KR101313846B1

KR101313846B1 - 산소-조절성 미생물

Info

Publication number: KR101313846B1
Application number: KR1020087008300A
Authority: KR
Inventors: 프레드릭 알. 블라트너; 존 월터 캠벨; 니안 시; 버피 스탈
Original assignee: 스캐랩 게노믹스, 엘엘씨
Priority date: 2005-09-08
Filing date: 2006-09-08
Publication date: 2013-10-01
Also published as: EP1922404B1; MX2008003242A; US20090053792A1; EP1922404A2; CA2621280A1; US8900849B2; MX297190B; WO2007030790A3; CA2621280C; KR20080055887A; WO2007030790A9; WO2007030790A2; JP5006325B2; JP2009507490A

Abstract

본 발명은 산소-조절성 물질대사를 가지는 미생물의 신규한 균주들에 관한 것이다. 이 미생물은 모체 균주들보다 더 높은 성장률을 가지고, 더 효율적이다. 이 미생물은 재조합 단백질, DNA와 같은 핵산, 아미노산, 화학제품 같은 목표하는 다양한 생성물들을 생산하기 위해 사용될 수 있다.

미생물, 산소-조절성 프로모터, 물질대사, 물질대사 흐름(flux), 유전자

Description

산소-조절성 미생물{OXYGEN-REGULATED MICROORGANISMS}

본 출원은, 여기에 참조로서 포함되어 있는 2005년 9월 8일에 출원된 미국 임시 출원 번호 60/715,702호와 2006년 8월 18일에 출원된 국제 출원 PCT/2006/032525호를 우선권으로 주장한다.

본 발명은 미생물들의 신규한 균주들과 이런 미생물들을 포함한 발효 과정들에 관한 것이다. 더 구체적으로는, 본 발명은 미생물들의 유전적으로 변형된 균주들과 재조합 단백질들, 핵산들, 아미노산들, 그리고 전문 화학제품들 같은 상업적 제품들의 생산을 위한 용도에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 그런 용도들을 위한 미생물들의 균주들을 생산하는 방법들에 관한 것이다.

박테리아 같은 미생물들은 바이오의약품들, 백신 성분들, 플라스미드 DNA들, 백신 DNA들, 그리고 아미노산들을 포함하는 많은 전문 화학제품들을 제조하기 위한 산업 공정들에서 광범위하게 사용된다. 산업 공정들에서 사용되는 박테리아는 전형적으로 탄소의 원료로서 글루코오스가 보충되는 액체 배양액에서 자란다. 용적 생산성 최대화, 전문 화학 제품들의 생산, 그리고 박테리아의 유지가 가능한 높은 밀도들로 박테리아가 자라기 위한 산업 공정들에서는, 많은 양의 글루코오스가 필요하다. 박테리아는 빠른 속도로 물질대사 산물들을 흡수하고 동화한다. 물질대사 산물들의 흐름(flux)이 너무 높아서 특정 물질대사 산물들의 농도가 올라감에 따라 박테리아의 중앙 탄소 경로들에서 하나 또는 그 이상의 생화학 반응들을 압도한다. 박테리아는 하나 또는 그 이상의 "오버플로우(overflow)" 경로들을3 사용함으로써 물질대사 산물들의 높은 농도를 처분한다.

E. 콜라이는 높은 세포 밀도 발효 동안 산소가 결핍되었을 때, 아세테이트(acetate)를 분비하는 경향이 있다. 그 근본 원인은 O₂보다 다른 수용체에 전자들의 처분을 위한 세포에 있어서의 필요에 의해서이다. 근접한 원인은 O₂존재하에서 보통 TCA회로(TCA cycle)에 의해 태워지는 해당작용의 산물인 아세틸-코에이(acetyl CoA)의 세포 내 축적이다. 그러나, O₂가 낮은 수준으로 존재할 때, TCA 회로는 아세틸-코에이를 효율적으로 물질대사할 수 없고, 따라서 그것은 세포 안에 쌓이게 된다. 과량의 아세틸-코에이는, 세포로부터 전자를 제거하기 위한 다른 유기산들과 함께 배출되는 아세테이트(acetate)로 변환된다. 이것은 야생에서 대장균의 생존가능하나 느린 물질대사의 해답을 제공하지만, 산업적인 발효조들에서는 세포 밀도가 더 높은 수준으로 되기 때문에 과량의 아세테이트는 독성이 있는 수준으로 축적될 수 있다.

이 문제는 전통적으로,배치발효에 의하여 공급될 때에 제기되어 왔으며, 여기에서 탄소체는 계량적으로 배양액에 공급되어 세포성장이 공급되는 산소에 상응하는 수준으로 제한된다. 탄소원이 측정됨에도 불구하고, 산소 이용은 결국 높은 세포 밀도에서 제한되게 된다. 낮은 산소 영역에서 분비되는 아세테이트(acetate)가 더 많은 산소가 있는 영역으로 운반되는 세포들에 의해 회수될 수 있음에도 불구하고, 이것은 물질대사적으로 비효율적이고, 결국, 더 많은 세포들이 쌓일수록, 배치기술에 의하여 공급됨에도 불구하고 아세테이트 수준은 끊임없이 상승한다. 유기산 수준이 배양액의 버퍼링 용량을 넘어 상승하기 때문에, pH는 공장 직원의 주의와 부가적인 기구를 필요로 할 뿐만 아니라, 발효조 폐기물 흐름에서 염 적재량뿐 아니라 하류 생성물 정화의 복잡함을 증가시킬 수 있는 NaOH 같은 미네랄 염기의 적정으로 유지된다. 오버플로우 물질대사를 최소화함으로서 특정 생성물 형성을 증가시키는 발효 조치는 그 기술에서 중요한 개선을 의미한다.

본 발명은 다양한 형태들로 실시되어 질 수 있으며, 산소수준에 의하여 조절되는 탄소원으로부터 대사흐름을 가지는 미생물을 제공한다. 미생물은 E. 콜라이(E. coli, 쉬겔라(Shigella), 살모넬라(Salmonella), 코린박터(Clrynebacter), 락토코커스(Lactococcus) 또는 스트렙토마이세테스(Streptomycetes)와 같은 원핵생물이다. 미생물은 또한 이스트와 같은 진핵생물일 수 있다. 이스트는 사카로마이세스 세레비시아에(Saccharomyces cerevisiae), 쉬조사카로마이세스 폼비(Schizosaccharomyces pombe) 또는 피치아 종(Pichia species)일 수도 있다. 탄소체는 글루코오스, 후럭토오스, 갈락토오스, 만노오스, 수크로오스, 말토오스, N-아세틸글루코사민, β-글루코사이드, 만니톨, 셀로비오스, 소르보오스, 글루시톨 또는 갈락티톨일 수 있다.

미생물은 포스포에톨 파이루베이트-의존 포스포트란스페라제 시스템의 단백질을 코딩하는 유전자에 활동적으로 연계된 산소-조절 프로모터를 포함할 수도 있다. 미생물은 또한 E. 콜라이 O157.H7 슈크로스 대사모듈의 단백질을 암호화하는 유전자에 활동적으로 연계된 산소-조절 프로모터를 포함할 수도 있다. 산소-조절 프로모터에 활동적으로 연계된 유전자는 휴전 단백질(fusion protein)을 코딩할 수도 있다.
[008] 본 발명의 이들 다른 예들은 다음에 더욱 상세히 설명된다.
본 발명은 다양한 형태들로 실시되어 질 수 있는 반면, 여러 실시예들의 아래의 설명은, 본 명세서가 발명의 예시로서 고려되기 위한 것이고, 기재된 특정의 실시예에 발명을 한정하는 의도는 아니다. 표제는 단지 편의를 제공하고, 어떤 방식으로도 그 발명을 한정하는 것으로 해석되는 것은 아니다. 어느 표제하에서 설명된 실시에들은 어느 다른 표제하에서 설명된 실시예들과 결합될 것이다.
만일 명백히 지시된 바가 없다면 이 출원에서 특정된 다양한 범위들의 수적인 값들의 사용은, 기술된 범위들에서 최소값과 최대값은 "약"이라는 용어가 앞서게 됨으로서 근사치로서 기술된다. 이러한 방법으로 기술된 범위의 위 아래의 약간의 변동은 범위들 내의 값들로서 실질적으로 같은 결과를 위해 사용될 수 있다. 여기서 수적인 값을 언급할 때 사용된 "약" 및 "대략"이란 용어들은 당업자에게는 명백하고 보통의 의미를 가질 것이다. 또한, 범위의 명세는 형성될 수 있는 어떤 범위뿐 아니라 인용된 최소값 및 최대값 사이에 모든 값을 포함하는 연속적인 범위로서 의도된다. 이것은 유한의 상부 및/또는 하부의 한도를 포함하거나 하지 아니하게 될 수 있는 범위를 포함한다. 따라서, 당업자는 많은 그런 비율, 범위 그리고 비율의 범위가 여기 존재하는 데이터 그리고 숫자들과 본 발명의 모든 대표적인 실시예들로부터 명백하게 유도될 수 있다는 것에 감사할 것이다.
한 실시예에서, 본 발명은 산소 수준에 의해 조절되는 물질대사 흐름(flux)을 가진 미생물과 관련된다. 이 미생물이 산소의 임계치이하의 수준의 환경에 있을 때 물질대사의 흐름은 감소한다. 낮은 산소 수준에서 물질대사 흐름이 감소함에 따라, 감소된 산소 환경에서 만들어진 의도하지 아니한 물질대사산물을 위해 오버플로우(overflow) 물질대사는 감소할 것이다. 산소 수준이 임계치 수준위로 증가될 때, 물질대사 흐름은 증가될 것이다. 배양액에서, 충분한 산소를 가진 미세환경과 효율적인 생성물 합성을 위해 불충분한 산소를 가진 미세환경이 있을 것이다. 미생물은 다양한 산소 수준하에서 스스로 조절되는 물질대사 흐름을 할 수 있을 것이고, 결국 오직 효율적인 생성물의 형성을 가능하게 하는 조건하에서 기질을 소비한다.
산소 수준의 기능으로서 물질대사율을 조절함으로서, 아세테이트와 다른 바람직하지 않은 오버플로우 물질대사산물의 생산에서 감소가 있을 것이다. 미생물이 스스로 조절하는 물질대사를 함에 따라, 목표하는(interest) 생성물은 더 효율적이고 비용이 덜 들게 생산될 것이다.

삭제

1. 미생물

미생물은 어느 모체 미생물로부터 기원된다. 대표적인 모체 미생물은 American Type Culture Collection으로부터 얻을 수 있다. 그 외의 대표적인 모체 미생물은 S.Y.Lee에 “High Density Culture of Escherichia coli”에 기재되어 있다.(Tibtech 14:98-103(1996)). 모체 미생물은 효모와 같은 진핵생물일 수 있다. S.cerevisiae, S.pomhe, Pichia 종을 포함하며 그 외의 종도 포함될 수 있다. 미생물의 모체는 박테리아 같은 원핵생물일 수도 있으며 chemoheterotrophic organotroph일 수도 있다. 대표적 예인 박테리아는 E.coli, Shigella, Salmonella, Corynebacter, Lactococcus, Streptomycetes을 포함하며 이들 이외의 종도 포함될 수 있다.

미생물은 환원형의 게놈 박테리아처럼 환원형의 게놈 미생물일 수도 있다. 미생물의 게놈에 포함된 많은 유전적 정보는 말단 물질대사물질 생성에 영향을 주지 않고 삭제될 수 있다. 게다가, 환원형의 게놈을 포함하는 미생물은 목표하는 물질 생산의 장점을 가질 수 있다. 그 예로서 환원형의 게놈은 모체 생성 물질이나 자체적으로 생산되는 물질량이 적어 관심 물질을 정제, 분리하는데 필요한 복잡한 과정을 줄일 수 있다. 또한, 환원형의 게놈은 물질대사적인 요구 물질이 적고, 목표하는 물질을 효율적으로 생산할 것이다. 환원형의 게놈 박테리아는 U.S. Patent No. 6,989,265에 기재되어 있으며 본 발명에 참고문헌으로 예시되어 있다. 천연 원형질막 내 단백질(natural periplasmic proteins)을 한정적으로 생산하는 환원형의 게놈 박테리아는 원형질막 내에서 재조합 단백질을 생산하는데 유리할 수 있다. 이에 적합한 환원형의 게놈 박테리아 균주의 예들은 아래와 같으나 이것에 한정되지는 않는다. MDS12, MDS13, MDS39, MDS40, MDS41, MDS42, MDS43, MDS44, MDS45, MDS46, MDS47, MDS48, MDS49, MDS50, MDS51, MDS52, MDS53, MDS54, MDS55, MDS56, MDS57, MDS58, MDS59 및 MDS60. 환원형의 게놈 미생물은 또한 한 개 혹은 한 개 이상의 미생물의 유전자나 오페론(operon)으로부터 도출될 수 있다.

2. 산소-조절되는 물질대사 흐름

산소농도는 미생물 내의 탄소원(carbon source)에 대한 물질대사 흐름을 조절할 것이다. 탄소원의 물질대사는 탄소원의 수입에서 조절되어 질 수 있다. 예로서 탄소 흡수에 관여하는 단백질의 발현은 산소로 조절되는 프로모터에 의해 제어될 수 있다.

탄소원의 물질대사는 세포내막의 첫 번째 물질대사 단계에서 조절되어 지며 첫 번째 단계 이후 탄소원 혹은 다음 물질대사 단계를 활성화 시키거나 통합하여 행하여 진다. 예로 당분해(glycolysis) 혹은 당분해를 위한 탄소원으로부터 기질로의 전환에 관여하는 단백질의 발현은 산소-조절되는 프로모터에 의해 제어될 수 있다.

a. 탄소원(Carbon source)

탄소원은 미생물 자체적으로 혹은 탄소원 물질대사에 관여하는 효소를 암호화(encoding)시키는 이종기원의 유전자(heterologous gene)나 오페론(operon)을 도입하는 방법으로 미생물의 증식 및/또는 물질대사에 관여하는 어느 탄소 물질을 일컬을 것이다. 탄소원은 글루코오스(glucose), 과당(fructose), 유당(galactose), 만노오즈(mannose)와 같은 단당류(monosaccharide)일 수 있다. 탄소원은 또한 슈크로오스(sucrose)와 같은 이당류(disaccharide)일 수도 있다. 다른 탄소원은 말토오스(maltose), N-아세틸글루코사민(N-acetylglucosamine), β-글루코사이드(β-glucosides), 만니톨(mannitol), 셀로비오스(cellobiose), 소르보오스(sorbose), 글루시톨(glucitol), 갈락티톨(galactitol) 등을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다.

박테리아는 탄소원을 포스포엔올피루베이트:탄수화물 인산전달효소(phosphopoenolpyruvate:carbohydrate phosphotransferase(PTS)) 시스템으로 생산한다. 대부분의 박테리아는 PTS 시스템으로 외부의 높은 질의 탄소원을 효율적으로 흡수(uptake)하고 물질대사 중 주요 이화작용을 행한다. PTS 시스템의 구성성분 발현은 산소-조절성 프로모터로 제어되며 이는 오버플로우 생산을 줄일 수 있다. 탄소원 흡수의 대체 경로는 잔존 산소로 제어되며 기질의 일부를 효율적으로 이용하여 발효과정을 통해 결과물을 생산한다.

PTS 시스템은, EI단백질(ptsH에 의해 암호화)이 인산기(phosphate group)를 Hpr단백질에 전달하고 Hpr단백질(ptsl에 의해 암호화)은 탄수화물 특정 EⅡA 소단위(대장균에서 글루코오스 특정 EⅡA 단백질을 crr 유전자에 의해 암호화시킴)를 인산화 시키고, 인산화된 EⅡA 소단위는 막 관련 단백질(membrane associated protein)이나 탄수화물 수송 복합체의 소단위와 반응하여 같은 기원의 당(cognate sugar)을 인산화시키며 내부로 유입(internalize)시키는 인산전달시스템(phospho-relay system)을 포함한다. 전체반응은 외인성(exogenous)의 당을 내부의 인산화 당으로 바꿈으로서 PEP를 피루베이트(pyrivate)로 전환시킨다.

E. 콜라이에서 보통의 PTS 원소, ptsH, pstl를 암호화하는 유전자는 crr 유전자를 가진 염색체와 연관된다. 3가지 유전자 모두 ptsH의 위쪽(upstream)에서 발견되는 프로모터 세트에 의해 전사된다. 또한 ptsl에 포함된 추가적 프로모터나 프로모터 쌍은 ptsl만을 포함하는 전사체(transcript)를 생성시킨다. ptsH의 위쪽(upstream) 프로모터의 발현은 혐기성 조건(anaerobic condition)에서 증가된다. 이 유전자의 과다 발현은 당 유입을 증가시키고 증가된 같은 기원의 당(cognate sugar)은 PTS 시스템을 활성화시킨다. 따라서 이 유전자들의 전사 증가는 불필요한 물질대사의 활성화를 야기하여 산소를 TCA 회로의 전자 수용체로 제한시키며 PTS 유전자의 발현을 증가시킴과 동시에 미생물의 수용가능한 당유입량을 증가시킨다. 선천적(native) ptsH 관련 프로모터를 산소-조절성 프로모터로 대체하면 산소에 의존적인 PTS 당 유입이 이루어질 수 있다. 따라서 탄소체의 소모는 산소에 의존적으로 이루어질 수 있다. 세포 내의 하나 또는 그 이상의 PTS 시스템 원소를 제어하여 다양한 탄소원의 활용 및/또는 이용가능성이 조절될 수 있다. 상기에서 언급된 바처럼, 탄소원의 활성과 유입은 불필요한 오버플로우 물질대사산물의 생산을 초래하여, 그들을 효율적으로 물질대사 시키기 위한 미생물의 능력을 초과할 수 있다. 덧붙여, 시키믹(shikimic) 산 경로에서 기원된 방향족 물질들 같이, PEP로부터 직접 기원한 화합물의 생산은 PTS 매개 당 운반을 위해 PEP의 소비에 의해 제한될 수 있다.

1) 수크로오스( Sucrose )

수크로오스(sucrose)는 미생물의 탄소원으로서 사용될 수 있다. 수크로오스는 글루코오스(glucose)와 프럭토오스(fructose)의 결합체인 이당류(disaccharide)이다. 수크로오스가 물질대사(분해)되기 위해서는 세포 내로 운반되고 단당체로 해체되어야 한다. 글루코오스와 프럭토오스로 해체된 후 당분해를 거쳐 글루코오스-6-인산염(glucose-6-phosphate)과 프럭토오스-6-인산염(fructose-6-phosphate)으로 될 수 있다.

대부분의 대장균의 균주를 포함한 많은 미생물들은 수크로오스에서 증식할 수 없다. 그러나 몇몇 균주들은 수크로오스를 단독의 탄소체로서 흡수하고 물질대사할 수 있는 유전자 시스템을 갖고 있다. 이런 유전자 시스템이나 혹은 이 시스템의 일부는 미생물에 도입되어 수크로오스를 탄소체로서 사용할 수 있다. 유전자는 미생물의 염색체나 플라스미드에 도입될 수 있다. 도입된 하나 혹은 그 이상의 유전자는 산소로 조절되는 프로모터의 조절 하에 위치할 수 있다. 수크로오스 외의 다른 탄소체의 흡수와 물질대사를 가능하게 하는 유전자의 도입 또한 고려해 볼 수 있다.

U.S Patent Nos. 6,365,723과 6,855,814는 참조로서 여기에 기재되어 있으며 수크로오스를 단독으로 흡수하고 물질대사하는 치밀한 유전자 시스템의 대표적인 예를 설명하고 있다. 도1은 E. 콜라이 O157:H7 수크로오스 물질대사 모듈이다. cscB 유전자 산물은 수크로오스를 세포 내로 유입시키며 cscA는 수크로오스 가수분해 효소(전화효소)를 암호화한다. 가수분해효소는 이당류인 수크로오스를 글루코오스와 프럭토오스로 해체시키고 cscK 유전자는 프럭토오스의 첫 번째 당 분해 효소인 프럭토카이네이즈(fructokinase)를 암호화 한다. 유전자 cscK 는 다른 프럭토카이네이즈와 높은 유사성을 보이고, 대장균 K-12의 fruK 유전자가 충분할 것이다. 그러나, E. 콜라이 K-12 세포는 전화효소와 수크로오스 가수분해효소의 활동이 부족할 것이다. cscR 유전자 산물은 전형적인 억제 단백질의 lacI-galR 계의 프로모터에 결합함으로서 수크로오스 사용가능성에 연관된 O157:H7 오페론의 유전자들의 발현을 조절하는 억제자이다.

b. 산소-조절성 프로모터

탄소체로부터 물질대사 흐름은, 탄소체의 물질대사에 수반된 하나 또는 그 이상의 단백질을 암호화하는 유전자에 연결되어 있는 산소 민감성의 프로모터들을 사용함으로서 조절되어 질 것이다. 산소 존재 하에서 작동되는 프로모터의 대표 예는 cyo 오페론과 과산화 불균등화효소(dismutase)(sodA) 내에 있는 프로모터이고, 그것은 산화적 피해에 대해 세포를 보호하는 효소를 암호화한다. 야생형의 K12 sodA의 염색체 부위는 도2에서 도시된다.

양성 산소 감수성 프로모터를 사용함으로서, 충분히 높은 산소 수준은, 오버플로우 물질대사산물의 생산 또는 이차적인 산물들의 생산을 최소화하는 반면 탄소체의 물질대사를 허용하는 단백질의 발현을 유도할 것이다. 프로모터의 응답시간은 산소 민감성 프로모터의 조절 하에서 세포질의 물질대사 단백질이 위치함으로서 증가 될 것이다. 반면, 비-세포질 단백질(e.q., 막간 단백질)은 다른 프로모터의 조절 하에 위치하거나 본질적으로 발현될 것이다.

물질대사가 줄어드는 산소 조건 하에서 감소되는 속도는, 물질대사 단백질의 물질대사회전율이 증가함에 따라 증가 될 것이다. 예를 들어, 탄소체의 물질대사와 연관된 단백질은 유비퀴틴을 가진 융합 단백질로서 발현될 것이다. 또한, 본 발명은 산소 감수성 프로모터의 조절 하에서 이종기원의 유전자에 유효하게 연결된 산소-조절성 프로모터를 포함하는 핵산 구성체들을 포함한다.

c. 성장률

미생물은 탄소원의 충분한 존재 하에서 성장할 때, 높은 성장률을 가질 것이다. 0%에서 최대 용인가능한% 농도까지의 탄소체를 포함하는 액체 상의 배양액에서 성장한 미생물은 숙주 미생물에 비해 약 25%에서 약 400%보다 큰 성장률을 가지고 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 미생물은 적어도 약 0.1%,0.2%, 0.3%, 0.4%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 4.5%, 5%, 5.5%, 6%, 6.5%, 7%, 7.5%, 8%, 8.5%, 9%, 9.5% 또는 10%w/v의 농도를 가지는 탄소체를 포함하는 배양액에서 자랄 것이다. 그런 조건에서, 미생물은 숙주 미생물과 비교할 때 약 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 105%, 110%, 115%, 120%, 125%, 130%, 135%, 140%, 145%, 150%, 155%, 160%, 165%, 170%, 175%, 180%, 185%, 190%, 195%, 200%, 205%, 210%, 215%, 220%, 225%, 230%, 235%, 240%, 245%, 250%, 255%, 260%, 265%, 270%, 275%, 280%, 285%, 290%, 295%, 300%, 305%, 310%, 315%, 320%, 325%, 330%, 335%, 340%, 345%, 350%, 355%, 360%, 365%, 370%, 375%, 380%, 385%, 390%, 395% 또는 400%보다 더 큰 성장률을 가질 것이다.

d. 물질대사 흐름( Metabolic Flux )

미생물은 풍부한 탄소원이 존재하는 환경에서 성장하면서 물질대사의 흐름을 개선시켰다. 미생물이 0%의 탄소원에서 최대 인용 가능한 %농도를 포함하는 액체 배양기 내에서 성장하는 경우에, 미생물은 희망하는 생성물과 관련되는 탄소원의 약 5%에서 약 95%에 이르는 물질대사 흐름을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 한 개의 균주는 약 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% 또는 90%의 물질대사 흐름을 가지고 있다.

일반적으로, 어떤 소정의 경로 상에서의 각 반응 단계를 통해 이루어지는 물질대사 흐름은 순방향과 역방향의 상대 비율에 따라 달라진다. 그 변화는 시간과 샘플 크기의 함수로서 분석대상(analyte)의 농도 변화율을 언급한다. 어떤 단일한 물질대사 변환을 통해 이루어지는 대사 흐름은 그 내용이 여기에서 참조로서 포함되어 있는 미국 특허 제 6,764,817호와 제 6,849,396호에 기재된 방법들을 이용하여 결정될 수 있다. 게다가, 그러한 결정에 대한 방법들과 변화에 대한 내용은, 그 내용이 여기에서 참조로서 포함되어 있는, 예를 들면, Newsholme, E. A. et al., Biochen . Soc . Symp 43:183-205(1978);Newsholme, E. A. et al., Biochen . Soc . Symp 41:61-110(1976);와 Newsholme, E.A. and Sart., C., Regulation in Metabolism, Chqp 1and 3, Wiley-Interscience Press(1973)에 의해 제공되고 있다.

e. 생성

본 발명의 미생물은 더욱 높은 비율로 최종 물질대사물질 또는 다른 생성물을 생산할 수 있다. 미생물이 0%의 탄소원에서 최대 인용 가능한 %농도를 포함하는 액체 배양기 내에서 성장하는 경우에, 미생물은 희망하는 생성물과 관련되는 탄소원의 0.00l g/L에서 100 g/L에 이르는 성분을 포함하는 최종 물질대사물질 또는 다른 생성물을 생산할 수 있다. 한 개의 균주는 약 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 또는 80%의 물질대사 흐름을 가지고 있다.

f. 생성율

물질대사의 흐름을 제어하는 기능의 관점에서 살펴보면, 미생물이 여러가지 변화율과, 탄소체 이용 효율의 변화율에서, 여러가지 최종 물질대사 물질을 생성할 수 있다. 본 발명의 균주는 최소한 10g/L, 20g/L, 30g/L, 40g/L, 50g/L, 60g/L, 70g/L, 80g/L, 90g/L과 100g/L을 포함하나 이에 한정되어 있지 않은 레벨로 최종 물질대사 물질을 생성할 수 있다.

미생물은, 적어도 약 0.50g/L/hr, 0.75g/L/hr, 1.00g/L/hr, 1.25g/L/hr, 1.50g/L/hr, 1.75g/L/hr, 2.00g/L/hr, 2.25g/L/hr, 2.50g/L/hr, 2.75g/L/hr, 3.00g/L/hr, 3.25g/L/hr, 3.50g/L/hr, 3.75g/L/hr, 4.00g/L/hr, 4.25g/L/hr, 4.50g/L/hr, 4.75g/L/hr와 5.00g/L/hr과 같은 비율에서, 최종 물질대사 물질을 생성할 수 있다. 그러나, 이러한 비율에 한정되지는 않는다.

미생물은, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%과 75%와 같은 탄소체 이용 효율에서 최종 물질대사 물질을 생성할 수 있다. 그러나, 이러한 비율에 한정되지는 않는다.

3. 원하는 생성물

미생물은 풍부한 탄소원을 가지는 배양액 내에서 높은 레벨의 효율로서 원하는 생성물을 생성하는데 이용될 수 있다. 미생물에 의해 생성된 원하는 생성물은 화학약품, 아미노산, 비타민, 공동인자(cofactors), DNA와 같은 핵산, 지방산, 성장 인자들, 단백질과 중간 생성물과 같은 한 개 이상의 어느 생성물이 될 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 원하는 생성물은 미생물에 의해 자연적으로 생성되는 생성물이 될 수 있다. 원하는 생성물은 또한 미생물에 부가되어 있는 이질적인 유전자에 의해 생성되는 비자연적인 생성물이 될 수 있다.

원하는 생성물은 미생물 내에서 세포 내에 위치할 수 있다. 원하는 생성물은 미생물의 페리플라즈마의 내부로 분비될 수 있다. 페리플라즈마(periplasma)는 단백질의 생성에 도움이 된다. 그 이유는 (i)재결합 인체 단백질이 정확한 아미노 말단(terminus)에 의해 생성되는 반면에, 싸이토플라즘(cytoplasm)내에서 생성된 단백질은 자연적인 단백질 내에는 존재하지 않는 부가적인 메티오닌부터 시작될 수 있다. (ii) 대부분의 단백질들은 페리플라즈마 공간 내에서 정확하게 겹쳐진다. (iii) 페리플라즘 내에서는 정확한 이황화물 결합이 형성된다. (iv) 페리플라즈마 공간은 싸이토플라즘보다 더욱 적은 단백질을 포함하므로, 세정(purification)을 단순화한다. (v) 단백질 소화 및 감소를 줄이는 프로테아제가 싸이토플라즘의 경우보다 더욱 적게 존재한다. (vi) 발현된 단백질들은 더욱 많은 싸이토플라즘 단백질로부터 실제적으로 자유로운 외부 막을 세밀하게 파괴시킴으로써, 다른 페리플라즈마 단백질에 의해 쉽게 해제된다. 원하는 생성물은 세포에 의하여 배양액으로 방출된다.

4. 발효

미생물은 배치 발효시에 희망하는 생성물들을 생성하는데 이용되며, 이 경우에는, 요구되는 탄소원의 모든 양이 발효의 초기에 부가될 수 있다. 탄소원의 소비를 이용가능한 산소에 대응시키기는 변형된 세포들의 기능에도 불구하고, 균주들은 또한 제공된 배치 발효 내에서 원하는 생성물을 생성하기 위해 이용될 수 있다. 탄소원의 공급율은 허용된 최대 농도를 생산하는 농도에 대응하는 어느 양이 될 수 있으나, 최대 생장률을 유지하기 위해 요구되는 최소 양이 되는 것이 바람직하다. 균주들은 또한 더욱 높은 희석율을 유지시키는 발효의 연속 모드 또는 “물질환경조절장치(chemostat) 모드”내에서 희망하는 생성물을 생성하기 위해 이용될 수 있다.

미생물은 필요한 물질대사 경로(들)를 통해 균주가 이용할 수 있는 적어도 한 개의 질소 원료와, 적어도 한 개의 탄소원, 적절하다면, 무기질 염류, 성장 인자 등을 포함하는 인공적인 또는 자연적인 배양액 내에서의 발효 처리를 위해 이용될 수 있다.

적합한 질소 원료의 대표적인 보기들은 암모니아 가스와 수용성 암모니아를 포함하는 암모니아; 염화암모늄, 인산암모늄, 황산암모늄과 초산암모늄과 같은 유기 또는 무기산의 암모니움염(ammmonium salts)과; 아미노산, 고기 추출물, 펩톤, 당밀(molasses), 콘스팁리쿼(steep liquor), 카세인 가수분해물, 대두박 가수분해물과 효소 추출물과 같은 다른 질소 함유 물질을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다.

최소한의 염류 배양액 내에 개별적으로 존재하는 몇몇 아미노산들은 탄소원으로서 박테리아에 의해 이용되지 않을 수도 있다. 박테리움의 각 종류는 자연적인 아미노산을 이용하는 능력이 다르다. 개별적으로 이용되지 않는 아미노산들은 다른 아미노산의 존재하에서 유용하게 잘 사용될 수 있다. 예를 들면, 세린(serine)은 글리신, 루신, 이소루신과 발린이 존재하는 경우에만 탄소원으로서 이용될 수 있다. 고농도 배양액에서는, 합성 아미노산 혼합물과 같이, 몇몇 아미노산들이 우선적으로 이용되어 다른 아미노산보다 먼저 사용될 수 있다. 통상의 배양액 성분인 카스아미노산류에 존재하는 16종의 아미노산들의 혼합물로부터, 세린, 프로린, 글리신, 아스파테이트, 스레오닌, 글루타메이트 또는 알라닌은 완전히 제거될 수도 있다, 한편, 다른 아미노산류는 천천히 또는 불완전하게 사용된다. 비슷한 결과들이 트립톤 수프 내에서 얻어진다. 최종 물질대사 물질로서 축적된 아미노산을 재사용하는 것이 바람직하다면, 그때에 아미노산은 세린, 프로린, 글리신, 아스파테이트, 글루타메이트와 알라닌이 바람직하며, 배양액은 탄소원으로서 사용을 자극하기 위하여 필요한 부가적인 아미노산을 더 포함할 수 있다. 배양액은 또한 트립톤, 카스아미노산과 대두 가수분해물을 또한 포함할 수 있다.
본 발명은 다수의 태양들을 가지며, 다음의 한정되지 않는 실시예들에 의하여 예시된다.

도 1은 대장균 O157:H7 수크로오스 물질대사 모듈(module)을 나타낸다.

도 2는 야생형의 K12 sodA 프로모터를 나타낸다.

도 3은 sodA 프로모터에 의해 조절되는 재배열된 O157:H7 수크로오스 물질대사 모듈을 나타낸다.

도 4는 PCR 증폭 산물들, a)cscA, b)cscKB, 및 c)cscA 및 cscKB 재조합 산물을 나타낸다.

도 5는 (a)콜로니 형성이 없는 하나의 탄소체로서 1% 수크로오스를 포함하는 M9 배양액에서 자란 MG1655 세포들, (b)재조합형들은 1% 수크로오스이상인 M9 배양액에서 자랄 수 있었던 cscAKB 오페론을 포함하는 MG1655 sodA pKD46 를 나타낸다.

도 6은 오직 cscA는 sodA 프로모터에 의한 산소에 의해 조절되고, 분리된 오페론(placｐ)는 cscKB를 조절한다는 점에서 대체적 실시예를 나타낸다.

도 7은 PCR 증폭 산물들, a)cscKB, b)Placｏｐ-cscKB-종결인자(terminator) 단편을 나타낸다.

도 8은 오직 cscA는 sodA 프로모터에 의한 산소에 의해 조절되고, 분리된 오페론(cscKｐ)는 cscKB를 조절한다는 점에서 대체적 실시예를 나타낸다.

도 9는 PCR 증폭 산물들, a)cscPro-B 와 b)cscProK-B 단편이 HindIII-XbaI 단편으로서 자르는 것을 나타낸다.

도 10은 1% 수크로오스를 가지는 최소한의 MOPS 배양액에서 MG1655sodA::csc의 성장곡선을 나타낸다. 그 곡선의 박스 쳐진 부분은 배양균이 무기성 조건하에서 성장된 것을 보여준다.

도 11은 하나의 탄소와 에너지 원료로서 0.4% 수크로오스를 가지는 최소한의 MOPS 배양액(회색 다이아몬드)과 0.2% 글루코오스와 0.4% 수크로오스를 가지는 MOPS배양액(검정 스퀘어)에서 MG1655sodA::csc의 성장곡선을 나타낸다. 그 곡선에서 박스 쳐진 부분은 배양균이 무산소성 조건하에서 성장된 시간을 보여준다.

도 12는 하나의 탄소와 에너지 원료로서 0.4% 수크로오스를 가지는 최소한의 MOPS 배양액(회색 다이아몬드)과 0.2% 글루코오스와 0.4% 수크로오스를 가지는 MOPS배양액(검정 스퀘어)에서 자란 MG1655sodA::csc에 대한 생존가능한 세포 수(패널 A)와 배양액 pH(패널 B)를 보여준다. 플롯의 박스 쳐진 부분은 배양균이 무산소성 조건하에서 성장된 시간을 보여준다.

도 13은 sodA 프로모터를 가진 선천적(native) PTS 프로모터들의 교환을 묘사한다.

도 14는 sodA 프로모터와 PCR 증폭에 사용될 것인 올리고뉴클레오타이드에 의해 조절되는 PTS의 재조합 구조를 위한 전략을 묘사한다.

본 발명은 다음의 제한되지 않는 보기들에 의해 설명되는 여러가지 특징들을 가지고 있다.

실시예 1

산소-제어 수크로오스 흡수와 물질대사

도 3에 도시된 바와 같이, E. coli K-12의 수크로오스 카타볼라이징(catabolizing : Suc+) 균주는, 자연적인 sodA 유전자를 E. coli O157:H17의 수크로오스(sucrose) 물질대사 모듈로 대체함으로써 생성되었다. 그 유전자들은 cscB 유전자를 반전시키고, 그것을 cscK와 동일한 라인에 배치함으로써 모듈 내부의 초기 구성으로부터 재배치되었다. 프로모터-조작자 영역이 프로모터와 sodA 유전자의 조절 인자로 대체되었으므로 cscR 유전자는 삭제되었다. 유전자 생성물의 활동성이 대장균 K-12의 fruK 유전자의 활동성에 비해 풍부(redundant)하므로, 그 균주는 cscK가 없이도 생성되었다는 것을 알아야 한다. 그 균주는 sodA와 같은, 분리된 프로모터의 제어하에서, 수크로오스 물질대사 모듈을 플라스미드 또는 게놈의 내부로 도입함으로써 생성될 수도 있는 것이다.

프라이머 1(P1)과 2(P2)는 단일한 2.2Kb 피스(도4b)로서 cscK와 cscB를 모두 확대시킬 수 있도록 되어 있었다. P1의 서열은 5‘-CCCACGGAGTGGCTGTGCTGCAACATGGAGCACTCTGGCTACTGGGTTAAGTCAGATGAATTTAAGGGAA-3'(SEQ ID NO:1)가 되었으며, 이 서열은 cscA 유전자의 3’-단부를 가지는 50-bp 오버랩(overlap)과 cscK 유전자의 리보솜 결합 영역(RSB)을 가지는 cscK 유전자의 5‘-단부의 20-bp를 가지고 있다. P2의 서열은 5‘-CAAAACCACATCAATTGAAACGCTGTTTTATTTTTATCGGATCATTGTTTCTATATTGCTGAAGGTACAG-3'(SEQ ID NO:2)가 되었으며, 이 서열은 sodA 터미네이터(terminator) 영역 이후의 3’-단부 서열을 가지는 50-bp와 cscB의 3‘-단부의 20-bp를 가지고 있다. 프라이머 3과 4는 게노믹 O157H:H7 DNA로부터 cscA(1.4kb : 도 4a)를 확대하기 위해 설계되었다. P4의 서열은 5‘-CTGCTTACGCGGCATTAACAATCGGCCGCCCGACAATACTGGAGATGAATATGACGCAATCTCGATTGCA-3'(SEQ ID NO:4)가 되었으며, 이 서열은 RSB를 포함하는 sodA 프로모터서열의 50-bp를 가지고 있다. P3의 서열은 5‘-TTAACCCAGTTAGCCAGAGTG-3'(SEQ ID NO:3)가 되었으며, 이 서열은 cscA 유전자의 3’-단부 서열과 매치된다.

cscA 또는 cscKB를 확대하기 위한 PCR의 제 1라운드에서는, 50μl PCR이 100ng의 O157H:H7 게노믹 DNA, 각 프라이머의 50pmol, 0.2mM dNTP와 2.5U의 Pfu 폴리메라제를 가지는 통속으로 운반되었다 cscA 확대를 위해, 반응은 95℃에서 1분의 주기, 95℃에서 1분의 25주기;55℃에서 15초의 어닐링과; 72℃에서의 4분간의 연장, 그 후에 72℃에서 10분 연장의 마지막 주기를 거치게 되었다. cscKB 확대를 위해, 어닐링 온도가 48℃가 되는 사실을 제외하고는 상기한 바와 같은 동일한 주기를 거치게 되었다.

재조합 PCR 반응의 재조합의 제 2라운드에서는, cscA와 cscKB 생성물의 동일한 몰 농도량은 0.2mM dNTP와 2.5U의 Pfu 폴리메라제를 가지는 각 프라이머(primer)의 50pmol을 포함하는 50μl 반응내에서 템플릿(templates)으로 혼합되었다. 그 반응은 95℃에서 5분의 주기, 95℃에서 30초 동안의 디네이쳐링(denaturing)의 5주기;65℃에서 30초간의 어닐링과; 72℃에서의 4분간의 연장, 그 후에 95℃에서 1분의 디네이쳐링의 25주기;72℃에서의 7.5분간의 연장, 그 후에 725℃에서 10분의 마지막 주기를 거치게 되었다. 최종 생성물은 3.7kb와 같은 예측되는 크기였다(도 4c).

재조합 PCR 생성물은 sodA5'서열, cscA, cscK, cscB의 50-bp와, sodA 터미네이터(terminator)이후의 3‘ 최종 서열(end sequence)의 50bp를 포함하고 있었다. 그러므로, 0157:H7d[서 나온 cscAKB 오페론(oeron)은 MG1655의 sodA 프로모터(promoter)의 제어하에 있게 되어, MG1655 sodA:csc를 생성한다. PCR 생성물은 세정되어 플라스미드 pKD46을 포함하는, MG1655의 sodA::Tn5 변종의 전기 천공법(electroporation)에 이용되었다. MG1655 세포들은, 도 5a에 도시된 바와같이, 단일한 탄소체인 1% 수크로오스(sucrose)를 포함하는 M9 배양액 내에서는 성장할 수 없다. 그러나, cscAKB 오페론을 포함하는 변형된 세포들은 도 5b에 도시된 바와 같이 앰피실린(ampicillin)(최종 농도 100μg/ml)이 존재하는 경우에 30℃에서 2일간 지난 후에 동일한 배양액에서는 성장할 수 있었다.

삭제

실시예 2
산소-조절 수크로오스 물질대사

전화효소는 수크로오스 물질대사가 거쳐야 하는 병목(bottleneck)이다. 세포질의 효소로서, 전화효소는 막 단백질보다 더욱 신속하게 전환(turn over)될 수 있다. 이것은 기능의 신속한 셧다운(shutdown)을 실행하는 경우에 중요하다. 사실은, 필요하다면 유비퀴틴 태그(ubiquitin tag) 및 기타 이러한 변형에 의해 분해율이 가속화되어 진행될 수 있다. 반대로, cscE 의 레벨들은 공동수송물질(symporter)이 막 단백질이므로, 이와는 다르게 신속하게 조절된다. 결과적으로, 우리는 도 6에 도시된 Suc+ 균주를 생성하게 되었다. 그 구조는 lac 프로모터를 이용하는 수크로오스 공동수송물질 cscB를 독립적으로 제어하기 위한 분리된 오페론을 제공한다. 상술한 바와 같이, 프럭토키나제(fructokinase) 유전자(cscK)는 과잉 상태가 될 수 있다.

프라이머(primer) 4와 5는 O157:H7 게놈 DNA로부터 cscA(1.4kb)를 증폭시키기 위해 디자인되었다. P4는 실시예 1에 기재된 것과 동일한 프라이머이다. P5에 대한 서열은: 5'-CAAAACCACATCAATTGAAACGCTGTTTTATTTTTATCGGATCATTGTTTTTAACCCAGTAGCCAGAGTG-3'(SEQ ID NO:5)이다. 따라서 cscA 유전자는 sodA (sodA_p-cscA-sodA_t )의 5'와 3'서열의 50-bp에 인접한다. 프라이머 K5와 B3는 한 단편(one piece)(2.2kb) 내의 cscK와 cscB 양쪽을 설명하기 위해 디자인되었다(도 7a). K5에 대한 서열은: 5'-GTAAGTCAGATGAATTTAAGGGAA-3'(SEQ ID NO:6)이고, cscK 유전자의 RBS 영역을 포함한다. B3에 대한 서열은: 5'-CTATATTGCTGAAGGTACAGGGGT-3'(SEQ ID NO:7)이고, cscb 유전자의 3' 끝의 20-bp를 가진다.

PCR은 cscA 또는 cscKB의 증폭을 위해 수행된다. 50-ml PCR 반응이 100ng의 O157 게놈 DNA, 각 프라이머 50pmol, 0.2mM dNTPs 및 2.5U의 Pfu 폴리머라아제(polymerase)를 포함하는 튜브 내에서 수행되었다. 상기 반응은 95℃에서 1 분간 1주기(cycle), 95℃에서 1분간 변성(denaturing) 25주기; 55℃에서 15초간 어닐링(annealing); 및 72℃에서 4분간 신장(extension), 그 후 72℃에서 10분간 신장의 최종주기(final cycle)를 거쳤다.

cscKB 생성물(product)의 4 마이크로리터(microliter)는 pFD1을 생성하기 위해 EcoRI 사이트(site)에서 pCR-블런트 벡터(pCR-Blunt vector)로 복제되었다. 따라서 cscKB 생성물은 유도가능한(inducible) Plac 촉진자(promoter)의 제어하에 위치된다. 2.7-kb-Plac - cscKB-종결인자 단편(terminator fragment)은 PvuII 소화(digestion) 및 겔-정화(gel-purified)에 의해 플라스미드로부터 삭제된다(도 7b). 이 단편은 pJW23의 SmaI 사이트로 부분 복제(sub-cloned)되고, att 사이트를 포함한다. 새로운 플라스미드, pFD6는, 그 후 NotI로 소화되고, 겔 정화 후에 더 큰 단편이 복구된다. Plac-cscKB-종결인자를 포함하는 이 단편은, pFD7을 생성하기 위해 재결찰(re-ligated)된다. 플라스미드 pFD7 및 pJW289는 통합(integration)을 가능하게 하기 위해 MG1655 또는 MDS42(pKD46 없음)의 sodA::Tn5 돌연변이체(mutant)로 상호 변형(co-transformed)된다. pJW289 플라스미드는 상기한 바와 같이 이후에 치유(cured)된다. pKD46 플라스미드는 재조합을 위해 치유된 숙주로 재도입된다.

sodA_p-cscA-sodA_t 의 PCR 생성물은 그 후 재조합을 가능하게 하기 위해 새로운 숙주를 변형시키는데 이용된다. 변형된 세포는 단일 탄소체로서 1%의 수크로오스 (sucrose)를 함유하는 M9 배지(medium)에 재배된다. 배지에서 성장가능한 변형체(transformants)는 Suc+ 표현형(phenotype)을 가진다.
실시예 3

삭제

산소-감수성 프로모터(Oxygen-sensitive promoter)에 의한 수크로오스 물질대사의 제어 및 수크로오스 양성 박테리아(Sucrose Positive Bacteria)를 위한 수크로오스 억제자에 의한 수크로오스의 흡수

실시예 3은 O157:H7과 같은 수크로오스 양성 균주(strain)에 대하여 일반적인 방식으로 세포 내에서 수크로오스의 레벨을 제어하기 위한 수크로오스 억제자 CscR을 보존한다. 이 설계(scheme)는 O157:H7의 수크로오스 오페론의 일반적인 위치에서 sodA 오페론으로 cscA 유전자를 이식하는(transplanting) 것과 같은 것이다. 이 제어방법은 수크로오스의 풀(pool)이 고정되고 제어하는 기능은 오직 전화효소(invertase), 병목효소(bottleneck enzyme)의 수준만이므로, 아세테이트(acetate)를 조정(regulating)하는데 가장 효과적일 수 있다. cscR 유전자는 이 설계로부터 제거되고, 결과적으로 수크로오스의 전송(transport)과 프럭토키나아제(fructikinase)의 활동을 구성한다. 전과 같이, sodA 유전자는 cscA로 대체되거나 또는 도 8에 나타낸 바와 같이 cscA와 직렬(series)로 결합 될 수 있다.

프라이머(primer) 4와 5는 O157 게놈 DNA로부터 cscA(1.4kb)를 설명하기 위해 디자인되었다. P4 및 P5는 실시예 1에 기재되어 있다. 따라서 cscA 유전자는 sodA의 5'와 3' 서열의 50-bp에 인접한다. 프라이머 ProK5와 B3는 한 단편(one piece)(2.2kb) 내의 cscK와 cscB 양쪽을 설명하기 위해 디자인되었다. ProK5에 대한 서열은: 5'-AAGAGGTTTATCACTAACATTTTGTG-3'(SEQ ID NO:8)이고, cscK 유전자의 프로모터 영역 전체를 포함한다. B3에 대한 서열은 상기한 바와 같다.

PCR은 cscProK-B (2.3kb)를 증폭시키기 위하여 수행되었다(도 9a). 50-㎕ PCR 반응이 100ng의 O157 게놈 DNA, 각 프라이머 50pmol, 0.2mM dNTPs 및 2.5U의 Pfu 폴리머라아제를 포함하는 튜브 내에서 수행되었다. 상기 반응은 95℃에서 1분간 1주기, 95℃에서 1분간 변성 25주기; 55℃에서 15초간 어닐링; 및 72℃에서 4분간 신장, 그 후 72℃에서 10분간 신장의 최종주기를 거쳤다.

cscProK-B 생성물의 4 마이크로리터는 pFD8을 생성하기 위해 pCR-블런트(Blunt) 벡터(Invitrogen)로 복제되었다. cscK-B 단편은 HindIII-XbaI 단편(2.7kb)(도 9b)으로 절단되고 pJW23으로 부분복제되며, att 사이트를 포함한다. 새로운 플라스미드 pFD14는 그 후 NotI로 절단되고, 겔 정화 후에 더 큰 단편이 복구된다. cscProK-B-종결인자를 포함하는 이 단편은, pFD15를 생성하기 위해 재결찰된다. 플라스미드 pFD15 및 pJW289는 통합을 가능하게 하기 위해 MG1655 또는 MDS42(pKD46 없음)의 sodA::Tn5 돌연변이체로 상호 변형된다. 두 플라스미드는 상기한 바와 같이 이후에 숙성(cured)된다. 플라스미드 pKD46은 그 후 숙성된 숙주로 재주입된다.

cscA의 PCR 생성물은 그 후 재조합을 가능하게 하기 위해 상기한 새로운 숙주를 변형시키는데 이용된다. 변형된 세포는 단일 탄소 공급원으로서 1%의 수크로오스를 함유하는 M9 배지에서 배양된다. 배지에서 성장가능한 변형체는 Suc+ 표현형을 가진다.
실시예 4
수크로오스 물질대사의 산소-제어된 성장
실시예 1의 MG1655 sodA::csc 균주의 호기성 의존 성장(aerobic dependent growth)은 단일 탄소 및 에너지 공급원으로서 수크로오스를 이용하고 호기성-무기성-호기성 주기를 거쳐서 성장을 모니터링하여 시험되었다. 상기 주기는 95:5의 질소와 이산화탄소의 혼합 공기로부터 배양조(fermentor)를 개폐함으로써 개시되고, 그 후 적절한 간격 후에 500ml 공기 중 발효(air-lift fermentation)에서의 공기로 돌아간다.

삭제

도 10은 단일 탄소 및 에너지 공급원으로서 1% 수크로오스를 이용하는 최소 MOPS 배양기(minimal MOPS medium)상에서의 균주의 전형적인 성장곡선을 나타내고 있다. 무기성 조건하에서의 성장 결핍은 세포가 더 이상 수크로오스를 이화(catabolize)할 수 없음을 나타낸다. 반면, 글루코오스에 수크로오스를 더한 MG1655 sodA::csc의 성장은 비교적 선두 부분(head space)의 기체(gas)의 변화에 의한 변화가 없고, 따라서 글루코오스 전송과 당분해(glycolysis)가 오직 배양액의 호기성 또는 무기성 상태에 의해서만 영향받지는 않는다.

도 11은, 하나는 단일 탄소 및 에너지 원료로서 0.4% 수크로오스를 함유하는 최소 MOPS 배양기에서 수행되었으며, 하나는 동일한 배양기에 단일 탄소 및 에너지 공급원으로서 0.4% 수크로오스에 더하여, 0.2% 글루코오스가 추가된, 두 가지의 유사한 공기 중 발효의 결과를 도시하고 있다. 무기성 조건하의 수크로오스에서는 균주가 성장하지 않았으나, 산소가 존재하거나 존재하지 않거나 계속해서 글루코오스를 분해하였다. 도 10 및 도 11에 나타낸 성장곡선에 더하여 전체의 성장가능한(viable) 세포 수가 수크로오스 만의 환경에서는 무기성 단계에 걸쳐 변화하지 않은 반면, 외인성(exogenous) 글루코오스가 존재하면 계속해서 증가한다는 것이 관찰에 의해 확인되었다(도 12a 참조). 이는 당분해에 생화학적 제한(biochemical restriction)이 없다는 것과 (csc 유전자 생성물의 작용에 의해)수크로오스로부터 생성된 글루코오스는 만일 발생하면 무기성 성장을 지지할 수 있음을 나타낸다. 무기성 조건하의 수크로오스에서의 성장결핍은 결국, 산소 의존성 sodA 프로모터로부터 csc 유전자의 전사 결핍으로 인한 것이다.

게다가, pH 도표(도 12B)는 수크로오스에서 성장은 매우 적은 산을 생산하는 것을 보여준다. 이에 반하여 수크로오스와 글루코오스를 모두 포함한 배양액은 많은 양의 산을 생산한다. 이것은 또한, 글루코오스의 무기성 동화작용이 아세테이트와 포르메이트의 많은 양을 생산하는 것으로 알려졌기 때문에 발효의 무기성 단계 동안에 수크로오스 물질대사는 적게 일어나거나 일어나지 아니한다는 견해를 지지한다. 무기성 변화의 과정 동안 어느 산을 생산하기 위해 수크로오스 위에서 배양하는 것이 불가능한 것은 산소가 없는 상태에서 세포 내에서 이용되는 글루코오스는 적거나 없다는 것을 가리킨다.
실시예 5
산소-감수성 프로모터에 의한 PTS 탄수화물 시스템의 제어
sodA 프로모터를 가지는 자연의 PTS 프로모터의 대체는 도 13 및 도 14에서 예시되어 있다. 원하는 구성은 3단계로 생성된다. 제 1단계는, 반대 말단에서 2개의 PCR 생성물의 융합을 허용하기 위한 공통의 서열뿐만 아니라, 일 말단에서 염색체 타겟에 유일한 서열 상동을 분배하는 2개의 분리된 PCR 생성물의 생성을 수반한다. 제 1의 초기 PCR 생성물은 cysK 유전자의 3'단에 서열 상동의 45염기들을 포함하며, 제 2의 PCR 생성물(이하에 도시)에 상동성을 제공하기 위한 비-코딩 링커 서열(non-coding linker sequence) 뿐만 아니라 그것의 프로모터에 더하여 완전한 클로람페니콜 아세틸트렌스페라아제 유전자(CAT)를 포함한다. CAT 유전자는, 낮은 케이스 서열이 3' 말단에 상동이고 높은 케이스 서열이 CAT 유전자의 3'-말단에 상동의 경우, 서열 5'-gcattgtttgccgatctcttcactgagaaagaattgcaacagtaaTTACGCCCCGCCCTGCCACTCATCG-3'(SEQ ID NO:9)를 가지는 올리고(Oligo) 1로 명명된 프라이머를 사용하는 플라스미드 pACYC184로부터 확장된다. 이 PCR에서 제 2올리고는, 낮은 케이스 서열이 제 2 PCR 생성물을 가지는 비-코딩 서열 상동이고 높은 케이스 서열이 CAT 프로모터 영역의 5'-말단에 상동의 경우, 서열 5'-acaaacctgaattttaagtccagtacctaCGACGCACTTTGCGCCGAATAAATACCTG-3'(SEQ ID NO:10)를 가지는 올리고 3으로 표시된다. 50-μ1 PCR 반응이 1ng pACYC184 DNA, 각 프라이머의 50pmol, 0.2 mM dNTPs 및 Pfu 폴리머라아제의 2.5 U를 포함하는 튜브에서 실행된다. 반응은 95℃에서 1분의 1사이클, 95℃에서 1분의 변성(denaturing); 55℃에서 15초의 어닐링(annealing); 및 72℃에서 2분의 신장(extension)의 30 사이클, 그리고 72℃에서 10분의 신장의 마지막 사이클을 실행하였다.

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초기의 PCR의 제 2생성물은 제 1생성물에 상동성을 제공하기 위한 짧은 비-코딩 서열, 완전한 산소-의존적 sodA 프로모터 및 ptsH 유전자의 5'말단에 서열 상동의 45염기들을 포함한다. sodA 프로모터 영역은, 낮은 케이스 서열이 제 1 PCR 생성물을 가지는 비-코딩 서열 상동이고 높은 케이스 서열이 E.coli 염색체의 sodA 프로모터 영역의 5'-측에 상동의 경우, 서열 5'-tgttttggacttaaaattcaggtcatggatAATGCGTCGACTCCTGCAAAACCATACCCT-3'(SEQ ID NO: 11)을 가지는 올리고 2로 표시된 프라이머를 사용하는 대장균 염색체 DNA로부터 확장된다. 이 PCR 반응의 제 2올리고는 서열 5'-gggtgtgcagaccgttcggagcggtaatggtaacttcttgctggaaCATATTCATCTCCAGTATTGTCGGG-3'(SEQ ID NO: 12)을 가지는 올리고 4로 표시되고, 낮은 케이스 서열은 ptsaH의 5'-말단에 상동이고 높은 케이스 서열은 sodA 프로모터의 3'-측에 상동이다. 이 올리고는 sodA의 시작 코돈(codon)을 ptsH의 시작 코돈으로 효과적으로 바꾼다. 50-μ1 PCR 반응은 100ng 대장균 MG1655 DNA, 각 프라이머의 50pmol, 0.2mM dNTPs 및 터보(Turbo) Pfu의 2.5U를 포함하는 튜브에서 수행된다. 반응은 95℃에서 2분의 1사이클, 95℃에서 1분의 변성; 55℃에서 15초의 어닐링(annealing); 및 72℃에서 1분의 신장(extension)의 30 사이클, 그리고 72℃에서 5분의 신장의 마지막 사이클을 실행하였다.

각 반응의 PCR 생성물은 아가로오즈(agarose) 겔로부터 회수되고 PCR의 제 2라운드 전에 퀴아젠(Qiagen) 세정 컬럼에서 세정된다. 이 반응에서 2개의 제 1라운드 PCR 생성물은 변성되고 신장 전에 재-어닐(anneal)을 위해 허용된다. 50-μ1 PCR 반응은 각 세정된 5ng, 제 1라운드 PCR 생성물, 0.2mM dNTPs 및 Pfu 폴리머라아제를 포함하는 튜브에서 수행되었다. 반응은 95℃에서 2분의 1사이클, 95℃에서 1분의 변성; 55℃에서 15초의 어닐링(annealing); 및 72℃에서 1분의 신장(extension)의 10 사이클을 실행하였다. 올리고 1 및 올리고 4의 50 pmoles의 제 1의 5 사이클이 반응에 추가된 후에 반응은 72℃에서 5분의 익스텐션의 마지막 사이클에 의해 따른, 추가의 25 사이클에 대해 연속된다. 제 2라운드 PCR 생성물은 퀴아젠 컬럼을 사용하여 세정되고 통합 가능한 pKD46을 포함하는 MG1655 혹은 MDS42로 변형된다. 안정된 통합은 클로람페니콜 내성 콜로니(chloramphenicol resistant colonies)로서 분리된다. pKD46 플라스미드는 상술한 바와 같이 숙성된다.
실시예 6
슈거 물질대사의 산소-조절성 성장

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산소-조절성 프로모터로부터의 PTS 탄수화물 운송 시스템의 전사 조절(transcriptional regulation)은 혐기성 조건(anaerobic conditions) 하에서 당 소비 면에서 PTS 시스템이 하는 역할을 감소시킨다. 글루코오스 또는 다른 탄수화물은 비-PTS 시스템(non-PTS systems)을 통해 취해질 수 있지만, PTS 시스템은 E. 콜라이 균에서 가장 빠른 당 흡수 방법을 나타내기 때문에 동화율은 크게 감소된다. E. 콜라이에서 모든 PTS 시스템의 공통의 역할을 하는 ptsH 및 ptsI 유전자의 발현의 추가적인 이점은, 산소-조절성 프로모터의 제어하에서, 모든 PTS 당의 소비를 제어하기 위한 조절의 단일점을 허용한다. 상기 실시예들에 기재된 수크로오스 모델을 가지는 직접적인 상사성(direct analogy)에 의해, 다른 당에서의 E. 콜라이 균주의 성장은 마지막 전자 수용자로서 산소의 능력에 보다 면밀히 부합하기 위하여 제한될 수 있으므로 PTS 당의 넓은 범위에 대해 처리된 세포에 의해 과잉 공급 물질대사물질의 생성을 최소화한다.

다양한 실시예들에서, 본 발명은 산소 수준에 의해 조절되는 탄소원으로부터 물질대사 흐름을 가지는 미생물을 제공한다. 미생물은 E. 콜라이(E.coli), 시겔라(Shigella), 살모넬라(Salmonella), 코리네박터(Corynebacter), 락토코커스(Lactococus) 또는 스트렙토미세스(Streptomycetes)와 같은 원핵생물일 것이다. 미생물은 또한 효모 같은 진핵생물일 것이다. 효모는 Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe 또는 Pichia 종들 일 것이다. 탄소원은 글루코 오스(glucose), 프럭토오스(fructose), 갈락토오스(galactose), 만노오스(mannose), 수크로오스(sucrose), 말토오스(maltose), N-아세틸글루코사민(N-acetylglucosamine), 베타-글루코시즈(b-glucosides), 만니톨(mannitol), 셀로비오스(cellobiose), 소르보오스(sorbose), 글루시톨(glucitol) 또는 갈락티톨(galactitol) 일 것이다.

미생물은 포스포엔올 피루베이트(phosphoenol pyruvate)-의존적 인산기 전이효소 시스템의 단백질을 암호화하는 유전자에 유효하게 연결된 산소-조절성 프로모터를 포함할 것이다. 미생물은 E. 콜라이 O157.H7 스쿠로오스 물질대사 모듈의 단백질을 암호화하는 유전자에 유효하게 연결된 산소-조절성 프로모터를 포함할 것이다. 유전자는 융합 단백질을 암호화하는 산소-조절성 프로모터에 유효하게 연결되었다. 융합 단백질은 유비퀴틴(ubiquitin)을 포함할 것이다.

SEQUENCE LISTING <110> Scarab Genomics LLC <120> Oxygen-regulated Microorganisms <130> 02730.0016.00PC00 <150> US 60/715,702 <151> 2005-09-08 <150> PCT/US2006/032525 <151> 2006-08-18 <160> 12 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic Primer <400> 1 cccacggagt ggctgtgctg caacatggag cactctggct actgggttaa gtcagatgaa 60 tttaagggaa 70 <210> 2 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic Primer <400> 2 caaaaccaca tcaattgaaa cgctgtttta tttttatcgg atcattgttt ctatattgct 60 gaaggtacag 70 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic Primer <400> 3 ttaacccagt agccagagtg 20 <210> 4 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic Primer <400> 4 ctgcttacgc ggcattaaca atcggccgcc cgacaatact ggagatgaat atgacgcaat 60 ctcgattgca 70 <210> 5 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic Primer <400> 5 caaaaccaca tcaattgaaa cgctgtttta tttttatcgg atcattgttt ttaacccagt 60 agccagagtg 70 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic Primer <400> 6 gtaagtcaga tgaatttaag ggaa 24 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic Primer <400> 7 ctatattgct gaaggtacag gcgt 24 <210> 8 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic Primer <400> 8 aagaggttta tcactaacat tttgtg 26 <210> 9 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic Primer <400> 9 gcattgtttg ccgatctctt cactgagaaa gaattgcaac agtaattacg ccccgccctg 60 ccactcatcg 70 <210> 10 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic Primer <400> 10 acaaacctga attttaagtc cagtacctac gacgcacttt gcgccgaata aatacctg 58 <210> 11 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic Primer <400> 11 tgttttggac ttaaaattca ggtcatggat aatgcgtcga ctcctgcaaa accataccct 60 <210> 12 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic Primer <400> 12 gggtgtgcag accgttcgga gcggtaatgg taacttcttg ctggaacata ttcatctcca 60 gtattgtcgg g 71

Claims

산소 레벨에 의하여 조절되는 탄소원으로부터의 물질대사 흐름을 가지는 E. 콜라이에 있어서,

상기 E. 콜라이는,

E. 콜라이 O157.H7 수크로오스(sucrose) 물질대사 모듈의 cscA 유전자를 포함하는 서열과, E. 콜라이 포스포엔올 피루베이트(phosphoenol pyruvate)-의존적인 인산기 전이효소 시스템의 ptsH, ptsI 및 ccr 유전자들을 포함하는 서열로 구성되는 그룹으로부터 선택된 한 서열에 유효하게 연결되어 있는 산소-조절성 프로모터를 포함하며,

산소 레벨의 감소에 대응하여 미생물내의 상기 탄소원으로부터 물질대사의 흐름이 감소되며,

상기 산소-조절성 프로모터가 상기 cscA 유전자를 포함하는 상기 서열에 유효하게 연결되어 있는 경우에, 상기 E. 콜라이가 수크로오스 대사작용 분해하는(catabolizing)(Suc+), 산소 레벨에 의하여 조절되는 탄소원으로부터의 물질대사 흐름을 가지는 E. 콜라이.
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제 1항에 있어서,

상기 산소-조절성 프로모터는,

E. 콜라이 포스포엔올 피루베이트(phosphoenol pyruvate)-의존적인 인산기 전이효소 시스템의 ptsH, ptsI 및 ccr 유전자들을 포함하는 서열에 유효하게 연결되어 있는 E. 콜라이.
제 1항에 있어서,

상기 산소-조절성 프로모터는,

E. 콜라이 O157.H7 수크로오스(sucrose) 물질대사 모듈의 cscA 유전자를 포함하는 서열에 유효하게 연결되어 있는 E. 콜라이.
제 8항에 있어서,

상기 서열은,

상기 유전자에 의해 암호화된 단백질과 유비퀴틴(ubiquitin)을 포함하는 한 개 이상의 융합(fusion) 단백질들을 암호화하는 E. 콜라이.
제 9항에 있어서,

상기 서열은,

상기 유전자에 의해 암호화된 단백질과 유비퀴틴(ubiquitin)을 포함하는 융합 단백질을 암호화하는 E. 콜라이.
E. 콜라이내에서 물질대사 흐름을 조절하는 방법에 있어서,

적당한 영양조건들 및 산소 농도들에서 원하는 물질대사 흐름을 생성하기 위해서, 청구항 1항의 E. 콜라이를 배양하는 단계를 포함하는, E. 콜라이내에서 물질대사 흐름을 조절하는 방법.
E. 콜라이내에서 오버플로우 물질대사 산물들의 생성을 감소시키는 방법에 있어서,

상기 방법은,

영양조건들 및, 산소의 임계레벨과 같거나, 적거나 또는 많은 산소 농도의 조건에서, 청구항 1항의 E. 콜라이를 배양하여,

상기 오버플로우(overflow) 물질대사 산물들을 생산하는 하나 이상의 경로를 통하여 탄소의 흐름을 변경시키는 단계를 포함하는, E. 콜라이내에서 오버플로우 대사산물들의 생성을 감소시키는 방법.
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제 9항에 있어서,

상기 서열은, 상기 E. 콜라이 O157.H7 수크로오스 물질대사 모듈의 cscK와 cscB 유전자를 추가로 포함하는 E. 콜라이.
제 9항에 있어서,

상기 E. 콜라이 O157.H7 수크로오스 물질대사 모듈의 cscK와 cscB 유전자는, 산소-조절성 프로모터에 유효하게 연결되어 있지 않는 E. 콜라이.