KR0185577B1 - 유전자 증폭용 벡터 및 5'-구아니실산의 제조방법 - Google Patents

Abstract

1. 청구범위에 기재되어 있는 발명이 속하는 기술 분야

유전공학

2. 그 발명이 해결하고자 하는 기술적 과제

글루타메이트 생산균으로부터 유도된 유전자의 유전공학적 조작에 의한 발현수율의 증대

3. 그 기술적 과제의 해결방법의 요지

브레비박테리움 속 미생물에서 코리네형 글루타메이트 생산균으로부터 유래된 유전자를 증폭할 수 있는 재조합 플라스미드 벡터 pAMP46.

4. 발명의 중요한 용도

퓨린계 핵산물질의 제조

Description

유전자 증폭용 벡터 및 5'-구아닐산의 제조방법

제 1 도는 본 발명에 따른 재조합 플라스미드 pAMP 46의 제작 및 유전자 증폭과정을 나타낸 작제도이다.

본 발명은 코리네형 글루타메이트 생산균 [예, 브레비박테리움 플라붐(Brevibacterium flavum), 브레비박테리움 락토퍼멘텀(Brevibacterium lactofermentum), 브레비박테리움 암모니아게네스(Brevibacterium ammoniagenes) 또는 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)]으로부터 유도된 유전자를 브레비박테리움 속 균주에서 증폭시킬 수 있는 신규한 재조합 플라스미드벡터, 이로 형질전환된 코리네형 글루타메이트 생산균주 및 이를 사용한 5'-구아닐산의 제조방법에 관한 것이다.

본 출원인은 브레비박테리움 암모니아게네스 ATCC 6872/pAMP46 균주를 1995년 12월 29일에 한국종균협회에 수탁번호 KFCC-10886으로 기탁하였다.

통상 유전자 재조합 균주의 발효시 플라스미드의 안정성이 낮아 발효 후반기에 플라스미드에 의해 코딩된 효소의 발현 정도가 원하는 수준보다 낮아 재조합 균주의 특성을 살리지 못하는 경우가 많다. 이러한 점을 해결하기 위한 방법으로서 여러 방법들이 도입되고 있다. 가장 간단한 방법으로, 재조합 플라스미디에 실려 있는 외부유전자의 크기를 줄여 배양 중 재조합 플라스미드의 안정성을 높이려는 시도가 있어 왔으나, 어느 정도 크기 이하의 유전자는 거의 동일한 안정성을 보이기 때문에 유전자의 크기 축소에 의해서는 안정성 증가에 별로 효과를 보지 못하는 실정이다. 다른 방법으로서, 세포분열시 플라스미드의 분배(partition)에 관여하여 재조합 플라스미드의 안정성을 증가시켜 주는 DNA 단편인 par 유전자를 도입함으로써 재조합 플라스미드의 안정성을 높이고자 하는 연구가 보고된 바 있으나 이는 대장균의 경우에 상세히 연구되었지만 대장균 이외의 미생물에서는 거의 보고된 바 없어 산업적으로 유용한 균주인 코리네형 글루타메이트 생성균에는 적용이 어려운 실정이다.

또 다른 유용한 방법으로는 강력한 활성을 가지는 프로모터를 도입하여 유전자에 의한 발현정도를 증가시키는 방법이 있는데, 그러나 이 방법 역시 대장균의 경우에는 lacI 프로모터, trp 프로모터, 람다(λ) 밥테이로파지 P_R, P_L프로모터 등 강력한 프로모터가 보고되었으나, 코리네형 글루타메이트 생성균에서는 분자생물학적 기초연구가 이제 시작단계이므로 그렇게 강력한 프로모터가 보고된 바 없으며, 본 발명자들의 자체연구에 의하면 상기의 대장균의 강력 프로모터(예: P_R, P_L)를 도입하여도 발현이 별로 증가되지 않는 것으로 보아 대장균 프로모터의 이들 코리네형 세균에 대한 응용성은 없는 것으로 보인다.

따라서, 본 발명자들은 코리네형 글루타메이트 생산균에서 재조합 플라스미드 벡터를 통해 목적하는 유전자를 증폭시켜 유전자의 복제수(copy number)를 늘림으로써 플라스미드 내의 유전자에 의한 발현을 증가시키는 방법을 도입하기로 하였다. 그러나 통상의 제한효소(class II)는 효소에 의해 인식되는 부위가 그의 중심을 기준으로 대칭을 이루며, 절단되고 난 후에 생성되는 말단의 염기 서열도 중심을 기준으로 대칭을 이루고 있기 때문에 양 말단이 서로 결합가능하여 구조적으로 불안정한 결합을 형성할 가능성이 매우 높으며[예: 회문구조(palindromel)], 또한 제한효소에 의한 절단부위와 인식부위가 동일하여 증폭반응에 한번 사용한 제한효소 부위는 더 이상의 증폭반응에 사용이 불가하여 유전자의 증폭이 제한되는 실정이다.

DNA 제한효소(DNA restriction endonuclease)는 다음과 같이 class I, II, III로 분류한다. class I 제한효소는 그의 인식부위로부터 멀리 떨어져 있는 부위를 무작위적으로 절단하는 효소이며, class II 제한효소는 인식부위 내부를 절단하고, class II 제한효소의 서브그룹인 class IIS 제한효소는 인식부위 외부에 아주 가까우며, 일정한 거리의 부위를 절단하는 효소이다. class III 제한효소는 class IIS와 유사하나, class II 제한효소에서는 제한효소 역가와 메틸화 반응 역가가 별도의 분자상에 존재하는 데 반해, class III 제한효소의 경우에는 한 분자 내에 다수도메인(multidomain)으로서 존재한다는 것이다. class II 제한효소와 class IIS 제한효소를 도식적으로 비교하면 아래와 같다.

[class II]

[class IIS]

즉, class IIS 제한효소의 절단에 의해 생성되는 말단의 염기서열은 임의로 조절하는 것이 가능하다. 본 발명자들은 이러한 성질을 이용하여 완전히 비대칭적이고 양끝이 서로 상보적인 접착성 말단(cohesive end)을 갖는 DNA 절편을 만든 뒤, T4 DNA 리가제를 처리하면 같은 방향성을 갖는 DNA 절편이 반복적으로 결합을 할 수 있어 클로닝된 DNA가 증폭된 효과를 얻을 수 있을 것으로 예상하였다.

이에, 본 발명자들은 제한효소에 의한 인식부위와 절단부위가 분리되어 있으며, 절단부위의 염기서열과는 전혀 무관하게 DNA를 절단시키는 class IIS의 제한효소를 이용하여 유전자를 안정적으로, 간편하게, 또한 유전자의 수를 무제한으로 증폭시킬 수 있는 플라스미드를 제작하고 이를 이용하여 목적유전자를 증폭시킬 수 있었다.

본 발명은 브레비박테리움 속의 미생물에서 곱제가 가능하고 내부에 class IIS 제한효소 절단부위가 2개 존재하고, 그 사이에 증폭시킬 유전자가 존재하며, class IIS 제한효소 절단에 의해 생성되는 양 말단의 염기서열이 동일해서 class IIS 제한효소 절단 및 재결합에 의해 유전자의 증폭이 가능한 재조합 플라스미드 벡터 pAMP46을 제공한다.

본 발명자들은 코리네형 글루타메이트 생산균의 숙주-벡터계의 개발을 위해 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13058 균주로부터 크립틱 플라스미드(cryptic plasmid)인 pCB 1을 분리한 뒤 에쉐리시아 속 균주의 클로닝 벡터(cloning vector)인 pACYC 177과 결합시켜 코리네박테리움과 에쉐리시아 속의 균주들에서 모두 형질전환 및 발현이 가능한 셔틀벡터인 pECCG 1을 제작하였으며, 이 pECCG 1로부터 엠피실린 내성 유전자 부분을 제거하고 플라스미드 pBluescript IIKS+의 다발성 절단부위(multi-cloning site)를 도입하여 코리네박테리움 속의 균주에서 안정하게 발현되는 셔틀벡터 pECCG 117을 제작하였다. 이의 제작과정을 문헌 Biotechnology letters vol 13, No. 10721-726(1991) 또는 대한민국 특허공고 제92-7401호에 자세히 기술되어 있다. 이 셔틀벡터 pECCG 117은 코리네박테리움 속 균주 뿐만 아니라 코리네형 글루타메이트 생산균의 일종인 브레비박테리움 속의 균주에서도 형질발현 및 안정성이 유지되기 때문에 브레비박테리움 속의 미생물에서 코리네형 글루타메이트 생산균으로부터 유래된 유전자를 증폭시키고 발현 시킬 수 있는 플라스미드 벡터를 제조하는 데 유리하게 이용할 수 있다.

증폭되는 DNA는 코리네형 글루타메이트 생산균으로부터 유래된 유전자를 포함한다. 본원에서는 데코이닌 내성을 갖는 브레비박테리움 암모니아게네스 균주로부터 클로닝된 5'-크산틸산 아미나제 유전자(guaA)를 예시적으로 성명한다. 이 유전자는 대한민국 특허출원 제 91-13227 호에 기재되어 있으며, 아래와 같은 반응기작을 가지고 있다:

본 발명은 본 발명에 따라 제조된 재조합 플라스미드 벡터 pAMP46에 브레비박테리움 암모니아게네스 균주로부터 클로닝된 5'-크산틸산 아미나제 유전자 한개를 도입한 재조합 플라스미드 pGX 1-1을 제공한다. 또한, 본 발명은 재조합 플라스미드 pGX1-1을 증폭시켜 유전자가 2 내지 5개를 함유한 재조합 플라스미드를 제공한다.

본 발명자들은 이들 플라스미드를 각각 pGX1-2, pGX1-3, pGX1-4 및 pGX1-5로 명명하였다 (각 명칭에서 마지막 숫자는 플라스미드에 함유된 유전자의 갯수를 나타낸다.)

또한, 본 발명은 상기한 재조합 플라스미드 pGX1-1, pGX1-2, pGX1-3, pGX1-4 또는 pGX1-5로 형질전환된 코리네형 글루타메이트 생산균을 제공한다.

또한 본 발명은 상기한 본 발명의 형질전환 미생물을 배양하고 배양액에 XMP를 첨가하여 반응시켜 XMP로부터 전환된 5'-구 아닐산(GMP)를 회수하여, GMP를 제조하는 방법을 제공한다.

XMP로부터 GMP로의 전환을 촉매하는 효소 5'-크산틸산 아미나제를 상당히 증가된 양으로 생성하는 본 발명에 따른 재조합 플라스미드를 갖는 형질 전환체의 배양은 공지의 방법에 의해 수행될 수 있다. 형질 전환체를 온도, PH 등을 조절하면서 호기성 조건하에 탄소원, 질소원, 무기화합물, 아미노산, 비타민, 및 기타 영양 요구물질 등을 함유한 통상의 배양배지에 배양하여 생성된 균체를 전환반응의 효소원으로 사용한다. 탄소원으로는 글루코오즈, 프럭토오즈, 슈크로오즈, 말토오즈, 만노오즈 및 당밀 등과 같은 각종 탄수화물, 피루브산, 푸마르산, 락트산 및 아세트산과 같은 각종 유기산이 사용될 수 있고, 질소원으로는 암모니아, 염화암모늄, 황산암모늄, 탄산암모늄 및 초산암모늄과 같은 각종 무기 및 유기암모늄염, 우레아 및 기타 질소 함유물질, 및 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 효모 추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물 탈지 대두 케이크, 또는 그의 분해 생성물 등이 사용될 수 있다. 무기 화합물로는 인산1수소칼륨, 인산2수소칼륨, 황산마그네슘, 염화나트륨, 황산철, 황산망간, 및 탄산칼슘 등이 사용될 수도 있으며, 이외에 필요에 따라 비타민, 아미노산 및 영양요구성 염기 등이 첨가될 수 있다. 배양은 호기적 조건하에, 예를 들면, 진탕배양 또는 통기교반 배양에 의해, 바람직하게는 20 내지 40의 온도에서 수행된다. 배지의 pH는 배양 동안 중성 근처에서 유지하는 것이 바람직하며 10 내지 50 시간 배양시킨 배양액 또는 원심분리하여 얻어진 균체를 전환반응의 효소원으로 사용한다. XMP의 GMP로의 전환방법은 효소 함유액에 XMP 용액 또는 XMP 발효약을 첨가하고 30 내지 50에서 암모니아수나 암모니아 가스로 pH를 7 내지 8로 조절하면서 24시간 내지 48시간 반응시키면 XMP가 GMP로 전환된다. 생성된 GMP는 공지의 방법에 따라 이온 교환수지 방법(예 Dowex 등)에 의해 회수한다.

하기의 실시예로 발명을 더욱 구체화한다. 그러나, 이들 실시예로 본 발명이 한정되는 것으로 이해되어서는 안된다. 본 발명에서 사용한 유전자 조작방법은 주로 분자 클로닝 실험 조작법(Molecular Cloning; A laboratory manual, 2nd ed., J. Sambrook, E. f., Fritch, T., Maniatis) 및 분자 클로닝 기술의 지표(Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, vol, 152, s.l., Berger, A.R. Kimme)등의 방법에 준하여 실시하였다.

[실시예 1]

유전자 증폭용 플라스미드 벡터 pAMP46제작

(1)Class IIS 제한효소 선정 및 pECCG117로부터 불필요한 제한효소 절단부위 제거

코리네형 클루타이메이트 생산균에 사용가능한 유전자 증폭용 플라스미드 제작을 위한 재료로서 이들 균주에서 복제가 가능한 에쉐리시아/크리네박테리움 셔틀벡터 pECCG117을 사용하였으며, 이 셔틀벡터 pECCG117(카나마이신내성, 5.8Kb)은 KFCC-10674 균주로부터 셔틀벡터 pECCG1을 분리하고 대한민국 특허공고 제 92-7401호에 기재된 방법에 따라 제조하였다. 증폭시킬 유전자로는 브레비박테리움 암모니아게네스속 미생물의 5'-크산틸산 아미나제 유전자를 사용하였다.

우선 셔틀벡터 및 5'-크산틸산 아미나제 유전자에 사용가능한 class IIS 제한효소절단부위를 조사하였다. 인식부위의 염기쌍 수가 5이하인 제한효소의 절단부위는 그의 존재확률이 높기 때문에 인식부위의 염기쌍의 수가 6인 제한효소 BbsI, BspMI, BpmI을 선정하여 절단시켜 본 결과 BbsI, BspMI, BpmI은 벡터 및 5'-크산틸산아미나제 유전자에 두 개 이상의 절단부위가 존재하여 사용이 불가함을 확인하였고, Bsal만이 벡터에 1개의 절단부위가 존재함을 확인하고 이를 사용하기 위하여 BsaI 절단부위 주위의 염기서열을 확인한 결과 다음과 같았다.:

즉, BsaI절단에 의해 한쪽 말단은 GCCA(A) 다른쪽 말단은 TGGC(B)로 서로 다른 말단을 형성함으로써 절단된 DNA 절편은 방향성을 갖게 됨으로써 T4 DNA 리가제로 반응시키면 (A)는 (A)말단과는 결합하지 못하고 (B)말단과만 결합할 수 있기 때문에 (A)와 (B)가 서로 반복적으로 결합하면 결과적으로 유전자가 희문구조 등의 불안정한 구조를 형성하기 않고 안정한 구조로서 반복적으로 결합함으로써 증폭되는 것이다. 이 부위의 염기서열을 그대로 이용하기로 하고, 셔틀벡터 pECCG117의 다발성 절단부위(pBluescript II KS)의 불필요한 제한효소 절단부위를 제거하기로 하였다. 제한효소 절단부위의 제거는 pECCG117을 XbaI과 KpnI 제한효소로 절단한 뒤, dNTP와 함께 T4 DNA 중합효소를 처리함으로써 말단을 블런트로 만들어 T4 DNA 리가제로 처리한 뒤, 브레비박테리움 암모니아게네스 ATCC6872균주에 형질전환함으로써 이루어 졌다. 결과로 얻어진 플라스미드는 pMOD 11 이라 명명하고 차후의 실험에 사용하였다. DNA 분리, 정제 및 절단, 변형 등은 각 효소의 제조회사에서 권장하는 대로 반응조건에 맞게 공지의 사실에 따라 수행하였다.

(2) DNA 합성 및 이의 도입에 의한 유전자 증폭용 플라스미드 벡터 pAMP46제작

상기 제작된 변형된 플라스미드 pMOD11의 BsaI 절단부위에 다음의 염기서열과 같은 2 가닥의 DNA를 합성하여 도입하였으며 이에 의한 유전자의 증폭원리를 도식하였다. 이때 같이 도입된 SalI, BamHI, XbaI, KpnI 절단부위는 증폭용 유전자의 도입을 위해 임의로 선정하였다.

벡터 pMOD11을 class IIS 제한효소 BsaI으로 절단하였을 때 생성되는 양쪽의 말단과 결합할 수 있도록 두가닥의 DNA를 각각 프라이머 1, 프라이머 2와 같이 합성하였으며, 중간에는 목적유전자 절편을 도입하기 위하여 SalI, BamHI, KpnI 효소절단부위들도 함께 도입하였다. DNA합성은 Applied Biosystems 사의 392 DNA/RNA 합성기를 사용하였다. 합성된 DNA의 정제는 55℃에서 12 내지 18시간 방치한 후 1/3 부피의 증류수를 첨가하고 동일부피의 n-부탄올로 암모니아를 3 내지 4회 추출하면서 농축시키고 나서 진공상태에서 원심분리하면서 건조시킨다. 여기에 적당량의 증류수를 첨가하여 흡광분석기(spectrophotometer)를 사용하여 파장 300 내지 200nm에서 스캐닝하면서 합성된 DNA를 정량한 후 최종적으로 두개의 합성 DNA의 농도를 동일하게 맞춘 후 동일량을 혼합하여 물중탕으로 100℃로 가열시킨 후에 천천히 냉각시킴으로써 두 DNA를 어닐링(annealing)시켰다. 합성된 DNA는 말단에 인산기를 갖고 있지 않기 때문에 T4 폴리뉴클레오타이드 키나제 반응에 의해 인산기를 도입시킨 후에, BamHI 절단 및 dNTP 존재하에서 T4 DNA 중합효소 처리한 pMOD11 플라스미드와 혼합하여 T4 DNA 리가제 처리한 후 브레비박테리움 암모니아게네스 ATCC6872균주를 형질전환시겼다. 이렇게 하여 얻어진 재조합 플라스미드를 pAMP46이라 명명하였으며, 이는 목적 유전자를 도입한 후 class IIS 제한효소 BsaI절단/T4 DNA리가제 처리에 의한 재결합으로 목적 유전자를 증폭시킬 수 있는 특성을 가지고 있다.

[실시예 2]

5'-크산틸산 아미나제 유전자의 도입 및 유전자 증폭

5'-크산틸산 아미나제 유전자를 갖고 있는 재조합 플라스미드 pGH16(KCCM 10008)의 염기서열을 바탕으로 제한효소 절단부위를 분석한 결과, HpaI과 SnaBI으로 절단하면 5'-크산틸산 아미나제의 코딩 부위를 포함하는 약 2kb 길이의 DNA절편을 생성함을 확인한 뒤 이들 두 효소로 절단하였다. 이때 사용한 제한효소완충액은 NEB(New England Biolabs)4번을 사용하여 37℃에서 1시간 반응시킨 뒤, 65℃에서 20분 처리하여 효소를 불활성화 시킨 후 0.8% 아가로오즈 젤(agarose gel)에서 전기영동하여 2kb 위치에 DNA 절편에 해당하는 띠(band)를 취한 후, BIO 101사 제품의 GENE CLEAN II Kit를 사용하여 DNA를 분리정제하여 목적 유전자원으로 사용하였다.

유전자 증폭용 폴라스미드 pAMP 46은 NEB에서 제공한 고유의 완충액(U) 존재하에서 BamHI 제한효소(polymerase)로 절단한 뒤, GENE CLEAN II kit로 분리 정제하고 나서 100μM의 dNTP존재하에서 T4 DNA 중합효소로 처리하여 양 말단을 블런트로 만들었다. 그리고 나서 카프 인테스틴 포스파타제(calf interstine phosphatase, CIP)을 사용하여 말단의 인산기를 제거하였으며, 이를 에탄올 침전에 의해 정제하여 크산틸산 아미나제 유전자와의 결합반응에 사용하였다. 제한효소 SnaBI과 HpaI에 의해 절단시킨 5'=크산틸산 아미나제 유전자와 BamHI 제한효소절단 후 T4 DNA 중합효소 처리 및 CIP 처리한 유전자 증폭용 플라스미드 pMAP 46을 몰비(molar ratio)로 약 2 내지 3대 1의 비율로 혼합한 뒤 1배의 완충액, 10μM ATP존재하에서 T4 DNA 리가제로 처리하여 15℃에서 16시간 반응시킨 뒤, 브레비박테리움 암모니아게네스 ATCC 6872균주에 전기적 충격법(electroporation)에 의해 형질전환시켰다. 이렇게 하여 얻어진 재조합 플라스미드는 pXG1-1이라 명명하였다.

유전자 증폭반응은 재조합 플라스미드 pXG1-1을 4번 NEB완충액 존재하에서 class IIS 제한효소인 BsaI로 55℃에서 1시간 처리하여 완전히 절단시킨 뒤, 페놀처리 및 에탄올 침전에 의해 정제하고 나서 T4 DNA 리가제로 처리한 뒤, 브레비박테리움 암모니아게네스 ATCC 6872균주에 전기적 충격법에 의해 형질전환시켰다. 형질전환주들로부터 재조합 플라스미드를 분리하여 크기별로 분류한 결과 목적유전자인 5'-크산틸산 아미나제 유전자를 2개 이상 갖는 것으로 보이는 플라스미드들을 분리, 정제하였다. 얻어진 재조합 플라스미드 각각을 제한효소로 절단하여 정확한 크기를 측정한 결과, 5'-크산틸산 아미나제 유전자의 수가 2개, 3개, 4개, 5개 존재하는 것을 확인하고 이들을 각각 pXG1-2, pXG1-3, pXG1-4, pXG1-5로 명명하였다.

[실시예 3]

브레비박테리움 형질전화주에서의 5'-크산틸산 아미나제 효소역가 분석

실시예 2에서 얻어진 재조합 플라스미드들을 갖는 형질전환체들로부터 통상의 방법에 의해 플라스미드 DNA를 분리하여 브레비박테리움 암모니아게네스 변이주 BA 17-2(5'-크산틸산 아미나제 강화변이주) 및 브레비박테리움 암모니아게네스 변이주 D-1550-40 (아데닌 및 구아닌 요구주)들에 형질 전환시켜 형질 전환체들의 5'-크산틸산 아미나제의 효소 활성을 측정하였다. 효소액을 얻기 위하여 형질 전환체들을 C배지(필요한 경우 가나마이신을 50㎍/ml되게 첨가하고, 아데닌, 구아닌을 소량 첨가)에서 대수증식기까지 키운 후 원심분리하여 균체를 회수하고 적당량의 0.1M 트리스완충액(pH 7.3)에 현탁하여 초음파 균체분쇄기(ultrasonicator)로 균체를 분쇄한 뒤 원심분리하여 얻어진 상등액을 효소액으로 사용하였다. 이렇게 하여 얻어진 효소액의 적당량을 2.4ml의 5'-크산틸산 아미나제 반응액(0.16M 트리스(pH7.6), 4mM ATP, 16mM 염화마그네슘, 25mM XMP, 0.33 M 황산암모늄)에 첨가하여 35 내지 50℃에서 30분 내지 1시간 반응시킨 뒤, 30ml의 3.5% 트리클로로아세트산을 첨가하고 원심분리하여 상등액의 흡광도를 290ml에서 측정하였다. 플라스미드 내에 존재하는 5'-크산틸산 아미나제 유전자의 수가 증가할수록 5'-크산틸산 아미나제 효소역가가 증가함을 확인할 수 있었다.

하기 표 2에 기록된 결과로부터 D 1550-40 균주에서는 5'-크산틸산 아미나제의 역가가 나타나지 않는데 반해 형질 전환주 D 1550-40/pGH 16에서 5'-크산틸산 아미나제의 역가가 발현됨을 볼 수 있었으며, 형질전환주 ATCC6872/pGH 16 및 BA 17-2/pGH 16의 경우에는 모 균주에 비해 현저히 증가된 5'-크산틸산 아미나제의 특이적 효소 활성(specific enzyme activity)을 나타냈음을 알 수 있다.

* 효소활성의 단위(U)는 반응 후 단위 시간당 290nm에서의 흡광도의 증가로써 표시하였다.

[실시예 4]

형질전환주에 의한 XMP의 GMP로의 전환반응

C 배지를 종 배양배지로 하여 500ml의 진탕용 삼각 플라스크에 30ml씩 분주하고 115℃에서 15분간 가압 살균하여 형질전환주 BA 17-2/pGX1-3균을 1 백금이 식균한 후 30℃에서 24시간 배양하여 종균액으로 사용하였다. 또한 발효배지 1.5L(글루코오즈 100g/L, 인산 제1, 2 수소칼륨 각 10g/L, 황산마그네슘 10g/L, 염화칼슘 0.1g/L, 황산철 10㎎/L, 황산망간 2mg/L, 효모추출물 10g/L, 카세인 가수분해물 10g/L, d-비오틴 30㎍/L, 아데닌 10㎎/L, pH 8.5)를 5L 발효조에 넣고 120℃에서 30분간 가압 살균한 후 종 배양액을 2% 용량으로 식균하여 30℃, pH 7.0으로 3일간 배양하였다. 이때 회전속도는 750rpm, 공기 첨가속도는 1vvm으로 하였다.

배양이 완료된 효소균체 함유액에 XMP를 최종농도 20㎎/ml되게 첨가하고 35 내지 50℃에서 pH를 7.0 내지 8.0으로 유지시키면서 24시간 반응시켰으며 이때 대조군으로 모균주 BA 17-2/pGH16 균주를 병행하여 실시하였다. 전환 반응의 시작은 적당량의 계면활성제(SDS, Hyamine 등)를 첨가함으로써 시작하였다. 반응중 경시적인 GMP의 전환율은 표 4에 게재하였으며, 표 4에서 볼 수 있듯이 전환 반응의 속도는 약 3배 증가하였다.

Claims (8)

1. 브레비박테리움 속 미생물에서 코리네형 글루타메이트 생산균으로 부터 유래된 유전자를 증폭할 수 있는 재조합 플라스미드 벡터 pAMP46.
2. 제1항에 있어서, 코리네형 글루타메이트 생산균으로부터 유래된 유전자가 브레비박테리움 플라붐(Brevibacterium flavum). 브레비박테리움 락토퍼멘텀(Brevibacterium lactofermentum), 브레비박테리움 암모니아게네스(Brevibacterium ammoniagenes) 또는 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)으로부터 유래된 유전자인 벡터.
3. 제2항에 있어서, 유전자가 브레비박테리움 암모니아게네스로부터 유래된 5'-크산틸산 아미나제 유전자인 벡터.
4. 브레빅테리움 암모니아게네스로부터 클로닝된 5'-크산틸산 아미나제 유전자 1개 이상이 제1항에 따른 벡터에 도입된 재조합 플라스미드.
5. 제4항에 있어서, 유전자가 2 내지 5개인 플라스미드.
6. 제4항에 따른 플라스미드로 형질전환된 코리네형 글루타메이트 생산균주.
7. 제6항에 있어서, 숙주가 브레비박테리움 플라붐, 브레비박테리움 락토퍼멘텀 또는 브레비박테리움 암모니아게네스인 균주.
8. 제7항에 따른 형질전환체의 배양액과 XMP를 반응시켜 GMP를 제조하는 방법.