JPH0358787A - Ｄｎａおよびその用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、かつお節の旨味成分である５′〜イノシン酸
（５゜−ＩＭＰ）および、しいたけの旨味戚分てある５
゛−グアニル酸（５゜−ＧＭＰ）の製造原料として重要
な物質であるイノシンお上びクアノノンを各々有利に製
造する方法、その製造に用いられる新規微生物、および
該新規微生物を作出するに用いられる新規ＤＮＡに関す
る。

２ （冬々月通 醗酵法によるイノノンの製造法に関しては、アデニン要
求性であるか、さらにそれに加えて各種の薬剤耐性をイ
テ］ｌｊ．シたバチルス属菌（特公昭５５２９５６号、
特公昭５７−４１９１５号、特開昭５　９　−　４．　
２　８　９　５号・）、ブ１ノビハクテリウム属菌（特
公昭５１−５０７５目）等か、またクアノノンの製造法
に関しては、ハヂルス属菌（特公昭５４１　７０３３号
、特公昭５　５　　４．　５　１　９　９　８・）、ゾ
Ｉノピバクナリウム属閑（特公昭５８．−１７５９２号
）等を用Ｌ）ろ方法か知ら９″ｌていろ。しかるに、イ
ノノン才３よびグアノシンか』ｌ：通の生合戊経路で作
られてＮξるこどから、往々にしこ、イノノン生産菌株
の育挿、生産培養の過程にわいてグアノシノが併産され
てきノこり、あるいはまた、逆に、グアノシン生産菌が
多吊のイノンノを併産することがあり、培養液からのイ
ノノンあるいはクアノノンの単離のために（よ、繁雉な
精製操作が必要てあー、た。このような背景のもとに、
近年発達した組換えＤ　Ｎ　Ａ技法を利用（２て、タア
ノノン生合成経路？おいて最も重要な働きをしているｉ
　Ｍ　１）デヒｌ・ロゲナーセ遺伝子をコードするＤＮ
Ａをプラスミｌ・に連結し、該プラスミドを保持４−る
形質転換株を用いてグアノシンを製造する方法も考案さ
れている（特開昭６０−１５６３８８号）。

まノこ一方、相換えＤＮ　Ａ　Ｈ法を用いて、Ｔ　Ｍ　
Ｉ）デヒトロケナーセ欠損性株を誘導し、グアノシンの
副成を抑える方法も考案されている（特開平ｌ１　７　
４　．’３　８　５号）。

■即≠５邂姻しようとする課題 しかしながら、このような方法でさえも、イノシンおよ
ひグアノシンの食品Ｔ業上の各々の重要度からず２１ば
、前者においては、プラスミ１・を用し）ているために
安定生産の面から、また、後者においては要求物質であ
るキザンチンの連続フィードという煩雑さの故に、必ず
しも満足できるものではなく、更に有利なイノノンの製
造法、およびグアノノンの製造法が望まれていた。

課題を解決するための手段 本発明者ら（Ｊ、このような現状に鑑み、生産菌の有す
るＩ　Ｍ　Ｉ〕デヒド「ｌケナーセ？ｂ　ＰＩ−がグア
ノシンの蓄積量に大きく関ち（７ていろという事実に着
目し、該酵素遺伝子を一″ｊく発現させるこどによって
グアノノンを選択的に著量蓄積せしめ、また逆に該酵素
逍｛Ｉ、子を低く発現させることによって、イノノンを
選択的に著量蓄積せしめろことによー、てグアノシンあ
るいは、イノシンの収量増人を図るこどを［１的どして
鋭色研究を行９た。

この結果、イノノン、あるい（Ｊ１　イノノンおよびグ
アノシンを月−産４−る能力を有ずろ菌株から、その染
担休十のＩ　Ｍ　Ｐデヒ１・ロケナーセ遺伝子をコー｝
”−Ｊ“ろｌ）　Ｎ　Ａのプ［Ｊモータ部分が、該菌株
内で高允現が可能な他のプ〔ノモータに置き換えられた
ような新規微生物を、また−・方、イノノンわよびグア
ノシンを、あるいは、イノノンおよびキザン｝−ノンを
、あろい（ｊキザン１・ノンおよび／まプこ（Ｊグアノ
ンノを各々生産する能力を有する菌株から、その染色体
−１−のＩＭＰテヒドｃＪｌｒナーゼ遺伝子をコー１・
−４るＩ）　Ｎ　Ａのプ〔ノモータ部分か、該菌｛１、
内で低発現か『ｊＪ能なｆｔｌｚのプ「ｌモーシに置，
き換えられたような新規微生物を組換えＩ）ＮＡ技法を
用いて作出するのに威功した。

この手法を用いて、バチルス属細菌から選ばれた微生物
を受容菌として、これから誘導された該新規微生物は、
高発現（または、低発現）のプロモータを持つＩＭＰデ
ヒドロケナーゼ遺伝子が、その染色体Ｉ）　Ｎ　Ａヒに
組み込まれているノこめに、多量のグアノノン（または
、イノノン）を蓄積し、きわめて安定性のある生産がく
りかえし実施できるこどを見出し２た。本発明はこの上
・うな知見に基づいて完成されたちのてあり、 バチルス属閑の染色体のＩ　Ｍ　Ｉ〕デヒドロゲナーセ
遺イ云子のプロモータか、発現可能な他のプ（１モータ
で置換されたｉＭＩ）デヒ｝・ロケナーゼ遺伝子を含む
ＤＮＡを提供するものである。また、本発明は該ＤＮＡ
が組み込まれたベクター、該１）　Ｎ　Ａもしくは該ベ
クターで形質転換されたイノシンおよび／また（」グア
ノシン生産能を有ずるバチルス属菌ならびに該バチルス
属菌を培地に培養し、イノノンわよび／またはクアノノ
ンを生成蓄積せしめ、これを採取することからなるイノ
ノンおよび／またはクアノノンの製造法を提供するもの
である。

本発明に用いられるＩＭＰデヒドロゲナーゼ遺伝子領域
を含むＤＮＡは、該酵素遺伝子をコードする全てのＤＮ
Ａ部分と、更にその前後に若干の周辺部分を含んでいる
ＤＮＡであることが望ましいが、該酵素の翻訳開始点を
含むオープン・リーディング・フレームの５゛側、ＳＤ
配列、プロモータおよび更にその５゛上流域を若干含む
ＤＮＡであっても差しつかえない。

かかるＤＮＡは微生物の染色体ＤＮＡより組換えＤＮＡ
技法を用いて単離するのが簡便であり、この目的に用い
られるホスト・ベクター系としては通常用いられるＥＫ
系、すなわち、宿主としてはエノエリヒア・コリ（Ｅｓ
ｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌｉ）ＫＩ２株由来の、た
とえば、エノエリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
　　ｃｏｌｉ）Ｃ　６　０　０　［テイ・マニアテイス
ら、「モレキュラークローニンク」、ア・ラボラトリー
・マニュアル、コールト・スプリング・ハ７ ーバー・ラボラトリー（Ｔ．　Ｍａｎｉａｔｉｓ　　ｅ
ｔ　　ａｔ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　　Ｃｌｏｎｉｎｇ
，　　Ａ．Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ＭａｎｕａｌＣｏｌ
ｄ　　Ｓｐｒｉｎｇ　　Ｈａｒｂｏｒ　　Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ）東大出版会刊　１９８２年、第５０４頁］、
エンエリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌ
ｉ）Ｊ　Ａ　２　２　１　（　Ｉ　Ｆ　０１４３５９，
ＡＴＣＣ３３８７５）、エシエリヒア・コリ（Ｅｓｃｈ
ｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）ＭＭ　２　９　４（ＡＴＣ
Ｃ３３　６　２５）［プロノーディングス・オブ・ナン
ヨナル・アカデミー・オブ・ザイエンンス（Ｐｒｏｃ．
　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　）ＵＳＡ，　７
　３４１７４（１９７６）］あるいはその誘導体が好適
に用いられる。また、ベクターとしては、ｐＢＲ３２２
．ｐＡＣＹＣ　　１８４．，ｐＡＣＹＣ　　１７７ｐＵ
Ｃ　１８．ｐＵＣ　１９，ｐｆ４ＳＧ３　９　６，ｐＨ
ＳＧ２９８などが好適に用いられる。

またＣ　ｈａｒｏｎ　４．　Ａ　（ｒモレキュラークロ
ーニンク」第３１頁）やＥＭＢＬ　　３、ＥＭＢＬ４［
ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．
Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）．　　１　７　０，　　８　２　
７コなどのファージベクタ８ ＤＰ　　５０ｓｕｐＦ（Ｊモレキュラークローニング」
第５０４頁）、エシェリヒア・コリ（Ｅ　ｓｃｈｅｒｉ
ｃｈｉａｃｏｌｉ）ＮＭ　　５　３　８、ＮＭ　５３９
［ノヤーナル・オブ・モレキュラー・ハイオロジー（Ｊ
．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）．　　Ｉ’　７　０　，　　８
　２　７］、エノエリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａ　　ｃｏｌｉ）Ｌ　Ｅ　　３　９　２　［ジャーナ
ル・オブ・ハイオロジカル・ケミストリ−（ＪＢｉｏｌ
．　Ｃｈｅｍ．）．　　２　１　８，　　９　７］など
を組合わせた宿主ベクター系も用いることができる。ま
た当然のことながら、バチルス属菌たとえばバチルス・
ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）
Ｍ　Ｉ　　ｌ　１　４［ジーン（Ｇｅｎｅ）．　　２　
４　．　　２　５　５］あるいはそれから誘導された変
異株を宿主としてバチルス属菌内で自律複製能を有する
プラスミドｐＵＢ１１０ｐＣ　１９４．ｐＥ　　１　９
４，ｐＳ　１９４，ｐＳＡ　　２１００ｐＨＹ　　３　
０　０　Ｐ　ＬＫなどをヘクターとずるような宿主ヘク
ター系も用いることができる。

ＩＭＰデヒドロゲナーゼ遺伝子の供与菌は、該菌株のＩ
ＭＰデヒドロケナーゼ遺伝子の塩基配列が後記の受容菌
として用いられるハヂルス属閑の染色体上のＩＭＰデヒ
ドロゲナーゼ遺伝子の塩基配列との相同性が高いもので
あれば、原間としてその由来については特別な制限はな
く、どのような微生物でも供与菌として用いることがで
きる。

とりわけ、バチルス属菌を用いればいわゆるセルフクロ
ーニングとなり、取扱いのうえからも好ましく、また得
られた形質転換株も安定であることが期待される。また
該供与菌は必ずしもイノシン、グアノシン、キザントシ
ンあるいは、これらのプリン塩基を生産する能力を有し
ている必要はないが、ＩＭＰデヒドロゲナーゼの欠損性
のないものが好ましい。

このようなＤＮＡ供与菌としては、バチルス・などのバ
チルス属菌が挙げられる。

のような菌株が例示される。

バチルス・ズブチリス（ＢａｃｉｌｌｕｓＮｏ．］　６
　８（ＢＧＳＣＩＡ１） たとえば、次 ｓｕｂｔｉｌｉｓ） ｌ０ バチルス・ズブヂリス（Ｙ３ａｃｉｌｌｕｓ　　ｓｕｌ
＋ｊｉｌｉｓ）Ｎｏ．ｌ１５（ＩＦＯｌ４１８７，ＦＥ
ＲＭ　　Ｔ’，Ｐ１３２７） ハヂルス・ズフー１リス（Ｊ３ａｃｉｌｌｕｓ　　ｓｕ
ｂｔｉｌｉｓ）ＭＩ　　１　１７Ｉ「ンーン（Ｇｅｎｅ
），　　２　４　，　　２　５　５　］バチルス０ブミ
ルス（Ｙ３ａｃｉｌｌｕｓ　　ｐｕｍｉｌｕｓ）ＡＴＣ
Ｃ　　　７０６１ ハヂルス・リケニフ１ルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ１ｉｃ
ｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）Ａ　′ＦＣ　Ｃ　　Ｉ　４　５
　８　０Ｂ　Ｇ　Ｓ　Ｃ　　ザ・バチルス・ノエネフー
インク・スｌ・ソク０センター（Ｔｈｅ　Ｆ３ａｃｉｌ
ｌｕｓ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　ＳｔｏｃｋＣ　ｅｎｔｅｒ） ＩＦＯ：ＩＩイ団法人允醇研究所 ＡＴＣＣ　ノ・アメリカン・タイプ・カルチャ０−１レ
クノｒＩノ（Ｔｌ〕ｅＡ　ｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅ　　
Ｃｕｌｔｕｒｅ　　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）このような
供勺菌からのＩＭＰデヒ１・ロゲナーセ遺イ云子を含む
ＤＮＡの単離は、特開昭６０１５６３８８号に記載の方
法に準じて行うこともてきるし、まノこ、特開昭６４−
２７４７７号に記載の方法にべＣ′じて、後記の受容閑
とし７て用いられるバチルス嘱菌のＩＭＩ）デヒ１・〔
ｌケナーゼ遺伝子の塩基配列と］］４同性が高いような
染色体を６Ｆするバチルス属菌の該酵素欠損性変５゛コ
株のギザンヂン要求性を相袖する組換え体を、供与閑の
遺伝子ライブラリーから選択することに３Ｌっでも該遺
伝了を含むＩ）　Ｎ　Ａを得ることができる。

かくして得られたＩＭＰデヒ１・口ケナーゼ遺伝子を含
むＩ）　Ｎ　Ａから本発明の新規１．）　Ｎ　Ａを逍成
１ｉ離ずるには組換えＩ）　Ｎ　Ａ技法を用いるのか簡
便であり、たどえばエノエリヒア・フリ（Ｅｓｃｈｅｒ
ｉｃｈｉａｃｏｌ　ｉ）の宿主ベクター系が好適に用い
られろ。

本発明の新規Ｉ）Ｎ△はＩ　Ｍ　ｌ）テヒド口ゲナーゼ
遺伝子を含むプラスミトから次のような手順て逓成単離
オることかてきる。

なお、以後のエノエリヒア・コリ（Ｅ　ｓｃｈｅｒｉｃ
ｈｉａｃｏｌｉ）中での本発明のＩ）　Ｎ　Ａの作製過
程に於いて｛ま、尖験の便宜上、Ｉ）　Ｎ　Ａ断片を新
しいベクターにザブクローン化したり、ポリリンカーの
下流に連結するのが好都合であることが多い。この目的
のためにたとえは、エンエリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒ
ｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）のｌ＼クターであるＩ）ＵＣ１
１９のポリリンカ一部分をｆｌｌ用してザブク［７　−
ニングを行えば、新規１）ＮＡの作製の際にも、また、
塩基配列決定の際にも好都合てある。

まず、Ｉ　ＩＶｆ　Ｔ〕デヒドロケナーセ瑣伝子を含む
丁）　Ｎ　Ａからプロモータ領域部分が削られたＤＮＡ
断片を作製する。たとえば次のようにして行うことがで
きる。ＩＭＰデヒド１′Ｊゲナーゼ瑣伝子を含むブラス
ミドを、そのプロモータのＬ流の、かつ、プ「ｌモータ
に近いｆ７Ｉ置に１１ｆｆ−の切断点を有する制限酵素
を用いてｕＪ断する。次Ｌ）て二本鎖Ｔ−）　Ｎ　Ａを
末端から順次消化づ゛ろエキソヌクレアーセ活性を有す
る酵素、たとえば、ＢＡＬ３］を用いて該切断点から消
化されてＩＭＰデヒドロゲナーセ遺伝子の上流域が削ら
れ、短くなー）たＤＮＡ断片を得ろ３、この際、ＩＭＰ
テヒドロゲナーセ遺伝子のプ［ノモータのみがＹ度削ら
，（１たＩ．）　Ｎ　Ａ断片を得るには、用いた醇素の
！７Ｌ反応ｌＩＪ７間を適宜変えて長さが種々異なー，
たＩ）　Ｎ　Ａ断片を得、その内から後記ずるような適
当な手段でたとえば該断片の塩基配列決定の結果から、
目的とするＤ　Ｎ　Ａ断片を選び出してやればよい。塩
基配列の決定ｔｅｌ該１．）　Ｎ　Ａ断片を塩基配列決
定に用いられるベクターたとえば、ＭＩ３、ｐＵｃＩＩ
８あるいｆＪ：ｐＵ　Ｃ　Ｉ　Ｉ　９などにザフクロー
ン化した後、公知の方法たとえばザンカーらの方法［Ｆ
　．　Ｓ　ａｎｇｅｒら、プ［ノンーディンクス・オブ
・ナノヨナル・アカデミー・オブ・ザイエンス（Ｐｒｏ
ｃ．　ＮａＬｌ．　Ａｃａｄ．　　Ｓｃｉ．　）ＬＪＳ
Ａ７４．，５４６３］を用いて行うことができる。

次に、かくして得られたＤＮＡのＩＭＰデヒドロケナー
ゼ遺伝子のオーブン・リーディンク・フレームの」二流
（ＳＤ配列の」−流）に別のプロモータを連結するには
、たとえば大略次のようにして行うことがてきる。プロ
モー夕を欠失したＩＭＰデヒ｝〜ロゲナーゼ遺伝子を含
むプラスミ１・のオープン・リーディンク・フレーｌ８
上流（Ｓ１）配列上流）に唯一の切断点を有する制限酵
素を用いて、常法により該プラスミドを切断し、また一
方、後記の受容菌中でプロモータ活性を有するＤＮＡ断
片を該断片を含むＤＮＡから切り出し、要すれば、該切
断片をたとえばアカロースケル電気沫動で分離後、抽出
単離し、両者を混合し、接着末端が同一の場合はそのま
まＥ）　４　Ｄ　Ｎ　Ａリカーゼを用いて連結し、また
接着末端が異なる場合はＴ４ＤＮＡポリメラーゼを用い
て平滑末端に転換してからＴ４ＤＮＡリガーセて連結ず
ることによって目的とずるＩ）ＮΔを得ることができる
。

なお、この際、置換されたプロモー夕の５′」二流にＩ
ＭＰデヒトロゲナーゼ遺伝子の５′−隣接領域の一部を
連結しておけば、後記する受容閑の染色体」二での組換
えの際にダブルクロースオーバー型の組換えをおこすの
で好都合である。

ＩＭＰデヒドロケナーゼ遺伝子を含むプラスミトを切断
ずる制限酵素としては、ＩＭＰデヒドロケナーセ遺伝子
の上流部に切断点を有するようなものであればどのよう
なものでも使用可能であるが、ＩＭＰデヒドロゲナーゼ
遺伝子のプロモータの５゜−−１二流で、かつ該プロモ
ータに近い位置に切断点を有し、該プラスミトの他の部
分を切断し１５ ないものが好ましく選ばれる。またプロモータを連結す
る際に、プロモータが削除されたＩＭＰデヒドロゲナー
ゼ遺伝子を含むプラスミトを切断ずるに用いられる制限
酵素としては、ＩＭＰデヒ１・ロゲナーゼ遺伝子のオー
プン・リーディング・フレームおよびＳＤ配列の５”一
側で、かつ該部分に近い位置に切断点を有し、かつ当該
プラスミトの他の部分を切断しないものが好ましく選ば
れる。

たとえば、 宜用いられる。

本発明に用いられるプロモー夕は後に用いられる宿主菌
内で発現可能なＤＮＡ配列を有するものであればよく、
その由来は原核生物，真核生物あるいは、合成ＤＮＡで
あるとを問わない。

たとえば、バチルス属閑の染色体由来、バチルス属閑の
ファーノ由来またはバチルス属菌体内で自立増殖可能な
プラスミド由来のプロモータで、バチルス属菌の染色体
のＩＭＰデヒドロゲナーゼ遺伝子よりも強く発現するプ
ロモータ、バチルス属の染色体のＩＭＰデヒドロゲナー
ゼ遺伝子よりも弱く発現するプロモータが挙げられる。

具体的には、たとえば、強く発現するプロモー夕として
は、マガザニク（Ｍａｇａｓａｎｉｋ）の方法［マガサ
ニクヒ’−、１０６〜ＩＩＩＬメソッド・イン・エンザ
イモａ　ノ−（Ｍａｇａｓａｎｉｋ．　Ｂ．．　ｐａｇ
ｅ１　０　６〜１　１　１　，　Ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎ　
Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　Ｖｏｌ．　Ｖ　Ｔｐｕｂｌｉｓ
ｈｅｄ　ｂｙ　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ．Ｎｅｗ
　Ｙｏｒｋ）に従って測定されたＩＭＰデヒトロゲナー
ゼの通常の酵素活性が１　．　５　ｎｍｏｌ生威ＸＭＰ
／分・ｍ９蛋白のとき７　．　５　ｎｍｏｌ生成ＸＭＰ
／分・ｙｒｒｇ蛋白以」二を与えるものが、また、弱く
発現するプロモータとしては、同様の条件下に０　．　
５　ｎｍｏｌ生威ＸＭＰ／分・ｍｇ蛋白以下のＩＭＰデ
ヒドロケナーゼの活性をうえるものが挙げられる。たど
えば、つぎのプロモータが挙げられる。

強い発現用プロモータ Ａ　ＡＡＡＧＧＴＡ　ＴＴＧＡ　ＣＴＴＴＣＣＣＴＡ　
ＣＡＧＧＧＴＧＴＧＴＡＡ　ＴＡ　ＡＴＴＴＡ　ＴＡ　
ＴＡ　ＣＡＳＰＯ］．−１．５［りー．ジイおよびペロ
，ジェイ、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロ
ジー（Ｌｅｅ，Ｇ　ａｎｄＰｅｒｏ，　Ｊ．　Ｍｏｌ．
　Ｂｉｏｌ．），１　５２．２４　７（１　９８　１）
ＩＡＡ　ＡＡＧＴＴＧＴＴＧＡＣＴＴＴＡＴＣＴＡＣＡ
ＡＧＧＴＧＴＧＧ　ＣＡ　ＴＡ　ＡＴＡ　ＡＴＣＴＴＡ
　Ａ　ＣＳＰＯＩ−２６［りーら、モレキュラー・アン
ト・ジェネラル・ンエネティックス（Ｌｅｅ　ｅｔ　ａ
ｌ，Ｍｏｌ．　ＧｅｎＧｅｎｅｔ．）．　　１　８　０
　，　　５　７（１　９　８　０）］ＧＡＡＡＡＧＴＧ
ＴＴＧＡＡＡＡＴＴＧＴＣＧＡＡＣＡＧＧＧＴＧＡＴＡ
ＴＡＡＴＡＡＡＡＧＡＧＴＡφ２９Ｇ３６［マレイ，シ
ー・エルおよびロビノヒッチ，ジェイ・シイ、ジャーナ
ル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｍａｒｒａ
ｙ，　　Ｃ，　Ｌ，　ａｎｄ　Ｒｏｂｉｎｏｗｉｔｚ，
　　ＪＣ．，　．丁　　　Ｂｉｏｌ．　　Ｃｈｅｍ．）
．２　　５　　７　　，　Ｉ　　Ｏ　　５　　３（１　
　９　　８　　２）］ＧＡＡＡＡＧＧＧＴＡＧＡＣＡＡ
ＡＣＴＡＴＣＧＴＴＴＡＡＣＡＴＧＴＴＡＴＡＣＴＡＴ
ＡＡＴＡＧ八人φ２９Ｇ２［ヨシカワ，エイヂら、プロ
ンーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ
・ザイエンス・ユー・エス争エイ（Ｙｏｓｈｉｋａｗａ
，　　Ｉ｛．　ｅｔ　ａｌ．，　　ＰｒｏｃＮａ口　Ａ
ｃａｄ．　　Ｓｃｉ．，　ＵＳＡ）．　　７８　　１　
３３６８ （＋９８１）Ｉ ＡＴＴＡＡＴＧＴＴＴＧＡＣＡＡＣＴＡＴＴＡＣＡＧＡ
ＧＴＡＴＧＣＴＡＴＡＡＴＧＧＴＡＧＴＡＴＣφ２９Ａ
Ｉ．［ヨノカワ，エイヂら、プ［！ンーデインクス・オ
ブ・ナノ？ナル・アカテミー・オブ・ザイエンス・ユー
・エス・エイ（Ｙｏｓｂｉｋａｗａ．　ＩＩ．　ｅｔ　
ａｌ．，　　ＰｒｏｃＮａｉｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ
．，　ＵＳＡ），　　７　８，　　Ｉ　３　３　６（１
９８１）］ Ｔ八ＡＴＡＴＣＧＴＴＧＡＣＡＴＴＡＴＣＣＡＴＧＴＣ
ＣＧＴＴＧＴＴＡＡＧＡＴＡＡＡＣＡＴＧＡＡプリン・
オペロン［エボーレ，ディ・ノエイおよびザルキン，エ
イヂ、ノヤー→ル・オフ・バイオロジカル・ケミストリ
ー（Ｅｂｂｏｌｅ，　Ｄ．　　Ｊ．　ａｎｄ　Ｚａｌｋ
ｉｎ，　ＩＩ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｃｍ．）．２６２．
８２７４（１　９８７）１弱い発現用プロモータ ＡＡＴＴＴＴＡＴＴＴＧＡＣＡＡＡ　Ａ　ＡＴＧＧＧＣ
ＴＣＧＴＧＴＴＧＴＡＣＡＡＴＡＡＡＴＧＴＡＧＴｖｅ
ｇ［モラン．ノー・ピー・ノコニアら、モレキュラー・
アンド・ンエネラル・シｊネティノクス（ＭｏｒａｎＣ
．　Ｐ．　　．Ｊｒ．　ｅｔ　ａｌ．　　Ｍｏｌ．　Ｇ
ｅｎ．　Ｇｅｎｅｔ．）１　８６，３３９（＋　９８２
）］ ＡＡＧＴＣＴＣＣＴＴＧＡＡＡＴＣＡＧＡＡＧ／ｔＴＡ
ＴＴＴＡＧＧＡＴＡＴＡＴＴＴＴＴＣＴＡＴＧＧｔｍｓ
［モラン，ノー・ピー・ンコニアら、モレキコラー・ア
ンド・ノエネラル・ジェネティックス（ＭｏｒａｎＣ，
　Ｐ，，　Ｊｒｅｔ　ａｌ．，　Ｍｏｌ．　Ｇｅｎ．　
Ｇｅｎｅｔ．）＋　８６，３３９（１　９８２）］ ＡＡＡＡＡＣＧＧＴＴＧＣＡＴＴＴＡＡＡＴＣＴＴＡＣ
ＡＴ八ＴＣＴＡＡＴＡＣＴＴＴＣＡＡＡＧＡＣｐｅｎｐ
［ヒメノ．テイら、シャーナル・オツ・ハクテリオロジ
ー（Ｉ−１ｉｍｅｎｏ．Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．．　　．丁
　Ｂ　ａｃｔｅｒｉｏｌ　．）１６８，１１．２８（１
９８６）］ ＣＡＧＴＡＡＴＡＴＴＧ　Ａ　ＣＴＴＴＴＡＡ　ＡＡ　
Ａ　ＡＧＧＡＴＴＧＡＴＴＣＴＡ　Ａ　１’ＧＡ　ＡＧ
Ａ　Ａ　ＡＧＣｃａｔ［ホリノヒソチェスおよびワイズ
ブラム　ヒー・ノエイ、ノヤーナル・オツ・バクテリオ
ロノー（ＴｌｏｒｉｎｏｖｉｃｈｉＳ．　ａｎｄ　Ｗｅ
ｉｓｂｌｕｍ，　Ｂ．，　　．Ｊ　．　Ｂａｃｔｅｒｉ
ｏｌ．）．　　１　５　０８　１．　５（１　９　８　
２）１ ΔΔＴＴＣＣＡＡＧＴＧＴＴＡＡＴＡＴＴＣＣＴＴＡＡ
ＡＡＡＡＣ八ＴＴＴ八ＣＴＴＣＣＡＴＧＧＡＡＡＡＴＧ
ＡＴＧＡＴＡＧＡＴＴＡＡＴＴＴＴＴＡ　ＡＧＡＡＡＡ
ＡＧＡ　Ａ　ＣＴＧＧＴＡＡＴＴＣＧＣＧＡ　ＡＴＴＡ
ＴＧＡＡΔＡＡＧＣＧＣＴＴＴＴＴＣＴＧＣＡ １）１［ケイ・ナカハマら、ジーン（Ｋ．　Ｎａｋａｈ
ａｍａ　ｅｔ　ａｌ．Ｇｅｎｅ）．　　３　６，］　７
　９（１　９　８　５）］これらのプ口モータは、該プ
ロモー夕を含むＩ）　Ｎ　Ａ　（プラスミ１・）から適
当な制限酵素を用いて切り出して、ノコとえげアガ〔１
−ス・ゲル電気泳動、ボリアクリルアミｌ’ケル電気泳
動で分別の後、回収して用いることも出来ろし、また、
市販のＤＮＡ合成装置（たとえばＡ　ｐｐｌ　ｉｅｄ　
　Ｒ　ｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて、そのブ口１
・＝１−ルに従って、フォスフォアミダイト法によって
１′．記プロモータの塩基配列を有するＩ）　ＮＡを合
成し、これを用いろことも出来る。

次に本発明の新規１）ＮΔを大量に得るに｛Ｊ１前記の
Ｔ４＋｝ＮＡリカーセで連結させた反応液を用いて、キ
ザンヂン要求性を０゛する宿主菌を形質転換し、入れか
えられたプロモータの発現により宿主閑のキザンヂノ要
求性が相補された形質転換株を得、この形質転換株から
自体公知の方法、たとえば１１０出の［モレキ：Ｉラー
・クローニンク」第８６頁〜第９３頁に記載の力法に従
って行うことができる。

かくして得られたプラスミトからプ「ｌモータか交換さ
れたＴＭＰデヒドＩ′１ゲナーセ遺伝子部分を単離ずる
には、常法により制限酵素を用いて該プラスミドを切断
し、アカ口ースケル電気泳動で分離した後、たとえばエ
レク｝・ロエルータを用いることによって容易に抽出単
離することかできる３、かくして得られた新規１）　Ｎ
　Ａを用いて受容閑を形質転換させ、新規微ノ１三物を
造成する方法にー）いて説明する。

この形質転換に用いられる受容閑としては、菌体外に与
えられた線状ＤＮＡを取り込み、染色体上において該１
）　Ｎ　Ａの塩基配列と相同性の高い部分で組換えをお
こし、形質が変化する性質、いわゆる形質転換能を有す
る菌であればよく、その染色体ＤＮＡの塩基配列が線状
ＤＮＡに含まれているＩＭＩ）デヒドロケナーゼ遺伝子
のものと高い相同性を示しているものであれば、必ずし
もＩＭＰデヒドロゲナーゼ遺伝子の供７９菌と同−であ
る必要はない。イノノンおよび／またはグアノノン生産
能の高い形質転換株を得る目的からはプリン系物質、た
とえばイノシン、グアノシン、ギザン１・シンの内の２
種以上を蓄積することが知られており、形質転換能を有
し、病原シＬがなく、工業的にも安全に使用されてきた
歴史があるという観点からは、バチルス属菌、特にバチ
ルス・ズブチリス好適である。

また、たとえばこれらの菌に更にプリン系物質の蓄積に
有利とされている公知の性質、たとえば８−アザクアニ
ン耐性などのプリンアナログ耐性、ヌクレオシトホスフ
ォリラーセ欠損性、５′−グアニル酸還元酵素欠損性、
葉酸拮抗剤耐性などか１または２以上ト［与されたもの
を受容菌として用いた場合は、イノシンおよび／または
グアノシン生産性の向上のために一層好適な結果を得る
ことが多い。

ハヂルス属の受容閑としては次のものが例示される。

バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　ｓｕｂｔ
ｉｌｉｓ）ＢＭ　　１０３２（ＩＦＯ　　１４５５９，
ＦＥＲＭＢＰ−１２４２） バチルス・ズブヂリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　ｓｕｂｔ
ｉｌｉｓ）２３ ＩＡ３（ＢＧＳＣ　　Ｎｏ．ＩＡ３） バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　ｓｕｂｔ
ｉｌｉｓ）ＮＡ−６０１１（ＩＦＯ　　１４１８９，Ｆ
ＥＲＭＢＰ−２９１） ハヂルス・ズブヂリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　ｓｕｂｔ
ｉｌｉｓ）ＮＡ−６０１２（ＴＦＯ　　１４ｉ９０，Ｆ
ＥＲＭＢＰ−２９２） バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　ｓｕｂｔ
ｉｌｉｓ）ＮＡ−６１２８（ＩＦＯ　　　１４３７３，
ＦＥＲＭＢＰ−６　１　７） バチルス・ズブヂリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　ｓｕｂｔ
ｉｌｉｓ）ＮＡ−７８２１（ＩＦＯ　　　１４３６８，
Ｆ’ＥＲＭＢＰ−６　＋　８） バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　ｓｕｂｔ
ｉｌｉｓ）ＡＴＣＣ　　　１９２２１ バチルス・ズブヂリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　ｓｕｂｔ
ｉｌｉｓ）ＡＴＣＣ　　　＋４６６２ バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　ｐｕｍｉｌ
ｕｓ）（ＦＥＲＭ　　Ｉ”−２　］　　１　６）バチル
ス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　ｐｕｍｉｌｕｓ）
２４ （ＦＥＲＭ　　Ｐ−４　８　３　２） バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　ｐｕｍｉｌ
ｕｓ）（ＦＥＲＭ　　ｒ’−４　８　２　９）バチルス
・リケニボルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆ
’ｏｒｍｉｓ）　Ｉ　Ｆ　Ｏ　　Ｉ　２　４　８　５本
発明の新規ＤＮＡはバチルス属菌の形質転換に用いられ
、この場合、プラスミドに組み込んだ状態で利用に供す
ることも可能であるが、一般にはプラスミトを開裂させ
た線状ＤＮＡあるいは本発明のＤＮＡを切り出して用い
るのが好ましい。

線状ＤＮＡ断片を用いてのバチルス属菌の形質転換は公
知の方法［シイ・アナグノストボウロスおよびシェイ・
スピツァイツエン・ジャーナル・オブ・バクテリオロジ
イ−（Ｃ．Ａｎａｇｎｏｓｔｏｐｏｕｌｏｓａｎｄ　　
Ｊ．　Ｓｐｉｚｉｚｅｎ，　Ｊ．　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ
．）８　１７４１（＋９６１）］を用いて行うことがで
きる。

本発明の形質転換株を効率よく得るためには、たとえば
、予め、受容菌のＩＭＰデヒドロゲナーゼ遺伝子のプロ
モータおよび構造遺伝子の全部もしくは、一部を欠失さ
せ、キサンヂン要求性にしておくことが有効である。こ
れにより、本発明のＤＮＡで形質転換させた株がキザン
チン要求性でなくなるために、受容菌の形質転換後、キ
サンチンを含まない寒天平板上に塗布し、生育させたと
きに、大多数の受容菌からの形質転換株の選択が容易に
なるからである。このような染色体」二のＩＭＰデヒド
ロゲナーゼ遺伝子のプロモー夕とオープン・リーディン
グ・フレームの全部または一部を欠失した変異株は、Ｉ
ＭＰデヒトロゲナーゼ遺伝子のプロモータとオープン・
リーディング・フレームの全部または一部を欠失したＤ
ＮＡを用いて、受容菌を形質転換し、レプリカ・プレー
ト法でキサンチン要求性株を選択することによって得る
ことができる。この目的に用いられるＤＮＡを作製する
には、受容菌のそれと相同性の高いＩＭＰデヒドロゲナ
ーゼ遺伝子およびその隣接領域を含むプラスミドから、
該遺伝子のプロモータを欠失したＤＮＡを得るのと同様
の手順で、更にエキソヌクレアーゼでの消化を続１：Ｉ
、プロモータのみならず構造遺伝子の全部または一部を
欠失さ２６ せるか、また適当な制限酵素を用いて該遺伝子のプロモ
ータおよびオープン・リーディンク・フレームの欠失し
たＤＮＡを作製することにより行える。この際、エキソ
ヌクレアーセの消化条件は、該遺伝子のプロモータおよ
びオープン・リーディンク・フレー１・を出来得る限り
多く欠失し、かつ、該遺伝子の隣接領域は出来得る限り
残すような条件が好適に選ばれる。また、このようなｒ
ｌＪΔを制限酵素を用いて作製する場合には、同様な条
件を満たずような切断部位を有する制限酵素が好適に選
ばれる。また、このようなＤＮＡを作製するにあたって
、欠失した部分に後記のようにマーカー遺伝子を挿入し
ておけば、キザンヂン要求性株かマーカーたとえば薬剤
耐性を指漂として得ることができ、選択が容易となって
実用上有利である。

選択マーカー遺伝子の挿入および形質転換株の取得につ
いて（ｊ、たとえば特開平１−１７／１３８５号に記載
の方法に準して行うことかできる。かくして得られたキ
ザンチン要求性株を受容菌として、本発明のＤＮＡを用
いて形質転換し、菌＠Ｂ　肢を、２７ キザンチンを含まない寒天平板培地」二に塗布し、生育
してきたコロニーより本発明の新規微生物を得ることが
できる。

このようにして得られた該形質転換株が新規微生物であ
ることは、該形質転換株および形質転換に用いた受容菌
の染色体ＤＮＡを、各々、適当な制限酵素で切断してア
ガロースゲル電気泳動を行い、アルカリ変性させてニト
ロセルロースフィルタに移しとり、一方ＩＭＰデヒトロ
ゲナーゼ遺伝子を含む断片および用いたプロモータを含
むＤＮＡ断片を各々放射能で標識し、これをプローブと
してザザン・ハイツリダイゼーンヨンを行い、各々が、
ハイブリダイズした断片の大きさを解析すると、プロモ
ータか置換されていることが確認されることから判明す
る。また形質転換株の染色体ＤＮＡ上のＩＭＰデヒドロ
ゲナーゼ遺伝子のプロモー夕部分の塩基配列を凋べるこ
とによっても、プロモータが置換されていることを確認
することができる。前記の形質転換株が、本発明のＤＮ
Ａで形質転換した際にダブル・クロス・オーハー型の組
換えをおこしたときは、ＩＭＰデヒドロケナーゼ遺伝子
の発現の強さに差があり、また、本発明のＤＮＡでノン
グル・クロス・オーバー型の組換えをおこしたときは、
」二の性質に加えて、用いたマーカーの性質が発現して
いるが、その他の菌学的性質（ｌＪ．形質転換前の受容
菌と変わらない。

このような本発明の形質転換株の代表的な例としては、
後記の実施例で得られた、 バチルス・ズブチリス（＋３ａｃｉｌｌｕｓ　　ｓｕｂ
ｔｉｌｉｓ）ＮＡ　　６２４２（ＩＦＯ］４８６７．Ｆ
ＥＲＭＢＰ−２３８１） バチルス・ズブヂリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　ｓｕｂｔ
ｉｌｉｓ）ＮＡ　　６２／＋３（ＩＦＯｌ４８６８　　
ＦＥＲＭＢＰ−２３８２） が挙げられる。なお、ここに、ＩＦＯ番号は前記のごと
く、則団法人発酵研究所への寄託番号を、マタ、Ｆ　Ｅ
　Ｒ　Ｍ　　Ｂ　Ｐ一番号はブタペスト条約の下での工
業技術院微生物工業技術研究所（ＦＲＩ）への寄託番号
であり、各菌株は、１９８９年４月３日イ；ｊでＩＦＯ
に、また、１９８９年４月１２日２９ イ」でＦＲＩにそれぞれ寄託されている。

もちろん、プロモータや受容菌を選ぶことによって、本
明細書に記載の方法に従って、同様に種々の形質転換株
を容易に作出することができる。

本発明で得られる形質転換株を用いてイノシンおよび／
またはグアノシンを製造するには、従来のイノノンおよ
び／またはグアノシン生産菌の培養方法と同様の方法が
用いられる。

すなわち、培地としては、炭素源、窒素源、金属イオン
類のほか、必要に応じてアミノ酸、核酸、ビタミン類な
どの栄養源を含有する培地が用いられる。たとえば、炭
素源としては、グルコース、ンユークロース、マルトー
ス、澱粉、澱粉糖化液、糖蜜などが用いられる。窒素源
としては、ペプトン、コーンスティープリカー、大豆粉
、乾燥酵母、尿素などの有機窒素源のほかに、硫酸、硝
酸、塩酸、炭酸などのアンモニウム塩やアンモニアガス
、アンモニア水などの無機窒素源がそれぞれ単独もしく
は混合して用いられる。その他の栄養源としては、菌の
生育に必要な各種の無機塩３０ 角、アミノ酸類、ヒタミン類などが適宜選択の−」二、
それぞれエ｝ラ独もしくは混合して用いられる。アデニ
ン源としては、アデニン、アデノノン、アデニル酸、核
酸（Ｊもと上り、それらを含有する微生物菌休やそれら
の抽出物なとが用いられる。

さらに、培地には必要に応じてノリコンオイル、ポリア
ルギレンクリコールエーテルなとの消泡剤や界面活性剤
なとを添加ずることかてきる。

培養は、通常、振盪あるいは通気撹拌深部培養などの好
気条件下に行なわれる。培地のｐＩ１は通常４ないし９
の範囲が好ましい。培養中にｐＨの変動が観察される場
合は、これを好ましい範囲に修正するために硫酸、炭酸
カルシウム、水酸化ナトリウム、アンモニアガス、アン
モニア水などを適宜添加してもよい。培養濡度は通常２
０°Ｃないし４５℃の範囲から、使用される微生物の生
育およびイノシンおよび／またはクアノソンの蓄積に好
適な温度が選択される。培養は実質的にイノシンおよび
／またはグアノノノの蓄積量が最大になるまで行なわれ
るが、通常２４時間ないし１４４３ 時間の培養で目的を達することがてきる。

培養物からイノシンおよび／またはグアノシンを分離採
取するには、すでに公知にされている通常の精製手段た
とえば枕澱法、イオン交換樹脂や活性炭によるクロマト
グラフィー法などの分離精製法か用いられる。

塞檄敗 以下に参考例および実施例を挙げて本発明を更に詳しく
説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。

なお、以下の参考例および実施例における制限酵素［全
てニッポン・ノーン（株）製］、修飾酵素は、ＤＮＡ１
μ９あたり５Ｕを用いた。

また、反応条件は特に断りのない限り、酵素メーカー指
定の条件て行った。

参考例ｌ バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　ｓｕｂｔ
ｉｌｉｓ）のＩＭＰデヒドロゲナーゼ遺伝子を含むプラ
スミドｐＥＸＩｌ７の単離 バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　ｓｕｂｔ
ｉｌｉｓ）ＮＡ−６０１２（ＩＦＯ　　１４＋９０、Ｆ
ＥＲＭ３２ ＢＰ−２９２）株由来のＩＭＰデヒドロゲナーゼ遺伝子
領域を含む組換えプラスミドｐＥＸＩ１７を保持する形
質転換株、エノエリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａ　　ｃｏｌｉ）ＴＥＸ　　ｌ　］　７（特開昭６０１
５６３８８号）から、該プラスミドの抽出を「モレキュ
ラー・クローニンク」第８６頁〜第９３頁に記載の方法
に従って行った。すなわち、エソエリヒア・コリ（Ｅｓ
ｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌｉ）ＴＥＸ　　Ｉ　Ｉ　
７をＬＢ培地（ハクト・トリプトンＩＯ９／（、酵母エ
キス５　９／（１、塩化ナトリウム５ｙ／ρ）に接種し
、プラスミドを増幅させるためにクロラムフェニコール
をＩ　４　０　ｕ９／ｒｔｒ（ｌとなるように添加して
一夜培養後、集菌、洗浄した。洗浄菌体にリゾヂームを
加え、更に１％ラウリル硫酸ナトリウムを含む０．２Ｎ
水酸化ナトリウム溶液を加えて溶菌し、５Ｍ酢酸カリウ
ムを加えた後、遠心分離によりプラスミドを含む上澄液
を得た。」二澄液に０　６容のイソプロパノールを加え
、プラスミドＤＮＡを沈澱させ、エタノールで浣浄した
後、ＴＥ緩衝肢（１０ｍＭトリス塩酸緩衝肢−１ｍＭ　
　ＥＤＴＡｐＩ｛８．０）に溶解した。これに比重が１
．６０となる上うに塩化センウムを加え、終濃度が６０
０μｔｉ／　ｙｔｒＱとなるようにエチジウム・ブロマ
イドを加えた。超遠心機（ロータ　Ｖ６５　Ｔｉ）を用
いて２０°Ｃで５０．００Ｏｒｐｍにて１２時間遠心分
離し、紫外線によって検出されるプラスミトのバンドを
取り、ｎ−ブタノールを用いてエチジウム・ブロマイド
を抽出除去した後、ＴＥ緩衝液に透析して、３００ｉＱ
．の培養肢から約２００μ９相当の組換えプラスミトｐ
ＥＸＩ１７を得た。

ｐＥＸ］４７を種々の制限酵素で切断し、ラムダファー
ジのＨｉｎｄＩＩＴ分解物の分子量を基準にしてアガロ
ース・ゲル電気泳動のパターンから第１図中に示すよう
な制限酵素切断地図を得た。Ｉ）ＥＸ１１７はｐＢＲ３
２２のＰｓｔｌサイトに約６　４キロベースペアのＤＮ
Ａ断片が挿入された組換えプラスミドである。

実施例Ｉ ＩＭＰデヒドロゲナーゼのプロモータ部分をＳＰＯＩプ
ロモータに置き換えた新規ＤＮＡの３４ 作製 １−ｉ）　　ＩＭＰデヒドロゲナーゼ遺伝子のサブクロ
ーニング ３μｙのｐＥＸｌ１７をＸｂａｌとＨｉｎｃＩＩで二重
消化し、一方ｐＵＣ　Ｉ　］　９　（Ｉ　μｇ）を同じ
＜ＸｂａｌとＩ−Ｔｉｎｃｌｌて二重消化し、両者を混
ぜ合わせ、これに１／２容の７．５Ｍ酢酸アンモニウム
を加え、更に終濃度が７０％となるようにエタノールを
加えてＤＮＡを沈澱させた。遠心分離後、該ＤＮＡをＴ
Ｅ緩衝液（５／ｉ）に溶解しライケーンヨン・キット（
宝酒遣製）を用いて両者を連結した。この反応液の一部
（５μのを用いてエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉ
ｃｈｉａ　　ｃｏｌｉ）Ｘ　８　９　５株（ＩＦＯ＋４
３０８　　ＦＥＲＭ　　Ｐ−７／ＩＩＩ．キザンヂン要
求性を有する）を形質転換して、２５μｇ／ｒｔｔＱの
アンピノリンを含むＭ−９　　ＣＡＴΔ培地（Ｎａ２Ｈ
　Ｐ　　Ｏ　４　　６　９／Ｏｌ１　　Ｋ　Ｈ２Ｐ　　
０　４　３　ｇ／（ｌＸ　　ＮａＣ　］０．５１ｊ／ｆ
！，Ｎｌ｛４Ｃｌ　　ｌｇ／Ｌ　ＭｇＳＯ．　　ＩｍＭ
、ＣａＣｌ２　］ｍＭ，グル：ｌ−ス２ｇ／（１、カザ
ミノ酸２ｑ／（１，　　トリプ１・ファン　！５０ｍｇ
／ｙｐ（１，アデニン３５ ５　Ｑ　ｕｑ／ｒｎＱ、寒天１　５ｇ／（２、ｐｒ］７
．２）に塗布し、３７℃で一日保温し、生育してきた形
質転換株から常法に従ってプラスミドを抽出し、ｐＥＸ
２１４と命名した。形質転換は、エス・エヌ・コーエン
（Ｓ．　Ｎ．　Ｃｏｈｅｎ）らの方法［プロシーデイン
ダス・オブ・ナノヨナル・アカデミー・オブ・ザイエイ
ンス（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．
　）ＵＳＡ６９．２１１０（１９７２）］に従って行っ
た。次に、参考例記載の方法に従って大量調製を行い、
Ｉｆｆの培養液から１３００μタのＤＮＡを得た。

ｐＥＸ２＋４の作製過程を第１図に示した。

１−ｉｉ）ｐＥＸ２１４に含まれるＩＭＰデヒドロゲナ
ーゼの塩基配列決定 ｐＥＸ２１４のＸｂａＩ　−ＨｉｎｃＨ断片について、
エヌ・ポンチ（Ｎ　．　Ｐ　ｏｎｃｚ）らの方法「プロ
シーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ
・ザイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
．）ＵＳＡ．７９　　４．２９８（］　９８２）］に従
って、欠失ＤＮＡ断片群を調製し、サンガー（　Ｓ　ａ
ｎｇｅｒ）法によって塩基配列決定を行った。サンガー
法を行うにあたっ３６ ては、ＳＥＱＵＥＮＡＳＥ［ユナイテッド・ステーツ・
ハイオケミカル・コーポレーション（ＵｎｉｔｅｄＳｔ
ａｔｅｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｒｐｏｒａｔ
ｉｏｎ）製］を用い、メーカのプロトコールに従って行
った。塩基配列の決定結果を第２図に示した。

１　−ｉｉｉ）　　ＩＭＰデヒドロゲナーセ遺伝子のプ
ロモータ部分の削除 ｐＥＸ　２　１　４　（１　０　μ９）をＸｂａｌて切
断後、エタノール沈澱にてＤＮＡを回収し、ＴＥ緩衝液
（１０μｇ）に溶解した。次に緩衝液、水、ＢＡＬ３１
（０　．　２　Ｕ）を加え、反応液を５０μｇとし、３
０°Ｃて反応ざＵた。１分毎に７μａを抜きとり、ＴＥ
飽和フェノール（７μのを加えて撹拌後、上澄液を回収
し、エタノール枕澱にてＤＮＡを回収し、各々ＴＥ緩衝
液（５μＱ）に溶解した。次いで、Ｔ４ＤＮＡポリメラ
ーゼを用いて、平滑末端に転換した。かくして得られた
７本のＤＮＡ溶肢にＰｓＬＴを加え、常法にて反応後、
各々アガロースゲル電気泳動を行い、約１．７Ｋｂ（１
．６〜Ｉ．７５Ｋｂ）のＤＮＡの電気泳動度に相当ケる
断片を含む寒天；３７ を切り出し、ここからエレクトロエルータ（ＴＢｒ社製
）を用いてＤＮＡ断片を回収した。なお、このような断
片はＢＡＬ３］の１分反応のサンプルから得られた。一
方、１μ９のＩｌｌＵＣＩ１９をＳｍａｌＰｓｔＩで二
重消化して約３．２Ｋｂに相当するＤＮＡ断片を同様の
方法で回収した。両者を混合し、ライゲーション・キッ
トを用いて連結の後、エンエリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅ
ｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９を形質転換し、
菌懸濁液をアンピンリンを含有するＬＢ寒天平板培地に
塗布し、１日保温後、生育してきた形質転換株を１２株
釣菌した。各形質転換株の保持するプラスミドの押入断
片部分の塩基配列を、前項に記載の方法に従って調べ、
３５領域を欠失しているプラスミドｐＥＸ２＋４△３を
選び出した。ｐＥＸ２１４△３の作製法およびその塩基
配列を第３図に示した。

１−ｉｖ）　　ＩＭＰデヒドロゲナーゼ遺伝子の５一隣
接領域のｐＥＸ２１４△３への挿 入 ｐＥＸ　］．　１　？　（５μｇ）をＳｍａｌとＸｂａ
ｌで二重切３８ 断し、またｐＥｘ２１４（２０μｇ）をＳｓｐＪで切断
して、各々をアガロースゲル電気泳動で分別後、前者か
らはＩ．４５Ｋｂの断片（約１μｇ）を、後者からは］
．２Ｋｂの断片（約４μｇ）を各々回収した。

２ＫｂのＳｓｐｌ断片は更にＸｂａＴて切断後、同様の
方法で分別し、０．ｌＫｂの断片（約０　２μｇ）を回
収した。一方、１μ９のｐＥＸ２＋４△３をＥｃｏＲＩ
で切断した後、モレキコラー・クローニンク３９５頁の
記載に従ってＴ４ＤＮＡポリメラーゼを用いて接着末端
を平滑末端に変換した後、先に回収したＩ．４５Ｋｂの
断片（１μｇ）と０．ＩＫｂの断片（０．２μｇ）を加
え、ライゲーノヨン・キットを用いて三者を連結し、反
応液の一部（５μＩ２）を用いてエシェリヒア・コリ（
Ｅ　ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）Ｘ　８　９　５株
を形質転換した。アンピンリンを含有するＬＢ寒天平板
培地に生育した形質転換株からプラスミドを抽出し、ｐ
ＥＸ２４＋と命名した。ｐＥＸ２４ｌの作製法を第４図
に示した。

１−ｖ）Ｉ）ＥＸ２４１へのＳＰＯＬ−２６プロモータ
の連結 ３９ ＳＰＯＩ−２６プロモータを含むプラスミドｐｓＰ０１
−２６（１０ｌｌｇ）をＥＣＯＲＩで切断し、アガロー
スゲル電気泳動で分別した後、約０．ＩＫｂのＤＮＡ断
片を回収し、ＴＥ緩衝肢（５μのに溶解した。一方、Ｉ
）Ｅ　Ｘ　２　４　＋　（ｌμｇ）をＫｐｎｌで切断し
て先の０　．　Ｉ　Ｋｂの断片と混合した後、Ｔ４ＤＮ
Ａポリメラーゼを用いて接着末端を平滑末端に転換した
。次いでライゲーンヨン・キットを用いて両者を連結し
、エノエリヒア・コリ（Ｅ　ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏ
ｌｉ）Ｘ　８　９　５株を形質転換して、アンピシリン
含有のＭ−９　　ＣＡＴＡ寒天平板培地に塗布し、生じ
たコロニーから形質転換株エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃ
ｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌｉ）Ｔ　Ｆ　２　４　２　
（　Ｉ　Ｆ　０１４８６４．ＦＥＲＭ　　ＢＰ−２３７
８）を取得した。参考例記載の方法に従って、ｌＱ．の
培養肢から約ｌ２００μ７のプラスミドを取得し、ｐＥ
Ｘ２４２と命名した。５０μ９のｐＥＸ２４．２をＰｖ
ｕＩとＰｓｔｌで二重切断し、アガロースゲル電気泳動
で分別後、２．９Ｋｂの断片を回収し、約７μタを得た
。ｐＥＸ２４２の作製法を第５図に示した。

４０ 実施例２ ２−ｉ）ＩＭＰデヒトロゲナーゼ遺伝子の大部分を欠失
したＤＮＡを含むプラス ミトｐＥＸ２１０の作製 ５μｇのｐＥＸＩ１７をＸｂａｌとＭｌｕｌで二重切断
し、アガロースゲル電気泳動で分別後、７．ＯＫｂの断
片と、３．８Ｋｂの断片を各々回収した。

３．８Ｋｂの断片は更にＮｒｕＴで切断して２．２Ｋｂ
のＮｒｕｌ−Ｍｌｕｌ断片を回収した。また実施例１■
の方法に従って、ｐＥＸ２１４からＸｂａＩＳｓｐｌ断
片（０．ＩＫｂ）を回収した。

更にｐｃ＋９４（５Ｉｚ９）をＣｌａｌで切断して１．
７ＫｂのＣｌａｌ断片を回収し、更にこれをＭｓｐＩ！
＝Ｍｂｏｌで二重切断してクロラムフェニコール・アセ
チルｌ・ランスフエラーゼ遺伝子を含む］．０５Ｋｂ断
片を回収した。該断片の接着末端をＴ４ＤＮＡポリメラ
ーゼを用いて平滑末端に転換した。

次に、この操作で得られた４種のＤＮＡ断片すなわち、
７．ＯＫｂ（７）Ｘｂａｌ−Ｍｌｕｒ断片？　．　２　
ＫｂのＮｒｕｒ−Ｍｌｕｌ断片０．ＩＫｂのＸｂａｌ−
Ｓｓｐｌ断片 １．０５ＫｂのＭｓｐ　Ｉ　−　Ｍｂｏ　Ｉ断片（両端
は平滑末端に転換済み） を各々０　５、０　５、０．１、０．２μｇ取り、混合
し、ライゲーション・キットを用いて連結した。

この反応液の一部（１μ９）を用いてエシェリヒア・コ
リ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）Ｃ　６　０　
０を形質転換し、菌懸濁岐をクロラムフエニコール（１
０μｇ／ｘ■およびテトラサイクリン（１２　５μ９／
ｍｃ）を含有するＬＢ寒天平板培地に塗布し、３７℃に
て１日保温後、生育してきた株の内から常法に従ってプ
ラスミドを抽出し、ｐＥＸ２１０と命名した。

ｐＥＸ２１０の作製法を第６図に示した。

２−ｉｉ）　　染色体上のＩＭＰデヒドロゲナーゼ遺伝
子の大部分を欠失した形質転換 株の作製 ｐＥＸ２１０（５０μ９）をＰｓｌｌで切断後、７０Ｋ
ｂの断片部分を実施例１−ｖの方法に従って分別回収し
た。この断片（１μ？）をシー・アナグノスト４２ ボウロスおよひジェイ・スピツァイツェン（ＣＡｎａｇ
ｎｏｓｔｏｐｏｕｌｏｓ　ａｎｄ　．Ｊ　．Ｓｐｉｚｉ
ｚｅｎ）の方法［ジャーナル・オブ・バクテリオロジー
（．ＪＢａｃｔｅｒｉｏｌ．），　　８　１．　　７４
　１（１　９６　１）］に従って作製されたバチルス・
ズブヂリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＮＡ
６　１　２８（ＩＦＯ　　Ｉ　４　３７３ＦＥＲＭ　　
ＢＰ−６　］　７）のコンビテントセル懸濁液１ｍＱに
加え、３７℃で１時間振盪培養後、クロラムフェニコー
ル（１０μ！？／７１１！）を含むＩ，Ｂ寒天平板培地
に塗布し、３７℃にて１１ヨ保温した。

生じた形質転換株を取得し、バチルス・ズブチリス（Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ　　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＮＡ　６　２　
１　０　（ｒ　Ｆ　０１４８６６、ＦＥＲＭ　　ＢＰ−
２３８０）と命名した。Ｍ−９　　ＣΔＴＡ寒天平板培
地およびこれに更にキザンチン（５０μｇ／ｍのを加え
た寒天平板培地に該菌株を接種し、両培地での生育をみ
たところ、前者には生育しないが後者には生育がみられ
た。このことから、ＮＡ６２１０株はキザンヂン要求性
となっていることが明らかであった。

２−ｉｉｉ）　　ＳＰＯＩ−２６プロモータを連結した
ＩＭＰデヒドロゲナーゼ遺伝子が組 み込まれた形質転換株の作製 バチルス・ズブヂリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　ｓｕｂｔ
ｉｌｉｓ）ＮＡ６２１０株のコンビテントセルを作製し
、この懸濁液Ｉｘ＆に実施例１’−■で作製したｐＥＸ
２４２のＰｖｕＩ−Ｐｓｔｌ断片（２　．　９　Ｋｂ，
　　Ｉ　７ｌ９）を添加し、３７°Ｃで１時間振盪した
。次いで菌懸濁液をＭ−９　　０ＡＴＡ培地に塗布して
３７℃にて１日保温し、生育してきたコロニーを釣菌し
、形質転換株バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｓｕｂｔｉｌｉｓ）Ｎ　Ａ　６　２　４　２株（ＩＦＯ
　　１２４８５ＦＥＲＭ　　ＢＰ−２３８１）を得た。

ＬＢ寒天平板培地およびクロラムフェニコール（１０μ
ｇ／ｍ（１）を含むＬＢ寒天平板培地」二での該菌の生
育を調べたところ、前者には生育したが、後者には生育
が認められず、ＮＡ６２１０株がクロラムフェニコール
に耐性であるのに対し、該菌は感受性になっていた。

２−ｉｖ） バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　ｓｕｂｔ
ｉｌｉｓ）ＮＡ６２４２株のＩＭＰデヒドロゲナーゼを
マガサニクの方法に従って測定したところ、１３ｎｍｏ
ｌ生成ＸＭＰ／分リ９蛋白であった。同様の方法でバチ
ルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　ｓｕｂｔｉｌ
ｉｓ）Ｎ’Ａ６１２８株のＩＭＰデヒドロゲナーゼ后性
を測定したところ、Ｉ　．　５　ｎｍｏｌ生成ＸＭＰ／
分リ９蛋白であり、プロモー夕の置換によって酵素活性
は約８　７倍上昇していた。

尖施例３ バチルス・ズブヂリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　ｓｕｂｔ
ｉｌｉｓ）ＮＡ６２４２によるグアノシン生産 第１表に示す種培地２０ｍ（ｌを含む２００＊（ｊ容三
角フラスコに、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＮＡ　６　２　４　２の一白金耳
を接種し、３７℃で１８時間振盪し、その１ｎｅを第１
表の主発酵培地２０Ｍを含む２０（］＋Ｃ容ヒダ付フラ
スコに接種し、回転式振盪機上で３７℃にて８４時間培
養した。培養終了肢のグアノシン蓄積量を高速肢体クロ
マトグラフィーで調べたところ、２４，ｏｆｆｇ／ｆｆ
ｃのクアノソンが蓄積していることがわかり４５ た。バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　ｓｕ
ｂｔｉｌｉｓ）ＮＡ６．１２８を同様の方法で培養した
ところ、グアノシンの蓄積は８　．　０　ｍｇ／ｒｙｒ
Ｑ．にすぎなかった。

第１表 ４６ 実施例４ ｒ＋ＥＸ２／１１へのＰ１プロモータの連結特開昭６０
−１３７２９］号に記載の方法で作製されたＰ１プロモ
ー夕を含むプラスミトｐＩ３ＴＭ１２８からＰ１プロモ
ータを含むＤＮＡ断片を切り出し、実施例ｌ−＼に記載
された方法で、ｐＥＸ２４．Ｉに連結した。ずなわち、
ＰＢＴＭ１　２　８（１　０μｇ）をＥｃｏＲＩおよび
ＰｓｔＩで二重切断し、アカロースケル電気泳動で分別
した後、約０．ＩＫｂのＤＮＡ断片を回収し、ＴＥ緩衝
液（５μＱ）に溶解した。一方、ｐＥＸ２４１（Ｉμｇ
）をＫｐｎＩで切断して先の０　．　１．　Ｋ　ｂの断
片と混合の後、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを用いて接着末
端を平滑末端に転換した。次いて、ライゲーノヨン・キ
ットを用いて両者を連結し、エノエリヒア・コリ（Ｅｓ
ｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌｉ）Ｘ　８　９　５株を
形質転換して、菌懸濁肢をアンピノリン含有のＭ９　　
ＣＡＴＡ寒天平板培地に塗布し、３７゜Ｃで一夜培養後
、生じたコロニーから形質転換株エンエリヒア・コリ（
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）ＴＦ　２　４　３
（ＩＦ　０　１４　８　６　５ＦＥＲＭ　　ＢＰ−２３
７９）を取得した。参考例記載の方法に従って、Ｉｆｆ
ｉの培養肢から、約１２００μ２のプラスミドを抽出し
、ｐＥＸ２４．３と命名した。５０μ９のｐＥＸ２４３
をＰｖｕｌとＰｓｔｒで二重切断し、アガロース・ケル
電気泳動で分別後、２．９Ｋｂの断片を回収し、約７μ
２のＤＮＡを得た。

実施例５ 染色体上にＰ１プロモータを有するＩＭＰデヒドロゲナ
ーゼで遺伝子が組込まれた形質転換株バチルス・ズブチ
リス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＮＡ６
２４３の作製 実施例２で作製されたバチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓ　　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＮＡ　−　６　２　１
　０のコンビテントセルに実施例４で作製されたｐＥＸ
２４３のＰｖｕｌ−Ｐｓｔｌ断片（２．９Ｋｂ：　７μ
ｇ）を加えて、実施例２−ｉｉｉと同様に形質転換を行
った。菌懸濁液をＭ９　　ＣＡＴＡ寒天平板培地上に塗
布し、生じたコロニーから形質転換株ハヂルス・ズブチ
リス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＮＡ　
６　２　４　３　（Ｉ　Ｆ　０１４８６８　　ＦＥＲＭ
　　ＢＰ−２３８２）を得た。

実施例２−ｉｉｉの方法で凋べたところ、ＮＡ６２ＩＯ
株かクロラムフエニコールに耐性てあるのに対し、該菌
は感受性になっていた。

実施例２−ｉｖ）と同様に、バチルス・ズブチリス（Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ　　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＮＡ　６　２　
４　３株のＩＭＰデヒドロゲナーセ活性を測定したとこ
ろ、０　．　５　ｎｍｏｉ生成ＸＭＰ／分・ｘ７蛋白で
あり、プロモータの置換によって酵素活性は約１／３に
低下していた。

実施例６ バチルス・ズブヂリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　ｓｕｂｔ
ｉｌｉｓ）ＮＡ６２４３によるイノシン生産 第１表に示す種培地２０ｍＯを含む２００ｘ（容三角フ
ラスコにバチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕ
ｂｔｉｌｉｓ）Ｎ　Ａ　６　２　４　３の一白金耳を接
種し、３７℃で１８時間振盪培養し、そのＩｍＱを第１
表の主発酵培地２０ｍ（ｌを含む２００＋（容ヒダ付フ
ラスコに接種し、回転式振盪機」二で３７゜Ｃにて８４
時間培養した。培養終了後のイノシンおよびクアノシン
の蓄積量を実施例３と同様の方法で調べたところ、２　
７　．　０　１１ｇ／ｍ（ｌのイノシンと３　．　０　
ｍｇ／ｒｔｔＱのグアノノンの蓄積が認められた。バチ
ルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　ｓｕｂｔｉｌ
ｉｓ）ＮＡ　６　１　２　８を同様の方法で培養したと
ころ、２　２　．ＯＬＩＩｇ／ｍＱのイノシンと８　．
　０　ｍｇ／ｍＱのグアノシンが蓄積したにすぎなかっ
た。

発明の効果 本発明によると、呈味性物質として重要な５イノシン酸
、５′−グアニル酸の原料であるイノシン、グアノシン
のいずれか一方の蓄積比率を高めこれらを収率よく工業
的に有利に製造することができる。

すなわち、イノシン、またはイノシンおよびグアノシン
を生産する能力を有するバチルス属菌を受容菌として、
本発明のＤＮＡを用いて形質転換することにより、ＩＭ
Ｐデヒドロゲナーゼ活性が上昇してグアノシン生産能が
高くなった新規微生物を得ることができる。該新規微生
物は高発現のプロモータを持つＩＭＰデヒドロゲナーゼ
遺伝子５０ がその染色体ＤＮＡ上に組込まれているために、きわめ
て安定性のある生産を繰返し実施することができる。ま
た、本発明によればイノシンおよびグアノシン、あるい
はイノノンおよび、キザントンン、あるいはキザントン
ンおよび／またはグアノシンを各々生産する能力を有す
るバチルス属菌を受容菌として、本発明の別のＤＮＡを
用いて形質転換ずることにより、イノノン生産能が高く
なった新規微生物を得ることができる。該新規微生物は
、その染色体上のＩＭＰデヒドロゲナーゼ遺伝子のプロ
モータが改変されているために、きわめて安定的にイノ
シンの生産を繰返し実施することができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ｐＥＸ２］４の構築図を、第２図はＩＭＰデ
ヒドロゲナーゼ遺伝子の塩基配列を、第３図はｐＥＸ２
１４△３の構築図および、ＩＭＰデヒドロケナーゼ遺伝
子の５゜一上流側の連結点近傍の塩基配列を、第４図は
ｐＥＸ２４＋の構築図を、第５図はｐＥＸ２４２の構築
図を、第６図はｐＥＸ２１０の構築図を各々示す。 図中のＰ，Ｘ，ＨＳＳｍ，Ｓ，Ｅ，Ｓａ，Ｋ，Ｃ，Ｍｓ
，Ｍｂ，Ｎ，Ｍは各々制限酵素Ｐｓｔｌ、ＸｂａＴ、Ｈ
　ｉｎｃ　Ｈ　，　Ｓ　ｍａ　Ｉ、ＳｓｐＪ、ＥｃｏＲ
Ｉ，ＳａｃｋｓＫｐｎＪ　　、　Ｃｌａｌ　　、　Ｍｓ
ｐｌ　　、　Ｍｂｏｌ，　　Ｎｒｕｌ　、　ＭｌｕＩの
切断点を表わす。 （ｆ）は平滑末端に転換されていることを表わず。 図中の斜線部分はＩＭＰデヒドロヶナーゼ遺伝子領域を
、白ヌキ部分はＩＭＰデヒトロゲナーゼ遺伝子の隣接領
域を、黒のぬりつぶし部分はＳＰＯＩ−２６プロモータ
を、大実線はクロラムフェニコール・アセヂルトランス
フェラーゼ遺伝子領域を、実線はベクター領域を表わす
。

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. （１）バチルス属菌の染色体のＩＭＰデヒドロゲナーゼ
   遺伝子のプロモータが、他の発現可能なプロモータで置
   換されたＩＭＰデヒドロゲナーゼ遺伝子を含むＤＮＡ。
2. （２）バチルス属菌の染色体由来、バチルス属菌のファ
   ージ由来またはバチルス属菌体内で自立増殖可能なプラ
   スミド由来の各プロモータで置換してなる請求項（１）
   のＤＮＡ。
3. （３）バチルス属菌の染色体のＩＭＰデヒドロゲナーゼ
   遺伝子よりも強く発現するプロモータで置換してなる請
   求項（１）のＤＮＡ。
4. （４）バチルス属菌の染色体のＩＭＰデヒドロゲナーゼ
   遺伝子よりも弱く発現するプロモータで置換してなる請
   求項（１）のＤＮＡ。
5. （５）請求項（１）、（２）、（３）または（４）のＤ
   ＮＡが組み込まれたベクター。
6. （６）バチルス属菌の染色体上の遺伝子のプロモータを
   他の発現可能なプロモータで置換した遺伝子を、染色体
   に挿入してなるバチルス属菌。
7. （７）請求項（１）、（２）、（３）または（４）のＤ
   ＮＡ、もしくは請求項（５）のベクターで形質転換され
   たイノシンおよび／またはグアノシン生産能を有するバ
   チルス属菌。
8. （８）請求項（７）のバチルス属菌を培地に培養し、イ
   ノシンおよび／またはグアノシンを生成蓄積せしめ、こ
   れを採取することを特徴とするイノシンおよび／または
   グアノシンの製造法。