JP2979184B2 - 藍藻を用いたポリ−β−ヒドロキシアルカノエートの製造法 - Google Patents
藍藻を用いたポリ−β−ヒドロキシアルカノエートの製造法Info
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Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
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- Biological Depolymerization Polymers (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、藍藻によるポリ−
β−ヒドロキシアルカノエートの製造方法に関する。
β−ヒドロキシアルカノエートの製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】ポリ−β−ヒドロキシアルカノエート
（ＰＨＡ）は、微生物が生産するバイオポリマーの一種
であり、微生物により分解可能な熱可塑性樹脂として、
医薬類、農薬類、医療材料、工業材料等の多方面での応
用が期待される材料である。
（ＰＨＡ）は、微生物が生産するバイオポリマーの一種
であり、微生物により分解可能な熱可塑性樹脂として、
医薬類、農薬類、医療材料、工業材料等の多方面での応
用が期待される材料である。
【０００３】ＰＨＡを微生物により生産させる方法は、
これまで種々開示されている。例えば、特開昭５９−２
２０１９２号、特開昭６４−２７４８３号および特開平
１−２２２７８８号の各公報でＰＨＢの製造方法につい
て開示されている。しかし、これらの何れの方法も資化
性炭素源として有機炭素源を必要とするという欠点があ
った。
これまで種々開示されている。例えば、特開昭５９−２
２０１９２号、特開昭６４−２７４８３号および特開平
１−２２２７８８号の各公報でＰＨＢの製造方法につい
て開示されている。しかし、これらの何れの方法も資化
性炭素源として有機炭素源を必要とするという欠点があ
った。
【０００４】最近、特開平６−３１５７６５号、特願平
７−３１８５９１号では、アルカリゲネス・ユウトロフ
ァス(Alcaligenes eutrophus)起源のβ−ケトチオラー
ゼ、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼおよびポリヒド
ロキシアルカノエートポリメラーゼを、藍藻シネココッ
カス種(Synechococcus sp.PCC7942)に導入し、ＰＨＡの
一種であるポリ−β−ヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）
を二酸化炭素から生産させることに成功している。しか
し、この遺伝子組換え藍藻は、固定化した二酸化炭素を
グリコーゲンとして蓄積する為、ＰＨＢの蓄積率として
は最大２％と少量しか得られなかった。
７−３１８５９１号では、アルカリゲネス・ユウトロフ
ァス(Alcaligenes eutrophus)起源のβ−ケトチオラー
ゼ、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼおよびポリヒド
ロキシアルカノエートポリメラーゼを、藍藻シネココッ
カス種(Synechococcus sp.PCC7942)に導入し、ＰＨＡの
一種であるポリ−β−ヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）
を二酸化炭素から生産させることに成功している。しか
し、この遺伝子組換え藍藻は、固定化した二酸化炭素を
グリコーゲンとして蓄積する為、ＰＨＢの蓄積率として
は最大２％と少量しか得られなかった。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】そこで本発明は、太陽
光、水、二酸化炭素および無機塩で生育する藍藻から効
率的に高収率でＰＨＡを生産させる方法を開発すること
を課題とする。
光、水、二酸化炭素および無機塩で生育する藍藻から効
率的に高収率でＰＨＡを生産させる方法を開発すること
を課題とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決すべく鋭意研究の結果、ＰＨＡを合成する藍藻を
明好気条件と暗嫌気条件を繰り返して培養することによ
り、ＰＨＡの生産性が向上することを見いだし、本発明
を完成した。即ち、本発明によれば、ＰＨＡ生産能を有
する藍藻を、明好気条件と暗嫌気条件を繰り返して培養
し、培養物からポリ−β−ヒドロキシアルカノエートを
採取することを特徴とするポリ−β−ヒドロキシアルカ
ノエートの製造方法が提供される。
を解決すべく鋭意研究の結果、ＰＨＡを合成する藍藻を
明好気条件と暗嫌気条件を繰り返して培養することによ
り、ＰＨＡの生産性が向上することを見いだし、本発明
を完成した。即ち、本発明によれば、ＰＨＡ生産能を有
する藍藻を、明好気条件と暗嫌気条件を繰り返して培養
し、培養物からポリ−β−ヒドロキシアルカノエートを
採取することを特徴とするポリ−β−ヒドロキシアルカ
ノエートの製造方法が提供される。
【０００７】
【発明の実施の形態】本発明に使用するＰＨＡ生産能を
有する藍藻は、例えば次のように遺伝子を組み換えるこ
とにより得ることができる。まず、アルカリゲネス・ユ
ウトロファス起源のβ−ケトチオラーゼ、アセトアセチ
ルＣｏＡレダクターゼおよびポリヒドロキシアルカノエ
ートポリメラーゼからなる酵素群をコードする構造遺伝
子群を調製する。この構造遺伝子群は既に配列決定され
ており、その調製法と共にThe Journal of Biological
Chemistry, Vol.264, No.26,15293-15297(1989)およびT
he Journal of Biological Chemistry, Vol.264, No.2
6,15298-15303(1989)に記載されている。このβ−ケト
チオラーゼ、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼおよび
ポリヒドロキシアルカノエートポリメラーゼからなる酵
素群をコードする構造遺伝子群は以下、ＰＨＡ合成遺伝
子断片と呼ぶ。
有する藍藻は、例えば次のように遺伝子を組み換えるこ
とにより得ることができる。まず、アルカリゲネス・ユ
ウトロファス起源のβ−ケトチオラーゼ、アセトアセチ
ルＣｏＡレダクターゼおよびポリヒドロキシアルカノエ
ートポリメラーゼからなる酵素群をコードする構造遺伝
子群を調製する。この構造遺伝子群は既に配列決定され
ており、その調製法と共にThe Journal of Biological
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he Journal of Biological Chemistry, Vol.264, No.2
6,15298-15303(1989)に記載されている。このβ−ケト
チオラーゼ、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼおよび
ポリヒドロキシアルカノエートポリメラーゼからなる酵
素群をコードする構造遺伝子群は以下、ＰＨＡ合成遺伝
子断片と呼ぶ。
【０００８】次に得られたＰＨＡ合成遺伝子断片をプラ
スミド（例えばpUC19（宝酒造株式会社製））に導入す
る。すなわち、例えば10mM Tris-HCl(pH7.5),10mM MgCl
2,1mM DTTなどのような緩衝液中、pUC19を制限酵素、例
えば、EcoRI及びSma Iで処理し、次いでアルカリホスフ
ァターゼを用いて脱リン酸化反応を行い、さらに例えば
フェノール抽出により精製し、制限酵素ECoRI及びSma I
処理pUC19（約2.7k塩基対）を得る。
スミド（例えばpUC19（宝酒造株式会社製））に導入す
る。すなわち、例えば10mM Tris-HCl(pH7.5),10mM MgCl
2,1mM DTTなどのような緩衝液中、pUC19を制限酵素、例
えば、EcoRI及びSma Iで処理し、次いでアルカリホスフ
ァターゼを用いて脱リン酸化反応を行い、さらに例えば
フェノール抽出により精製し、制限酵素ECoRI及びSma I
処理pUC19（約2.7k塩基対）を得る。
【０００９】これとは別にＰＨＡ合成遺伝子断片を例え
ば10mM Tris-HCl(pH7.5),10mM MgCl2,1mM DTTなどのよ
うな公知の緩衝液中、Sma IおよびEcoRIを用いて処理
し、さらに例えばフェノール抽出により精製してSma I
及びEcoRI処理したＰＨＡ合成遺伝子断片を得る。
ば10mM Tris-HCl(pH7.5),10mM MgCl2,1mM DTTなどのよ
うな公知の緩衝液中、Sma IおよびEcoRIを用いて処理
し、さらに例えばフェノール抽出により精製してSma I
及びEcoRI処理したＰＨＡ合成遺伝子断片を得る。
【００１０】前記のようにして得られた制限酵素処理pU
C19およびＰＨＡ合成遺伝子断片を10mM Tris-HCl(pH7.
5),10mM MgCl2,1mM DTT,1mM ATPなどのような公知の緩
衝液中Ｔ４リガーゼを用いて連結し、pUC19にＰＨＡ合
成遺伝子断片を導入した約8k塩基対プラスミドを構築
し、これをpAE100と名付ける。
C19およびＰＨＡ合成遺伝子断片を10mM Tris-HCl(pH7.
5),10mM MgCl2,1mM DTT,1mM ATPなどのような公知の緩
衝液中Ｔ４リガーゼを用いて連結し、pUC19にＰＨＡ合
成遺伝子断片を導入した約8k塩基対プラスミドを構築
し、これをpAE100と名付ける。
【００１１】次に、pAE100からＰＨＡ合成遺伝子断片を
切り出し、藍藻由来のプロモータ活性を持つ遺伝子配列
の下流に組み込んだ、藍藻と大腸菌のシャトルベクター
を構築する。このとき使用できるプラスミドとしては、
例えばアンピシリン耐性遺伝子を有する藍藻と大腸菌の
シャトルベクターpECAN8にプラスミドpKK232-8(Pharmac
ia社製)のクロラムフェニコール耐性遺伝子および藍藻
由来のプロモーター活性を有する遺伝子を組み込んだpK
E4-9が挙げられる。前記pECAN8の製法は、FEMSMicrobio
l.Lett.,Vol.27,253-256(1985)に記載されている。
切り出し、藍藻由来のプロモータ活性を持つ遺伝子配列
の下流に組み込んだ、藍藻と大腸菌のシャトルベクター
を構築する。このとき使用できるプラスミドとしては、
例えばアンピシリン耐性遺伝子を有する藍藻と大腸菌の
シャトルベクターpECAN8にプラスミドpKK232-8(Pharmac
ia社製)のクロラムフェニコール耐性遺伝子および藍藻
由来のプロモーター活性を有する遺伝子を組み込んだpK
E4-9が挙げられる。前記pECAN8の製法は、FEMSMicrobio
l.Lett.,Vol.27,253-256(1985)に記載されている。
【００１２】pAE100からＰＨＡ合成遺伝子断片を切り出
すには、例えば10mM Tris-HCl(pH7.5),10mM MgCl2,1mM
DTT, 50mM NaClなどのような緩衝液中、制限酵素、例え
ばEcoRI及びHindIIIを用いて、pAE100を３７℃で１時間
反応させ、次いで例えばフェノール抽出により精製す
る。このようにして得られた遺伝子断片のうち約5,200
塩基の大きさのものを選択し、これをさらに例えば3mM
Tris-酢酸(pH7.9),66mM酢酸カリウム、10mM酢酸マグネ
シウム、0.5mM DTT,0.1mg/ml BSA、0.1mM dATP,0.1mM d
CTP,0.1mM dTTP,01mM dGTPなどのような緩衝液中、Ｔ４
ポリメラーゼを用いて処理し、次いで例えばフェノール
抽出することにより精製ＰＨＡ合成遺伝子断片が得られ
る。
すには、例えば10mM Tris-HCl(pH7.5),10mM MgCl2,1mM
DTT, 50mM NaClなどのような緩衝液中、制限酵素、例え
ばEcoRI及びHindIIIを用いて、pAE100を３７℃で１時間
反応させ、次いで例えばフェノール抽出により精製す
る。このようにして得られた遺伝子断片のうち約5,200
塩基の大きさのものを選択し、これをさらに例えば3mM
Tris-酢酸(pH7.9),66mM酢酸カリウム、10mM酢酸マグネ
シウム、0.5mM DTT,0.1mg/ml BSA、0.1mM dATP,0.1mM d
CTP,0.1mM dTTP,01mM dGTPなどのような緩衝液中、Ｔ４
ポリメラーゼを用いて処理し、次いで例えばフェノール
抽出することにより精製ＰＨＡ合成遺伝子断片が得られ
る。
【００１３】pKE4-9にＰＨＡ合成遺伝子断片を導入する
には、例えば、50mM Tris-HCl(pH7.5),10mM MgCl2,1mM
DTT,100mM NaClなどのような緩衝液中、制限酵素、例え
ばSalIを用いて、pKE4-9を３７℃で約１時間反応させ、
次いで例えば3mM Tris-酢酸(pH7.9)、66mM酢酸カリウ
ム、10mM酢酸マグネシウム、0.5mM DTT,0.1mg/ml BSA,
0.1mM dATP,0.1mM dCTP,0.1mM dTTP,0.1mM dGTPなどの
ような緩衝液中Ｔ４ポリメラーゼを用いて通常３７℃で
５分間処理し、さらにアルカリホスファターゼを用いて
脱リン酸化反応を行い、さらに例えばフェノール抽出に
より精製した後、ＰＨＡ合成遺伝子断片との結合に使用
する。こうして得られたSalI処理pKE4-9とＰＨＡ合成遺
伝子断片を連結するには、公知の緩衝液中、10mM Tris-
HCl(pH7.5),10mM MgCl2,1mM DTT,1mM ATP中で、ＰＨＡ
合成遺伝子断片とpKE4-9をＴ４リガーゼを用いて通常１
６℃で約１時間処理すればよい。このようにしてpKE4-9
にＰＨＡ合成遺伝子断片を導入した14k塩基対の組換え
プラスミドを得、これをpAEN1と名付けた。この構成を
図１に示す。
には、例えば、50mM Tris-HCl(pH7.5),10mM MgCl2,1mM
DTT,100mM NaClなどのような緩衝液中、制限酵素、例え
ばSalIを用いて、pKE4-9を３７℃で約１時間反応させ、
次いで例えば3mM Tris-酢酸(pH7.9)、66mM酢酸カリウ
ム、10mM酢酸マグネシウム、0.5mM DTT,0.1mg/ml BSA,
0.1mM dATP,0.1mM dCTP,0.1mM dTTP,0.1mM dGTPなどの
ような緩衝液中Ｔ４ポリメラーゼを用いて通常３７℃で
５分間処理し、さらにアルカリホスファターゼを用いて
脱リン酸化反応を行い、さらに例えばフェノール抽出に
より精製した後、ＰＨＡ合成遺伝子断片との結合に使用
する。こうして得られたSalI処理pKE4-9とＰＨＡ合成遺
伝子断片を連結するには、公知の緩衝液中、10mM Tris-
HCl(pH7.5),10mM MgCl2,1mM DTT,1mM ATP中で、ＰＨＡ
合成遺伝子断片とpKE4-9をＴ４リガーゼを用いて通常１
６℃で約１時間処理すればよい。このようにしてpKE4-9
にＰＨＡ合成遺伝子断片を導入した14k塩基対の組換え
プラスミドを得、これをpAEN1と名付けた。この構成を
図１に示す。
【００１４】次にpAEN1を用いてシネココッカス種を形
質転換する。まず、シネココッカス種の細胞を例えば表
１に示すＢＧ１１培地や表２に示すＭＤＭ培地中で所定
量となるまで培養する。
質転換する。まず、シネココッカス種の細胞を例えば表
１に示すＢＧ１１培地や表２に示すＭＤＭ培地中で所定
量となるまで培養する。
【００１５】
【表１】
【００１６】
【表２】
【００１７】次にPackerおよびA.N.Clazer編集のMethod
in Enzymology Vol.167(ACADEMICPRESS,INC.1988)に記
載された方法に従い、pAEN1を用いて該藍藻を自然形質
転換する。
in Enzymology Vol.167(ACADEMICPRESS,INC.1988)に記
載された方法に従い、pAEN1を用いて該藍藻を自然形質
転換する。
【００１８】本発明に使用する藍藻は、上記の方法で得
られた藍藻に限定されるものではなく、ＰＨＡを生産す
る遺伝子群を有する遺伝子組換え藍藻や、自然界から分
離したＰＨＡを生産する藍藻であればよい。
られた藍藻に限定されるものではなく、ＰＨＡを生産す
る遺伝子群を有する遺伝子組換え藍藻や、自然界から分
離したＰＨＡを生産する藍藻であればよい。
【００１９】次に、藍藻により二酸化炭素からＰＨＡを
生産させる。すなわち、藍藻を上記ＢＧ１１培地のよう
な培地で明好気、暗嫌気状態を繰り返して培養を行う。
一般に培養温度は２０〜６０℃、好ましくは２５〜５５
℃、培養液のｐＨは６〜１２、好ましくは７〜１０が望
ましい。また明条件における光強度は１０００〜３００
０Luxが好ましく、時間は４〜１６８時間、好ましくは
８〜４８時間が望ましい。暗条件の時間は、２〜４８時
間、好ましくは４〜１６時間が望ましい。次に、所定量
まで培養したら、藍藻菌体を培養液からろ過、遠心分離
等の方法により分離する。また、さらに菌体内のＰＨＡ
蓄積率を上げるためには、分離した藍藻菌体を栄養源を
制限した培養液、例えば、ＢＧ１１培地から硝酸ナトリ
ウムを除いた培地にて培養を行うことが好適である。こ
のようにして藍藻菌体にＰＨＡを生成蓄積させ、このＰ
ＨＡをG.Brauneggらの方法(European Journal of Appli
edMicrobiology and Biotechnology 6,29-37(1978))等
の方法により培養物から採取する。ＰＨＡの含有率は乾
燥菌体重量当たり４〜６ｗｔ％であり、従来法でせいぜ
い３ｗｔ％であったのに比較して格段に優れている。
生産させる。すなわち、藍藻を上記ＢＧ１１培地のよう
な培地で明好気、暗嫌気状態を繰り返して培養を行う。
一般に培養温度は２０〜６０℃、好ましくは２５〜５５
℃、培養液のｐＨは６〜１２、好ましくは７〜１０が望
ましい。また明条件における光強度は１０００〜３００
０Luxが好ましく、時間は４〜１６８時間、好ましくは
８〜４８時間が望ましい。暗条件の時間は、２〜４８時
間、好ましくは４〜１６時間が望ましい。次に、所定量
まで培養したら、藍藻菌体を培養液からろ過、遠心分離
等の方法により分離する。また、さらに菌体内のＰＨＡ
蓄積率を上げるためには、分離した藍藻菌体を栄養源を
制限した培養液、例えば、ＢＧ１１培地から硝酸ナトリ
ウムを除いた培地にて培養を行うことが好適である。こ
のようにして藍藻菌体にＰＨＡを生成蓄積させ、このＰ
ＨＡをG.Brauneggらの方法(European Journal of Appli
edMicrobiology and Biotechnology 6,29-37(1978))等
の方法により培養物から採取する。ＰＨＡの含有率は乾
燥菌体重量当たり４〜６ｗｔ％であり、従来法でせいぜ
い３ｗｔ％であったのに比較して格段に優れている。
【００２０】
【実施例】以下、実施例により本発明をさらに具体的に
説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるもの
ではない。
説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるもの
ではない。
【００２１】実施例１ まず、アルカリゲネス・ユウトロファス(Alcaligenes e
utrophus)からβ−ケトチオラーゼ、アセトアセチルＣ
ｏＡレダクターゼおよびポリヒドロキシアルカノエート
ポリメラーゼからなる酵素群をコードする構造遺伝子群
断片（ＰＨＡ合成遺伝子断片）を、The Journal of Bio
logical Chemistry, Vol.264, No.26,15293-15297(198
9)および15298-15303(1989)に記載されている方法で調
製した。
utrophus)からβ−ケトチオラーゼ、アセトアセチルＣ
ｏＡレダクターゼおよびポリヒドロキシアルカノエート
ポリメラーゼからなる酵素群をコードする構造遺伝子群
断片（ＰＨＡ合成遺伝子断片）を、The Journal of Bio
logical Chemistry, Vol.264, No.26,15293-15297(198
9)および15298-15303(1989)に記載されている方法で調
製した。
【００２２】得られたＰＨＡ合成遺伝子断片をプラスミ
ドに導入するため、プラスミドpUC19 100μm(宝酒造株
式会社製）を用意し、緩衝液10mM Tris-HCl(pH7.5),10m
M MgCl2,1mM DTT中、制限酵素EcoRIおよびSma Iをそれ
ぞれ500ユニットずつを用いて、３７℃で１時間反応さ
せ、次いでアルカリホスファターゼ２ユニットを用いて
３７℃で１時間脱リン酸化反応を行い、さらに例えばフ
ェノール抽出により精製した。このようにして、制限酵
素ECoRIおよびSmaI処理したpUC19（約2.7k塩基対）と、
ＰＨＡ合成遺伝子とを連結するために、ＰＨＡ合成遺伝
子断片200μgを緩衝液10mM Tris-HCl(pH7.5),10mM MgCl
2,1mM DTT中、SmaIおよびEcoRIをそれぞれ500ユニット
ずつ用いて、３７℃で約１時間反応させ、さらにフェノ
ール抽出により精製した。その後、10mM Tris-HCl(pH7.
5),10mM MgCl2,1mM DTT,1mM ATP中で、上記処理したＰ
ＨＡ合成遺伝子断片100ngと上記処理したpUC19 50ngに
対して５ユニットＴ４リガーゼを用いて１６℃で約１時
間処理した。このようにしてpUC19にＰＨＡ合成遺伝子
断片を導入した約8k塩基対の組換えプラスミドをpAE100
と名付けた。
ドに導入するため、プラスミドpUC19 100μm(宝酒造株
式会社製）を用意し、緩衝液10mM Tris-HCl(pH7.5),10m
M MgCl2,1mM DTT中、制限酵素EcoRIおよびSma Iをそれ
ぞれ500ユニットずつを用いて、３７℃で１時間反応さ
せ、次いでアルカリホスファターゼ２ユニットを用いて
３７℃で１時間脱リン酸化反応を行い、さらに例えばフ
ェノール抽出により精製した。このようにして、制限酵
素ECoRIおよびSmaI処理したpUC19（約2.7k塩基対）と、
ＰＨＡ合成遺伝子とを連結するために、ＰＨＡ合成遺伝
子断片200μgを緩衝液10mM Tris-HCl(pH7.5),10mM MgCl
2,1mM DTT中、SmaIおよびEcoRIをそれぞれ500ユニット
ずつ用いて、３７℃で約１時間反応させ、さらにフェノ
ール抽出により精製した。その後、10mM Tris-HCl(pH7.
5),10mM MgCl2,1mM DTT,1mM ATP中で、上記処理したＰ
ＨＡ合成遺伝子断片100ngと上記処理したpUC19 50ngに
対して５ユニットＴ４リガーゼを用いて１６℃で約１時
間処理した。このようにしてpUC19にＰＨＡ合成遺伝子
断片を導入した約8k塩基対の組換えプラスミドをpAE100
と名付けた。
【００２３】次に、pAE100からＰＨＡ合成遺伝子断片を
切り出し、藍藻由来のプロモーター活性を持つ遺伝子配
列の下流に組み込んだ、藍藻と大腸菌のシャトルベクタ
ーを構築するための、プラスミドpKE4-9を100μg用意し
た。pKE4-9は、アンピシリン耐性遺伝子を有する藍藻と
大腸菌のシャトルベクターpECAN8にプラスミドpKK232-8
(Pharmacia社製)のクロラムフェニコール耐性遺伝子
と、藍藻由来のプロモーター活性を有する遺伝子を組み
込んだものである。
切り出し、藍藻由来のプロモーター活性を持つ遺伝子配
列の下流に組み込んだ、藍藻と大腸菌のシャトルベクタ
ーを構築するための、プラスミドpKE4-9を100μg用意し
た。pKE4-9は、アンピシリン耐性遺伝子を有する藍藻と
大腸菌のシャトルベクターpECAN8にプラスミドpKK232-8
(Pharmacia社製)のクロラムフェニコール耐性遺伝子
と、藍藻由来のプロモーター活性を有する遺伝子を組み
込んだものである。
【００２４】pAE100からＰＨＡ合成遺伝子断片を切り出
すため、緩衝液10mM Tris-HCl(pH7.5),10mM MgCl2,1mM
DTT,50mM NaCl中、制限酵素EcoRI及びHindIIIをそれぞ
れ500ユニットずつ用いて、pAE100の200μgを３７℃で
１時間反応させ、フェノール抽出により精製した。次
に、得られた遺伝子断片のうち約5,200塩基の大きさの
ものを選択し、これをさらに3mM Tris-酢酸(pH7.9),66m
M酢酸カリウム、10mM酢酸マグネシウム、0.5mM DTT,0.1
mg/ml BSA、0.1mM dATP,0.1mM dCTP,0.1mM dTTP,0.1mM
dGTP中、200ユニットのＴ４ポリメラーゼを用いて３７
℃で５分間処理し、次いでフェノール抽出することによ
り精製ＰＨＡ合成遺伝子断片を得た。
すため、緩衝液10mM Tris-HCl(pH7.5),10mM MgCl2,1mM
DTT,50mM NaCl中、制限酵素EcoRI及びHindIIIをそれぞ
れ500ユニットずつ用いて、pAE100の200μgを３７℃で
１時間反応させ、フェノール抽出により精製した。次
に、得られた遺伝子断片のうち約5,200塩基の大きさの
ものを選択し、これをさらに3mM Tris-酢酸(pH7.9),66m
M酢酸カリウム、10mM酢酸マグネシウム、0.5mM DTT,0.1
mg/ml BSA、0.1mM dATP,0.1mM dCTP,0.1mM dTTP,0.1mM
dGTP中、200ユニットのＴ４ポリメラーゼを用いて３７
℃で５分間処理し、次いでフェノール抽出することによ
り精製ＰＨＡ合成遺伝子断片を得た。
【００２５】pKE4-9に上記切り出したＰＨＡ合成遺伝子
断片を導入するため、緩衝液50mMTris-HCl(pH7.5),10mM
MgCl2,1mM DTT,100mM NaCl緩衝液中、制限酵素SalIを5
00ユニット用いて、pKE4-9の200μgを３７℃で約１時間
反応させ、次いで3mM Tris-酢酸(pH7.9)、66mM酢酸カリ
ウム、10mM酢酸マグネシウム、0.5mM DTT,0.1mg/mlBSA,
0.1mM dATP,0.1mM dCTP,0.1mM dTTP,0.1mM dGTPの緩衝
液中、200ユニットのＴ４ポリメラーゼを用いて３７℃
で５分間処理し、さらにアルカリホスファターゼ２ユニ
ットを用いて３７℃で１時間脱リン酸化反応を行った
後、フェノール抽出により精製した。
断片を導入するため、緩衝液50mMTris-HCl(pH7.5),10mM
MgCl2,1mM DTT,100mM NaCl緩衝液中、制限酵素SalIを5
00ユニット用いて、pKE4-9の200μgを３７℃で約１時間
反応させ、次いで3mM Tris-酢酸(pH7.9)、66mM酢酸カリ
ウム、10mM酢酸マグネシウム、0.5mM DTT,0.1mg/mlBSA,
0.1mM dATP,0.1mM dCTP,0.1mM dTTP,0.1mM dGTPの緩衝
液中、200ユニットのＴ４ポリメラーゼを用いて３７℃
で５分間処理し、さらにアルカリホスファターゼ２ユニ
ットを用いて３７℃で１時間脱リン酸化反応を行った
後、フェノール抽出により精製した。
【００２６】その後、前記SalI処理pKE4-9と前記切り出
したＰＨＡ合成遺伝子断片を連結するため、緩衝液10mM
Tris-HCl(pH7.5),10mM MgCl2,1mM DTT,1mM ATP中で、
ＰＨＡ合成遺伝子断片100ngと前記処理pKE4-9の50ngに
対して５ユニットのＴ４リガーゼを用いて１６℃で約１
時間処理した。このようにしてpKE4-9のSalIサイトにＰ
ＨＡ合成遺伝子断片を導入した14k塩基対の組換えプラ
スミドをpAEN1と名付けた。
したＰＨＡ合成遺伝子断片を連結するため、緩衝液10mM
Tris-HCl(pH7.5),10mM MgCl2,1mM DTT,1mM ATP中で、
ＰＨＡ合成遺伝子断片100ngと前記処理pKE4-9の50ngに
対して５ユニットのＴ４リガーゼを用いて１６℃で約１
時間処理した。このようにしてpKE4-9のSalIサイトにＰ
ＨＡ合成遺伝子断片を導入した14k塩基対の組換えプラ
スミドをpAEN1と名付けた。
【００２７】次にpAEN1を用いて形質転換藍藻を得るた
め、シネココッカス種PCC7942(Synechococcus sp.PCC79
42)をＢＧ１１培地40mlにて2,000Lux、３０℃にてＯＤ6
60=0.2になるまで培養し、pAEN1の20μgを用いて自然形
質転換した。自然形質転換の方法は、PackerおよびA.N.
Clazer編集のMethod in Enzymology Vol.167(ACADEMIC
PRESS,INC.1988)に記載されている方法を用いた。このp
AEN1を保有するシネココッカス種PCC7942の形質転換体
は、pAEN1-1と命名し、工業技術院生命工学工業技術研
究所に平成７年９月１９日に寄託した（受託番号=FERMP
-15189)。
め、シネココッカス種PCC7942(Synechococcus sp.PCC79
42)をＢＧ１１培地40mlにて2,000Lux、３０℃にてＯＤ6
60=0.2になるまで培養し、pAEN1の20μgを用いて自然形
質転換した。自然形質転換の方法は、PackerおよびA.N.
Clazer編集のMethod in Enzymology Vol.167(ACADEMIC
PRESS,INC.1988)に記載されている方法を用いた。このp
AEN1を保有するシネココッカス種PCC7942の形質転換体
は、pAEN1-1と命名し、工業技術院生命工学工業技術研
究所に平成７年９月１９日に寄託した（受託番号=FERMP
-15189)。
【００２８】次に、pAEN1-1をアンピシリン2mg/mlおよ
びクロラムフェニコール10mg/mlを含有するＢＧ１１培
地200mlに植菌し、2,000Lux、３０℃にて１４日間培養
を行った。この培養物を３０℃、1,580 G,10分間の条件
で遠心し、培養液から藍藻菌体を分離した。その後、分
離した菌体をＢＧ１１培地から硝酸ナトリウムを除いた
培地に懸濁させ、2,000Lux、３０℃で３２時間の通気培
養、１６時間の暗嫌気培養を繰り返して１４日間培養し
た。培養後の藍藻菌体によるＰＨＢの蓄積率は乾燥菌体
重量当たり６％であった。
びクロラムフェニコール10mg/mlを含有するＢＧ１１培
地200mlに植菌し、2,000Lux、３０℃にて１４日間培養
を行った。この培養物を３０℃、1,580 G,10分間の条件
で遠心し、培養液から藍藻菌体を分離した。その後、分
離した菌体をＢＧ１１培地から硝酸ナトリウムを除いた
培地に懸濁させ、2,000Lux、３０℃で３２時間の通気培
養、１６時間の暗嫌気培養を繰り返して１４日間培養し
た。培養後の藍藻菌体によるＰＨＢの蓄積率は乾燥菌体
重量当たり６％であった。
【００２９】ＰＨＢの定量は、ガスクロマトグラフにて
下記のように行った。すなわち、凍結乾燥した菌体40mg
をスクリューキャップ付き10ml試験管に入れ、クロロホ
ルム2mlと、３ｗｔ％硫酸−メタノール溶液2mlを加え、
栓をして100℃で3.5時間反応させた。反応終了後、水1m
lを加えて激しく10分間振とうした後に、２層に分離し
た下層のクロロホルム層を取り出し、このクロロホルム
層をガスクロマトグラフィーにかけて、ヒドロキシ酪酸
メチルのピークの面積からＰＨＢ量を計算して求めた。
下記のように行った。すなわち、凍結乾燥した菌体40mg
をスクリューキャップ付き10ml試験管に入れ、クロロホ
ルム2mlと、３ｗｔ％硫酸−メタノール溶液2mlを加え、
栓をして100℃で3.5時間反応させた。反応終了後、水1m
lを加えて激しく10分間振とうした後に、２層に分離し
た下層のクロロホルム層を取り出し、このクロロホルム
層をガスクロマトグラフィーにかけて、ヒドロキシ酪酸
メチルのピークの面積からＰＨＢ量を計算して求めた。
【００３０】比較例１ pAEN1-1をアンピシリン2mg/mlおよびクロラムフェニコ
ール10mg/mlを含有するＢＧ１１培地200mlに植菌し、2,
000Lux、３０℃にて１４日間培養を行った。この培養物
を３０℃、1,580 G,10分間の条件で遠心し、培養液から
藍藻菌体を分離した。その後、分離した菌体をＢＧ１１
培地から硝酸ナトリウムを除いた培地に懸濁させ、１４
日間、2,000Lux、３０℃で通気培養を行った。培養後の
藍藻菌体によるＰＨＢの蓄積率は乾燥菌体重量当たり１
ｗｔ％であった。
ール10mg/mlを含有するＢＧ１１培地200mlに植菌し、2,
000Lux、３０℃にて１４日間培養を行った。この培養物
を３０℃、1,580 G,10分間の条件で遠心し、培養液から
藍藻菌体を分離した。その後、分離した菌体をＢＧ１１
培地から硝酸ナトリウムを除いた培地に懸濁させ、１４
日間、2,000Lux、３０℃で通気培養を行った。培養後の
藍藻菌体によるＰＨＢの蓄積率は乾燥菌体重量当たり１
ｗｔ％であった。
【００３１】比較例２ pAEN1-1をアンピシリン2mg/mlおよびクロラムフェニコ
ール10mg/mlを含有するＢＧ１１培地200mlに植菌し、2,
000Lux、３０℃にて１４日間培養を行った。この培養物
を３０℃、1,580 G,10分間の条件で遠心し、培養液から
藍藻菌体を分離した。その後、分離した菌体をＢＧ１１
培地から硝酸ナトリウムを除いた培地に懸濁させ、１４
日間、2,000Lux、３０℃で３２時間の通気培養、１６時
間の暗条件で通気培養を繰り返した。培養後の藍藻菌体
によるＰＨＢの蓄積率は乾燥菌体重量当たり１．３ｗｔ
％であった。
ール10mg/mlを含有するＢＧ１１培地200mlに植菌し、2,
000Lux、３０℃にて１４日間培養を行った。この培養物
を３０℃、1,580 G,10分間の条件で遠心し、培養液から
藍藻菌体を分離した。その後、分離した菌体をＢＧ１１
培地から硝酸ナトリウムを除いた培地に懸濁させ、１４
日間、2,000Lux、３０℃で３２時間の通気培養、１６時
間の暗条件で通気培養を繰り返した。培養後の藍藻菌体
によるＰＨＢの蓄積率は乾燥菌体重量当たり１．３ｗｔ
％であった。
【００３２】実施例２ 自然界から分離した好熱性藍藻シネココッカス種MA19
（Synechococcus sp.MA19株）をＢＧ１１培地２００ｍ
ｌに植菌し、2,000Lux、５０℃にて１０日間培養を行っ
た。この培養物を３０℃、1,580 G,１０分間の条件で遠
心し、培養液から藍藻菌体を分離した。その後、分離し
た菌体をＢＧ１１培地から硝酸ナトリウムを除いた培地
に懸濁させ、2,000Lux、５０℃で、１２時間の通気培
養、１２時間の暗嫌気培養を繰り返して８日間培養し
た。培養後の藍藻菌体によるＰＨＢの蓄積率は乾燥菌体
重量当たり６．７ｗｔ％であった。
（Synechococcus sp.MA19株）をＢＧ１１培地２００ｍ
ｌに植菌し、2,000Lux、５０℃にて１０日間培養を行っ
た。この培養物を３０℃、1,580 G,１０分間の条件で遠
心し、培養液から藍藻菌体を分離した。その後、分離し
た菌体をＢＧ１１培地から硝酸ナトリウムを除いた培地
に懸濁させ、2,000Lux、５０℃で、１２時間の通気培
養、１２時間の暗嫌気培養を繰り返して８日間培養し
た。培養後の藍藻菌体によるＰＨＢの蓄積率は乾燥菌体
重量当たり６．７ｗｔ％であった。
【００３３】比較例３ 好熱性藍藻シネココッカス種MA19（Synechococcus sp.M
A19株）をＢＧ１１培地２００ｍｌに植菌し、2,000Lu
x、５０℃にて１０日間培養を行った。この培養物を３
０℃、1,580 G,１０分間の条件で遠心し、培養液から藍
藻菌体を分離した。その後、分離した菌体をＢＧ１１培
地から硝酸ナトリウムを除いた培地に懸濁させ、2,000L
ux、５０℃で、明条件で１２時間の通気培養、暗条件で
１２時間通気培養を繰り返して８日間培養した。培養後
の藍藻菌体によるＰＨＢの蓄積率は乾燥菌体重量当たり
４．６ｗｔ％であった。
A19株）をＢＧ１１培地２００ｍｌに植菌し、2,000Lu
x、５０℃にて１０日間培養を行った。この培養物を３
０℃、1,580 G,１０分間の条件で遠心し、培養液から藍
藻菌体を分離した。その後、分離した菌体をＢＧ１１培
地から硝酸ナトリウムを除いた培地に懸濁させ、2,000L
ux、５０℃で、明条件で１２時間の通気培養、暗条件で
１２時間通気培養を繰り返して８日間培養した。培養後
の藍藻菌体によるＰＨＢの蓄積率は乾燥菌体重量当たり
４．６ｗｔ％であった。
【００３４】比較例４ 好熱性藍藻シネココッカス種MA19（Synechococcus sp.M
A19株）をＢＧ１１培地２００ｍｌに植菌し、2,000Lu
x、５０℃にて１０日間培養を行った。この培養物を３
０℃、1,580 G,１０分間の条件で遠心し、培養液から藍
藻菌体を分離した。その後、分離した菌体をＢＧ１１培
地から硝酸ナトリウムを除いた培地に懸濁させ、2,000L
ux、５０℃で、明条件で８日間通気培養した。培養後の
藍藻菌体によるＰＨＢの蓄積率は乾燥菌体重量当たり
３．３ｗｔ％であった。
A19株）をＢＧ１１培地２００ｍｌに植菌し、2,000Lu
x、５０℃にて１０日間培養を行った。この培養物を３
０℃、1,580 G,１０分間の条件で遠心し、培養液から藍
藻菌体を分離した。その後、分離した菌体をＢＧ１１培
地から硝酸ナトリウムを除いた培地に懸濁させ、2,000L
ux、５０℃で、明条件で８日間通気培養した。培養後の
藍藻菌体によるＰＨＢの蓄積率は乾燥菌体重量当たり
３．３ｗｔ％であった。
【００３５】
【発明の効果】本発明により、ポリ−β−ヒドロキシア
ルカノエート生産能を有する藍藻から、ＰＨＡを効率的
に生産することが可能となった。
ルカノエート生産能を有する藍藻から、ＰＨＡを効率的
に生産することが可能となった。
【図１】組換えプラスミドpAEN1の構成を示す概略図で
ある。
ある。
ＰＵＨ２４：藍藻由来の遺伝子で、藍藻中で複製する為
に必要な領域 Ｎｏ．９ ：藍藻で活性を有するプロモータ配列 ｐｈｂ Ｃ：ポリヒドロキシアルカノエートポリメラー
ゼ遺伝子 ｐｈｂ Ａ：β−ケトチオラーゼ遺伝子 ｐｈｂ Ｂ：アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ遺伝子 ＣＡＴ ：クロラムフェニコール耐性遺伝子 Ａｍｐ ：アンピシリン耐性遺伝子 ＯＲＩ ：大腸菌で複製する為に必要な領域
に必要な領域 Ｎｏ．９ ：藍藻で活性を有するプロモータ配列 ｐｈｂ Ｃ：ポリヒドロキシアルカノエートポリメラー
ゼ遺伝子 ｐｈｂ Ａ：β−ケトチオラーゼ遺伝子 ｐｈｂ Ｂ：アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ遺伝子 ＣＡＴ ：クロラムフェニコール耐性遺伝子 Ａｍｐ ：アンピシリン耐性遺伝子 ＯＲＩ ：大腸菌で複製する為に必要な領域
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:89） (Ｃ１２Ｐ 7/62 Ｃ１２Ｒ 1:89） (72)発明者 高橋 英之 東京都港区西新橋２−８−11 第７東洋 海事ビル８階 財団法人地球環境産業技 術研究機構 ＣＯ２固定化等プロジェク ト室内 (72)発明者 三宅 正人 茨城県つくば市東１丁目１番３ 工業技 術院生命工学工業技術研究所内 (72)発明者 浅田 泰男 茨城県つくば市東１丁目１番３ 工業技 術院生命工学工業技術研究所内 (72)発明者 常盤 豊 茨城県つくば市東１丁目１番３ 工業技 術院生命工学工業技術研究所内 審査官 高堀 栄二 (56)参考文献 特開 平９−131186（ＪＰ，Ａ) 特開 平８−187085（ＪＰ，Ａ) 特開 平７−170989（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12P 7/62 ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)
Claims (3)
- 【請求項１】 ポリ−β−ヒドロキシアルカノエート生
産能を有する藍藻を明好気条件と暗嫌気条件を繰り返し
て培養し、培養物からポリ−β−ヒドロキシアルカノエ
ートを採取することを特徴とするポリ−β−ヒドロキシ
アルカノエートの製造法。 - 【請求項２】 前記藍藻が、β−ケトチオラーゼ、アセ
トアセチルＣｏＡレダクターゼおよびポリヒドロキシア
ルカノエートポリメラーゼからなる酵素群をコードする
構造遺伝子群を組み込んだ遺伝子組換え藍藻シネココッ
カス種である請求項１記載の製造法。 - 【請求項３】 前記構造遺伝子群が、アルカリゲネス・
ユウトロファス起源のものである請求項２記載の製造
法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9017518A JP2979184B2 (ja) | 1997-01-14 | 1997-01-14 | 藍藻を用いたポリ−β−ヒドロキシアルカノエートの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9017518A JP2979184B2 (ja) | 1997-01-14 | 1997-01-14 | 藍藻を用いたポリ−β−ヒドロキシアルカノエートの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH10191992A JPH10191992A (ja) | 1998-07-28 |
| JP2979184B2 true JP2979184B2 (ja) | 1999-11-15 |
Family
ID=11946186
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9017518A Expired - Lifetime JP2979184B2 (ja) | 1997-01-14 | 1997-01-14 | 藍藻を用いたポリ−β−ヒドロキシアルカノエートの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
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| JP (1) | JP2979184B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US9765205B2 (en) | 2011-08-24 | 2017-09-19 | Algix, Llc | Macrophyte-based bioplastic |
| EP3221460A1 (en) | 2014-11-20 | 2017-09-27 | Full Cycle Bioplastics Inc. | Producing polyhydroxyalkanoate copolymers from organic waste products |
-
1997
- 1997-01-14 JP JP9017518A patent/JP2979184B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH10191992A (ja) | 1998-07-28 |
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