JP2777598B2 - ポリ−β−ヒドロキシ酪酸の製造方法 - Google Patents
ポリ−β−ヒドロキシ酪酸の製造方法Info
- Publication number
- JP2777598B2 JP2777598B2 JP7318592A JP31859295A JP2777598B2 JP 2777598 B2 JP2777598 B2 JP 2777598B2 JP 7318592 A JP7318592 A JP 7318592A JP 31859295 A JP31859295 A JP 31859295A JP 2777598 B2 JP2777598 B2 JP 2777598B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- phb
- cyanobacteria
- plasmid
- hydroxybutyric acid
- poly
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- WHBMMWSBFZVSSR-UHFFFAOYSA-N 3-hydroxybutyric acid Chemical compound CC(O)CC(O)=O WHBMMWSBFZVSSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims description 10
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 10
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 37
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 32
- 241000192700 Cyanobacteria Species 0.000 claims description 25
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 25
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 14
- 108010003902 Acetyl-CoA C-acyltransferase Proteins 0.000 claims description 10
- 102100026105 3-ketoacyl-CoA thiolase, mitochondrial Human genes 0.000 claims description 9
- 229920000331 Polyhydroxybutyrate Polymers 0.000 claims description 9
- 108091000039 acetoacetyl-CoA reductase Proteins 0.000 claims description 9
- 239000005015 poly(hydroxybutyrate) Substances 0.000 claims description 9
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 8
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 6
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 claims description 5
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 claims description 5
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 claims description 5
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 claims description 5
- 241001464430 Cyanobacterium Species 0.000 claims description 4
- 241000135402 Synechococcus elongatus PCC 6301 Species 0.000 claims description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 4
- 230000010076 replication Effects 0.000 claims description 4
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims description 3
- 241000252867 Cupriavidus metallidurans Species 0.000 claims description 2
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 claims 1
- 125000002339 acetoacetyl group Chemical group O=C([*])C([H])([H])C(=O)C([H])([H])[H] 0.000 claims 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 33
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 21
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 17
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 9
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 8
- SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M potassium acetate Chemical compound [K+].CC([O-])=O SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 8
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- VWDWKYIASSYTQR-UHFFFAOYSA-N sodium nitrate Chemical compound [Na+].[O-][N+]([O-])=O VWDWKYIASSYTQR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 5
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 4
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 4
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 4
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 4
- 235000011056 potassium acetate Nutrition 0.000 description 4
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 3
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 3
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- 241000192707 Synechococcus Species 0.000 description 3
- 241000192560 Synechococcus sp. Species 0.000 description 3
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 3
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 3
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 3
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 3
- UEGPKNKPLBYCNK-UHFFFAOYSA-L magnesium acetate Chemical compound [Mg+2].CC([O-])=O.CC([O-])=O UEGPKNKPLBYCNK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 235000011285 magnesium acetate Nutrition 0.000 description 3
- 239000011654 magnesium acetate Substances 0.000 description 3
- 229940069446 magnesium acetate Drugs 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 102220201851 rs143406017 Human genes 0.000 description 3
- 239000004317 sodium nitrate Substances 0.000 description 3
- 235000010344 sodium nitrate Nutrition 0.000 description 3
- 241000588986 Alcaligenes Species 0.000 description 2
- ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N acetyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N 0.000 description 2
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 2
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000006209 dephosphorylation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000004817 gas chromatography Methods 0.000 description 2
- 229910017053 inorganic salt Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SJZRECIVHVDYJC-UHFFFAOYSA-M 4-hydroxybutyrate Chemical compound OCCCC([O-])=O SJZRECIVHVDYJC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- SJZRECIVHVDYJC-UHFFFAOYSA-N 4-hydroxybutyric acid Chemical compound OCCCC(O)=O SJZRECIVHVDYJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000016425 Arthrospira platensis Nutrition 0.000 description 1
- 240000002900 Arthrospira platensis Species 0.000 description 1
- 108700019535 Phosphoprotein Phosphatases Proteins 0.000 description 1
- 102000045595 Phosphoprotein Phosphatases Human genes 0.000 description 1
- 241000192589 Synechococcus elongatus PCC 7942 Species 0.000 description 1
- QOBLJVUECBDJGF-UHFFFAOYSA-N [Mg].CC(O)=O Chemical compound [Mg].CC(O)=O QOBLJVUECBDJGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 239000003905 agrochemical Substances 0.000 description 1
- 238000010364 biochemical engineering Methods 0.000 description 1
- 229920001222 biopolymer Polymers 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000030609 dephosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 229960004275 glycolic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 239000012770 industrial material Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000012567 medical material Substances 0.000 description 1
- WCYAALZQFZMMOM-UHFFFAOYSA-N methanol;sulfuric acid Chemical compound OC.OS(O)(=O)=O WCYAALZQFZMMOM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DDMCDMDOHABRHD-UHFFFAOYSA-N methyl 2-hydroxybutanoate Chemical compound CCC(O)C(=O)OC DDMCDMDOHABRHD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 230000029553 photosynthesis Effects 0.000 description 1
- 238000010672 photosynthesis Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 229940082787 spirulina Drugs 0.000 description 1
- 229920005992 thermoplastic resin Polymers 0.000 description 1
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、遺伝子組換えシネ
ココッカス種（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）
によるポリ−β−ヒドロキシ酢酸の製造方法に関する。
ココッカス種（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）
によるポリ−β−ヒドロキシ酢酸の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】ポリ−β−ヒドロキシ酪酸（ＰＨＢ）
は、微生物が生産するバイオポリマーの一種であり、微
生物により分解可能な熱可塑性樹脂として、医薬類、農
薬類、医療材料、工業材料等の多方面での応用が期待さ
れる材料である。ＰＨＢを微生物により生産させる方法
は、これまでに種々開示されている。例えば、特開昭５
９−２２０１９２号、特開昭６４−２７４８３号および
特開平１−２２２７８８号の各公報でＰＨＢの製造方法
について開示されている。しかし、これらの何れの方法
も資化性炭素源として有機炭素源を必要とするという欠
点があった。また、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂａｃｔｅ
ｒｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１７２，Ｎｏ．５，２７９１
−２７９２（１９９０）によれば、藍藻類のスピルリナ
（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ）は光合成を行うことにより有機
炭素源を必要とすることなくＰＨＢを生産することが可
能である。ところが、藍藻のＰＨＢ含有率は極めて少な
く、せいぜい６％と低かった。そこで、Ａｄｖａｎｃｅ
ｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒ
ｉｎｇ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．４１，
７８−７９（１９）によると、藍藻類のクロログレア
（Ｃｈｌｏｒｏｇｌｅａ）は無機塩培地に酢酸を加え、
二酸化炭素を通気してやることで１０％までＰＨＢが蓄
積していることが報告されている。
は、微生物が生産するバイオポリマーの一種であり、微
生物により分解可能な熱可塑性樹脂として、医薬類、農
薬類、医療材料、工業材料等の多方面での応用が期待さ
れる材料である。ＰＨＢを微生物により生産させる方法
は、これまでに種々開示されている。例えば、特開昭５
９−２２０１９２号、特開昭６４−２７４８３号および
特開平１−２２２７８８号の各公報でＰＨＢの製造方法
について開示されている。しかし、これらの何れの方法
も資化性炭素源として有機炭素源を必要とするという欠
点があった。また、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂａｃｔｅ
ｒｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１７２，Ｎｏ．５，２７９１
−２７９２（１９９０）によれば、藍藻類のスピルリナ
（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ）は光合成を行うことにより有機
炭素源を必要とすることなくＰＨＢを生産することが可
能である。ところが、藍藻のＰＨＢ含有率は極めて少な
く、せいぜい６％と低かった。そこで、Ａｄｖａｎｃｅ
ｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒ
ｉｎｇ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．４１，
７８−７９（１９）によると、藍藻類のクロログレア
（Ｃｈｌｏｒｏｇｌｅａ）は無機塩培地に酢酸を加え、
二酸化炭素を通気してやることで１０％までＰＨＢが蓄
積していることが報告されている。
【０００３】最近、特開平６−３１５７６５号では、ア
ルカリゲネス・ユウトロファス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅ
ｓ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）起源のβ−ケトチオラーゼ、
アセトアセチルＣｏＡレダクターゼおよびポリヒドロキ
シブチレートポリメラーゼの中をクローニングしたベク
ターに藍藻由来の遺伝子を導入したものを用いること
で、ＰＨＢ生産能の無いシネココッカス種（Ｓｙｎｅｃ
ｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）にＰＨＢを生産させること
に成功している。しかし、この遺伝子組換え藍藻におけ
るＰＨＢ蓄積率は約１％と少なく、また細胞増殖期、Ｐ
ＨＢ生産期の二段階の培養が必要であった。
ルカリゲネス・ユウトロファス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅ
ｓ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）起源のβ−ケトチオラーゼ、
アセトアセチルＣｏＡレダクターゼおよびポリヒドロキ
シブチレートポリメラーゼの中をクローニングしたベク
ターに藍藻由来の遺伝子を導入したものを用いること
で、ＰＨＢ生産能の無いシネココッカス種（Ｓｙｎｅｃ
ｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）にＰＨＢを生産させること
に成功している。しかし、この遺伝子組換え藍藻におけ
るＰＨＢ蓄積率は約１％と少なく、また細胞増殖期、Ｐ
ＨＢ生産期の二段階の培養が必要であった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】そこで本発明は、太陽
光、水、二酸化炭素および無機塩で生育する藍藻から効
率的に高収率でＰＨＢを生産させる方法を開発すること
を課題とする。
光、水、二酸化炭素および無機塩で生育する藍藻から効
率的に高収率でＰＨＢを生産させる方法を開発すること
を課題とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決すべく鋭意研究の結果、β−ケトチオラーゼ、ア
セトアセチルＣｏＡレダクターゼおよびポリヒドロキシ
ブチレートポリメラーゼからなる酵素群をコードする構
造遺伝子群を組み込んだ組換えプラスミドを構築し、こ
の組換えプラスミドを移入した、ＰＨＢ生産能を有する
遺伝子組換え藍藻シネココッカス種を通常の無機塩培地
の他に、安価な酢酸を加えて培養したところ、増殖させ
ながらＰＨＢの生産を行わせることができること、さら
にまた、窒素源を制限した培地を用いると、さらによい
結果が得られることを見いだし、本発明を完成した。即
ち、本発明によれば、β−ケトチオラーゼ、アセトアセ
チルＣｏＡレダクターゼおよびポリヒドロキシブチレー
トポリメラーゼからなる酵素群をコードする構造遺伝子
群を組み込んだ組換えプラスミドを含有し、ポリ−β−
ヒドロキシ酪酸生産能を有する遺伝子組換え藍藻シスコ
コッカス種を酢酸を添加した培地で培養し、培養物から
ポリ−β−ヒドロキシ酪酸を採取することを特徴とする
ポリ−β−ヒドロキシ酪酸の製造方法が提供される。本
発明によれば、さらに、前記組換えプラスミドが藍藻で
の複製に必要な領域を持ち、藍藻由来のプロモーター活
性を有する配列の下流にアルカリゲネス・ユウトロファ
ス起源のβ−ケトチオラーゼ、アセトアセチルＣｏＡレ
ダクターゼおよびポリヒドロキシブチレートポリメラー
ゼからなる酵素群をコードする遺伝子群を組み込んだ組
換えプラスミド、特にアンピシリンおよびクロラムフェ
ニコール耐性遺伝子を有するｐＡＥＮ１プラスミドであ
る前記製造方法が提供される。さらに本発明によれば、
前記遺伝子組換え藍藻シネココッカス種がＦＥＲＭＰ−
１５１８９である製造方法が提供される。本発明はさら
に、前記培地がさらに窒素源を制限されたものである前
記製造方法にも関する。
を解決すべく鋭意研究の結果、β−ケトチオラーゼ、ア
セトアセチルＣｏＡレダクターゼおよびポリヒドロキシ
ブチレートポリメラーゼからなる酵素群をコードする構
造遺伝子群を組み込んだ組換えプラスミドを構築し、こ
の組換えプラスミドを移入した、ＰＨＢ生産能を有する
遺伝子組換え藍藻シネココッカス種を通常の無機塩培地
の他に、安価な酢酸を加えて培養したところ、増殖させ
ながらＰＨＢの生産を行わせることができること、さら
にまた、窒素源を制限した培地を用いると、さらによい
結果が得られることを見いだし、本発明を完成した。即
ち、本発明によれば、β−ケトチオラーゼ、アセトアセ
チルＣｏＡレダクターゼおよびポリヒドロキシブチレー
トポリメラーゼからなる酵素群をコードする構造遺伝子
群を組み込んだ組換えプラスミドを含有し、ポリ−β−
ヒドロキシ酪酸生産能を有する遺伝子組換え藍藻シスコ
コッカス種を酢酸を添加した培地で培養し、培養物から
ポリ−β−ヒドロキシ酪酸を採取することを特徴とする
ポリ−β−ヒドロキシ酪酸の製造方法が提供される。本
発明によれば、さらに、前記組換えプラスミドが藍藻で
の複製に必要な領域を持ち、藍藻由来のプロモーター活
性を有する配列の下流にアルカリゲネス・ユウトロファ
ス起源のβ−ケトチオラーゼ、アセトアセチルＣｏＡレ
ダクターゼおよびポリヒドロキシブチレートポリメラー
ゼからなる酵素群をコードする遺伝子群を組み込んだ組
換えプラスミド、特にアンピシリンおよびクロラムフェ
ニコール耐性遺伝子を有するｐＡＥＮ１プラスミドであ
る前記製造方法が提供される。さらに本発明によれば、
前記遺伝子組換え藍藻シネココッカス種がＦＥＲＭＰ−
１５１８９である製造方法が提供される。本発明はさら
に、前記培地がさらに窒素源を制限されたものである前
記製造方法にも関する。
【０００６】
【発明の実施の形態】本発明に使用する組換えプラスミ
ドを含有する藍藻シネココッカス種は例えば次のように
して得ることができる。
ドを含有する藍藻シネココッカス種は例えば次のように
して得ることができる。
【０００７】まず、アルカリゲネス・ユウトロファス起
源のβ−ケトチオラーゼ、アセトアセチルＣｏＡレダク
ターゼおよびポリヒドロキシブチレートポリメラーゼか
らなる酵素群をコードする構造遺伝子群断片を調製す
る。この構造遺伝子群は既に配列決定されており、調製
法と共にＴｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇ
ｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．２６４，Ｎ
ｏ．２６，１５２９３−１５２９７（１９８９）および
Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ
Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．２６４，Ｎｏ．２６，
１５２９８−１５３０３（１９８９）に記載されてい
る。このβ−ケトチオラーゼ、アセトアセチルＣｏＡレ
ダクターゼおよびポリヒドロキシブチレートポリメラー
ゼからなる酵素群をコードする構造遺伝子群は以下，Ｐ
ＨＢ合成遺伝子断片と呼ぶ。
源のβ−ケトチオラーゼ、アセトアセチルＣｏＡレダク
ターゼおよびポリヒドロキシブチレートポリメラーゼか
らなる酵素群をコードする構造遺伝子群断片を調製す
る。この構造遺伝子群は既に配列決定されており、調製
法と共にＴｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇ
ｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．２６４，Ｎ
ｏ．２６，１５２９３−１５２９７（１９８９）および
Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ
Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．２６４，Ｎｏ．２６，
１５２９８−１５３０３（１９８９）に記載されてい
る。このβ−ケトチオラーゼ、アセトアセチルＣｏＡレ
ダクターゼおよびポリヒドロキシブチレートポリメラー
ゼからなる酵素群をコードする構造遺伝子群は以下，Ｐ
ＨＢ合成遺伝子断片と呼ぶ。
【０００８】次に、得られたＰＨＢ合成遺伝子断片をプ
ラスミド（例えばｐＵＣ１９（宝酒造株式会社製））に
導入する。すなわち、例えば、１０ｍＡ Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ（ｐＨ７．５），１０ｍＭ ＭｇＣｌ2，１ｍＭ
ＤＴＴなどのような緩衝液中、ｐＵＣ１９を制限酵素、
例えばＥｃｏＲＩ及びＳｍａＩで処理し、次いでアルカ
リホスファターゼを用いて脱リン酸化反応を行い、さら
に例えばフェノール抽出により精製し、制限酵素Ｅｃｏ
ＲＩおよびＳｍａＩ処理ｐＵＣ１９（約２．７Ｋ塩基
対）を得る。これとは別にＰＨＢ合成遺伝子断片を例え
ば１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１０ｍ
Ｍ ＭｇＣｌ2、１ｍＭ ＤＴＴなどのような公知の緩
衝液中、ＳｍａＩおよびＥｃｏＲＩを用いて処理し、さ
らに例えばフェノール抽出により精製してＳｍａＩおよ
びＥｃｏＲＩ処理したＰＨＢ合成遺伝子断片を得る。
ラスミド（例えばｐＵＣ１９（宝酒造株式会社製））に
導入する。すなわち、例えば、１０ｍＡ Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ（ｐＨ７．５），１０ｍＭ ＭｇＣｌ2，１ｍＭ
ＤＴＴなどのような緩衝液中、ｐＵＣ１９を制限酵素、
例えばＥｃｏＲＩ及びＳｍａＩで処理し、次いでアルカ
リホスファターゼを用いて脱リン酸化反応を行い、さら
に例えばフェノール抽出により精製し、制限酵素Ｅｃｏ
ＲＩおよびＳｍａＩ処理ｐＵＣ１９（約２．７Ｋ塩基
対）を得る。これとは別にＰＨＢ合成遺伝子断片を例え
ば１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１０ｍ
Ｍ ＭｇＣｌ2、１ｍＭ ＤＴＴなどのような公知の緩
衝液中、ＳｍａＩおよびＥｃｏＲＩを用いて処理し、さ
らに例えばフェノール抽出により精製してＳｍａＩおよ
びＥｃｏＲＩ処理したＰＨＢ合成遺伝子断片を得る。
【０００９】前記のようにして得られた制限酵素処理ｐ
ＵＣ１９およびＰＨＢ合成遺伝子断片を１０ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１０ｍＭ ＭｇＣｌ2，
１ｍＭ ＤＴＴ，１ｍＭ ＡＴＰなどのような公知の緩
衝液中Ｔ４リガーゼを用いて連結し、ｐＵＣ１９にＰＨ
Ｂ合成遺伝子断片を導入した約８Ｋ塩基対プラスミドを
構築し、これをｐＡＥ１００と名付ける。
ＵＣ１９およびＰＨＢ合成遺伝子断片を１０ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１０ｍＭ ＭｇＣｌ2，
１ｍＭ ＤＴＴ，１ｍＭ ＡＴＰなどのような公知の緩
衝液中Ｔ４リガーゼを用いて連結し、ｐＵＣ１９にＰＨ
Ｂ合成遺伝子断片を導入した約８Ｋ塩基対プラスミドを
構築し、これをｐＡＥ１００と名付ける。
【００１０】次に、ｐＡＥ１００からＰＨＢ合成遺伝子
断片を切り出し、藍藻由来のプロモータ活性を持つ遺伝
子配列の下流に組み込んだ、藍藻と大腸菌のシャトルベ
クターを構築する。このとき使用できるプラスミドとし
ては、例えばアンピシリン耐性遺伝子を有する藍藻と大
腸菌のシャトルベクターｐＥＣＡＮ８にプラスミドｐＫ
Ｋ２３２−８（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）のクロラムフ
ェニコール耐性遺伝子および藍藻由来のプロモーター活
性を有する遺伝子を組み込んだｐＫＥ４−９が挙げられ
る。前記ｐＥＣＡＮ８の製法は、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏ
ｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，Ｖｏｌ．２７，２５３−２５６
（１９８５）に記載されている。ｐＡＥ１００からＰＨ
Ｂ合成遺伝子断片を切り出すには、例えば１０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１０ｍＭ ＭｇＣ
ｌ2，１ｍＭ ＤＴＴ，５０ｍＭ ＮａＣｌなどのよう
な緩衝液中、制限酵素、例えばＥｃｏＲＩおよびＨｉｎ
ｄＩＩＩを用いて、ｐＡＥ１００を３７℃で１時間反応
させ、次いで例えばフェノール抽出により精製する。こ
のようにして得られ遺伝子断片のうち約５，２００塩基
の大きさのものを選択し、これをさらに例えば３ｍＭ
Ｔｒｉｓ−酢酸（ｐＨ７．９），６６ｍＭ酢酸カリウ
ム、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、０．５ｍＭ ＤＴＴ，
０．１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、０．１ｍＭ ｄＡＴＰ，
０．１ｍＭｄＣＴＰ，０．１ｍＭ ｄＴＴＰ，０．１ｍ
Ｍ ｄＧＴＰなどのような緩衝液中、Ｔ４ポリメラーゼ
を用いて処理し、次いで例えばフェノール抽出すること
により精製ＰＨＢ合成遺伝子断片が得られる。
断片を切り出し、藍藻由来のプロモータ活性を持つ遺伝
子配列の下流に組み込んだ、藍藻と大腸菌のシャトルベ
クターを構築する。このとき使用できるプラスミドとし
ては、例えばアンピシリン耐性遺伝子を有する藍藻と大
腸菌のシャトルベクターｐＥＣＡＮ８にプラスミドｐＫ
Ｋ２３２−８（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）のクロラムフ
ェニコール耐性遺伝子および藍藻由来のプロモーター活
性を有する遺伝子を組み込んだｐＫＥ４−９が挙げられ
る。前記ｐＥＣＡＮ８の製法は、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏ
ｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，Ｖｏｌ．２７，２５３−２５６
（１９８５）に記載されている。ｐＡＥ１００からＰＨ
Ｂ合成遺伝子断片を切り出すには、例えば１０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１０ｍＭ ＭｇＣ
ｌ2，１ｍＭ ＤＴＴ，５０ｍＭ ＮａＣｌなどのよう
な緩衝液中、制限酵素、例えばＥｃｏＲＩおよびＨｉｎ
ｄＩＩＩを用いて、ｐＡＥ１００を３７℃で１時間反応
させ、次いで例えばフェノール抽出により精製する。こ
のようにして得られ遺伝子断片のうち約５，２００塩基
の大きさのものを選択し、これをさらに例えば３ｍＭ
Ｔｒｉｓ−酢酸（ｐＨ７．９），６６ｍＭ酢酸カリウ
ム、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、０．５ｍＭ ＤＴＴ，
０．１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、０．１ｍＭ ｄＡＴＰ，
０．１ｍＭｄＣＴＰ，０．１ｍＭ ｄＴＴＰ，０．１ｍ
Ｍ ｄＧＴＰなどのような緩衝液中、Ｔ４ポリメラーゼ
を用いて処理し、次いで例えばフェノール抽出すること
により精製ＰＨＢ合成遺伝子断片が得られる。
【００１１】ｐＫＥ４−９にＰＨＢ合成遺伝子断片を導
入するには、例えば、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐ
Ｈ７．５），１０ｍＭ ＭｇＣｌ2，１ｍＭ ＤＴＴ，
１００ｍＭ ＮａＣｌなどのような緩衝液中、制限酵
素、例えばＳａｌＩを用いて、ｐＫＥ４−９を３７℃で
約１時間反応させ、次いで例えば３ｍＭ Ｔｒｉｓ−酢
酸（ｐＨ７．９）、６６ｍＭ酢酸カリウム、１０ｍＭ酢
酸マグネシウム、０．５ｍＭ ＤＴＴ，０．１ｍｇ／ｍ
ｌ ＢＳＡ，０．１ｍＭ ｄＡＴＰ，０．１ｍＭｄＣＴ
Ｐ，０．１ｍＭ ｄＴＴＰ，０．１ｍＭ ｄＧＴＰなど
のような緩衝液中、Ｔ４ポリメラーゼを用いて通常３７
℃で５分間処理し、さらにアルカリホスファターゼを用
いて脱リン酸化反応を行い、さらに例えばフェノール抽
出により精製した後、ＰＨＢ合成遺伝子断片との結合に
使用する。こうして得られたＳＡｌＩ処理ｐＫＥ４−９
とＰＨＢ合成遺伝子断片を連結するには、公知の緩衝液
中、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１０
ｍＭ ＭｇＣｌ2，１ｍＭ ＤＴＴ，１ｍＭ ＡＴＰ中
で、ＰＨＢ合成断片とｐＫＥ４−９をＴ４リガーゼを用
いて通常１６℃で約１時間処理すればよい。このように
してｐＫＥ４−９にＰＨＢ合成遺伝子断片を導入した１
４．００ｋｂ組換えプラスミドを得、これをｐＡＥＮ１
と名付けた。その構成を図１に示す。
入するには、例えば、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐ
Ｈ７．５），１０ｍＭ ＭｇＣｌ2，１ｍＭ ＤＴＴ，
１００ｍＭ ＮａＣｌなどのような緩衝液中、制限酵
素、例えばＳａｌＩを用いて、ｐＫＥ４−９を３７℃で
約１時間反応させ、次いで例えば３ｍＭ Ｔｒｉｓ−酢
酸（ｐＨ７．９）、６６ｍＭ酢酸カリウム、１０ｍＭ酢
酸マグネシウム、０．５ｍＭ ＤＴＴ，０．１ｍｇ／ｍ
ｌ ＢＳＡ，０．１ｍＭ ｄＡＴＰ，０．１ｍＭｄＣＴ
Ｐ，０．１ｍＭ ｄＴＴＰ，０．１ｍＭ ｄＧＴＰなど
のような緩衝液中、Ｔ４ポリメラーゼを用いて通常３７
℃で５分間処理し、さらにアルカリホスファターゼを用
いて脱リン酸化反応を行い、さらに例えばフェノール抽
出により精製した後、ＰＨＢ合成遺伝子断片との結合に
使用する。こうして得られたＳＡｌＩ処理ｐＫＥ４−９
とＰＨＢ合成遺伝子断片を連結するには、公知の緩衝液
中、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１０
ｍＭ ＭｇＣｌ2，１ｍＭ ＤＴＴ，１ｍＭ ＡＴＰ中
で、ＰＨＢ合成断片とｐＫＥ４−９をＴ４リガーゼを用
いて通常１６℃で約１時間処理すればよい。このように
してｐＫＥ４−９にＰＨＢ合成遺伝子断片を導入した１
４．００ｋｂ組換えプラスミドを得、これをｐＡＥＮ１
と名付けた。その構成を図１に示す。
【００１２】次にｐＡＥＮ１を用いてシネココッカス種
を形質転換する。まず、シネココッカス種の細胞を例え
ば表１に示すＢＧ−１１培地や表２に示すＭＤＭ培地中
で所定量となるまで培養する。
を形質転換する。まず、シネココッカス種の細胞を例え
ば表１に示すＢＧ−１１培地や表２に示すＭＤＭ培地中
で所定量となるまで培養する。
【００１３】
【表１】
【００１４】
【表２】
【００１５】次にＰａｃｋｅｒおよびＡ．Ｎ．Ｃｌａｚ
ｅｒ編集のＭｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ
Ｖｏｌ．１６７（ＡＣＡＤＥＭＩＣ ＰＲＥＳＳ，Ｉ
ＮＣ．１９８８）に記載された方法等に従い、ｐＡＥＮ
１を用いて該藍藻を自然形質転換する。本発明に使用す
る藍藻は、上記の方法で得られた藍藻に限定されるもの
ではなく、アセチルＣｏＡを介してＰＨＢを生産する遺
伝子群を有する遺伝子組換え藍藻であればよい。
ｅｒ編集のＭｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ
Ｖｏｌ．１６７（ＡＣＡＤＥＭＩＣ ＰＲＥＳＳ，Ｉ
ＮＣ．１９８８）に記載された方法等に従い、ｐＡＥＮ
１を用いて該藍藻を自然形質転換する。本発明に使用す
る藍藻は、上記の方法で得られた藍藻に限定されるもの
ではなく、アセチルＣｏＡを介してＰＨＢを生産する遺
伝子群を有する遺伝子組換え藍藻であればよい。
【００１６】次に、得られた形質転換藍藻にＰＨＢを生
産させる。すなわち、形質転換藍藻を、上記ＢＧ−１１
培地のような培地に酢酸を加え、通常通気撹拌培養を行
う。酢酸は最終濃度０．１〜２００ｍＭが好ましく、１
〜１００ｍＭが特に好ましい。一般に培養温度は２０〜
６０℃、好ましくは２５〜５５℃、培養液のｐＨは６〜
１１、好ましくは７〜９が望ましい。また、光強度は１
０００〜３０００Ｌｕｘが好ましい。次に、所定量まで
培養したら、藍藻菌体を培養液からろ過、遠心分離等の
方法により分離する。また、さらに藍藻菌体内のＰＨＢ
蓄積率を上げる為には、分離した藍藻菌体を栄養源を制
限した培養液、例えば、ＢＧ−１１培地から硝酸ナトリ
ウムを除いた酢酸入り培地にて培養を行うことが好適で
ある。このようにして遺伝子組換え藍藻菌体にＰＨＢを
生成蓄積させ、このＰＨＢをＧ．Ｂｒａｕｎｅｇｇらの
方法（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｐ
ｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉ
ｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６，２９−３７（１９７
８））等の方法により培養物から採取する。ＰＨＢの含
有率は乾燥菌体重量当り１２〜２５％であり、従来法で
せいぜい１０％であったのに比較して格段に優れてい
る。
産させる。すなわち、形質転換藍藻を、上記ＢＧ−１１
培地のような培地に酢酸を加え、通常通気撹拌培養を行
う。酢酸は最終濃度０．１〜２００ｍＭが好ましく、１
〜１００ｍＭが特に好ましい。一般に培養温度は２０〜
６０℃、好ましくは２５〜５５℃、培養液のｐＨは６〜
１１、好ましくは７〜９が望ましい。また、光強度は１
０００〜３０００Ｌｕｘが好ましい。次に、所定量まで
培養したら、藍藻菌体を培養液からろ過、遠心分離等の
方法により分離する。また、さらに藍藻菌体内のＰＨＢ
蓄積率を上げる為には、分離した藍藻菌体を栄養源を制
限した培養液、例えば、ＢＧ−１１培地から硝酸ナトリ
ウムを除いた酢酸入り培地にて培養を行うことが好適で
ある。このようにして遺伝子組換え藍藻菌体にＰＨＢを
生成蓄積させ、このＰＨＢをＧ．Ｂｒａｕｎｅｇｇらの
方法（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｐ
ｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉ
ｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６，２９−３７（１９７
８））等の方法により培養物から採取する。ＰＨＢの含
有率は乾燥菌体重量当り１２〜２５％であり、従来法で
せいぜい１０％であったのに比較して格段に優れてい
る。
【００１７】
【実施例】以下、実施例により本発明をさらに具体的に
説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるもの
ではない。
説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるもの
ではない。
【００１８】実施例 まず、アルカリゲネス・ユウトロファス（Ａｌｃａｌｉ
ｇｅｎｅｓ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）からβ−ケトチオラ
ーゼ、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼおよびポリヒ
ドロキシブチレートポリメラーゼからなる酵素群をコー
ドする構造遺伝子群断片（ＰＨＢ合成遺伝子断片）をＴ
ｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ
Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．２６４，Ｎｏ．２６，１
５２９３−１５２９７および１５２９８−１５３０３
（１９８９）に記載されている方法で調製した。得られ
たＰＨＢ合成遺伝子断片をプラスミドに導入するため、
プラスミドｐＵＣ１９ １００μｇ（宝酒造株式会社
製）を用意し、緩衝液１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐ
Ｈ７．５），１０ｍＭ ＭｇＣｌ2，１ｍＭ ＤＴＴ
中、制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＳｍａＩそれぞれ５００ユ
ニットずつを用いて、３７℃で１時間反応させ、次いで
アルカアリホスファターゼ２ユニットを用いて３７℃で
１時間脱リン酸化反応を行い、さらに例えばフェノール
抽出により精製した。
ｇｅｎｅｓ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）からβ−ケトチオラ
ーゼ、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼおよびポリヒ
ドロキシブチレートポリメラーゼからなる酵素群をコー
ドする構造遺伝子群断片（ＰＨＢ合成遺伝子断片）をＴ
ｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ
Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．２６４，Ｎｏ．２６，１
５２９３−１５２９７および１５２９８−１５３０３
（１９８９）に記載されている方法で調製した。得られ
たＰＨＢ合成遺伝子断片をプラスミドに導入するため、
プラスミドｐＵＣ１９ １００μｇ（宝酒造株式会社
製）を用意し、緩衝液１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐ
Ｈ７．５），１０ｍＭ ＭｇＣｌ2，１ｍＭ ＤＴＴ
中、制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＳｍａＩそれぞれ５００ユ
ニットずつを用いて、３７℃で１時間反応させ、次いで
アルカアリホスファターゼ２ユニットを用いて３７℃で
１時間脱リン酸化反応を行い、さらに例えばフェノール
抽出により精製した。
【００１９】このようにして、制限酵素ＥｃｏＲＩおよ
びＳｍａｌＩ処理したｐＵＣ１９（約２．７Ｋ塩基対）
と、ＰＨＢ合成遺伝子とを連結するために、ＰＨＢ合成
遺伝子断片２００μｇを緩衝液１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ（ｐＨ７．５），１０ｍＭ ＭｇＣｌ2，１ｍＭ
ＤＴＴ中、ＳｍａＩおよびＥｃｏＲＩをそれぞれ５００
ユニットずつ用いて、３７℃で約１時間反応させ、さら
にフェノール抽出により精製した。その後、緩衝液１０
ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１０ｍＭ Ｍ
ｇＣｌ2，１ｍＭ ＤＴＴ，１ｍＭ ＡＴＰ中で、上記
処理したＰＨＢ合成遺伝子断片１００ｎｇと上記処理し
たｐＵＣ１９ ５０ｎｇに対して５ユニットのＴ４リガ
ーゼを用いて１６℃で約１時間処理した。このようにし
てｐＵＣ１９にＰＨＢ合成遺伝子断片を導入した約８Ｋ
塩基対の組換えプラスミドをｐＡＥ１００と名付けた。
びＳｍａｌＩ処理したｐＵＣ１９（約２．７Ｋ塩基対）
と、ＰＨＢ合成遺伝子とを連結するために、ＰＨＢ合成
遺伝子断片２００μｇを緩衝液１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ（ｐＨ７．５），１０ｍＭ ＭｇＣｌ2，１ｍＭ
ＤＴＴ中、ＳｍａＩおよびＥｃｏＲＩをそれぞれ５００
ユニットずつ用いて、３７℃で約１時間反応させ、さら
にフェノール抽出により精製した。その後、緩衝液１０
ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１０ｍＭ Ｍ
ｇＣｌ2，１ｍＭ ＤＴＴ，１ｍＭ ＡＴＰ中で、上記
処理したＰＨＢ合成遺伝子断片１００ｎｇと上記処理し
たｐＵＣ１９ ５０ｎｇに対して５ユニットのＴ４リガ
ーゼを用いて１６℃で約１時間処理した。このようにし
てｐＵＣ１９にＰＨＢ合成遺伝子断片を導入した約８Ｋ
塩基対の組換えプラスミドをｐＡＥ１００と名付けた。
【００２０】次に、ｐＡＥ１００からＰＨＢ合成遺伝子
断片を切り出し、藍藻由来のプロモーター活性を持つ遺
伝子配列の下流に組み込んだ、藍藻と大腸菌のシャトル
ベクターを構築するための、プラスミドｐＫＥ４−９を
１００μｇ用意した。ｐＫＥ４−９は、アンピリン耐性
遺伝子を有する藍藻と大腸菌のシャトルベクターｐＥＣ
ＡＮ８にプラスミドｐＫＫ２３２−８（Ｐｈａｒｍａｃ
ｉａ社製）のクロラムフェニコール耐性遺伝子と、藍藻
由来のプロモーター活性を有する遺伝子を組み込んだも
のである。ｐＡＥ１００からＰＨＢ合成遺伝子断片を切
り出すため、緩衝液１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ
７．５），１０ｍＭ ＭｇＣｌ2，１ｍＭ ＤＴＴ，５
０ｍＭ ＮａＣｌ中、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎ
ｄＩＩＩをそれぞれ５００ユニットずつ用いて、ｐＡＥ
１００ ２００μｇを３７℃で１時間反応させ、フェノ
ール抽出により精製した。次に、得られた遺伝子断片の
うち約５，２００塩基の大きさのものを選択し、これを
さらに緩衝液３ｍＭ Ｔｒｉｓ−酢酸（ｐＨ７．９），
６６ｍＭ酢酸カリウム，１０ｍＭ酢酸マグネシウム，
０．５ｍＭ ＤＴＴ，０．１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ，０．
１ｍＭ ｄＡＴＰ，０．１ｍＭ ｄＣＴＰ，０．１ｍＭ
ｄＴＴＰ，０．１ｍＭ ｄＧＴＰ中、２００ユニット
のＴ４ポリメラーゼを用いて３７℃で５分間処理し、次
いでフェノール抽出することにより精製ＰＨＢ合成遺伝
子断片を得た。ｐＫＥ４−９に上記切り出したＰＨＢ合
成遺伝子断片を導入するため、緩衝液５０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１０ｍＭ ＭｇＣｌ2，１
ｍＭＤＴＴ，１００ｍＭ ＮａＣｌ緩衝液中、制限酵素
ＳａｌＩを５００ユニット用いて、ｐＫＥ４−９ ２０
０μｇを３７℃で１時間反応させ、次いで３ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ−酢酸（ｐＨ７．９），６６ｍＭ 酢酸カリウム，
１０ｍＭ 酢酸マグネシウム，０．５ｍＭ ＤＴＴ，
０．１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ，０．１ｍＭ ｄＡＴＰ，
０．１ｍＭ ｄＣＴＰ，０．１ｍＭ ｄＴＴＰ，０．１
ｍＭ ｄＧＴＰの緩衝液中、２００ユニットのＴ４ポリ
メラーゼを用いて３７℃で５分間処理し、さらにアルカ
リホスファターゼ２ユニットを用いて３７℃で１時間脱
リン酸化反応を行った後、フェノール抽出により精製し
た。
断片を切り出し、藍藻由来のプロモーター活性を持つ遺
伝子配列の下流に組み込んだ、藍藻と大腸菌のシャトル
ベクターを構築するための、プラスミドｐＫＥ４−９を
１００μｇ用意した。ｐＫＥ４−９は、アンピリン耐性
遺伝子を有する藍藻と大腸菌のシャトルベクターｐＥＣ
ＡＮ８にプラスミドｐＫＫ２３２−８（Ｐｈａｒｍａｃ
ｉａ社製）のクロラムフェニコール耐性遺伝子と、藍藻
由来のプロモーター活性を有する遺伝子を組み込んだも
のである。ｐＡＥ１００からＰＨＢ合成遺伝子断片を切
り出すため、緩衝液１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ
７．５），１０ｍＭ ＭｇＣｌ2，１ｍＭ ＤＴＴ，５
０ｍＭ ＮａＣｌ中、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎ
ｄＩＩＩをそれぞれ５００ユニットずつ用いて、ｐＡＥ
１００ ２００μｇを３７℃で１時間反応させ、フェノ
ール抽出により精製した。次に、得られた遺伝子断片の
うち約５，２００塩基の大きさのものを選択し、これを
さらに緩衝液３ｍＭ Ｔｒｉｓ−酢酸（ｐＨ７．９），
６６ｍＭ酢酸カリウム，１０ｍＭ酢酸マグネシウム，
０．５ｍＭ ＤＴＴ，０．１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ，０．
１ｍＭ ｄＡＴＰ，０．１ｍＭ ｄＣＴＰ，０．１ｍＭ
ｄＴＴＰ，０．１ｍＭ ｄＧＴＰ中、２００ユニット
のＴ４ポリメラーゼを用いて３７℃で５分間処理し、次
いでフェノール抽出することにより精製ＰＨＢ合成遺伝
子断片を得た。ｐＫＥ４−９に上記切り出したＰＨＢ合
成遺伝子断片を導入するため、緩衝液５０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１０ｍＭ ＭｇＣｌ2，１
ｍＭＤＴＴ，１００ｍＭ ＮａＣｌ緩衝液中、制限酵素
ＳａｌＩを５００ユニット用いて、ｐＫＥ４−９ ２０
０μｇを３７℃で１時間反応させ、次いで３ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ−酢酸（ｐＨ７．９），６６ｍＭ 酢酸カリウム，
１０ｍＭ 酢酸マグネシウム，０．５ｍＭ ＤＴＴ，
０．１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ，０．１ｍＭ ｄＡＴＰ，
０．１ｍＭ ｄＣＴＰ，０．１ｍＭ ｄＴＴＰ，０．１
ｍＭ ｄＧＴＰの緩衝液中、２００ユニットのＴ４ポリ
メラーゼを用いて３７℃で５分間処理し、さらにアルカ
リホスファターゼ２ユニットを用いて３７℃で１時間脱
リン酸化反応を行った後、フェノール抽出により精製し
た。
【００２１】その後、前記ＳａｌＩ処理ｐＫＥ４−９と
前記切り出したＰＨＢ合成遺伝子断片を連結するため、
緩衝液１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１
０ｍＭ ＭｇＣｌ2，１ｍＭ ＤＴＴ，１ｍＭ ＡＴＰ
中で、ＰＨＢ合成遺伝子断片１００ｎｇと前記処理ｐＫ
Ｅ４−９ ５０ｎｇに対して５ユニットのＴ４リガーゼ
を用いて１６℃で約１時間処理した。このようにしてｐ
ＫＥ４−９のＳａｌＩサイトにＰＨＢ合成遺伝子断片を
導入した１４．００ｋｂ塩基対プラスミドをｐＡＥＮ１
と名付けた。次にｐＡＥＮ１を用いて形質転換藍藻を得
るため、シネココッカス種ＰＣＣ７９４２（Ｓｙｎｅｃ
ｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＰＣＣ７９４２）をＢＧ−１
１培地４０ｍｌにて２，０００Ｌｕｘ，３０℃にてＯＤ
660＝０．２の値になるまで培養し、ｐＡＥＮ１ ２０
μｇを用いて自然形質転換した。自然形質転換の方法
は、ＰａｃｋｅｒおよびＡ．Ｎ．Ｃｌａｚｅｒ編集のＭ
ｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．１
６７（ＡＣＡＤＥＭＩＣ ＰＲＥＳＳ，ＩＮＣ．１９８
８）に記載されている方法を用いた。このｐＡＥＮ１を
保有するシネココッカス種ＰＣＣ７９４２の形質転換体
は、ｐＡＥＮ１−１と命名し、工業技術院生命工学工業
技術研究所に平成７年９月１９日に寄託した（受託番号
＝ＦＥＲＭＰ−１５１８９）。
前記切り出したＰＨＢ合成遺伝子断片を連結するため、
緩衝液１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１
０ｍＭ ＭｇＣｌ2，１ｍＭ ＤＴＴ，１ｍＭ ＡＴＰ
中で、ＰＨＢ合成遺伝子断片１００ｎｇと前記処理ｐＫ
Ｅ４−９ ５０ｎｇに対して５ユニットのＴ４リガーゼ
を用いて１６℃で約１時間処理した。このようにしてｐ
ＫＥ４−９のＳａｌＩサイトにＰＨＢ合成遺伝子断片を
導入した１４．００ｋｂ塩基対プラスミドをｐＡＥＮ１
と名付けた。次にｐＡＥＮ１を用いて形質転換藍藻を得
るため、シネココッカス種ＰＣＣ７９４２（Ｓｙｎｅｃ
ｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＰＣＣ７９４２）をＢＧ−１
１培地４０ｍｌにて２，０００Ｌｕｘ，３０℃にてＯＤ
660＝０．２の値になるまで培養し、ｐＡＥＮ１ ２０
μｇを用いて自然形質転換した。自然形質転換の方法
は、ＰａｃｋｅｒおよびＡ．Ｎ．Ｃｌａｚｅｒ編集のＭ
ｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．１
６７（ＡＣＡＤＥＭＩＣ ＰＲＥＳＳ，ＩＮＣ．１９８
８）に記載されている方法を用いた。このｐＡＥＮ１を
保有するシネココッカス種ＰＣＣ７９４２の形質転換体
は、ｐＡＥＮ１−１と命名し、工業技術院生命工学工業
技術研究所に平成７年９月１９日に寄託した（受託番号
＝ＦＥＲＭＰ−１５１８９）。
【００２２】次に、ｐＡＥＮ１−１をアンピシリン２ｍ
ｇ／ｍｌおよびクロラムフェニコール１０ｍｇ／ｍｌを
含有する１０ｍＭ酢酸入りＢＧ−１１培地２００ｍｌに
植菌し、２，０００Ｌｕｘ、３０℃にて１４日間培養を
行った。この培養物を３０℃、１５８０Ｇ，１０分間の
条件で遠心し、培養液から藍藻菌体を分離した。藍藻菌
体によるＰＨＢ蓄積率は１２％であった。また、ＰＨＢ
蓄積率を上げるため、分離した藍藻菌体をＢＧ−１１培
地から硝酸ナトリウムを除いた１０ｍＭ酢酸入り培地に
懸濁させ、２，０００Ｌｕｘ、３０℃でさらに１４日間
培養を行った。培養後の藍藻菌体によるＰＨＢ蓄積率は
乾燥菌体重量当たり２５％であった。なお、酢酸を入れ
ず、窒素源を制限した培地ＰＨＢの蓄積は、約１％であ
った。ＰＨＢの定量は、ガスクロマトグラフにて下記の
ように行った。すなわち、凍結乾燥した菌体４０ｍｇを
スクリューキャップ付き１０ｍｌ試験管に入れ、クロロ
ホルム２ｍｌと、３ｗｔ％硫酸−メタノール溶液２ｍｌ
を加え、栓をして１００℃で３．５時間反応させた。反
応終了後、水１ｍｌを加えて激しく１０分間振とうした
後に、２層に分離した下層のクロロホルム層を取り出
し、このクロロホルム層をガスクロマトグラフィーにか
けて、ヒドロキシ酪酸メチルのピークの面積からＰＨＢ
量を計算して求めた。
ｇ／ｍｌおよびクロラムフェニコール１０ｍｇ／ｍｌを
含有する１０ｍＭ酢酸入りＢＧ−１１培地２００ｍｌに
植菌し、２，０００Ｌｕｘ、３０℃にて１４日間培養を
行った。この培養物を３０℃、１５８０Ｇ，１０分間の
条件で遠心し、培養液から藍藻菌体を分離した。藍藻菌
体によるＰＨＢ蓄積率は１２％であった。また、ＰＨＢ
蓄積率を上げるため、分離した藍藻菌体をＢＧ−１１培
地から硝酸ナトリウムを除いた１０ｍＭ酢酸入り培地に
懸濁させ、２，０００Ｌｕｘ、３０℃でさらに１４日間
培養を行った。培養後の藍藻菌体によるＰＨＢ蓄積率は
乾燥菌体重量当たり２５％であった。なお、酢酸を入れ
ず、窒素源を制限した培地ＰＨＢの蓄積は、約１％であ
った。ＰＨＢの定量は、ガスクロマトグラフにて下記の
ように行った。すなわち、凍結乾燥した菌体４０ｍｇを
スクリューキャップ付き１０ｍｌ試験管に入れ、クロロ
ホルム２ｍｌと、３ｗｔ％硫酸−メタノール溶液２ｍｌ
を加え、栓をして１００℃で３．５時間反応させた。反
応終了後、水１ｍｌを加えて激しく１０分間振とうした
後に、２層に分離した下層のクロロホルム層を取り出
し、このクロロホルム層をガスクロマトグラフィーにか
けて、ヒドロキシ酪酸メチルのピークの面積からＰＨＢ
量を計算して求めた。
【００２３】比較例１ シネココッカス種ＰＣＣ７９４２を１０ｍＭ酢酸入りＢ
Ｇ−１１培地２００ｍｌに植菌し、２，０００Ｌｕｘ、
３０℃にて１４日間培養を行った。さらに、この培養液
を３０℃、１５８０Ｇ、１０分間の条件で遠心し、培養
物から藍藻菌体を分離し、ＰＨＢの蓄積量を定量した。
また、分離した藍藻菌体をＢＧ−１１培地から硝酸ナト
リウムを除いた１０ｍＭ酢酸入り培地に懸濁させ、２，
０００Ｌｕｘ、３０℃で、さらに１４日培養を行った場
合の蓄積量も定量した。しかし、どちらの場合もＰＨＢ
の蓄積は認められなかった（乾燥菌体重量当たり０．０
０１％未満）。ＰＨＢの定量は、実施例１と同様にして
行った。
Ｇ−１１培地２００ｍｌに植菌し、２，０００Ｌｕｘ、
３０℃にて１４日間培養を行った。さらに、この培養液
を３０℃、１５８０Ｇ、１０分間の条件で遠心し、培養
物から藍藻菌体を分離し、ＰＨＢの蓄積量を定量した。
また、分離した藍藻菌体をＢＧ−１１培地から硝酸ナト
リウムを除いた１０ｍＭ酢酸入り培地に懸濁させ、２，
０００Ｌｕｘ、３０℃で、さらに１４日培養を行った場
合の蓄積量も定量した。しかし、どちらの場合もＰＨＢ
の蓄積は認められなかった（乾燥菌体重量当たり０．０
０１％未満）。ＰＨＢの定量は、実施例１と同様にして
行った。
【００２４】
【発明の効果】本発明により、ポリ−β−ヒドロキシ酪
酸生産能を有する遺伝子組換え藍藻から、高収量でＰＨ
Ｂを効率的に生産することが可能となった。
酸生産能を有する遺伝子組換え藍藻から、高収量でＰＨ
Ｂを効率的に生産することが可能となった。
【図１】組換えプラスミドｐＡＥＮ１の構成を示す概略
図である。
図である。
ＰＵＨ２４：藍藻由来の遺伝子で、藍藻中で複製する為
に必要な領域 Ｎｏ．９ ：藍藻由来のプロモーター ｐｈｂ Ｃ：ポリヒドロキシブチレートポリメラーゼ遺
伝子 ｐｈｂ Ａ：β−ケトチオラーゼ遺伝子 ｐｈｂ ｂ：アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ遺伝子 ＣＡＴ：クロラムフェニコール耐性遺伝子 Ａｍｐ：アンピシリン耐性遺伝子 ＯＲＩ：大腸菌で複製する為に必要な領域
に必要な領域 Ｎｏ．９ ：藍藻由来のプロモーター ｐｈｂ Ｃ：ポリヒドロキシブチレートポリメラーゼ遺
伝子 ｐｈｂ Ａ：β−ケトチオラーゼ遺伝子 ｐｈｂ ｂ：アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ遺伝子 ＣＡＴ：クロラムフェニコール耐性遺伝子 Ａｍｐ：アンピシリン耐性遺伝子 ＯＲＩ：大腸菌で複製する為に必要な領域
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:89） (Ｃ１２Ｎ 1/38 Ｃ１２Ｒ 1:89） (Ｃ１２Ｐ 7/62 Ｃ１２Ｒ 1:89） (72)発明者 高橋 英之 東京都港区西新橋２−８−11 第７東洋 海事ビル８階 財団法人地球環境産業技 術研究機構 ＣＯ２固定化等プロジェク ト室内 (72)発明者 浅田 泰男 茨城県つくば市東１丁目１番３ 工業技 術院生命工学工業技術研究所内 (72)発明者 常盤 豊 茨城県つくば市東１丁目１番３ 工業技 術院生命工学工業技術研究所内 (72)発明者 三宅 正人 茨城県つくば市東１丁目１番３ 工業技 術院生命工学工業技術研究所内 審査官 中木 亜希 (56)参考文献 特開 平５−500751（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ（Ｇ ＥＮＥＴＹＸ) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (4)
- 【請求項１】 β−ケトチオラーゼ、アセトアセチルＣ
ｏＡレダクターゼおよびポリヒドロキシブチレートポリ
メラーゼからなる酵素群をコードする構造遺伝子群を組
み込んだ組換えプラスミドを含有し、ポリ−β−ヒドロ
キシ酪酸生産能を有する遺伝子組換え藍藻シスココッカ
ス種を酢酸を添加した培地で培養し、培養物からポリ−
β−ヒドロキシ酪酸を採取することを特徴とするポリ−
β−ヒドロキシ酪酸の製造方法。 - 【請求項２】 前記組換えプラスミドが藍藻での複製に
必要な領域を持ち、藍藻由来のプロモーター活性を有す
る配列の下流にアルカリゲネス・ユウトロファス起源の
β−ケトチオラーゼ、アセトアセチルＣｏＡレダクター
ゼおよびポリヒドロキシブチレートポリメラーゼからな
る酵素群をコードする遺伝子群を組み込んだ組換えプラ
スミドである請求項１記載の製造方法。 - 【請求項３】 前記プラスミドがアンピシリンおよびク
ロラムフェニコール耐性遺伝子を有するｐＡＥＮ１プラ
スミドである請求項１記載の製造方法。 - 【請求項４】 前記形質転換藍藻シネココッカス種がＦ
ＥＲＭ Ｐ−１５１８９である請求項１記載の製造方
法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7318592A JP2777598B2 (ja) | 1995-11-13 | 1995-11-13 | ポリ−β−ヒドロキシ酪酸の製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7318592A JP2777598B2 (ja) | 1995-11-13 | 1995-11-13 | ポリ−β−ヒドロキシ酪酸の製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09131182A JPH09131182A (ja) | 1997-05-20 |
| JP2777598B2 true JP2777598B2 (ja) | 1998-07-16 |
Family
ID=18100866
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7318592A Expired - Lifetime JP2777598B2 (ja) | 1995-11-13 | 1995-11-13 | ポリ−β−ヒドロキシ酪酸の製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2777598B2 (ja) |
-
1995
- 1995-11-13 JP JP7318592A patent/JP2777598B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH09131182A (ja) | 1997-05-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Garrity et al. | Class I. Alphaproteobacteria class. nov. | |
| CN102459625B (zh) | 生物技术生产软骨素 | |
| CN100558886C (zh) | 醛脱氢酶基因 | |
| CN103571892B (zh) | 二氢查耳酮的生物技术生产方法 | |
| CN107075465A (zh) | 阿魏酸转化为香草醛的方法 | |
| CN101463358B (zh) | 一种腈水合酶基因簇及其应用 | |
| AU753879B2 (en) | Industrial method for producing heterologous proteins in E.coli and strains useful for said method | |
| US8962287B2 (en) | Scyllo-inositol-producing cell and scyllo-inositol production method using said cells | |
| JP2777598B2 (ja) | ポリ−β−ヒドロキシ酪酸の製造方法 | |
| CN110062807B (zh) | 聚羟基链烷酸酯的制造方法及微生物 | |
| JPH05260979A (ja) | Ｄ−リボースの製造法 | |
| JP2678209B2 (ja) | 遺伝子組換え藍藻によるポリ−β−ヒドロキシ酪酸の生産 | |
| JP2979184B2 (ja) | 藍藻を用いたポリ−β−ヒドロキシアルカノエートの製造法 | |
| JP2777597B2 (ja) | 組換えプラスミド、それを含有する形質転換藍藻およびポリ−β−ヒドロキシ酪酸の製造方法 | |
| US20120058563A1 (en) | Production of 2-keto-l-gulonic acid | |
| DE69920470T2 (de) | Neuartiges gen und transformant, welcher dieses beinhaltet | |
| EP1404808A2 (en) | Nucleic acid free ghost preparations | |
| AU2002328340A1 (en) | Nucleic acid free ghost preparations | |
| JP2006141216A (ja) | Ｄ−キロ−イノシトールの製造方法 | |
| JPS63157986A (ja) | 遺伝子組換によるｌ−フエニルアラニンの製造方法 | |
| KR102613937B1 (ko) | 갈락토스 이용에 관여하는 모든 유전자가 결손된 효모 균주 및 이를 이용한 재조합 단백질 생산방법 | |
| JP2001046093A (ja) | 多価アルコール芳香族カルボン酸の製造方法 | |
| US5968801A (en) | Polyhydroxyalkanoate depolymerase and process for producing the same | |
| CN113789311B (zh) | 一种(r)-3-氨基丁酸的合成与纯化方法 | |
| JP5737650B2 (ja) | アセトイン産生細胞および当該細胞を用いたアセトインの製造方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313115 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313117 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| S533 | Written request for registration of change of name |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313533 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |