. La PCR se llevó a cabo para amplificar cscProK-B (2.3 kb) (Figura 9a) . Una reacción de PCR de 50 µl se llevó a cabo en un tubo que contiene 100 ng de ADN genómico 0157, 50 pmoles de cada cebador, 0.2 mM de dNTPs y 2.5 U de Pf"u polimerasa. La reacción pasó de 1 ciclo de 1 minuto a 95°C, 25 ciclos de 1 minuto de desnaturalización a 95°C; 15 segundos de recocido a 55°C; y 4 minutos de extensión a 72°C, luego un ciclo final de 30 minutos de extensión a 72°C. Cuatro microlitos del producto cscProK-B se clonó en un vector pCR-Blunt (Invitrogen) para crear pFD8. El fragmento cscProK-B se cortó como un fragmento HindlII-X.foal (2.7 kb) (Figura 9b) y se sub-clonó en pJW23, el cual tiene un sitio att . El nuevo plásmido pFD14 se cortó entonces con Notí , y el fragmento más grande se recuperó después de la purificación de gel. Este fragmento, que contiene el terminador cscProK-B se volvió a ligar para producir pFD15. Los plásmidos pFD15 y pJ 289 se co-transformaron en un mutante sodA : : Tn5 de MG1655 o MDS42 (sin pKD46) para permitir la integración. Ambos plásmidos se curaron después como se describe previamente. Los plásmidos pKD46 se introdujeron entonces de nuevo en el huésped curado. Los productos de PCR de cscA se utilizaron entonces para transformar los nuevos huéspedes anteriores para permitir la recombinación. Las células transformadas se colocaron en placas en un medio M9 que contiene 1% de sacarosa como una fuente única de carbono. Las transformantes capaces de desarrollarse en el medio tienen un fenotipo Suc+.

EJEMPLO 4 Crecimiento Regulado por Oxígeno de Metabolismo de Sacarosa El crecimiento dependiente aeróbico de la cepa MG1655 sodA : : esc del Ejemplo 1 se examinó utilizando sacarosa como una fuente única de carbono y de energía y monitoreando el crecimiento en todo el ciclo aeróbico-anaeróbico-aeróbico. El ciclo se inició alternando el fermentador a partir de aire a una mezcla de 95:5 de Nitrógeno y dióxido de carbono, y luego de regreso al aire después de un intervalo adecuado en 500 mi de fermentaciones de agitación por aire. La Figura 10 representa una curva de crecimiento típica de la cepa en un medio MOPS mínimo con 1% de sacarosa como la única fuente de carbono y de energía. La carencia de crecimiento bajo condiciones anaeróbicas indica que las células no fueron capaces de catabolizar la sacarosa. En contraste, el crecimiento de MG1655 sodA : : csc en glucosa más sacarosa está relativamente sin cambios por cambios en el gas de expansión, ya que el transporte de glucosa y la glicólisis no se afectan únicamente por el estado aeróbico o anaeróbico del cultivo. La Figura 11 describe los resultados de dos fermentaciones de agitación por aire, una llevada a cabo en un medio MOPS mínimo que contiene 0.4% de sacarosa como la única fuente de carbono y de energía y una llevada a cabo en el mismo medio suplementado con 0.2% de glucosa, además de 0.4% de sacarosa como una fuente de carbono y de energía. La cepa no se desarrolló en sacarosa debido a condiciones anaeróbicas, pero continuó para catabolizar glucosa si se presentó o no el oxígeno. Además de que las gráficas de crecimiento mostradas en las Figuras 10 y 11 se confirman por la observación de que los conteos celulares viables totales no cambiaron en toda la fase anaeróbica en la sacarosa únicamente en el cultivo, mientras continuaron para incrementarse cuando la glucosa exógena se presentó (mostrada en la Figura 12A) . Esto indica que no existe restricción bioquímica en glicólisis y que la glucosa producida a partir de sacarosa (por la acción de los productos genéticos esc) pudo soportar el crecimiento anaeróbico si ocurre. La carencia de crecimiento en la sacarosa bajo condiciones anaeróbicas se debe por lo tanto a la carencia de transcripción de los genes esc a partir del promotor sodA dependiente de oxígeno. Además, los perfiles de pH (Figura 12B) demuestran que el crecimiento en sacarosa genera muy poco ácido, mientras que el cultivo que contiene tanto sacarosa como glucosa produce una gran cantidad de ácido. Esto también respalda el concepto de que poco o ningún catabolismo de sacarosa toma lugar durante la fase anaeróbica de la fermentación ya que la asimilación anaeróbica de la glucosa se conoce para generar grandes cantidades de acetato y formiato. La incapacidad de crecimiento del cultivo en sacarosa para producir cualquier ácido durante el curso del cambio anaeróbico indica que poca o ninguna glucosa está disponible dentro de la célula en la ausencia de oxígeno.

EJEMPLO 5 Control del Sistema de Carbohidrato PTS por un Promotor Sensible a Oxígeno El reemplazo de los promotores de PTS nativos con el promotor de sodA se ilustra en las Figuras 13 y 14. La construcción deseada se produce en tres etapas. La primera etapa implica la producción de dos productos de PCR separados que comparten una secuencia única homologa a sus objetivos cromosomales en un extremo, así como una secuencia común que permite la fusión de los dos productos de PCR en los extremos opuestos. El primero de los productos de PCR iniciales incluye 45 bases de secuencias homologas al extremo 3' del gen cysK, el gen de cloranfenicol acetil -transferasa (CAT) completo más su promotor así como una secuencia enlazadora no codificante para proporcionar homología al segundo producto de PCR (descrito posteriormente) . El gen CAT se amplifica a partir del plásmido pACYC184 utilizando un cebador designado como Oligo 1 con la secuencia 5 ' -gcattgtttgccgatctcttcactgag aaagaattgcaacagtaaTTACGCCCCGCCCTGCCACTCATCG-3' (SEQ ID NO: 9) , en donde la secuencia en minúsculas es homologa al extremo 3' de cysK y la secuencia en mayúsculas es homologa al extremo 3' del gen CAT. El segundo oligo en la reacción de PCR se designa Oligo 3 con la secuencia 5'-acaaacctgaattttaagtccagtacctaCGACGCACTTTGCGCCGAATAAATACCTG-3' (SEQ ID NO: 10) en donde la secuencia en minúsculas es la secuencia no codificante homologa con el segundo producto de PCR y la secuencia en mayúsculas es homologa al extremo 5' de la región promotora CAT. Una reacción de PCR de 50 µl se lleva a cabo en un tubo que contiene 1 ng de ADN de pACYC184, 50 pmoles de cada cebador, 0.2 mM de dNTPs y 2.5 U de Pfu polimerasa. La reacción pasó de 1 ciclo de 1 minuto a 95°C, 30 ciclos de 1 minuto de desnaturalización a 95°C; 15 segundos de recocido a 55°C; y 2 minutos de extensión a 72°C, luego un ciclo final de 10 minutos de extensión a 72 °C. El segundo de los productos de PCR inicial incluye una secuencia no codificante corta que proporciona homología al primer producto de PCR, el promotor sodA dependiente de oxígeno intacto y 45 bases de secuencia homologa al extremo 5' del gen ptsH. La región promotora sodA se amplifica a partir del ADN cromosomal E. coli utilizando un cebador designado como Oligo 2 con la secuencia 5 ' -tgttttggactt aaaattcaggtcatggatAATGCGTCGACTCCTGCAAAACCATACCCT-3' (SEA ID NO: 11) en donde la secuencia en minúsculas es la secuencia no codificante homologa con el primer producto de PCR y la secuencia en mayúsculas es homologa al lado 5' de la región promotora sodA del cromosoma E. coli . El segundo oligo de esta reacción de PCR se designa Oligo 4 con la secuencia 5'-gggtgtgcagaccgttcggagcggtaatggtaacttcttgctggaaCATATTCATCTCCAG TATTGTCGGG-3' (SEQ ID NO: 12), la secuencia en minúsculas es homologa al extremo 5' de ptsH y la secuencia en mayúsculas es homologa al lado 3' del promotor sodA . Este oligo efectivamente reemplaza el codón de inicio de sodA con el codón de inicio de ptsH. Una reacción de PCR de 50 µl se lleva a cabo en un tubo que contiene 100 ng de ADN MG1655 de E. coli , 50 pmoles de cada cebador, 0.2 mM de dNTPs y 2.5 U de Turbo Pfu . La reacción pasó de 1 ciclo de 2 minutos a 95°C, 30 ciclos de 1 minuto de desnaturalización a 95°C; 15 segundos de recocido a 55°C; y 1 minuto de extensión a 72°C, luego un ciclo final de 5 minutos de extensión a 72 °C. Los productos de PCR de cada reacción se recuperan a partir de geles de agarosa y se purifican en columnas de purificación Qiagen antes de un segundo ciclo de PCR. En esta reacción las dos primeras rondas de productos de PCR se desnaturalizan y se les permite volver a recocerse antes de la extensión. Se llevó a cabo una reacción de PCR de 50 µl en un tubo que contiene 5 ng de cada primera ronda del producto de PCR purificado, 0.2 mM de dNTPs, y 2.5 U de Pfu polimerasa. La reacción pasa de 1 ciclo de 2 minutos a 95°C, 10 ciclos de 1 minuto de desnaturalización a 95°C; 15 segundos de recocido a 55 °C; y 1 minuto de extensión a 72 °C.

Después de los primeros 5 ciclos 50 pmoles de Oligo 1 y Oligo 4 se agregan a las reacciones y las reacciones se continúan durante 25 ciclos adicionales, seguidas por un ciclo final de 5 minutos de extensión a 72 °C. La segunda ronda del producto de PCR se purifica utilizando una columna Qiagen y se transforma en MG1655 o MDS42 conteniendo pKD46 para permitir la integración. Integrantes estables se aislan como colonias resistentes a cloranfenicol . El plásmido pKD46 se cura como se describe previamente .

EJEMPLO 6 Crecimiento Regulado por Oxígeno de Metabolismo de Azúcar La regulación de transcripción del sistema de transporte de carbohidrato PTS a partir de promotores regulados por oxígeno reduce el papel que el sistema PTS juega en el consumo de azúcar bajo condiciones anaeróbicas. Aunque la glucosa u otros carbohidratos pueden aún absorberse mediante tasas de sistemas sin PTS de asimilación se reducen en gran medida ya que el sistema de PTS representa la estrategia de incorporación de azúcar a velocidad más elevada en E. coli . Un beneficio adicional para producir expresión de los genes ptsH y ptsl, los cuales juegan un papel común en todos los sistemas de PTS en E. coli baj o el control de un promotor regulado por oxígeno permite un punto sencillo de regulación para controlar el consumo de todos los azúcares de PTS. Por analogía directa con el modelo de sacarosa descrito en ejemplos anteriores, el crecimiento de cepas E. coli en otros azúcares puede restringirse para igualar más estrechamente la disponibilidad de oxígeno como un aceptor de electrones terminal por lo que se minimiza la producción de metabolitos de sobreflujo por la célula diseñada para un amplio rango de azúcares de PTS.

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES 1. Un microorganismo con flujo metabólico a partir de una fuente de carbono regulada por niveles de oxígeno. 2. El microorganismo de la reivindicación 1, en donde el microorganismo es un procariote. 3. El microorganismo de la reivindicación 2, en donde el procariote se selecciona del grupo que consiste de E. coli , Shigella, Salmonella, Corynebacter, Lactococcus y Streptomycetes . 4. El microorganismo de la reivindicación 1, en donde el microorganismo es un eucariote . 5. El microorganismo de la reivindicación 4, en donde el eucariote es una levadura. 6. El microorganismo de la reivindicación 5, en donde la levadura se selecciona del grupo que consiste de S. cerevisiae y S. pombe . 1 . El microorganismo de la reivindicación 1, en donde la fuente de carbono se selecciona del grupo que consiste de glucosa, fructosa, galactosa, mañosa, sacarosa, maltosa, N-acetilglucosamina, ß-glucósidos, manitol, celobiosa, sorbosa, glucitol y galactitol. 8. El microorganismo de la reivindicación 1, en donde el microorganismo comprende un promotor regulado por oxígeno unido operativamente a un gen que codifica una proteína de un sistema de fosfotransferasa dependiente de piruvato de fosfoenol. 9. El microorganismo de la reivindicación 1, en donde el microorganismo comprende un promotor regulado por oxígeno operativamente unido a un gen que codifica un módulo de metabolismo de sacarosa 0157 :H7 de E. coli . 10. El microorganismo de la reivindicación 8, en donde el gen codifica una proteína de fusión que comprende la proteína del sistema de fosfotransferasa dependiente de piruvato de fosfoenol y ubiquitina. 11. El microorganismo de la reivindicación 9, en donde el gen codifica una proteína de fusión que comprende la proteína del módulo de metabolismo de sacarosa 0157. H7 de E. coli y ubiquitina. 12. Un método para regular flujo metabólico en un microorganismo, que comprende cultivar el microorganismo de la reivindicación 1, bajo condiciones de nutrientes adecuadas y concentraciones de oxígeno para producir un flujo metabólico deseado. 13. Un método para reducir la producción de metabolitos de sobreflujo en el microorganismo, el método comprende cultivar el microorganismo de la reivindicación 1, bajo condiciones de nutrientes y bajo concentraciones de oxígeno bajo, sobre o en un nivel de umbral de oxígeno por lo que se altera el flujo de carbono a través de una o más trayectorias metabólicas que producen los metabolitos de sobreflujo . 14. Un microorganismo, que comprende un promotor sensible a oxígeno, los promotores son capaces de regular flujo metabólico de una fuente de carbono a través de una o más trayectorias metabólicas del microorganismo y en donde el promotor sensible al oxígeno se une operativamente a un gen heterólogo no naturalmente bajo el control de transcripción del promotor sensible a oxígeno.