JPH05260979A - Ｄ−リボースの製造法 - Google Patents
Ｄ−リボースの製造法Info
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- JPH05260979A JPH05260979A JP4042925A JP4292592A JPH05260979A JP H05260979 A JPH05260979 A JP H05260979A JP 4042925 A JP4042925 A JP 4042925A JP 4292592 A JP4292592 A JP 4292592A JP H05260979 A JPH05260979 A JP H05260979A
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- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
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- C12N15/75—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Bacillus
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- C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
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Abstract
(57)【要約】
【目的】Ｄ−リボースを効率よく製造する。
【構成】グルコン酸オペロンの発現に関与するＤＮＡ配
列の一部または全部が、該グルコン酸オペロンをバチル
ス属細菌内で高発現させるように改変されているＤ−リ
ボース生産能を有するバチルス属細菌を培地に培養し、
Ｄ−リボースを生成蓄積せしめ、これを採取することか
らなるＤ−リボースの製造法。 【効果】Ｄ−リボースをきわめて安定に多量に製造する
ことができる。
列の一部または全部が、該グルコン酸オペロンをバチル
ス属細菌内で高発現させるように改変されているＤ−リ
ボース生産能を有するバチルス属細菌を培地に培養し、
Ｄ−リボースを生成蓄積せしめ、これを採取することか
らなるＤ−リボースの製造法。 【効果】Ｄ−リボースをきわめて安定に多量に製造する
ことができる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、発酵法によるＤ−リボ
ースの製造法に関し、Ｄ−リボースを効率よく生産する
ように遺伝子組換えを行なったバチルス属細菌を用いた
Ｄ−リボースの製造法に関する。
ースの製造法に関し、Ｄ−リボースを効率よく生産する
ように遺伝子組換えを行なったバチルス属細菌を用いた
Ｄ−リボースの製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】Ｄ−リボースは、リボ核酸の構成成分と
してすべての生体に含まれ、又その還元型誘導体である
リビトールは、ビタミンＢ2や細胞壁構成体であるリビ
トールタイコン酸の構成成分として含まれ、生理的にも
きわめて重要な物質である。一方、Ｄ−リボースは、従
来からビタミンＢ2の合成原料として使用され、近年で
は核酸系調味料などの合成原料としても使用され脚光を
あび、これを安価にかつ大量に製造することは工業上き
わめて意義深いことである。これまでＤ−リボースの製
造法としては、天然物中から抽出単離する方法、フラン
やグルコースなどを原料として合成する方法、あるいは
微生物による発酵法などが知られている（特公昭４７−
７９４８号、特公昭５０−１６８７８号、特公昭５１−
７７５３号、特公昭５２−１９９３号、特公昭５８−１
７５９１号、特公昭５９−２６２７６号）。
してすべての生体に含まれ、又その還元型誘導体である
リビトールは、ビタミンＢ2や細胞壁構成体であるリビ
トールタイコン酸の構成成分として含まれ、生理的にも
きわめて重要な物質である。一方、Ｄ−リボースは、従
来からビタミンＢ2の合成原料として使用され、近年で
は核酸系調味料などの合成原料としても使用され脚光を
あび、これを安価にかつ大量に製造することは工業上き
わめて意義深いことである。これまでＤ−リボースの製
造法としては、天然物中から抽出単離する方法、フラン
やグルコースなどを原料として合成する方法、あるいは
微生物による発酵法などが知られている（特公昭４７−
７９４８号、特公昭５０−１６８７８号、特公昭５１−
７７５３号、特公昭５２−１９９３号、特公昭５８−１
７５９１号、特公昭５９−２６２７６号）。
【０００３】一方、バチルス・ズブチリス (Bacillus s
ubtilis) においては、グルコン酸の菌体内への透過を
司るグルコネート パーミアーゼ（gluconate permeas
e）やグルコン酸から６−フォスフォグルコン酸を生成
するグルコノキナーゼ（gluconokinase）といった酵素
が存在するが、それらの酵素はグルコン酸オペロン（ｇ
ｎｔ ｏｐｅｒｏｎ）と呼ばれる一つの遺伝子にコード
されている。そしてこのグルコン酸オペロン（ｇｎｔ
ｏｐｅｒｏｎ）はｇｎｔＲ，ｇｎｔＫ，ｇｎｔＰおよび
ｇｎｔＺという４つの領域から成っている〔Y. Fujita
ら、ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミスト
リー(J. Biol. Chem.)，261，13744-13753（1986）〕。
これら酵素の発現は、これら酵素をコードする構造遺伝
子（ｇｎｔＫ，ｇｎｔＰ）の５’上流側に隣接して存在
する発現制御領域（ｇｎｔＲ）によって制御されている
〔Y. Fujita ら、プロシージングス・オブ・ザ・ナショ
ナル・アカデミー・オブ・サイエンス・ユー・エス・エ
ー(Pro. Natl. Acad. Sci. U.S.A.)，84，4524-4528（1
987）〕。しかしながら、この文献においてはＤ−リボ
ース生産能との関係については全く示唆されていない。
ubtilis) においては、グルコン酸の菌体内への透過を
司るグルコネート パーミアーゼ（gluconate permeas
e）やグルコン酸から６−フォスフォグルコン酸を生成
するグルコノキナーゼ（gluconokinase）といった酵素
が存在するが、それらの酵素はグルコン酸オペロン（ｇ
ｎｔ ｏｐｅｒｏｎ）と呼ばれる一つの遺伝子にコード
されている。そしてこのグルコン酸オペロン（ｇｎｔ
ｏｐｅｒｏｎ）はｇｎｔＲ，ｇｎｔＫ，ｇｎｔＰおよび
ｇｎｔＺという４つの領域から成っている〔Y. Fujita
ら、ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミスト
リー(J. Biol. Chem.)，261，13744-13753（1986）〕。
これら酵素の発現は、これら酵素をコードする構造遺伝
子（ｇｎｔＫ，ｇｎｔＰ）の５’上流側に隣接して存在
する発現制御領域（ｇｎｔＲ）によって制御されている
〔Y. Fujita ら、プロシージングス・オブ・ザ・ナショ
ナル・アカデミー・オブ・サイエンス・ユー・エス・エ
ー(Pro. Natl. Acad. Sci. U.S.A.)，84，4524-4528（1
987）〕。しかしながら、この文献においてはＤ−リボ
ース生産能との関係については全く示唆されていない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】前記したＤ−リボース
の製造方法はいずれも製造工程が煩雑であったり、原料
が高価であったり、あるいはグルコン酸を副生して収率
が低かったりなどの欠点を有し、工業的に安価にＤ−リ
ボースを製造する方法としては必ずしも満足できるもの
ではなく、更に有利な製造法が望まれていた。
の製造方法はいずれも製造工程が煩雑であったり、原料
が高価であったり、あるいはグルコン酸を副生して収率
が低かったりなどの欠点を有し、工業的に安価にＤ−リ
ボースを製造する方法としては必ずしも満足できるもの
ではなく、更に有利な製造法が望まれていた。
【０００５】
【発明を解決するための手段】本発明者らは、このよう
な現状に鑑み、微生物を用いる方法、特にバチルス属細
菌を用いた発酵法によるＤ−リボースの効率的生産に関
与する因子を鋭意検索した。その結果、Ｄ−リボースを
生産する能力を有するバチルス属細菌においては、Ｄ−
リボースは、グルコース−６−リン酸を経由する通常の
ペントース リン酸回路を経て生成する他に、グルコン
酸を経由する経路からも生成することがわかった。即ち
グルコン酸は、グルコノキナーゼ（gluconokinase）で
燐酸化されて６−フォスフォグルコン酸が生成し、ここ
からペントース リン酸回路を経て、Ｄ−リボースが生
成蓄積されるものと考えた。本発明者らは更に研究を進
めた結果、バチルス属細菌を用いた発酵法によるＤ−リ
ボースの生産においては、グルコン酸からＤ−リボース
への転換に重要な酵素であるグルコノキナーゼ（glucon
okinase)、グルコネート パーミアーゼ（gluconate per
mease）をコードするグルコン酸オペロン（gnt operon)
を高発現させることが、Ｄ−リボースを効率的かつ多量
に生産するために重要であることを見出した。
な現状に鑑み、微生物を用いる方法、特にバチルス属細
菌を用いた発酵法によるＤ−リボースの効率的生産に関
与する因子を鋭意検索した。その結果、Ｄ−リボースを
生産する能力を有するバチルス属細菌においては、Ｄ−
リボースは、グルコース−６−リン酸を経由する通常の
ペントース リン酸回路を経て生成する他に、グルコン
酸を経由する経路からも生成することがわかった。即ち
グルコン酸は、グルコノキナーゼ（gluconokinase）で
燐酸化されて６−フォスフォグルコン酸が生成し、ここ
からペントース リン酸回路を経て、Ｄ−リボースが生
成蓄積されるものと考えた。本発明者らは更に研究を進
めた結果、バチルス属細菌を用いた発酵法によるＤ−リ
ボースの生産においては、グルコン酸からＤ−リボース
への転換に重要な酵素であるグルコノキナーゼ（glucon
okinase)、グルコネート パーミアーゼ（gluconate per
mease）をコードするグルコン酸オペロン（gnt operon)
を高発現させることが、Ｄ−リボースを効率的かつ多量
に生産するために重要であることを見出した。
【０００６】上記したようにグルコン酸オペロンには酵
素の発現制御に係わる領域が存在することが知られてい
るが、本発明者等は、そのような領域としてｇｎｔＲ部
分だけが存在するのではなくて、プロモータ部分も重要
な働きをしていることをも見出し、このｇｎｔＲ部分の
みならずプロモータ部分を高発現が期待される構造に改
変し、この下流にグルコノキナーゼ、グルコネート パ
ーミアーゼの構造遺伝子が連結された構造を有する新規
ＤＮＡを作製、さらに該ＤＮＡを用いてＤ−リボース生
産能を有するバチルス属細菌を形質転換し、グルコン酸
オペロンが高発現する新規微生物を得、この微生物を培
養することによって、多量のＤ−リボースを安定して生
成蓄積できることを見出した。本発明はこのような知見
に基づいて完成されたもので、（１）グルコン酸オペロ
ンの発現に関与するＤＮＡ配列の一部または全部が、該
グルコン酸オペロンをバチルス属細菌内で高発現させる
ように改変されているＤ−リボース生産能を有するバチ
ルス属細菌を培地に培養し、Ｄ−リボースを生成蓄積せ
しめ、これを採取することを特徴とするＤ−リボースの
製造法、（２）グルコン酸オペロンの発現に関与するＤ
ＮＡ配列の一部または全部が、該グルコン酸オペロンを
バチルス属細菌内で高発現させるように改変されている
ＤＮＡで形質転換されたＤ−リボース生産能を有する新
規なバチルス属細菌、（３）バチルス属細菌のグルコン
酸オペロンのプロモータが、該グルコン酸オペロンをバ
チルス属細菌内で高発現させるように改変されている新
規なＤＮＡ、および（４）バチルス属細菌のグルコン酸
オペロンのプロモータが、該グルコン酸オペロンをバチ
ルス属細菌内で高発現させるように改変されたＤＮＡが
組み込まれている新規なベクター、に関するものであ
る。
素の発現制御に係わる領域が存在することが知られてい
るが、本発明者等は、そのような領域としてｇｎｔＲ部
分だけが存在するのではなくて、プロモータ部分も重要
な働きをしていることをも見出し、このｇｎｔＲ部分の
みならずプロモータ部分を高発現が期待される構造に改
変し、この下流にグルコノキナーゼ、グルコネート パ
ーミアーゼの構造遺伝子が連結された構造を有する新規
ＤＮＡを作製、さらに該ＤＮＡを用いてＤ−リボース生
産能を有するバチルス属細菌を形質転換し、グルコン酸
オペロンが高発現する新規微生物を得、この微生物を培
養することによって、多量のＤ−リボースを安定して生
成蓄積できることを見出した。本発明はこのような知見
に基づいて完成されたもので、（１）グルコン酸オペロ
ンの発現に関与するＤＮＡ配列の一部または全部が、該
グルコン酸オペロンをバチルス属細菌内で高発現させる
ように改変されているＤ−リボース生産能を有するバチ
ルス属細菌を培地に培養し、Ｄ−リボースを生成蓄積せ
しめ、これを採取することを特徴とするＤ−リボースの
製造法、（２）グルコン酸オペロンの発現に関与するＤ
ＮＡ配列の一部または全部が、該グルコン酸オペロンを
バチルス属細菌内で高発現させるように改変されている
ＤＮＡで形質転換されたＤ−リボース生産能を有する新
規なバチルス属細菌、（３）バチルス属細菌のグルコン
酸オペロンのプロモータが、該グルコン酸オペロンをバ
チルス属細菌内で高発現させるように改変されている新
規なＤＮＡ、および（４）バチルス属細菌のグルコン酸
オペロンのプロモータが、該グルコン酸オペロンをバチ
ルス属細菌内で高発現させるように改変されたＤＮＡが
組み込まれている新規なベクター、に関するものであ
る。
【０００７】本発明におけるグルコン酸オペロンの発現
に関与するＤＮＡ配列の一部または全部の改変に当って
は、グルコン酸オペロンのグルコノキナーゼをコードす
るオープン・リーディングフレームの上流側に存在する
発現制御領域たるｇｎｔＲ部分の改変および／またはプ
ロモータ部分の改変が挙げられる。ここでｇｎｔＲ部分
の改変とは、具体的にはｇｎｔＲ部分の欠失あるいは該
領域への別のＤＮＡの挿入等による失活である。このｇ
ｎｔＲ部分には、グルコースによる発現抑制に関する領
域、グルコン酸による発現誘導に関与するＤＮＡ領域が
存在するが、いずれの領域の欠失あるいは失活でもよ
い。一方、グルコン酸オペロンのプロモータの改変とし
ては、例えば、当該プロモータをバチルス属細菌内で発
現可能な他の遺伝子のためのプロモータで交換すること
が挙げられ、具体的には後述するようにバチルス属細菌
の染色体ＤＮＡ由来のプロモータ、バチルス属細菌のフ
ァージ由来のプロモータ等による交換が挙げられる。本
発明におけるＤＮＡ配列の改変はｇｎｔＲ部分の改変お
よび／またはプロモータ部分の改変を意味するが、両者
の改変を併わせて行なうことが最も好ましい。
に関与するＤＮＡ配列の一部または全部の改変に当って
は、グルコン酸オペロンのグルコノキナーゼをコードす
るオープン・リーディングフレームの上流側に存在する
発現制御領域たるｇｎｔＲ部分の改変および／またはプ
ロモータ部分の改変が挙げられる。ここでｇｎｔＲ部分
の改変とは、具体的にはｇｎｔＲ部分の欠失あるいは該
領域への別のＤＮＡの挿入等による失活である。このｇ
ｎｔＲ部分には、グルコースによる発現抑制に関する領
域、グルコン酸による発現誘導に関与するＤＮＡ領域が
存在するが、いずれの領域の欠失あるいは失活でもよ
い。一方、グルコン酸オペロンのプロモータの改変とし
ては、例えば、当該プロモータをバチルス属細菌内で発
現可能な他の遺伝子のためのプロモータで交換すること
が挙げられ、具体的には後述するようにバチルス属細菌
の染色体ＤＮＡ由来のプロモータ、バチルス属細菌のフ
ァージ由来のプロモータ等による交換が挙げられる。本
発明におけるＤＮＡ配列の改変はｇｎｔＲ部分の改変お
よび／またはプロモータ部分の改変を意味するが、両者
の改変を併わせて行なうことが最も好ましい。
【０００８】本発明に用いられるグルコン酸オペロンを
含むＤＮＡは、該オペロンの全てのＤＮＡ部分と、さら
にその前後に若干の周辺部分を含んでいるＤＮＡである
ことが望ましいが、該オペロンの５'側の一部あるい
は、該オペロンの５'側の一部とその上流域を含んでい
るＤＮＡであっても差し支えない。かかるＤＮＡは微生
物の染色体ＤＮＡより組換えＤＮＡ技法を用いてクロー
ニングにより単離するのが簡便であり、例えば、大腸菌
を宿主とするホスト−ベクター系（ＥＫ系)、枯草菌を
宿主とするホスト−ベクター系（ＢＳ系）等が用いられ
る。グルコン酸オペロンを含むＤＮＡの供与菌は必ずし
もＤ−リボースを生産する能力を有している必要はな
く、該菌株のグルコン酸オペロンの塩基配列が後記のＤ
−リボース生産能を有する受容菌として用いられるバチ
ルス属細菌の染色体上のグルコン酸オペロンの塩基配列
との相同性が高いものであれば、原則としてその由来に
ついては特別な制限はなく、どのような微生物でも供与
菌として用いることができる。とりわけ、バチルス属細
菌を用いれば、いわゆるセルフクローニングとなり、取
扱いのうえからも好ましく、また、得られた形質転換株
も安定であることが期待される。
含むＤＮＡは、該オペロンの全てのＤＮＡ部分と、さら
にその前後に若干の周辺部分を含んでいるＤＮＡである
ことが望ましいが、該オペロンの５'側の一部あるい
は、該オペロンの５'側の一部とその上流域を含んでい
るＤＮＡであっても差し支えない。かかるＤＮＡは微生
物の染色体ＤＮＡより組換えＤＮＡ技法を用いてクロー
ニングにより単離するのが簡便であり、例えば、大腸菌
を宿主とするホスト−ベクター系（ＥＫ系)、枯草菌を
宿主とするホスト−ベクター系（ＢＳ系）等が用いられ
る。グルコン酸オペロンを含むＤＮＡの供与菌は必ずし
もＤ−リボースを生産する能力を有している必要はな
く、該菌株のグルコン酸オペロンの塩基配列が後記のＤ
−リボース生産能を有する受容菌として用いられるバチ
ルス属細菌の染色体上のグルコン酸オペロンの塩基配列
との相同性が高いものであれば、原則としてその由来に
ついては特別な制限はなく、どのような微生物でも供与
菌として用いることができる。とりわけ、バチルス属細
菌を用いれば、いわゆるセルフクローニングとなり、取
扱いのうえからも好ましく、また、得られた形質転換株
も安定であることが期待される。
【０００９】このようなＤＮＡ供与菌としては、バチル
ス・ズブチリス(Bacillus subtilis)、バチルス・プミル
ス（Bacillus pumilus）のようなバチルス属細菌が挙げ
られる。例えば、次のような菌株が例示される。 Bacillus subtilis No.168 (BGSC1A1) Bacillus subtilis No.115（IFO14187, FERM BP-1327） Bacillus subtilis MI114（Gene, 24, 255 (1983)） ＢＧＳＣ：ザ・バチルス・ジェネティック・ストック・
センター（The Bacillus Genetic Stock Center) ＩＦＯ：財団法人発酵研究所 供与菌からの染色体ＤＮＡの調製法としては、公知の方
法、例えば、フェノールを用いて染色体ＤＮＡを抽出す
る方法［H. Saito and K. Miura 、バイオシミカ・エ・
バイオフィジカ・アクタ（Biochim．Biophy． Acta), 7
2, 619］が用いられる。かくして得られた染色体ＤＮＡ
は適宜選択された制限酵素で切断され、ＤＮＡリガーゼ
を用いてベクターと連結され、この連結反応液を用い
て、グルコン酸資化能欠損性の宿主菌を形質転換し、該
欠損性が相補された形質転換株を選択することによっ
て、グルコン酸オペロンを含むＤＮＡを得ることもでき
るし、あるいはまた、公知のバチルス・ズブチリス（Ba
cillus subtillis）のグルコン酸オペロンの塩基配列
［Y．Fujita ら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・
ケミストリー（ J. Biol. Chem.） 261, 13744〜13753
(1986)］の一部をプローブとして、コロニー・ハイブリ
ダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション
法を用いて、グルコン酸オペロンを含むＤＮＡをクロー
ン化することができる。宿主菌の形質転換は、宿主菌が
エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）の場合には公
知の方法、例えば、エス・エヌ・コーエン（S. N. Cohe
n.）らの方法［プロシーディングス・オブ・ナショナル
・アカデミー・オブ・サイエンス・ユー・エス・エイ
（Pro. Natl. Acad. Sci. USA), 69, 2110］に従って行
うことができる。かくして得られた形質転換株より該遺
伝子を含むＤＮＡを大量に得るには、「モレキュラー・
クローニング第２版」Molecular Cloning 2nd edition,
T.Maniatis et al, Cold Spring Harbor Laboratory P
ress (1989) １．３３〜１．５２に記載の方法に従って
行うことができる。
ス・ズブチリス(Bacillus subtilis)、バチルス・プミル
ス（Bacillus pumilus）のようなバチルス属細菌が挙げ
られる。例えば、次のような菌株が例示される。 Bacillus subtilis No.168 (BGSC1A1) Bacillus subtilis No.115（IFO14187, FERM BP-1327） Bacillus subtilis MI114（Gene, 24, 255 (1983)） ＢＧＳＣ：ザ・バチルス・ジェネティック・ストック・
センター（The Bacillus Genetic Stock Center) ＩＦＯ：財団法人発酵研究所 供与菌からの染色体ＤＮＡの調製法としては、公知の方
法、例えば、フェノールを用いて染色体ＤＮＡを抽出す
る方法［H. Saito and K. Miura 、バイオシミカ・エ・
バイオフィジカ・アクタ（Biochim．Biophy． Acta), 7
2, 619］が用いられる。かくして得られた染色体ＤＮＡ
は適宜選択された制限酵素で切断され、ＤＮＡリガーゼ
を用いてベクターと連結され、この連結反応液を用い
て、グルコン酸資化能欠損性の宿主菌を形質転換し、該
欠損性が相補された形質転換株を選択することによっ
て、グルコン酸オペロンを含むＤＮＡを得ることもでき
るし、あるいはまた、公知のバチルス・ズブチリス（Ba
cillus subtillis）のグルコン酸オペロンの塩基配列
［Y．Fujita ら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・
ケミストリー（ J. Biol. Chem.） 261, 13744〜13753
(1986)］の一部をプローブとして、コロニー・ハイブリ
ダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション
法を用いて、グルコン酸オペロンを含むＤＮＡをクロー
ン化することができる。宿主菌の形質転換は、宿主菌が
エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）の場合には公
知の方法、例えば、エス・エヌ・コーエン（S. N. Cohe
n.）らの方法［プロシーディングス・オブ・ナショナル
・アカデミー・オブ・サイエンス・ユー・エス・エイ
（Pro. Natl. Acad. Sci. USA), 69, 2110］に従って行
うことができる。かくして得られた形質転換株より該遺
伝子を含むＤＮＡを大量に得るには、「モレキュラー・
クローニング第２版」Molecular Cloning 2nd edition,
T.Maniatis et al, Cold Spring Harbor Laboratory P
ress (1989) １．３３〜１．５２に記載の方法に従って
行うことができる。
【００１０】かくして得られたグルコン酸オペロンを含
むＤＮＡから本発明の新規ＤＮＡを創製するには、組換
えＤＮＡ技法を用いるのが簡便であり、例えば、エシェ
リヒア・コリ（Escherichia coli）の宿主ベクター系を
用いて概略次のような手順で作成単離することができ
る。なお、以後のエシェリヒア・コリ（Escherichia co
li）中での本発明のＤＮＡの作成過程においては、実験
の便宜上、ＤＮＡ断片を新しいベクターにサブクローン
化したり、ポリリンカーを利用して連結するのが好都合
であることが多い。この目的のために、例えば、エシェ
リヒア・コリ（Escherichia coli）のベクターであるｐ
ＵＣ１１８や、ｐＨＳＧ３９８のポリリンカー部分を利
用してサブクローニングを行えば、新規ＤＮＡの作成の
際にも、また、塩基配列決定の際にも好都合である。グ
ルコン酸オペロンを含むプラスミドから適当な制限酵素
と、必要に応じて、二本鎖ＤＮＡを末端から順次消化す
るエキソヌクレアーゼ活性を有する酵素、例えば、ＢＡ
Ｌ３１を用いて、グルコン酸オペロンの発現制御に関わ
る部分を除去し、更に具体的にはグルコノキナーゼをコ
ードするオープン・リーディング・フレームの５'−上
流域を切断削除し、これにＤ−リボース生産能を有する
バチルス属細菌の１６ＳリボソームＲＮＡとの結合に関
与する配列であるリボソーム結合部位をオープン・リー
ディング・フレームの開始コドンの５'−側に方向を合
わせて結合し、さらに、その５'−上流側にプロモータ
配列を連結せしめることによって本発明のＤＮＡを得る
ことができる。プロモータ配列の連結の際、バチルス属
細菌で高発現可能なプロモータ活性を有する、グルコン
酸オペロンプロモータ以外のプロモータ配列を連結せし
めることが好ましい。
むＤＮＡから本発明の新規ＤＮＡを創製するには、組換
えＤＮＡ技法を用いるのが簡便であり、例えば、エシェ
リヒア・コリ（Escherichia coli）の宿主ベクター系を
用いて概略次のような手順で作成単離することができ
る。なお、以後のエシェリヒア・コリ（Escherichia co
li）中での本発明のＤＮＡの作成過程においては、実験
の便宜上、ＤＮＡ断片を新しいベクターにサブクローン
化したり、ポリリンカーを利用して連結するのが好都合
であることが多い。この目的のために、例えば、エシェ
リヒア・コリ（Escherichia coli）のベクターであるｐ
ＵＣ１１８や、ｐＨＳＧ３９８のポリリンカー部分を利
用してサブクローニングを行えば、新規ＤＮＡの作成の
際にも、また、塩基配列決定の際にも好都合である。グ
ルコン酸オペロンを含むプラスミドから適当な制限酵素
と、必要に応じて、二本鎖ＤＮＡを末端から順次消化す
るエキソヌクレアーゼ活性を有する酵素、例えば、ＢＡ
Ｌ３１を用いて、グルコン酸オペロンの発現制御に関わ
る部分を除去し、更に具体的にはグルコノキナーゼをコ
ードするオープン・リーディング・フレームの５'−上
流域を切断削除し、これにＤ−リボース生産能を有する
バチルス属細菌の１６ＳリボソームＲＮＡとの結合に関
与する配列であるリボソーム結合部位をオープン・リー
ディング・フレームの開始コドンの５'−側に方向を合
わせて結合し、さらに、その５'−上流側にプロモータ
配列を連結せしめることによって本発明のＤＮＡを得る
ことができる。プロモータ配列の連結の際、バチルス属
細菌で高発現可能なプロモータ活性を有する、グルコン
酸オペロンプロモータ以外のプロモータ配列を連結せし
めることが好ましい。
【００１１】リボソーム結合部位は、後記のＤ−リボー
ス生産能を有するバチルス属細菌の１６Ｓリボソームの
メッセンジャーＲＮＡ結合部位である3'OHＵＣＵＵＵＣ
ＣＵＣＣ5'（配列番号:1）を相補する配列であればよ
く、バチルス属ＤＮＡよりクローン化された配列や合成
ＤＮＡは勿論のこと、前記のクローン中に存在するグル
コノキナーゼのオープン・リーディング・フレーム上流
に存在している配列をそのまま利用してもよい。この
際、グルコン酸オペロンの発現制御に係わる部分を過不
足なく除去するためには、それぞれ用いる制限酵素の種
類およびエキソヌクレアーゼ活性を有する酵素の量、反
応時間を適宜変えて、削られた部分の種類、大きさが種
々異なったＤＮＡ断片を得、その内から後記するような
適当な手段、例えば、該断片の塩基配列決定の結果によ
り、目的とするＤＮＡ断片を選び出せばよい。塩基配列
の決定は該ＤＮＡ断片を塩基配列決定に用いられるベク
ター、例えば、Ｍ１３、ｐＵＣ１１８あるいは、ｐＨＳ
Ｇ３９８などにサブクローン化した後、公知の方法、例
えばエフ・サンガー（F. Sangar）らの方法［プロシーデ
ィングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイ
エンス・ユー・エス・エイ（Proc. Natl. Acad. Sci. U
SA), 74, 5463］を用いて行うことができる。
ス生産能を有するバチルス属細菌の１６Ｓリボソームの
メッセンジャーＲＮＡ結合部位である3'OHＵＣＵＵＵＣ
ＣＵＣＣ5'（配列番号:1）を相補する配列であればよ
く、バチルス属ＤＮＡよりクローン化された配列や合成
ＤＮＡは勿論のこと、前記のクローン中に存在するグル
コノキナーゼのオープン・リーディング・フレーム上流
に存在している配列をそのまま利用してもよい。この
際、グルコン酸オペロンの発現制御に係わる部分を過不
足なく除去するためには、それぞれ用いる制限酵素の種
類およびエキソヌクレアーゼ活性を有する酵素の量、反
応時間を適宜変えて、削られた部分の種類、大きさが種
々異なったＤＮＡ断片を得、その内から後記するような
適当な手段、例えば、該断片の塩基配列決定の結果によ
り、目的とするＤＮＡ断片を選び出せばよい。塩基配列
の決定は該ＤＮＡ断片を塩基配列決定に用いられるベク
ター、例えば、Ｍ１３、ｐＵＣ１１８あるいは、ｐＨＳ
Ｇ３９８などにサブクローン化した後、公知の方法、例
えばエフ・サンガー（F. Sangar）らの方法［プロシーデ
ィングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイ
エンス・ユー・エス・エイ（Proc. Natl. Acad. Sci. U
SA), 74, 5463］を用いて行うことができる。
【００１２】用いるプロモータ配列は後に用いるＤ−リ
ボース生産能を有するバチルス属細菌内で発現可能なＤ
ＮＡ配列を有するものであればいずれでもよく、その由
来は原核生物、真核生物、あるいは、合成ＤＮＡである
とを問わない。例えば、バチルス属細菌の染色体ＤＮＡ
由来のプロモータ、バチルス属細菌のファージ由来のプ
ロモータ、バチルス属細菌の菌体内で自律増殖可能なプ
ラスミド由来のプロモータ等が挙げられる。このような
プロモータの例としては、具体的には、例えば、 AAAAGGTATTGACTTTCCCTACAGGGTGTGTAATAATTTATATACA SPO1-15 （配列番号:2） AAAAGTTGTTGACTTTATCTACAAGGTGTGGCATAATAATCTTAAC SPO1-26 （配列番号:3） GAAAAGTGTTGAAAATTGT CGAACAGGGTGATATAATAAAAGAGTA φ29G3b （配列番号:4） GAAAAGGGTAGACAAACTATCGTTTAACATGTTATACTATAATAGAA φ29G2 （配列番号:5） ATTAATGTTTGACAACTAT TACAGAGTATGCTATAATGGTAGTATC φ29A1 （配列番号:6） TAATATCGTTGACATTATCCATGTCCGTTGTTAAGATAAACATGAA pur operon （配列番号: 7） CCGCTTCCTTGACATGCTCTTGGCTAGTTGATAATCAACATATAAT gua B （配列番号:8） AAAACATTTACTCCATGGAAAATGATGATAGATTAATTTTTAA PI （配列番号:9） などが挙げられる。
ボース生産能を有するバチルス属細菌内で発現可能なＤ
ＮＡ配列を有するものであればいずれでもよく、その由
来は原核生物、真核生物、あるいは、合成ＤＮＡである
とを問わない。例えば、バチルス属細菌の染色体ＤＮＡ
由来のプロモータ、バチルス属細菌のファージ由来のプ
ロモータ、バチルス属細菌の菌体内で自律増殖可能なプ
ラスミド由来のプロモータ等が挙げられる。このような
プロモータの例としては、具体的には、例えば、 AAAAGGTATTGACTTTCCCTACAGGGTGTGTAATAATTTATATACA SPO1-15 （配列番号:2） AAAAGTTGTTGACTTTATCTACAAGGTGTGGCATAATAATCTTAAC SPO1-26 （配列番号:3） GAAAAGTGTTGAAAATTGT CGAACAGGGTGATATAATAAAAGAGTA φ29G3b （配列番号:4） GAAAAGGGTAGACAAACTATCGTTTAACATGTTATACTATAATAGAA φ29G2 （配列番号:5） ATTAATGTTTGACAACTAT TACAGAGTATGCTATAATGGTAGTATC φ29A1 （配列番号:6） TAATATCGTTGACATTATCCATGTCCGTTGTTAAGATAAACATGAA pur operon （配列番号: 7） CCGCTTCCTTGACATGCTCTTGGCTAGTTGATAATCAACATATAAT gua B （配列番号:8） AAAACATTTACTCCATGGAAAATGATGATAGATTAATTTTTAA PI （配列番号:9） などが挙げられる。
【００１３】これらのプロモータは、該プロモータを含
むＤＮＡ（プラスミド）から適当な制限酵素を用いて切
り出して、例えば、アガロース・ゲル電気泳動、ポリア
クリルアミドゲル電気泳動で分別の後、回収して用いる
こともできるし、また、市販のＤＮＡ合成装置［例えば
アプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）
社製］を用いて、そのプロトコールに従って、フォスフ
ォアミダイド法によって前記プロモータの塩基配列を有
するＤＮＡを合成し、これを用いることもできる。かく
して本発明のＤＮＡが作成され、バチルス属細菌の形質
転換に供せられるが、本発明のＤＮＡにさらにバチルス
属細菌内で発現可能なマーカー遺伝子、例えば、薬剤耐
性遺伝子を連結しておけば、後記するバチルス属細菌の
形質転換株選択の際に好都合なことがある。また、この
際、連結されたプロモータの５'−上流にグルコン酸オ
ペロンの５'−隣接領域の一部を連結しておけば、後記
するＤ−リボース生産能を有するバチルス属細菌の染色
体上での組換えの際にダブルクロスオーバー型の組換え
を起こすので好都合である。
むＤＮＡ（プラスミド）から適当な制限酵素を用いて切
り出して、例えば、アガロース・ゲル電気泳動、ポリア
クリルアミドゲル電気泳動で分別の後、回収して用いる
こともできるし、また、市販のＤＮＡ合成装置［例えば
アプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）
社製］を用いて、そのプロトコールに従って、フォスフ
ォアミダイド法によって前記プロモータの塩基配列を有
するＤＮＡを合成し、これを用いることもできる。かく
して本発明のＤＮＡが作成され、バチルス属細菌の形質
転換に供せられるが、本発明のＤＮＡにさらにバチルス
属細菌内で発現可能なマーカー遺伝子、例えば、薬剤耐
性遺伝子を連結しておけば、後記するバチルス属細菌の
形質転換株選択の際に好都合なことがある。また、この
際、連結されたプロモータの５'−上流にグルコン酸オ
ペロンの５'−隣接領域の一部を連結しておけば、後記
するＤ−リボース生産能を有するバチルス属細菌の染色
体上での組換えの際にダブルクロスオーバー型の組換え
を起こすので好都合である。
【００１４】次に本発明の新規ＤＮＡを大量に得るに
は、前記のＴ４ ＤＮＡリガーゼで連結させた反応液を
用いて、エシェリキア・コリ（Escherichia coli ）の
宿主菌を形質転換し、選択培地、例えば、薬剤耐性を選
択マーカーにした場合には、該薬剤を含有する培地に生
育してきた株を取得し、この形質転換株から自体公知の
方法、例えば前記の「モレキュラー・クローニング第２
版」１．３３〜１．５２に記載の方法に従って行うこと
ができる。
は、前記のＴ４ ＤＮＡリガーゼで連結させた反応液を
用いて、エシェリキア・コリ（Escherichia coli ）の
宿主菌を形質転換し、選択培地、例えば、薬剤耐性を選
択マーカーにした場合には、該薬剤を含有する培地に生
育してきた株を取得し、この形質転換株から自体公知の
方法、例えば前記の「モレキュラー・クローニング第２
版」１．３３〜１．５２に記載の方法に従って行うこと
ができる。
【００１５】次に、かくして得られた新規ＤＮＡを用い
てＤ−リボース生産能を有するバチルス属細菌を形質転
換させ、新規微生物を作出する方法について説明する。
Ｄ−リボース生産能を有するバチルス属細菌としては、
バチルス属のいかなる種（ｓｐｅｃｉｅｓ）に属するも
のであってもよく、例えば、バチルス・ズブチリス（Ba
cillus subtilis)、バチルス・プミルス（Bacillus pum
ilus)、などに属するものが好適である。とりわけ、バ
チルス・ズブチリスに属するものが最も好ましい。本発
明によりＤ−リボース生産を効果的ならしめるために
は、これらのＤ−リボース生産菌がグルコン酸を生成す
る能力を有することが好ましい。たとえば、この能力の
強すぎる菌株は培地中に多量のグルコン酸を蓄積するた
めそのままではＤ−リボースの効率的生産は望めない
が、該菌株を本発明のＤＮＡで形質転換された株に於て
は、グルコン酸がＤ−リボースに転換されるため、グル
コン酸の副成はなく、Ｄ−リボースの効率的な生成蓄積
が達せられる。また逆に、グルコン酸を生成する能力を
有していない株を使用した場合には、２−デオキシ−Ｄ
−グルコース酸化活性の強化あるいは、クローン化され
たバチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）のグル
コースデヒドロゲナーゼ遺伝子〔ランペル (K. A. Lamp
el ）ら、ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（J. Ba
cteriol. ）166, 238-243〕を用いて該遺伝子を発現さ
せることにより、グルコン酸を生成する能力を有する菌
株へと容易に誘導することができ、この菌株を用いるこ
とによって、本発明の実施が可能になる。また、例え
ば、これらの菌に、さらに、Ｄ−リボースの生成蓄積に
有利とされている公知の性質、例えば、トランスケトラ
ーゼ及びＤ−リブロース−５−ホスフェート−３−エピ
メラーゼの少なくとも一方の欠損性、胞子形成能欠損性
などが１つまたは２つ以上付与されたものをＤ−リボー
ス生産受容菌として用いると、Ｄ−リボース生産性の向
上のために一層好適な結果を得ることが多い。
てＤ−リボース生産能を有するバチルス属細菌を形質転
換させ、新規微生物を作出する方法について説明する。
Ｄ−リボース生産能を有するバチルス属細菌としては、
バチルス属のいかなる種（ｓｐｅｃｉｅｓ）に属するも
のであってもよく、例えば、バチルス・ズブチリス（Ba
cillus subtilis)、バチルス・プミルス（Bacillus pum
ilus)、などに属するものが好適である。とりわけ、バ
チルス・ズブチリスに属するものが最も好ましい。本発
明によりＤ−リボース生産を効果的ならしめるために
は、これらのＤ−リボース生産菌がグルコン酸を生成す
る能力を有することが好ましい。たとえば、この能力の
強すぎる菌株は培地中に多量のグルコン酸を蓄積するた
めそのままではＤ−リボースの効率的生産は望めない
が、該菌株を本発明のＤＮＡで形質転換された株に於て
は、グルコン酸がＤ−リボースに転換されるため、グル
コン酸の副成はなく、Ｄ−リボースの効率的な生成蓄積
が達せられる。また逆に、グルコン酸を生成する能力を
有していない株を使用した場合には、２−デオキシ−Ｄ
−グルコース酸化活性の強化あるいは、クローン化され
たバチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）のグル
コースデヒドロゲナーゼ遺伝子〔ランペル (K. A. Lamp
el ）ら、ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（J. Ba
cteriol. ）166, 238-243〕を用いて該遺伝子を発現さ
せることにより、グルコン酸を生成する能力を有する菌
株へと容易に誘導することができ、この菌株を用いるこ
とによって、本発明の実施が可能になる。また、例え
ば、これらの菌に、さらに、Ｄ−リボースの生成蓄積に
有利とされている公知の性質、例えば、トランスケトラ
ーゼ及びＤ−リブロース−５−ホスフェート−３−エピ
メラーゼの少なくとも一方の欠損性、胞子形成能欠損性
などが１つまたは２つ以上付与されたものをＤ−リボー
ス生産受容菌として用いると、Ｄ−リボース生産性の向
上のために一層好適な結果を得ることが多い。
【００１６】Ｄ−リボースを生産する能力のあるバチル
ス属細菌の代表例としては、例えば次のものが挙げられ
る。 Bacillus subtilis No. 429(IFO 12603, ATCC21359) ＊１ 〃 〃 No. 483(IFO 12604, ATCC21360) ＊１ 〃 〃 No. 608(IFO 13323, FERM P-1490) ＊２ 〃 〃 No. 957(IFO 13565, FERM P-2259) ＊３ 〃 〃 No. 941(IFO 13573, FERM P-2360) ＊３ 〃 〃 No.1054(IFO 13586, FERM P-2467) ＊３ 〃 〃 No.1067(IFO 13588, FERM P-2468) ＊３ 〃 〃 No.1097(IFO 13621, FERM P-2833) ＊３，４ 〃 〃 TK 103(IFO 15138, FERM BP-3290) Bacillus Pumilus No. 503(IFO 12600, ATCC21356) ＊１ 〃 〃 No. 537(IFO 12601, ATCC21357) ＊１ 〃 〃 No. 558(IFO 12602, ATCC21358) ＊１ 〃 〃 No. 716(IFO 13322, FERM BP-812) ＊２ 〃 〃 No. 911(IFO 13566, FERM P-2260) ＊３ 〃 〃 No.1027(IFO 13585, FERM P-2466) ＊３ 〃 〃 No.1083(IFO 13620, FERM P-2832) ＊３，４ ＊１：特公昭４７−７９４８号公報、ＵＳＰ ３，６０７，６４８号 ＊２：特公昭５０−１６８７８号公報、ＵＳＰ ３，９１９，０４６号 ＊３：特公昭５１−７７５３号公報、特公昭５２−１９９３号公報、ＵＳＰ ３，９７０，５２２号 ＊４：特公昭５８−１７５９１号公報 本発明においては、バチルス属細菌のグルコン酸オペロ
ンの発現に関与するＤＮＡ配列と該配列の３'-隣接領域
を含む染色体ＤＮＡであって、該グルコン酸オペロンの
発現に関与するＤＮＡ配列の一部または全部が、該グル
コン酸オペロン遺伝子をバチルス属細菌内で高発現させ
るように改変された新規ＤＮＡが、Ｄ−リボース生産能
を有するバチルス属細菌の形質転換に用いられ、この場
合、プラスミドに組み込んだ状態で利用に供することも
可能であるし、また、プラスミドを開裂させた線状ＤＮ
Ａあるいは本発明のＤＮＡを切り出して用いることも可
能である。この形質転換は、該ＤＮＡ断片をそのまま用
いて行なってもよいし、また該ＤＮＡ断片をベクターに
組み込むことによって行なってもよい。該ＤＮＡ断片を
用いてのバチルス属細菌の形質転換は公知の方法［シイ
・アナグノストポウロスおよびジェイ・スピツァイツェ
ン(C. Anagnostopoulos and J. Spizizen）、ジャーナ
ル・オブ・バクテリオロジー（ J. Bacteriol.), 81, 7
41(1961)］等を用いて行うことができる。形質転換株の
選択は、例えば、薬剤耐性遺伝子を選択マーカーとした
ときには対応する薬剤を含有する寒天平板を用いること
によって容易に行うことができる。
ス属細菌の代表例としては、例えば次のものが挙げられ
る。 Bacillus subtilis No. 429(IFO 12603, ATCC21359) ＊１ 〃 〃 No. 483(IFO 12604, ATCC21360) ＊１ 〃 〃 No. 608(IFO 13323, FERM P-1490) ＊２ 〃 〃 No. 957(IFO 13565, FERM P-2259) ＊３ 〃 〃 No. 941(IFO 13573, FERM P-2360) ＊３ 〃 〃 No.1054(IFO 13586, FERM P-2467) ＊３ 〃 〃 No.1067(IFO 13588, FERM P-2468) ＊３ 〃 〃 No.1097(IFO 13621, FERM P-2833) ＊３，４ 〃 〃 TK 103(IFO 15138, FERM BP-3290) Bacillus Pumilus No. 503(IFO 12600, ATCC21356) ＊１ 〃 〃 No. 537(IFO 12601, ATCC21357) ＊１ 〃 〃 No. 558(IFO 12602, ATCC21358) ＊１ 〃 〃 No. 716(IFO 13322, FERM BP-812) ＊２ 〃 〃 No. 911(IFO 13566, FERM P-2260) ＊３ 〃 〃 No.1027(IFO 13585, FERM P-2466) ＊３ 〃 〃 No.1083(IFO 13620, FERM P-2832) ＊３，４ ＊１：特公昭４７−７９４８号公報、ＵＳＰ ３，６０７，６４８号 ＊２：特公昭５０−１６８７８号公報、ＵＳＰ ３，９１９，０４６号 ＊３：特公昭５１−７７５３号公報、特公昭５２−１９９３号公報、ＵＳＰ ３，９７０，５２２号 ＊４：特公昭５８−１７５９１号公報 本発明においては、バチルス属細菌のグルコン酸オペロ
ンの発現に関与するＤＮＡ配列と該配列の３'-隣接領域
を含む染色体ＤＮＡであって、該グルコン酸オペロンの
発現に関与するＤＮＡ配列の一部または全部が、該グル
コン酸オペロン遺伝子をバチルス属細菌内で高発現させ
るように改変された新規ＤＮＡが、Ｄ−リボース生産能
を有するバチルス属細菌の形質転換に用いられ、この場
合、プラスミドに組み込んだ状態で利用に供することも
可能であるし、また、プラスミドを開裂させた線状ＤＮ
Ａあるいは本発明のＤＮＡを切り出して用いることも可
能である。この形質転換は、該ＤＮＡ断片をそのまま用
いて行なってもよいし、また該ＤＮＡ断片をベクターに
組み込むことによって行なってもよい。該ＤＮＡ断片を
用いてのバチルス属細菌の形質転換は公知の方法［シイ
・アナグノストポウロスおよびジェイ・スピツァイツェ
ン(C. Anagnostopoulos and J. Spizizen）、ジャーナ
ル・オブ・バクテリオロジー（ J. Bacteriol.), 81, 7
41(1961)］等を用いて行うことができる。形質転換株の
選択は、例えば、薬剤耐性遺伝子を選択マーカーとした
ときには対応する薬剤を含有する寒天平板を用いること
によって容易に行うことができる。
【００１７】このようにして得られた形質転換株が、目
的通りの特徴を有する新規微生物であるか否かは、グル
コノキナーゼ活性を測定することによって容易に判定で
きる。すなわち、グルコン酸オペロンの発現が脱抑制さ
れ、高められた本発明のＤＮＡで形質転換された新規微
生物は、その親株に比し高いグルコノキナーゼ活性を有
するために、Ｄ−リボース生成蓄積能が親株に比して著
しく高い。このような本発明の形質転換株の代表的な例
としては、後記の実施例２で得られた、バチルス・ズブ
チリス（Bacillus subtilis）ＲＳ１０１（IFO 15138，
FERM BP-3291) が挙げられる。勿論、プロモータやバチ
ルス属細菌を選ぶことによって、本明細書に記載の方法
に従って、同様に種々の形質転換株を容易に作出するこ
とができる。本発明で得られた形質転換株を用いてＤ−
リボースを製造するには、従来のＤ−リボース生産菌の
培養方法と同様の方法が用いられる。すなわち、培地と
しては、各種栄養源即ち炭素源、窒素源などが使用さ
れ、該炭素源としては、例えばＤ−グルコース、Ｄ−フ
ラクトース、Ｄ−マンノース、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−
マンニトール、シュークロース、糖蜜、澱粉加水分解
物、澱粉、酢酸、エタノールなどが挙げられる。該窒素
源としては、コーンスティーブリカー、綿実粕、酵母エ
キス、乾燥酵母、フィッシュミール、肉エキス、ペプト
ン、カザミノ酸、その他の含窒素有機資源、アンモニア
水、アンモニアガス、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニ
ウム、塩化アンモニウム、炭酸アンモニウム、リン酸ア
ンモニウム、硝酸ナトリウムなどの無機窒素化合物のほ
か、尿素、アミノ酸などの有機窒素化合物が使用される
が、なかでもコーンスティーブリカーが有利に使用され
る。
的通りの特徴を有する新規微生物であるか否かは、グル
コノキナーゼ活性を測定することによって容易に判定で
きる。すなわち、グルコン酸オペロンの発現が脱抑制さ
れ、高められた本発明のＤＮＡで形質転換された新規微
生物は、その親株に比し高いグルコノキナーゼ活性を有
するために、Ｄ−リボース生成蓄積能が親株に比して著
しく高い。このような本発明の形質転換株の代表的な例
としては、後記の実施例２で得られた、バチルス・ズブ
チリス（Bacillus subtilis）ＲＳ１０１（IFO 15138，
FERM BP-3291) が挙げられる。勿論、プロモータやバチ
ルス属細菌を選ぶことによって、本明細書に記載の方法
に従って、同様に種々の形質転換株を容易に作出するこ
とができる。本発明で得られた形質転換株を用いてＤ−
リボースを製造するには、従来のＤ−リボース生産菌の
培養方法と同様の方法が用いられる。すなわち、培地と
しては、各種栄養源即ち炭素源、窒素源などが使用さ
れ、該炭素源としては、例えばＤ−グルコース、Ｄ−フ
ラクトース、Ｄ−マンノース、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−
マンニトール、シュークロース、糖蜜、澱粉加水分解
物、澱粉、酢酸、エタノールなどが挙げられる。該窒素
源としては、コーンスティーブリカー、綿実粕、酵母エ
キス、乾燥酵母、フィッシュミール、肉エキス、ペプト
ン、カザミノ酸、その他の含窒素有機資源、アンモニア
水、アンモニアガス、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニ
ウム、塩化アンモニウム、炭酸アンモニウム、リン酸ア
ンモニウム、硝酸ナトリウムなどの無機窒素化合物のほ
か、尿素、アミノ酸などの有機窒素化合物が使用される
が、なかでもコーンスティーブリカーが有利に使用され
る。
【００１８】又培地には、これらの炭素源や窒素源のほ
か、用いられる微生物の生育に必要な種々の金属、ビタ
ミン、アミノ酸類などが適宜添加される。培養は、通
常、振盪あるいは通気撹拌深部培養などの好気条件下に
行なわれる。培養条件、即ち培養温度、培地のｐＨ、培
養時間などは特に限定されないが、培養温度は一般的に
は約１８ないし４５℃、更に好ましくは約２５ないし４
０℃である。培地のｐＨは一般的には約４．５ないし９
であり、更に好ましくは約５．５ないし８であり、培養
時間は一般的には約１８ないし１８０時間であり、更に
好ましくは約３６ないし１２０時間である。生成蓄積さ
れたＤ−リボースを培養液中から採取するには、従来公
知のＤ−リボースの分離、採取法が採用される。例え
ば、培養液をろ過又は遠心分離することにより、菌体を
除去した後、菌体除去液を活性炭処理、イオン交換樹脂
処理等により脱色、脱塩後濃縮し、濃縮液にエチルアル
コールなどの有機溶媒を添加して結晶化することによっ
て得ることができる。
か、用いられる微生物の生育に必要な種々の金属、ビタ
ミン、アミノ酸類などが適宜添加される。培養は、通
常、振盪あるいは通気撹拌深部培養などの好気条件下に
行なわれる。培養条件、即ち培養温度、培地のｐＨ、培
養時間などは特に限定されないが、培養温度は一般的に
は約１８ないし４５℃、更に好ましくは約２５ないし４
０℃である。培地のｐＨは一般的には約４．５ないし９
であり、更に好ましくは約５．５ないし８であり、培養
時間は一般的には約１８ないし１８０時間であり、更に
好ましくは約３６ないし１２０時間である。生成蓄積さ
れたＤ−リボースを培養液中から採取するには、従来公
知のＤ−リボースの分離、採取法が採用される。例え
ば、培養液をろ過又は遠心分離することにより、菌体を
除去した後、菌体除去液を活性炭処理、イオン交換樹脂
処理等により脱色、脱塩後濃縮し、濃縮液にエチルアル
コールなどの有機溶媒を添加して結晶化することによっ
て得ることができる。
【００１９】本発明明細書および図面において、塩基な
どを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Commiss
ion on Biochemical Nomenclature による略号あるいは
当該分野における慣用略号に基づくものであり、その例
を下記する。 ＤＮＡ ：デオキシリボ核酸 Ａ ：アデニン Ｔ ：チミン Ｇ ：グアニン Ｃ ：シトシン ｄＡＴＰ：デオキシアデノシン三リン酸 ｄＴＴＰ：デオキシチミジン三リン酸 ｄＧＴＰ：デオキシグアノシン三リン酸 ｄＣＴＰ：デオキシシチジン三リン酸 ＡＴＰ ：アデノシン三リン酸 ＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸
どを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Commiss
ion on Biochemical Nomenclature による略号あるいは
当該分野における慣用略号に基づくものであり、その例
を下記する。 ＤＮＡ ：デオキシリボ核酸 Ａ ：アデニン Ｔ ：チミン Ｇ ：グアニン Ｃ ：シトシン ｄＡＴＰ：デオキシアデノシン三リン酸 ｄＴＴＰ：デオキシチミジン三リン酸 ｄＧＴＰ：デオキシグアノシン三リン酸 ｄＣＴＰ：デオキシシチジン三リン酸 ＡＴＰ ：アデノシン三リン酸 ＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸
【００２０】
【実施例】以下の実施例により本発明をより具体的に説
明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
後述の実施例１（１）において用いられたバチルス・ズ
ブチリスNo.115は、昭和57年７月13日からＩＦＯに受託
番号ＩＦＯ １４１８７として寄託され、又該微生物は
昭和62年３月28日からＦＲＩに受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ
−１３２７として寄託されている。
明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
後述の実施例１（１）において用いられたバチルス・ズ
ブチリスNo.115は、昭和57年７月13日からＩＦＯに受託
番号ＩＦＯ １４１８７として寄託され、又該微生物は
昭和62年３月28日からＦＲＩに受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ
−１３２７として寄託されている。
【００２１】後述の実施例２で得られた形質転換体バチ
ルス・ズブチリス（Bacillus subtilis) ＴＫ１０３お
よびバチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis) ＲＳ
１０１は平成３年２月14日から財団法人発酵研究所（Ｉ
ＦＯ）に受託番号ＩＦＯ １５１３８，ＩＦＯ １５１３
９としてそれぞれ寄託され、また該微生物は平成３年２
月21日から通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所
（ＦＲＩ）に受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−３２９０，ＦＥ
ＲＭ ＢＰ−３２９１としてそれぞれ寄託されている。
以下の実施例における操作は特に記載する場合を除き、
次の（１）〜（８）の方法に従った。 （１）制限酵素によるＤＮＡの消化 制限酵素（宝酒造(株)製）の緩衝液は酵素メーカー推薦
のものを用い、消化条件は１０単位／μgＤＮＡの酵素
を用いて、３７℃で６０分間保温した。次いで、ＴＥ緩
衝液（１０ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ７．５)、１ｍＭの
ＥＤＴＡ)で飽和したフェノールで抽出し、１／１０倍
容の３Ｍの酢酸ナトリウム（ｐＨ６）を加え、２．５倍
容のエタノールを加えて遠心分離してＤＮＡを回収し
た。 （２）プラスミドの大量抽出法 「モレキュラー・クローニング」、１．３３−１．５２
に記載の方法に従った。すなわち、プラスミドＤＮＡを
含むエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）を２５０
mlのＬＢ培地（バクトトリプトン１０g／l、酵母エキス
５g／l、塩化ナトリウム５g／l）に接種し、一夜培養
後、集菌、洗浄した。次に、洗浄菌体にリゾチームを加
え、さらに１％ラウリル硫酸ナトリウムを含む０．２Ｎ
水酸化ナトリウム溶液を加えて溶菌し、５Ｍ酢酸カリウ
ムを加えた後、遠心分離によりプラスミドを含む上澄液
を得た。上澄液に０．６容のイソプロパノールを加え、
プラスミドＤＮＡを沈澱させ、エタノールで洗浄した
後、ＴＥ緩衝液に溶解した。これに比重が１．６０とな
るように塩化セシウムを加え、終濃度が６００μg／ml
となるようにエチジウム・ブロマイドを加えた。超遠心
機（ロータＶ65Ｔｉ）を用いて２０℃で５０，０００rp
mにて１２時間遠心分離し、紫外線によって検出される
プラスミドのバンドを取り、ｎ−ブタノールを用いてエ
チジウム・ブロマイドを抽出除去した後、エタノール沈
澱を行った。
ルス・ズブチリス（Bacillus subtilis) ＴＫ１０３お
よびバチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis) ＲＳ
１０１は平成３年２月14日から財団法人発酵研究所（Ｉ
ＦＯ）に受託番号ＩＦＯ １５１３８，ＩＦＯ １５１３
９としてそれぞれ寄託され、また該微生物は平成３年２
月21日から通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所
（ＦＲＩ）に受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−３２９０，ＦＥ
ＲＭ ＢＰ−３２９１としてそれぞれ寄託されている。
以下の実施例における操作は特に記載する場合を除き、
次の（１）〜（８）の方法に従った。 （１）制限酵素によるＤＮＡの消化 制限酵素（宝酒造(株)製）の緩衝液は酵素メーカー推薦
のものを用い、消化条件は１０単位／μgＤＮＡの酵素
を用いて、３７℃で６０分間保温した。次いで、ＴＥ緩
衝液（１０ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ７．５)、１ｍＭの
ＥＤＴＡ)で飽和したフェノールで抽出し、１／１０倍
容の３Ｍの酢酸ナトリウム（ｐＨ６）を加え、２．５倍
容のエタノールを加えて遠心分離してＤＮＡを回収し
た。 （２）プラスミドの大量抽出法 「モレキュラー・クローニング」、１．３３−１．５２
に記載の方法に従った。すなわち、プラスミドＤＮＡを
含むエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）を２５０
mlのＬＢ培地（バクトトリプトン１０g／l、酵母エキス
５g／l、塩化ナトリウム５g／l）に接種し、一夜培養
後、集菌、洗浄した。次に、洗浄菌体にリゾチームを加
え、さらに１％ラウリル硫酸ナトリウムを含む０．２Ｎ
水酸化ナトリウム溶液を加えて溶菌し、５Ｍ酢酸カリウ
ムを加えた後、遠心分離によりプラスミドを含む上澄液
を得た。上澄液に０．６容のイソプロパノールを加え、
プラスミドＤＮＡを沈澱させ、エタノールで洗浄した
後、ＴＥ緩衝液に溶解した。これに比重が１．６０とな
るように塩化セシウムを加え、終濃度が６００μg／ml
となるようにエチジウム・ブロマイドを加えた。超遠心
機（ロータＶ65Ｔｉ）を用いて２０℃で５０，０００rp
mにて１２時間遠心分離し、紫外線によって検出される
プラスミドのバンドを取り、ｎ−ブタノールを用いてエ
チジウム・ブロマイドを抽出除去した後、エタノール沈
澱を行った。
【００２２】（３）エシェリヒア・コリ（Escherichia
coli）の形質転換 「モレキュラー・クローニング」１．７４−１．８４に
記載の方法に従った。
coli）の形質転換 「モレキュラー・クローニング」１．７４−１．８４に
記載の方法に従った。
【００２３】３mlのＬＢ培地にエシェリヒア・コリ(Esch
erichia coli）を植菌し、一夜培養し、そのうちの１ml
を１００mlのＬＢ培地に植え、３７℃で菌量が約５×１
０7セル／mlになるまで振盪培養した。次に、集菌し、
氷冷した５０ｍＭの塩化カルシウムと１０ｍＭのトリス
塩酸（ｐＨ８）を含む滅菌水溶液を５０ml加え、懸濁し
て１５分間氷冷した。遠心分離した菌体を再び上記の水
溶液の６．７mlに懸濁し、この０．２mlにＤＮＡを加
え、３０分間氷冷した。これに０．８mlのＬＢ培地を添
加し、３７℃で１時間培養し、薬剤を含むＬＢ寒天平板
培地に塗布し、３７℃で一夜培養した。 （４）ＢＡＬ３１エキソヌクレアーゼ消化処理 ＤＮＡの二本鎖とも両末端から消化するためにＢＡＬ３
１消化処理を行った。すなわち、制限酵素処理した１０
μgのＤＮＡを１００μlのＢＡＬ３１緩衝液（１２ｍＭ
の塩化カルシウム、１２ｍＭの塩化マグネシウム、２０
０ｍＭの塩化ナトリウム、２０ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ
８)、２ｍＭのＥＤＴＡ）に溶解し、１単位のＢＡＬ３
１エキソヌクレアーゼ（宝酒造(株)製）を加え、３０℃
で保温した。反応後フェノール抽出、エタノール沈澱を
行った。次に、消化したＤＮＡの末端を平滑化するため
に上記のＤＮＡを２０μlのＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ
用緩衝液（３３ｍＭのトリス酢酸（ｐＨ７．９)、１０
ｍＭの酢酸マグネシウム、０．５ｍＭのジチオスレイト
ール、６６ｍＭの酢酸カリウム、０．０１％のＢＳＡ、
各０．１ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴ
Ｐを含む）に懸濁し、５単位のＴ４ ＤＮＡポリメラー
ゼ（宝酒造(株)製）を加え、３７℃で３０分間保温し
た。反応後、フェノール抽出、エタノール沈澱を行っ
た。 （５）ＤＮＡの連結反応 ２〜３種のＤＮＡ断片の連結にはＤＮＡライゲーション
・キット(宝酒造(株)製)を用いた。連結条件はメーカー
指定の方法に従った。
erichia coli）を植菌し、一夜培養し、そのうちの１ml
を１００mlのＬＢ培地に植え、３７℃で菌量が約５×１
０7セル／mlになるまで振盪培養した。次に、集菌し、
氷冷した５０ｍＭの塩化カルシウムと１０ｍＭのトリス
塩酸（ｐＨ８）を含む滅菌水溶液を５０ml加え、懸濁し
て１５分間氷冷した。遠心分離した菌体を再び上記の水
溶液の６．７mlに懸濁し、この０．２mlにＤＮＡを加
え、３０分間氷冷した。これに０．８mlのＬＢ培地を添
加し、３７℃で１時間培養し、薬剤を含むＬＢ寒天平板
培地に塗布し、３７℃で一夜培養した。 （４）ＢＡＬ３１エキソヌクレアーゼ消化処理 ＤＮＡの二本鎖とも両末端から消化するためにＢＡＬ３
１消化処理を行った。すなわち、制限酵素処理した１０
μgのＤＮＡを１００μlのＢＡＬ３１緩衝液（１２ｍＭ
の塩化カルシウム、１２ｍＭの塩化マグネシウム、２０
０ｍＭの塩化ナトリウム、２０ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ
８)、２ｍＭのＥＤＴＡ）に溶解し、１単位のＢＡＬ３
１エキソヌクレアーゼ（宝酒造(株)製）を加え、３０℃
で保温した。反応後フェノール抽出、エタノール沈澱を
行った。次に、消化したＤＮＡの末端を平滑化するため
に上記のＤＮＡを２０μlのＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ
用緩衝液（３３ｍＭのトリス酢酸（ｐＨ７．９)、１０
ｍＭの酢酸マグネシウム、０．５ｍＭのジチオスレイト
ール、６６ｍＭの酢酸カリウム、０．０１％のＢＳＡ、
各０．１ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴ
Ｐを含む）に懸濁し、５単位のＴ４ ＤＮＡポリメラー
ゼ（宝酒造(株)製）を加え、３７℃で３０分間保温し
た。反応後、フェノール抽出、エタノール沈澱を行っ
た。 （５）ＤＮＡの連結反応 ２〜３種のＤＮＡ断片の連結にはＤＮＡライゲーション
・キット(宝酒造(株)製)を用いた。連結条件はメーカー
指定の方法に従った。
【００２４】（６）バチルス・ズブチリス（Bacillus s
ubtilis）の形質転換 デュブノー（Dubnou）らの方法に従った。すなわち、５
mlのＬＢ培地に植菌し、３７℃で一夜培養し、この０．
５mlを２０mlのＳＰＩ培地（１．４％のリン酸二カリウ
ム、０．６％のリン酸一カリウム、０．２％の硫酸アン
モニウム、０．１％のクエン酸ナトリウム、０．０２％
の硫酸マグネシウム、０．５％のグルコース、０．０２
％のカザミノ酸、０．１％の酵母エキス、５０μg/mlの
トリプトファン、５０μg/mlのロイシンを含む）に移
し、３７℃で４時間培養した。次に、この１０mlの培養
液を１００mlのＳＰII培地（１．４％のリン酸二カリウ
ム、０．６％のリン酸一カリウム、０．２％の硫酸アン
モニウム、０．１％のクエン酸ナトリウム、０．０２％
の硫酸マグネシウム、０．５％のグルコース、７５μg
／mlの塩化カルシウム、５０８μg／mlの塩化マグネシ
ウムを含む）に移し、３７℃で９０分間培養した。この
菌懸濁液１mlにＤＮＡ １μgを加え、３７℃で３０分間
振盪した後、薬剤を含むＬＢ寒天平板培地に塗布し、３
７℃で一夜培養した。
ubtilis）の形質転換 デュブノー（Dubnou）らの方法に従った。すなわち、５
mlのＬＢ培地に植菌し、３７℃で一夜培養し、この０．
５mlを２０mlのＳＰＩ培地（１．４％のリン酸二カリウ
ム、０．６％のリン酸一カリウム、０．２％の硫酸アン
モニウム、０．１％のクエン酸ナトリウム、０．０２％
の硫酸マグネシウム、０．５％のグルコース、０．０２
％のカザミノ酸、０．１％の酵母エキス、５０μg/mlの
トリプトファン、５０μg/mlのロイシンを含む）に移
し、３７℃で４時間培養した。次に、この１０mlの培養
液を１００mlのＳＰII培地（１．４％のリン酸二カリウ
ム、０．６％のリン酸一カリウム、０．２％の硫酸アン
モニウム、０．１％のクエン酸ナトリウム、０．０２％
の硫酸マグネシウム、０．５％のグルコース、７５μg
／mlの塩化カルシウム、５０８μg／mlの塩化マグネシ
ウムを含む）に移し、３７℃で９０分間培養した。この
菌懸濁液１mlにＤＮＡ １μgを加え、３７℃で３０分間
振盪した後、薬剤を含むＬＢ寒天平板培地に塗布し、３
７℃で一夜培養した。
【００２５】（７）プラークハイブリダイゼーション in vitro パッケージングされたλＺＡＰ（東洋紡績
製）をEscherichia coliＢＢ４に感染させ寒天平板上に
まき、プラークを形成させた後、該寒天平板上にナイロ
ンフィルター（コロニー／プラークスクリーンＮＥＦ−
９７８Ｘ，デュポン社製）を３分間密着させた。次に、
このナイロンフィルターを平板培地よりはがし、０．５
Ｎの水酸化ナトリウム水溶液中に１０分間浸し、続い
て、１Ｍのトリス塩酸（ｐＨ７.５)に１０分間浸した
後、フィルターを室温で乾燥した。その一方で、プロー
ブの作製を行った。作製にはＭＥＧＡＬＡＢＥＬ（宝酒
造(株)製）を用い、方法はメーカーの指定するプロトコ
ールに従った。ハイブリダイゼーションの方法は、ナイ
ロンフィルター指定のプロトコールに従った。 （８）塩基配列決定 ＤＮＡの塩基配列の決定には、シークエナーゼ（東洋紡
(株)製）を用いた。方法は、メーカー指定の方法を用い
た。
製）をEscherichia coliＢＢ４に感染させ寒天平板上に
まき、プラークを形成させた後、該寒天平板上にナイロ
ンフィルター（コロニー／プラークスクリーンＮＥＦ−
９７８Ｘ，デュポン社製）を３分間密着させた。次に、
このナイロンフィルターを平板培地よりはがし、０．５
Ｎの水酸化ナトリウム水溶液中に１０分間浸し、続い
て、１Ｍのトリス塩酸（ｐＨ７.５)に１０分間浸した
後、フィルターを室温で乾燥した。その一方で、プロー
ブの作製を行った。作製にはＭＥＧＡＬＡＢＥＬ（宝酒
造(株)製）を用い、方法はメーカーの指定するプロトコ
ールに従った。ハイブリダイゼーションの方法は、ナイ
ロンフィルター指定のプロトコールに従った。 （８）塩基配列決定 ＤＮＡの塩基配列の決定には、シークエナーゼ（東洋紡
(株)製）を用いた。方法は、メーカー指定の方法を用い
た。
【００２６】実施例１ （１）染色体ＤＮＡの調製 バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis) No.１１５
［ＩＦＯ １４１８７、ＦＥＲＭ ＢＰ−１３２７（寄
託日：１９８７年３月２８日）、（特公平３−３５９１
６、ＵＳＰ４，７０１，４１３）］を４０mlのＬＢ培地
に接種し、３７℃で一夜培養し、フェノールを用いる染
色体ＤＮＡ抽出法によって５mgの染色体ＤＮＡを得た。 （２）グルコン酸オペロン（ｇｎｔ ｏｐｅｒｏｎ）の
クローニング 前記（１）項で調製した染色体ＤＮＡの１０μgをＥｃ
ｏＲＩで消化し、アガロースゲル電気泳動で分画し、約
７．０〜８．０kbに相当するＤＮＡをユニディレクショ
ナル・エレクトロエルータ［インターナショナル・バイ
オテクノロジーズ・インコーポレイテッド（Internatio
nal Biotechnologies Inc.）製］を用いて回収した。
［ＩＦＯ １４１８７、ＦＥＲＭ ＢＰ−１３２７（寄
託日：１９８７年３月２８日）、（特公平３−３５９１
６、ＵＳＰ４，７０１，４１３）］を４０mlのＬＢ培地
に接種し、３７℃で一夜培養し、フェノールを用いる染
色体ＤＮＡ抽出法によって５mgの染色体ＤＮＡを得た。 （２）グルコン酸オペロン（ｇｎｔ ｏｐｅｒｏｎ）の
クローニング 前記（１）項で調製した染色体ＤＮＡの１０μgをＥｃ
ｏＲＩで消化し、アガロースゲル電気泳動で分画し、約
７．０〜８．０kbに相当するＤＮＡをユニディレクショ
ナル・エレクトロエルータ［インターナショナル・バイ
オテクノロジーズ・インコーポレイテッド（Internatio
nal Biotechnologies Inc.）製］を用いて回収した。
【００２７】一方、０．５μgのλＺＡＰ（東洋紡績
製）をＥｃｏＲＩで消化し、上記のＤＮＡ断片と混合
し、連結して、in vitro パッケージングを行い、エシ
ェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＢＢ４株（東洋紡
績製）に感染させ、寒天平板上にプラークを形成させ、
合成オリゴヌクレオチド（5'-AGCTACGAAAGCTCATGTCTCGG
CGCCTGC-3'：配列番号：10）をプローブとして用いて、
プラークハイブリダイゼーションを行った。in vitroパ
ッケージングはPackgene（生化学工業製）を用い添付の
プロトコールに従って行った。この結果、陽性のプラー
クからＤＮＡを取得し、これに挿入されている７．０kb
のＥｃｏＲＩ断片をｐＢＲ３２２のＥｃｏＲＩサイトに
サブクローン化し、グルコン酸オペロン（gnt R，gnt
K，gnt P，gntZ）を含む組換えプラスミドｐＧＮＴ３を
取得した。ｐＧＮＴ３の制限酵素地図を図１（ａ）に示
した。
製）をＥｃｏＲＩで消化し、上記のＤＮＡ断片と混合
し、連結して、in vitro パッケージングを行い、エシ
ェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＢＢ４株（東洋紡
績製）に感染させ、寒天平板上にプラークを形成させ、
合成オリゴヌクレオチド（5'-AGCTACGAAAGCTCATGTCTCGG
CGCCTGC-3'：配列番号：10）をプローブとして用いて、
プラークハイブリダイゼーションを行った。in vitroパ
ッケージングはPackgene（生化学工業製）を用い添付の
プロトコールに従って行った。この結果、陽性のプラー
クからＤＮＡを取得し、これに挿入されている７．０kb
のＥｃｏＲＩ断片をｐＢＲ３２２のＥｃｏＲＩサイトに
サブクローン化し、グルコン酸オペロン（gnt R，gnt
K，gnt P，gntZ）を含む組換えプラスミドｐＧＮＴ３を
取得した。ｐＧＮＴ３の制限酵素地図を図１（ａ）に示
した。
【００２８】（３）ｇｎｔＲの大部分を欠失したＤＮＡ
断片の調製 ５μgのｐＧＮＴ３をＨｉｎｄIIIとＥｃｏＲＩで二重消
化後、アガロースゲル電気泳動を行い、５．０kbに相当
する断片をゲルより抽出し、これをｐＵＣ１９のＨｉｎ
ｄIII−ＥｃｏＲＩサイトに挿入し、Escherichia coli
ＪＭ１０９を形質転換し、アンピシリン耐性株 Escheri
chia coli ＪＭ１０９（ｐＧＮＴ５）から図１（ｂ）に
示すプラスミドｐＧＮＴ５を得た。
断片の調製 ５μgのｐＧＮＴ３をＨｉｎｄIIIとＥｃｏＲＩで二重消
化後、アガロースゲル電気泳動を行い、５．０kbに相当
する断片をゲルより抽出し、これをｐＵＣ１９のＨｉｎ
ｄIII−ＥｃｏＲＩサイトに挿入し、Escherichia coli
ＪＭ１０９を形質転換し、アンピシリン耐性株 Escheri
chia coli ＪＭ１０９（ｐＧＮＴ５）から図１（ｂ）に
示すプラスミドｐＧＮＴ５を得た。
【００２９】次に１０μgのｐＧＮＴ５をＨｉｎｄIIIで
消化した後に、５分間のＢＡＬ３１処理を行った。次い
でＳｐｈＩで完全消化し、アガロースゲル電気泳動で分
画し、約３．７kbに相当するＤＮＡを回収した。このＤ
ＮＡをＳｍａＩとＳｐｈＩで二重消化した０.５μgのｐ
ＨＳＧ３９８（宝酒造製）に連結し、Escherichia coli
ＪＭ１０９を形質転換しクロラムフェニコール（３０mg
／ml）に耐性株を選択した。この結果、図２に示す構造
を有するプラスミドｐＨＧＤ９１８を得た。塩基配列の
決定結果から、本プラスミドは、グルコン酸オペロンの
内、ｇｎｔＲ遺伝子の大部分を欠失し、ｇｎｔＫ遺伝
子、ｇｎｔＰ遺伝子の全部とｇｎｔＺ遺伝子の一部を含
むプラスミドであることを確認した。
消化した後に、５分間のＢＡＬ３１処理を行った。次い
でＳｐｈＩで完全消化し、アガロースゲル電気泳動で分
画し、約３．７kbに相当するＤＮＡを回収した。このＤ
ＮＡをＳｍａＩとＳｐｈＩで二重消化した０.５μgのｐ
ＨＳＧ３９８（宝酒造製）に連結し、Escherichia coli
ＪＭ１０９を形質転換しクロラムフェニコール（３０mg
／ml）に耐性株を選択した。この結果、図２に示す構造
を有するプラスミドｐＨＧＤ９１８を得た。塩基配列の
決定結果から、本プラスミドは、グルコン酸オペロンの
内、ｇｎｔＲ遺伝子の大部分を欠失し、ｇｎｔＫ遺伝
子、ｇｎｔＰ遺伝子の全部とｇｎｔＺ遺伝子の一部を含
むプラスミドであることを確認した。
【００３０】（４）バチルス属細菌内で高発現可能なグ
ルコン酸オペロンを含むプラスミドの作製 ｉ）ｓｐプロモータが組込まれたプラスミドｐＳＰ１９
（ヨーロッパ特許出願公開第412,688号公報）をＥｃｏ
ＲＩとＫｐｎＩで二重消化し、回収した０．１kbの断片
をクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺
伝子を含むプラスミドｐＳＫＣ（ヨーロッパ特許出願公
開第412,688号公報）のＥｃｏＲＩ−ＫｐｎＩサイトに
連結し、Escherichia coli ＪＭ１０９を形質転換して
クロラムフェニコール耐性株よりプラスミドｐＳＫＣＳ
Ｐを得た。次に１０μgのｐＳＫＣＳＰをＢａｍＨＩで
切断後、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑化し、更にＫｐ
ｎＩで切断してアガロースゲル電気泳動を行い、約１．
１kbの断片をゲルより回収した。
ルコン酸オペロンを含むプラスミドの作製 ｉ）ｓｐプロモータが組込まれたプラスミドｐＳＰ１９
（ヨーロッパ特許出願公開第412,688号公報）をＥｃｏ
ＲＩとＫｐｎＩで二重消化し、回収した０．１kbの断片
をクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺
伝子を含むプラスミドｐＳＫＣ（ヨーロッパ特許出願公
開第412,688号公報）のＥｃｏＲＩ−ＫｐｎＩサイトに
連結し、Escherichia coli ＪＭ１０９を形質転換して
クロラムフェニコール耐性株よりプラスミドｐＳＫＣＳ
Ｐを得た。次に１０μgのｐＳＫＣＳＰをＢａｍＨＩで
切断後、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑化し、更にＫｐ
ｎＩで切断してアガロースゲル電気泳動を行い、約１．
１kbの断片をゲルより回収した。
【００３１】ii）５μgのｐＨＧＤ９１８をＫｐｎＩと
ＳｐｈＩで二重消化し、アガロースゲル電気泳動で分画
後、約３．７kbの断片を回収した。 iii）同様にして、ｐＧＮＴ３から約５.４kbのＳｔｕＩ
−ＳｐｈＩ断片を回収した。 iv）上述のｉ、ii、iiiの３断片を混合連結して、Esche
richia coli ＪＭ１０９を形質転換し、アンピシリン耐
性株Escherichia coli ＪＭ１０９（ｐＧＬＳＣ４）を
得た。該株よりプラスミドを抽出し、ｐＧＬＳＣ４を得
た。ｐＧＬＳＣ４の作製方法を図３に、また詳細を図４
に示した。
ＳｐｈＩで二重消化し、アガロースゲル電気泳動で分画
後、約３．７kbの断片を回収した。 iii）同様にして、ｐＧＮＴ３から約５.４kbのＳｔｕＩ
−ＳｐｈＩ断片を回収した。 iv）上述のｉ、ii、iiiの３断片を混合連結して、Esche
richia coli ＪＭ１０９を形質転換し、アンピシリン耐
性株Escherichia coli ＪＭ１０９（ｐＧＬＳＣ４）を
得た。該株よりプラスミドを抽出し、ｐＧＬＳＣ４を得
た。ｐＧＬＳＣ４の作製方法を図３に、また詳細を図４
に示した。
【００３２】ｐＧＬＳＣ４はグルコン酸オペロンのｇｎ
ｔＫ遺伝子ｇｎｔＰ遺伝子の全部とｇｎｔＺの一部を含
み、かつこれらの発現制御に関与すると考えられるｇｎ
ｔＲの大部分を欠失し、ｇｎｔの５’−上流側にＳＰプ
ロモータを有する組換えプラスミドである。
ｔＫ遺伝子ｇｎｔＰ遺伝子の全部とｇｎｔＺの一部を含
み、かつこれらの発現制御に関与すると考えられるｇｎ
ｔＲの大部分を欠失し、ｇｎｔの５’−上流側にＳＰプ
ロモータを有する組換えプラスミドである。
【００３３】実施例２ グルコン酸オペロンが高発現しているバチルス属細菌の
形質転換株の取得 笹島（Sasajima) らの方法〔アグリカルチュラル・バイ
オロジカル・ケミストリー（Agric. Biol. Chem. )．，
34，381 (1970)，ibid．，35，509 (1971)〕および特公
昭５２−１９９３号公報（ＵＳＰ 3,970,522号）に記載
の方法に従い、Bacillus subtilis No.１１５(ＩＦＯ
１４１８７、ＦＥＲＭ ＢＰ １３２７）（特公平３−
３５９１６、ＵＳＰ４，７０１，４１３）を親株として
Ｎ−メチル−Ｎ'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンで
変異処理を行い、通常のレプリカプレート法を用いてシ
キミ酸要求性で、かつ２−デオキシ−Ｄ−グルコース酸
化活性の高い変異株Bacillus subtilis ＴＫ１０３（Ｉ
ＦＯ １５１３８、ＦＥＲＭ ＢＰ−３２９０）を得
た。本変異株はＤ−リボース生産能を有する。次に、実
施例１で得られたｐＧＬＳＣ４の１０μgをＳｐｈＩで
完全消化して線状ＤＮＡとし、このＤＮＡを用いてBaci
llus subtilis ＴＫ１０３を形質転換し、クロラムフェ
ニコール(１０μg／ml）耐性株を得、その内の一株をBa
cillus subtilis ＲＳ１０１（ＩＦＯ １５１３９、Ｆ
ＥＲＭ ＢＰ−３２９１）と命名した。グルコースを主
炭素源とした培地に本菌を培養し、そのグルコノキナー
ゼ（gluconokinase) 活性を測定したところ、菌体破砕
上澄液中の蛋白１mg・１分間当り７５ナノモルの６−ホ
スホグルコン酸を生成する活性を有していた。同条件で
Bacillus subtilis ＴＫ１０３のグルコノキナーゼ活性
を測定したところ、菌体破砕上澄液中の蛋白１mg・１分
間当り僅か０．３ナノモルの６−ホスホグルコン酸を生
成する活性しか示さなかった。尚、グルコノキナーゼ活
性の測定は J．Nishida and Y. Fujita の方法［バイオ
ケミカル・バイオフィジカル・アクタ （Biochem. Biop
hys. Acta ），798, 88〜95 (1984)］に従って行った。
形質転換株の取得 笹島（Sasajima) らの方法〔アグリカルチュラル・バイ
オロジカル・ケミストリー（Agric. Biol. Chem. )．，
34，381 (1970)，ibid．，35，509 (1971)〕および特公
昭５２−１９９３号公報（ＵＳＰ 3,970,522号）に記載
の方法に従い、Bacillus subtilis No.１１５(ＩＦＯ
１４１８７、ＦＥＲＭ ＢＰ １３２７）（特公平３−
３５９１６、ＵＳＰ４，７０１，４１３）を親株として
Ｎ−メチル−Ｎ'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンで
変異処理を行い、通常のレプリカプレート法を用いてシ
キミ酸要求性で、かつ２−デオキシ−Ｄ−グルコース酸
化活性の高い変異株Bacillus subtilis ＴＫ１０３（Ｉ
ＦＯ １５１３８、ＦＥＲＭ ＢＰ−３２９０）を得
た。本変異株はＤ−リボース生産能を有する。次に、実
施例１で得られたｐＧＬＳＣ４の１０μgをＳｐｈＩで
完全消化して線状ＤＮＡとし、このＤＮＡを用いてBaci
llus subtilis ＴＫ１０３を形質転換し、クロラムフェ
ニコール(１０μg／ml）耐性株を得、その内の一株をBa
cillus subtilis ＲＳ１０１（ＩＦＯ １５１３９、Ｆ
ＥＲＭ ＢＰ−３２９１）と命名した。グルコースを主
炭素源とした培地に本菌を培養し、そのグルコノキナー
ゼ（gluconokinase) 活性を測定したところ、菌体破砕
上澄液中の蛋白１mg・１分間当り７５ナノモルの６−ホ
スホグルコン酸を生成する活性を有していた。同条件で
Bacillus subtilis ＴＫ１０３のグルコノキナーゼ活性
を測定したところ、菌体破砕上澄液中の蛋白１mg・１分
間当り僅か０．３ナノモルの６−ホスホグルコン酸を生
成する活性しか示さなかった。尚、グルコノキナーゼ活
性の測定は J．Nishida and Y. Fujita の方法［バイオ
ケミカル・バイオフィジカル・アクタ （Biochem. Biop
hys. Acta ），798, 88〜95 (1984)］に従って行った。
【００３４】実施例３ Bacillus subtilis ＲＳ１０１によるリボースの生産 実施例２で得られた形質転換株Bacillus subtilis ＲＳ
１０１をソルビトール２％、コーンスティープリカー２
％、ＫＨ2ＰＯ4 ０．１％、Ｋ2ＨＰＯ4 ０．３％、Ｌ
−トリプトファン ５０μg／ml（ｐＨ７．２）から成
る培地２０mlに接種し、３７℃で１６時間振盪培養し
た。この１mlをグルコース１６％(別滅菌)、コーンステ
ィープリカー２％、(ＮＨ4)2ＳＯ4 ０．５％、ＣａＣ
Ｏ3 １．５％、Ｌ−トリプトファン ５０μg／mlから
成る培地２０mlに移植し、３７℃で７２時間振盪培養し
た。培養終了後のＤ−リボースの蓄積量を高速液体クロ
マトグラフィーで定量したところ、６２mg／mlのＤ−リ
ボースが蓄積していた。Bacillus subtilis ＴＫ１０３
株を同条件で培養したところ、培養終了液中のＤ−リボ
ースの蓄積量は３９mg／mlにすぎなかった。
１０１をソルビトール２％、コーンスティープリカー２
％、ＫＨ2ＰＯ4 ０．１％、Ｋ2ＨＰＯ4 ０．３％、Ｌ
−トリプトファン ５０μg／ml（ｐＨ７．２）から成
る培地２０mlに接種し、３７℃で１６時間振盪培養し
た。この１mlをグルコース１６％(別滅菌)、コーンステ
ィープリカー２％、(ＮＨ4)2ＳＯ4 ０．５％、ＣａＣ
Ｏ3 １．５％、Ｌ−トリプトファン ５０μg／mlから
成る培地２０mlに移植し、３７℃で７２時間振盪培養し
た。培養終了後のＤ−リボースの蓄積量を高速液体クロ
マトグラフィーで定量したところ、６２mg／mlのＤ−リ
ボースが蓄積していた。Bacillus subtilis ＴＫ１０３
株を同条件で培養したところ、培養終了液中のＤ−リボ
ースの蓄積量は３９mg／mlにすぎなかった。
【００３５】
【発明の効果】本発明のバチルス属細菌のグルコン酸オ
ペロンの発現に関与するＤＮＡ配列と該配列の３'-隣接
領域を含む染色体ＤＮＡであって、該グルコン酸オペロ
ンの発現に関与するＤＮＡ配列の一部または全部が、該
グルコン酸オペロン遺伝子をバチルス属細菌内で高発現
させるように改変されているＤＮＡを用いてグルコン酸
を生成する能力を有するバチルス属のＤ−リボース生産
菌を形質転換することにより、グルコン酸からＤ−リボ
ースへの転換に重要な酵素であるグルコノキナーゼ等を
コードするグルコン酸オペロンが高発現し、該酵素活性
が上昇した、Ｄ−リボース生産能を有する新規微生物を
得ることができる。該新規微生物を培地に培養すること
によりグルコン酸を実質的に蓄積することなくＤ−リボ
ースをきわめて安定的に多量に生産することができる。
ペロンの発現に関与するＤＮＡ配列と該配列の３'-隣接
領域を含む染色体ＤＮＡであって、該グルコン酸オペロ
ンの発現に関与するＤＮＡ配列の一部または全部が、該
グルコン酸オペロン遺伝子をバチルス属細菌内で高発現
させるように改変されているＤＮＡを用いてグルコン酸
を生成する能力を有するバチルス属のＤ−リボース生産
菌を形質転換することにより、グルコン酸からＤ−リボ
ースへの転換に重要な酵素であるグルコノキナーゼ等を
コードするグルコン酸オペロンが高発現し、該酵素活性
が上昇した、Ｄ−リボース生産能を有する新規微生物を
得ることができる。該新規微生物を培地に培養すること
によりグルコン酸を実質的に蓄積することなくＤ−リボ
ースをきわめて安定的に多量に生産することができる。
【００３６】
配列番号：1 配列の長さ：10 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 配列の種類：rRNA 配列 CCUCCUUUCU 10。
【００３７】配列番号：2 配列の長さ：46 配列の型：核酸 鎖の数：２本鎖 配列の種類：Genomic DNA 配列の特徴 特徴を表す記号：promoter 配列 AAAAGGTATT GACTTTCCCT ACAGGGTGTG TAATAATTTA TATACA 46。
【００３８】配列番号：3 配列の長さ：46 配列の型：核酸 鎖の数：２本鎖 配列の種類：Genomic DNA 配列の特徴 特徴を表す記号：promoter 配列 AAAAGTTGTT GACTTTATCT ACAAGGTGTG GCATAATAAT CTTAAC 46。
【００３９】配列番号：4 配列の長さ：46 配列の型：核酸 鎖の数：２本鎖 配列の種類：Genomic DNA 配列の特徴 特徴を表す記号：promoter 配列 GAAAAGTGTT GAAAATTGTC GAACAGGGTG ATATAATAAA AGAGTA 46。
【００４０】配列番号：5 配列の長さ：47 配列の型：核酸 鎖の数：２本鎖 配列の種類：Genomic DNA 配列の特徴 特徴を表す記号：promoter 配列 GAAAAGGGTA GACAAACTAT CGTTTAACAT GTTATACTAT AATAGAA 47。
【００４１】配列番号：6 配列の長さ：46 配列の型：核酸 鎖の数：２本鎖 配列の種類：Genomic DNA 配列の特徴 特徴を表す記号：promoter 配列 ATTAATGTTT GACAACTATT ACAGAGTATG CTATAATGGT AGTATC 46。
【００４２】配列番号：7 配列の長さ：46 配列の型：核酸 鎖の数：２本鎖 配列の種類：Genomic DNA 配列の特徴 特徴を表す記号：promoter 配列 TAATATCGTT GACATTATCC ATGTCCGTTG TTAAGATAAA CATGAA 46。
【００４３】配列番号：8 配列の長さ：46 配列の型：核酸 鎖の数：２本鎖 配列の種類：Genomic DNA 配列の特徴 特徴を表す記号：promoter 配列 CCGCTTCCTT GACATGCTCT TGGCTAGTTG ATAATCAACA TATAAT 46。
【００４４】配列番号：9 配列の長さ：43 配列の型：核酸 鎖の数：２本鎖 配列の種類：Genomic DNA 配列の特徴 特徴を表す記号：ｐｒｏｍｏｔｅｒ 配列 ＡＡＡＡＣＡＴＴＴＡ ＣＴＣＣＡＴＧＧＡＡ ＡＡＴＧＡＴＧＡＴＡ ＧＡＴ
ＴＡＡＴＴＴＴ ＴＡＡ 43。
ＴＡＡＴＴＴＴ ＴＡＡ 43。
【００４５】配列番号：10 配列の長さ：30 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 配列の種類：他の核酸、合成ＤＮＡ 配列 AGCTACGAAA GCTCATGTCT CGGCGCCTGC 30。
【図１（ａ）】実施例１（２）で得られたプラスミドｐ
ＧＮＴ３の制限酵素切断地図を表わす。
ＧＮＴ３の制限酵素切断地図を表わす。
【図１（ｂ）】実施例１（３）で得られたプラスミドｐ
ＧＮＴ５の制限酵素切断地図を表わす。図中の白ヌキ部
分は挿入断片を、また実線部分はベクターを表わす。遺
伝子記号ｇｎｔＲ、ｇｎｔＫ、ｇｎｔＰ、ｇｎｔＺは挿
入断片中のグルコン酸オペロンの４つのオープンリーデ
ィングフレームに対応する位置を表わす。
ＧＮＴ５の制限酵素切断地図を表わす。図中の白ヌキ部
分は挿入断片を、また実線部分はベクターを表わす。遺
伝子記号ｇｎｔＲ、ｇｎｔＫ、ｇｎｔＰ、ｇｎｔＺは挿
入断片中のグルコン酸オペロンの４つのオープンリーデ
ィングフレームに対応する位置を表わす。
【図２】プラスミドｐＨＧＤ９１８の制限酵素地図およ
び、ベクターと挿入断片の連結部分の塩基配列の一部を
表わす。塩基配列中縦の点線はベクターと挿入断片の連
結点であり、ＲＢＳと表示のある点線の配列はリボゾー
ムバインディングサイトを、またStart Codonと表示の
ある配列は、ｇｎｔＫ遺伝子のオープンリーディングフ
レームの開始コドンを表わす。
び、ベクターと挿入断片の連結部分の塩基配列の一部を
表わす。塩基配列中縦の点線はベクターと挿入断片の連
結点であり、ＲＢＳと表示のある点線の配列はリボゾー
ムバインディングサイトを、またStart Codonと表示の
ある配列は、ｇｎｔＫ遺伝子のオープンリーディングフ
レームの開始コドンを表わす。
【図３】プラスミドｐＧＬＳＣ４の構築図を表わす。図
中Ｂ、Ｅ、Ｋ、Ｓｐ、Ｓｔは各々制限酵素ＢａｍＨＩ、
ＥｃｏＲＩ、ＫｐｎＩ、ＳｐｈＩ、ＳｔｕＩの切断点を
表わす。Ｓｔ／Ｂは、ＳｔｕＩの切断点とＢａｍＨＩ切
断後平滑化した末端との連結点を表わす。白ヌキ部分は
グルコン酸オペロンおよびその隣接領域を、斜線部分は
クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝
子を、また黒の塗りつぶし部分はＳＰプロモータを表わ
す。
中Ｂ、Ｅ、Ｋ、Ｓｐ、Ｓｔは各々制限酵素ＢａｍＨＩ、
ＥｃｏＲＩ、ＫｐｎＩ、ＳｐｈＩ、ＳｔｕＩの切断点を
表わす。Ｓｔ／Ｂは、ＳｔｕＩの切断点とＢａｍＨＩ切
断後平滑化した末端との連結点を表わす。白ヌキ部分は
グルコン酸オペロンおよびその隣接領域を、斜線部分は
クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝
子を、また黒の塗りつぶし部分はＳＰプロモータを表わ
す。
【図４】プラスミドｐＧＬＳＣ４の制限酵素地図およ
び、グルコン酸オペロンの遺伝子座を表わす。図中白ヌ
キ部分はｇｎｔオペロンおよび、その５'隣接領域、斜
線部分はクロラムフェニコールアセチルトランスフェラ
ーゼ遺伝子、黒の塗りつぶし部分はＳＰプロモータ、実
線部分はベクターをそれぞれ表わす。
び、グルコン酸オペロンの遺伝子座を表わす。図中白ヌ
キ部分はｇｎｔオペロンおよび、その５'隣接領域、斜
線部分はクロラムフェニコールアセチルトランスフェラ
ーゼ遺伝子、黒の塗りつぶし部分はＳＰプロモータ、実
線部分はベクターをそれぞれ表わす。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:125） (Ｃ１２Ｐ 19/02 Ｃ１２Ｒ 1:125）
Claims (20)
- 【請求項１】グルコン酸オペロンの発現に関与するＤＮ
Ａ配列の一部または全部が、該グルコン酸オペロンをバ
チルス属細菌内で高発現させるように改変されているＤ
−リボース生産能を有するバチルス属細菌を培地に培養
し、Ｄ−リボースを生成蓄積せしめ、これを採取するこ
とを特徴とするＤ−リボースの製造法。 - 【請求項２】改変されるＤＮＡ配列部分が、ｇｎｔＲ領
域である請求項１記載のＤ−リボースの製造法。 - 【請求項３】改変されるＤＮＡ配列部分が、グルコン酸
オペロンのプロモータである請求項１記載のＤ−リボー
スの製造法。 - 【請求項４】グルコン酸オペロンのプロモータが、バチ
ルス属細菌内で発現可能な他のプロモータで交換されて
いる請求項３記載のＤ−リボースの製造法。 - 【請求項５】他のプロモータが、バチルス属細菌の染色
体ＤＮＡ由来またはバチルス属細菌のファージ由来のプ
ロモータである請求項４記載のＤ−リボースの製造法。 - 【請求項６】更にｇｎｔＲ部分が改変されている請求項
３記載のＤ−リボースの製造法。 - 【請求項７】グルコン酸オペロンの発現に関与するＤＮ
Ａ配列の一部または全部が、該グルコン酸オペロンをバ
チルス属細菌内で高発現させるように改変されているＤ
ＮＡで形質転換されたＤ−リボース生産能を有するバチ
ルス属細菌。 - 【請求項８】改変されるＤＮＡ配列部分が、ｇｎｔＲ領
域である請求項７記載のバチルス属細菌。 - 【請求項９】改変されるＤＮＡ配列部分が、グルコン酸
オペロンのプロモータである請求項７記載のバチルス属
細菌。 - 【請求項１０】グルコン酸オペロンのプロモータが、バ
チルス属細菌内で発現可能な他のプロモータで交換され
ている請求項９記載のバチルス属細菌。 - 【請求項１１】他のプロモータが、バチルス属細菌の染
色体ＤＮＡ由来またはバチルス属細菌のファージ由来の
プロモータである請求項１０記載のバチルス属細菌。 - 【請求項１２】更にｇｎｔＲ部分が改変されている請求
項９記載のバチルス属細菌。 - 【請求項１３】バチルス属細菌のグルコン酸オペロンの
プロモータが、該グルコン酸オペロンをバチルス属細菌
内で高発現させるように改変されているＤＮＡ。 - 【請求項１４】グルコン酸オペロンのプロモータが、バ
チルス属細菌内で発現可能な他のプロモータで交換され
ている請求項１３記載のＤＮＡ。 - 【請求項１５】他のプロモータが、バチルス属細菌の染
色体ＤＮＡ由来またはバチルス属細菌のファージ由来の
プロモータである請求項１４記載のＤＮＡ。 - 【請求項１６】更にｇｎｔＲ部分が改変されている請求
項１３記載のＤＮＡ。 - 【請求項１７】バチルス属細菌のグルコン酸オペロンの
プロモータが、該グルコン酸オペロンをバチルス属細菌
内で高発現させるように改変されたＤＮＡが組み込まれ
ているベクター。 - 【請求項１８】グルコン酸オペロンのプロモータが、バ
チルス属細菌内で発現可能な他のプロモータで交換され
ている請求項１７記載のベクター。 - 【請求項１９】他のプロモータが、バチルス属細菌の染
色体ＤＮＡ由来またはバチルス属細菌のファージ由来の
プロモータである請求項１８記載のベクター。 - 【請求項２０】更にｇｎｔＲ部分が改変されている請求
項１７記載のベクター。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3612991 | 1991-03-01 | ||
| JP4-8696 | 1992-01-21 | ||
| JP869692 | 1992-01-21 | ||
| JP3-36129 | 1992-01-21 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05260979A true JPH05260979A (ja) | 1993-10-12 |
Family
ID=26343262
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4042925A Pending JPH05260979A (ja) | 1991-03-01 | 1992-02-28 | Ｄ−リボースの製造法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5281531A (ja) |
| EP (1) | EP0501765A1 (ja) |
| JP (1) | JPH05260979A (ja) |
| IE (1) | IE920659A1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2012020833A1 (ja) | 2010-08-12 | 2012-02-16 | 三井化学株式会社 | ｇｎｔＲを破壊することによって生産性が向上したイソプロピルアルコール生産細菌 |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6723540B1 (en) | 1992-11-05 | 2004-04-20 | Xyrofin Oy | Manufacture of xylitol using recombinant microbial hosts |
| US20080038779A1 (en) * | 1992-11-05 | 2008-02-14 | Danisco Sweeteners Oy | Manufacture of Five-Carbon Sugars and Sugar Alcohols |
| US7226761B2 (en) | 1992-11-05 | 2007-06-05 | Danisco Sweeteners Oy | Manufacture of five-carbon sugars and sugar alcohols |
| JP2001518624A (ja) | 1997-09-26 | 2001-10-16 | ユニバーシティ・オブ・ワシントン | 同時の粒子分離および化学反応 |
| KR100823855B1 (ko) | 2000-01-21 | 2008-04-21 | 다니스코 스위트너스 오와이 | ５탄당 및 당 알콜의 제조 |
| US20050131368A2 (en) * | 2003-03-04 | 2005-06-16 | Diaperoos, Llc | Vacuum-packed diaper |
| DE102012201297A1 (de) * | 2012-01-31 | 2013-08-01 | Basf Se | Expressionsverfahren |
| CN105992817B (zh) * | 2014-02-07 | 2020-09-11 | 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 | 改良的芽孢杆菌宿主 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CH616706A5 (ja) * | 1973-11-23 | 1980-04-15 | Takeda Chemical Industries Ltd | |
| TW201793B (ja) * | 1989-08-04 | 1993-03-11 | Takeda Pharm Industry Co Ltd |
-
1992
- 1992-02-26 EP EP92301596A patent/EP0501765A1/en not_active Withdrawn
- 1992-02-28 JP JP4042925A patent/JPH05260979A/ja active Pending
- 1992-02-28 IE IE065992A patent/IE920659A1/en not_active Application Discontinuation
- 1992-02-28 US US07/844,295 patent/US5281531A/en not_active Expired - Fee Related
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2012020833A1 (ja) | 2010-08-12 | 2012-02-16 | 三井化学株式会社 | ｇｎｔＲを破壊することによって生産性が向上したイソプロピルアルコール生産細菌 |
| JP5674789B2 (ja) * | 2010-08-12 | 2015-02-25 | 三井化学株式会社 | ｇｎｔＲを破壊することによって生産性が向上したイソプロピルアルコール生産細菌 |
| US9267156B2 (en) | 2010-08-12 | 2016-02-23 | Mitsui Chemicals, Inc. | Isopropyl alcohol-producing bacterium having improved productivity by GntR destruction |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| IE920659A1 (en) | 1992-09-09 |
| US5281531A (en) | 1994-01-25 |
| EP0501765A1 (en) | 1992-09-02 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20040106 |