KR100463983B1 - 유전자 재조합 미생물에 의한 5'-구아닐산의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 브레비박테리움 (Brevibacterium) 속 미생물 내에서 균체내 ATP-재생계를 활성화시키기 위해 글루타메이트 생산균으로부터 유도된 유전자를 유전공학적 조작에 의해 작제한 재조합 플라스미드를 사용하여 5'-구아닐산의 생산 수율을 증대시키는 방법 및 이에 사용되는 숙주-벡터계에 관한 것이다.

Description

유전자 재조합 미생물에 의한 5'-구아닐산의 제조방법

본 발명은 코리네형 글루타메이트 생산균 (예, 브레비박테리움 플라붐(Brevibacterium flavum), 브레비박테리움 락토퍼멘텀 (Brevibacterium lactofermetum), 브레비박테리움 암모니아게네스(Brevibacterium ammoniagenes), 또는 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) 내에서 복제 가능한 신규한 재조합 플라스미드 벡터, 이 벡터로 형질전환된 코리네형 글루타메이트 생산 균주 및 이들을 사용한 5'-구아닐산(이하, 'GMP'라고 함)의 제조 방법에 관한 것이다.

GMP는 모노소디움 글루타메이트 (MSG) 및 5'-이노신산 (IMP)과 더불어 조미료로서 직접 이용되고 있고 조미 식품의 식품 첨가제로서 많은 양이 요구되고 있어 식품 공업 분야에서 중요한 품목 중의 하나이다.

지금까지 알려진 GMP의 제조 방법으로서는 (1) 효모 세포로부터 추출한 리보핵산을 효소학적으로 분해하는 방법, (2) 미생물 발효법으로 생산한 구아노신을 화학적으로 인산화시키는 방법, 및 (3) 미생물 발효법으로 생산한 5'-크산틸산(XMP)을 미생물을 이용하여 GMP로 전환시키는 방법(J. Ferment. Technol. Vol. 62, No. 2, pp. 131-137), (4) 미생물 발효법에 의한 GMP의 직접 생산법 등이 있는데, 그 중 (4)의 방법은 GMP의 세포막 투과성이 매우 낮아 공업적 이용이 불가능하며, (3)의 방법이 현재 경제적으로 생산 비용이 저렴하여 공업적으로 가장 널리 이용되고 있다.

(3)의 방법과 같이 효소 균체를 이용하여 XMP로 부터 GMP를 제조하는 방법에는 XMP 아미나제(XMP aminase)라는 효소가 관여하며 이의 효소학적 반응 메카니즘은 다음의 반응식과 같이 나타낼 수 있다.

[반응식 1]

XMP 아미나제 효소 활성을 강화시키기 위한 방법으로는 이 효소의 특이적 저해물질인 테코이닌에 대한 내성을 미생물에 부여하거나(Biotechnol. Bioengineer. Vol. 13, 229-240, 1971, Vol. 16, 795-803, 1973, 대한민국 특허 출원 제87-5453), XMP 아미나제를 코딩하는 유전자(guaA)를 함유하는 DNA 단편 및 벡터 DNA로 이루어진 재조합 DNA로 형질전환된 형질전환체를 이용하는 방법(일본국 공개 특허 공보 제85-224498호) 등이 알려져 있다.

또한 상기 (3)의 방법에 사용되는 또다른 기질인 ATP는 값이 비싸므로 ATP의 첨가를 수반하는 방법에 있어서 효소학적 반응을 이용하여 GMP를 생산할 수 있는 경제적인 공정의 개발이 요구되어 왔으며, GMP 합성 반응계와 5'-아데닐산 (AMP)를 재생하는 반응계를 병행시켜 ATP를 반복적으로 생산함으로써 반응 공정에 ATP를 첨가할 필요가 없게 되었다. 즉, ATP 재생용 기질인 아데닌(adenine)을 배지 중에 공급하면, 아데닌이 균체내로 들어가 생체 내 대사 물질 중의 하나인 PRPP (5'-phosphoribosy1-1'-pyrophosphate)로부터 리보실-인산기를 전달받아 AMP로 전환된 후, 생성된 AMP로부터 ATP를 재생하는 반응계 (이하, 'ATP-재생계'라 칭함)와 XMP, 암모니아 및(또는) 글루타민, 및 ATP로부터 GMP를 생성하는 반응계(이하, '전환 반응계'라 칭함)를 조합시킨 공역 반응을 이용하여 XMP로부터 GMP를 효소학적으로 생산하는 반응을 수행할 수 있다. 상기 공역 반응에서 이용하는 ATP-재생계로서는 비용이 저렴한 기질을 이용하여 ATP를 재생시킬 수 있는 반응계가 적당하다. 그 중에서도 글루코오스와 같은 당류 또는 기타 다른 탄수화물을 균체내에서 이용하는 계가 GMP를 생산하는 데에 있어서 경제적일 수 있다.

이러한 관점에서 코리네형 미생물 또는 대장균을 이용하는 방법들이 개발되었다(일본국 공개 특허 공보 제85-224498호). 이 방법에 있어서는, 2 가지 반응계에서 필요로 하는 활성, 즉 XMP를 GMP로 전환시키는 활성 및 ATP를 재생하는 활성이 동일한 1 종의 미생물에 의존되는 경우와 단일 활성을 갖는 2 종의 미생물을 이용하는 방법으로 대별될 수 있다. 2가지활성에 대한 효소원으로써 2 가지 활성을 동시에 갖는 1종의 미생물을 이용하는 방법이 단일 활성을 갖는 2종의 미생물을 이용하는 방법에 비해 반응계가 보다 간단하다는 이점이 있다. 그러나, 반응계를 구성하는 2가지 활성을 각기 분리시켜 독립적으로 조절할 수 없을 경우에 있어서는 2가지 활성들 간의 균형을 최적 수준으로 조절하는 생산성을 최대화시키기가 어렵다는 문제점이 있다.

상술한 문제점 이외에도, 종래의 문헌들에 기술되어 있는 방법들은 아직도 보다 더 개선되어야 할 문제점들을 갖고 있다. 즉, 종래의 방법에 있어서, XMP 아미나제 활성의 증가에 따라 미생물의 양을 감소시킬 경우 ATP-재생 활성이 제한 단계(limiting step)가 된다. 따라서, ATP-재생활성의 결손을 보강하여 GMP의 생산성을 향상시키기 위해서는 ATP 재생에 관여하는 미생물들을 상대적으로 다량사용해야 한다는 문제점이 있다.

대장균을 사용할 경우, 현저하게 증가된 XMP 아미나제 활성을 갖는 균주를 유전자 재조합 기술로 수득하여 활용할 수 있다. 그 결과, GMP 생산성이 두드러지게 증가되었다 (일본국 공개 특허 공보 제85-224498호). 그러나, 이 방법은 ATP-재생 활성이 또한 제한 단계로서도 작용하므로 비교적 다량의 미생물을 필요로 하는 문제점을 여전히 수반하고 있다.

또한, 공업적인 XMP 생산균들은 구아닌-요구성의 특성을 가지며, 퓨린 뉴클레오티드 생합성 반응에 관여하는 XMP 대사효소인 XMP 아미나제가 결여되어 있으나, 그들의 ATP-재생활성은 일반적으로 강하다. XMP로부터 GMP로 반응계를 전환시키는 데 있어서의 ATP-재생계로서 XMP 생산 미생물의 강력한 ATP-재생활성을 활용하고자 하는 노력이 있어 왔다. 즉, XMP 생산균의 폐기 세포들을 ATP-재생활성을 갖는 효소원으로 활용하고, 또한 ATP 재생계 및 전환 반응계의 2 가지 활성을 분리하여 GMP를 생산하는 방법이 알려져 있다(Biosci. Biotech. Biochem. Vol. 61(5), 840-845, 1997). 그러나, 전술한 바대로 2 가지 활성들(ATP-재생계, 전환반응계) 간의 균형을 최적 수준으로 조절하여 생산성을 최대화시키기가 어렵다는 문제점을 여전히 수반하고 있다.

본 발명은 상기한 바와 같은 종래 기술의 문제점을 고려하여 상기의 ATP 생성 반응의 각 단계를 촉매하는 효소를 코딩하는 유전자들을 본 발명자들이 개발한 바 있는 특정의 벡터계에 도입시켜 APT 재생 능력을 향상시킨 숙주-벡터계를 제공하고 이러한 미생물계를 이용하여 5'-구아닐산을 제조하는 방법을 제공하는데 그 목적이 있다.

GMP 생산에 있어서 중요한 요인들로서는 ① 우선 고농도 XMP를 생산할 수 있는 XMP 생산 균주가 개발되어야 하고 ② 또한 XMP 발효 공정이 공업화되어야 한다. 그 다음 단계로서 ③ XMP에서 GMP로 전환되는 강력한 효소를 소유하는 미생물의 개발과 ④ 그 전환 공정의 공업화 과정이 GMP 제조에 있어서 가장 중요하다. 특히 후자의 단계에서 XMP에서 GMP로의 강력한 전환 효소 균주와 전환 효소 균주의 APT(adenosine 5'-phosphate)-재생 능력은 GMP 생산에 있어서 특히 중요하다.

본 발명자들은 XMP 아미나제를 코딩하는 guaA 유전자를 포함하는 DNA 단편으로 형질전환된 미생물을 효소원 및 ATP 공급원으로 사용하는 즉, 2 가지 활성에 대한 효소원으로써 2 가지 활성을 동시에 갖는 1 종의 미생물을 이용하는 방법의 제한 단계라 할 수 있는 ATP-재생 단계의 문제점을 해결하고자 예의 연구하였다. 특히, 본 발명자들은 상기의 ATP 생성 반응의 각 단계를 촉매하는 효소를 코딩하는 유전자들 중에서 대장균 혹은 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) 균주의 prs (PPRP synthase), apt (adenine phosphoribosyl transferase), adk (adenylate kinase), pyk (pyruvate kinase)의 염기 서열들을 Genebank Database (NCBI; National center for biotechnology Information)를 검색하여 찾아낸 뒤, 이들 대장균 (E. coli) 혹은 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) 균주의 염색체 DNA를 주형으로 하여 PCR 방법에 의해 DNA 절편을 획득한 뒤, 이들 DNA 단편들을 각각 본 발명자들이 개발한 바 있는 guaA 유전자 함유 플라스미드 pGX1-2(대한민국 특허출원 공개 제97-43051호)에 도입하였다. 이와 같이 제작된 재조합 플라스미드들에 형질전환된 형질전환체를 이용하여, GMP 전환반응을 수행한 결과, prs 유전자를 함유한 재조합 플라스미드에 의해 형질전환된 형질전환체를 이용한 경우에 균체의 ATP-재생 능력의 향상되어 GMP 전환반응이 월등히 개선됨을 확인하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

ATP-재생을 위하여 외부로부터 공급되는 아데닌으로부터 ATP가 생성되기까지의 단계별 진행도를 아래의 반응식과 같이 정의할 수 있다.

[반응식 2]

즉, 외부로부터 배지 성분으로 공급되는 아데닌이 PRPP로부터 리보오스-인산기를 전달받아 AMP가 형성되고, 이렇게 생성된 AMP는 아데닐레이트 키나아제(adenylate kinase)에 의해 ATP로부터 인산기를 전달받아 ADP로 전환된다. ADP는 생체내에 존재하는 고에너지 인산 화합물들(acetyl-phosphate, phosphoeno pyruvate 등)으로부터 인산기를 전달받아 최종적으로 ATP가 생성된다. 이 때, 아데노신에 리보오스-인산기를 전달하는 PRPP는 PRPP 신타아제(syntase)라는 효소에 의해 생성되며, 퓨린 뉴클레오티드 대사 과정 이외에도 아미노산 생합성, 피리미딘 대사 등에 관여하는 생체 내에서 기능적으로 매우 중요한 중간 산물이다.

본 발명에 이용된 대장균 유래의 prs 유전자는 Genebank database에 M13714의 등록번호로 등록되어 있으며, 그의 염기 서열은 서열 번호 1에 나타낸 바와 같고, 그 유전자에 의해 코딩되는 PRPP 합성효소(synthase) 효소는 ribose-1'-phosphate와 ATP(adenosine 5'-triphosphate)로부터 퓨린 뉴클레오티드 생합성의 전구 물질인 PRPP를 생성시키는 반응을 촉매한다.

prs-함유 유전자 서열로부터 prs 유전자를 클로닝하기 위하여 아래의 2 가지 프라이머(서열 번호 2 및 서열 번호3)를 제작하였으며, 이들 프라이머 서열들과 대장균(E. coli W3110)의 염색체 DNA를 주형으로 사용하여 PCR 반응을 수행하였다.

얻어진 DNA 단편을 본 발명자들이 개발한 바 있는 2 복제수(copy)의 guaA 유전자 함유 재조합 플라스미드 pGX1-2(대한민국 특허출원 공개 제97-43051호)에 도입한다. 이렇게 하여 제작된 재조합 플라스미드인 pMPSE82에 의해 형질전환된 형질전환주를 이용하여, GMP 전환반응을 수행하면 GMP의 전환효율이 증가된다.

본 발명자들은 코리네박테리움 글루타메이트 생산균의 숙주-벡터계의 개발을 위해 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) 균주 ATCC13058 균주로부터 크립틱 플라스미드인 pCG1을 분리한 뒤, 대장균의 클로닝 벡터인 pACYC177과 결합시켜 코리네박테리움과 대장균들에서 모두 형질전환 및 발현이 가능한 셔틀벡터인 pECCG1을 개발하였으며, 이 벡터로부터 앰피실린 내성 유전자 부분을 제거하고 플라스미드 pBluescript Ⅱ KS+의 다발성 절단부위(multiple cloning site)를 도입하여 코리네박테리움 속의 균주에서 안정하게 발현되는 셔틀 벡터 pECCG117을 개발하였다(대한민국 특허 공고 제92-7401호 참조). 이 셔틀 벡터 pECCG117은 코리네박테리움 속 균주 뿐만 아니라 코리네형 글루타메이트 생산 균주의 일종인 브레비박테리움 속의 균주에서도 형질발현 및 안정성이 유지되기 때문에 브레비박테리움 속의 미생물에서 목적 유전자를 발현시킬 수 있는 벡터를 제조하는데 유리하게 이용될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 XMP 생산균의 예로서는 브레비박테리움 암모니아게네스(Brevibacterium ammoniagenes) D1550-40 (대한민국 특허 공고 제78-344호)과 그의 변이주들이며, 이들 미생물들을 통상적인 배양 방법으로 배양함으로써 상당량의 XMP를 배지 중에 축적시킬 수 있다.

즉, 상술한 미생물들을 적당한 탄소원, 질소원, 무기물질, 아미노산, 비타민 등을 함유하는 통상의 배지 내에서 호기성 조건하에서 온도, pH 등을 조절하면서 배양한다.

탄소원으로서는 글루코오스, 프락토오스, 수크로오스, 말토오스 등과 같은 탄수화물, 만니톨 소르비톨, 글리세롤 등과 같은 각종 유기산 및 글루타민산, 메치오닌, 라이신 등과 같은 각종 아미노산을 사용할 수 있다. 나아가, 전분 가수 분해물, 당밀, 옥수수 침지액 등과 같은 천연 유기 영양원들을 사용할 수도 있다. 사용가능한 질소원으로는 암모니아, 염화 암모늄, 황산 암모늄, 탄산 암모늄, 아세트산 암모늄 등과 같은 각종 무기 및 유기 암모늄염, 글루타민산, 글루타민, 메치오닌 등과 같은 아미노산, 및 펩톤, N2-아민, 옥수수 침지액, 고기 추출물, 카세인 가수분해물 등과 같은 질소함유 유기물질 등을 들 수 있다. 또한 무기물질로서, 인산이수소칼륨, 인산 일수소나트륨, 황산 마그네슘, 염화나트륨, 염화칼슘, 염화철, 황산구리, 염화망간, 몰리브덴산 암모늄, 황산아연 등을 필요에 따라 배지에 첨가할 수 있고, 필요하다면, 미생물 성장에 필요한 비타민류, 아미노산, 핵산 등을 배지에 첨가할 수 있다. 물론, 이들이 상술한 다른 배지 성분으로서 공급된다면, 이들 특정 영양소들을 따로 첨가할 필요는 없다.

일반적으로 배양은 호기성 조건하에, 예를 들면, 진탕 또는 통기 조건하에 교반하여 수행한다. 바람직한 배양 온도는 일반적으로 25-35 ℃이고 배지의 pH는 배양동안 중성 부근에서 유지하는 것이 바람직하다. 배양 시간은 통상적으로 10 - 120 시간이 바람직하다.

배양 결과 얻어진 XMP 발효액을 약하게 살균 처리 (예, 80 ℃, 5분)를 하여, XMP 균체를 불활성화시킨 후에 XMP 아미나제 활성을 갖는 미생물들을 배양시킨다.

본 발명에 이용가능한 XMP -> GMP 전환균주로서는 XMP, 암모니아 및(또는) 글루타민 및 ATP로부터 GMP를 생성하는 XMP 아미나제 활성을 갖는 임의의 모든 미생물이 가능하다. 이러한 전환균주의 적당한 예로서는 상기 제작된 재조합 플라스미드에 의해 형질전환이 가능한 대장균과 코리네형 미생물이 가능하며, 구체적인 예로는 브레비박테리움 암모니아게네스(Brebibacterium ammomiagenes) ATCC6872, 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum) ATCC13059, 대장균(E. coli.) 등이 사용가능하다. 이들 균주들 외에도 약물-내성 변이와 같은 통상적인 인공 변이법을 이용하여, XMP 아미나아제 활성을 증가시킨 이들 균주들의 변이주들도 이용할 수 있다.

상술한 미생물들을 적당한 탄소원, 적당한 질소원, 무기물질, 아미노산, 비타민 등을 함유하는 통상의 배지 내에서 호기성 조건하에 온도, pH 등을 조정하여 배양한다.

상기 배지에 사용되는 탄소원으로서는 글루코오스, 프락토오스, 수크로오스, 말토오스 등과 같은 탄수화물, 만니톨 소르비톨, 글리세롤 등과 같은 각종 유기산 및 글루타민산, 메치오닌, 라이신 등과 같은 각종 아미노산을 사용할 수 있다. 나아가, 전분 가수 분해물, 당밀, 옥수수 침지액 등과 같은 천연 유기 영양원들을 사용할 수도 있다. 사용가능한 질소원으로는 암모니아, 염화 암모늄, 황산 암모늄, 탄산 암모늄, 아세트산 암모늄 등과 같은 각종 무기 및 유기 암모늄염, 글루타민산, 글루타민, 메치오닌 등과 같은 아미노산, 및 펩톤, N2-아민, 옥수수 침지액, 고기 추출물, 카세인 가수분해물 등과 같은 질소함유 유기 물질 등을 들 수 있다. 또한 무기물질로서, 인산이수소칼륨, 인산 일수소나트륨, 황산 마그네슘, 염화나트륨, 염화칼슘, 염화철, 황산구리, 염화망간, 몰리브덴산 암모늄, 황산아연 등을 필요에 따라 배지에 첨가할 수 있고, 필요하다면, 미생물 성장에 필요한 비타민류, 아미노산, 핵산 등을 배지에 첨가할 수 있다. 물론, 이들이 상술한 다른 배지 성분으로서 공급된다면, 이들 특정 영양소들을 따로이 첨가할 필요는 없다.

일반적으로 배양은 호기성 조건하에, 예를 들면, 진탕 도는 통기 조건하에 교반하여 수행한다. 바람직한 배양 온도는 일반적으로 25-35 ℃이고 배지의 pH는 배양동안 중성 부근에서 유지하는 것이 바람직하다. 배양 시간은 통상적으로 10 - 120 시간이다.

수득된 전환균체를 함유하는 XMP 발효액에 암모니아 및(또는) 글루타민 및 인산염 이온, 마그네슘이온 및 계면활성제 및(또는) 유기 용매를 pH 7-8로 조절하고, 온도를 30 - 50℃로 유지시키면서 1 - 48 시간 동안 필요에 따라 첨가시킴으로써 수행한다.

ATP-재생 기질로서는 XMP 생산균이 이용할 수 있는 한, 글루코오스, 아라비노오스, 락토오스, 말토오스, 수크로스, 만니톨, 소르비톨, 트레할로스, 전분 가수분해물과 같은 탄수화물, 피루브산, 락트산, 아세트산, 2-케토글루타르산 등과 같은 유기산, 글리신, 알라닌, 아스파라긴산, 글루타민산 등과 같은 아미노산 모두를 사용할 수 있다. 또한, 아세틸 인산, 카르바밀 인산, 크레아틴 인산 등의 나트륨 또는 칼륨염과 같은 인산화 화합물을 사용할 수도 있다.

계면활성제로서는 양이온계 계면활성제, 음이온계 계면활성제, 및 양성 계면활성제 등을 사용할 수 있으며, 이들은 통상적으로 1 - 20 ㎎/㎖의 농도로 사용하는 것이 좋다.

XMP의 GMP로의 전환 반응 동안, 인산염 이온 및 마그네슘 이온의 농도를 4 - 400 mM의 범위 이내로 유지시키는 것이 적당하다. 배지 또는 균체에 의해 전환계 내에 제공되는 이들 이온의 함량이 상술한 농도 이내에 부합될 경우, 이들 이온을 전환계에 첨가할 필요가 없는 반면, 이들 이온의 함량이 부족할 경우에는 상술한 농노 범위 이내가 되도록 이들 이온을 첨가해야 한다. 상기 인산염 이온으로서는 인산의 나트륨염, 칼륨염, 마그네슘염 등과 같은 임의의 염을 사용할 수가 있고, 마그네슘 염으로서는 임의의 무기 및 유기염들을 사용할 수 있다. 암모니아 및(또는) 글루타민 원으로서는 임의의 암모니아 가스, 각종 무기 및 유기 암모늄염, 글루타민 및 효모 추출물, 카사미노산, 옥수수 침지액 등과 같은 글루타민 함유 천연물을 사용할 수 있다.

배양물로부터 GMP의 회수는 통상적인 방법에 따라 활성 탄소, 이온교환 수지 등을 사용하여 수행할 수 있다.

<실시예>

하기에 실시예 및 비교예 의해 본 발명을 더욱 상세히 설명하지만, 본원 발명의 범위가 이들로 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1>

ATP-재생계 관여 효소의 선정 및 클로닝

(1) ATP-재생계 관여 효소의 선정

배지 중에 공급되는 아데닌으로부터 ATP가 만들어지기 위해서는 균체내에서 상기한 바의 반응도 2에서와 같이 PRPP로부터 리보실-인산기를 전달받아 AMP가 만들어진 후에 이 AMP가 ATP로 부터 인산기를 전달 받아 ADP로 전환되고, 생체 내 다른 고에너지 화합물들 (예, acetyl phosphate, phosphophenol pyruvate 등)로부터 고에너지 인산기를 전달받아 ATP로 전환된다. 이러한 일련의 ATP 생성 경로의 각 단계를 촉매하는 효소를 코딩하는 유전자들, 즉 PRPP의 합성을 촉매하는 prs(PRPP) 유전자와 PRPP로부터 아데닌으로 리보실-인산기를 전달하는 apt(adenosine phosphoribosyl transferase) 유전자, AMP로부터 ADP를 형성하는 adk(adenosyl kinase) 유전자, substrate-level 인산화 단계를 위해서는 탄소 대사의 가장 중요한 해당작용 경로에서 ATP를 생산하는 pyk(pyruvate kinase) 유전자 등의 염기 서열을 Genebank databse에서 검색한 결과, prs, adk, apt 유전자는 대장균에서 그 서열들이 보고되어 있으며, 코리네형 미생물로부터는 그에 관한 보고가 없다. 따라서, 대장균의 유전자를 클로닝하였으며, pyk 유전자는 대장균과 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacteriumglutamicum) 균주로부터 클로닝 및 염기 서열이 보고되어 있어서 코리네박테리움 글루타미쿰 균주로부터 클로닝하였다. 클로닝은 다음과 같이 수행하였다.

코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) 균주 ATCC13032를 32℃의 온도에서 LB 배지(1% 트립톤, 0.5% 효모 추출물, 1% 염화나트륨)에서 16시간 동안 진탕 배양한 후, 원심분리에 의해 균체를 회수하였다. 여기에 10 ㎖의 1mM 트리스 완충액(pH 8.0)으로 세척한 뒤, 40 ㎖의 라이소자임 반응 완충액(10 mM 트리스, 5 mM 염화나트륨, 1mM 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA), 0.5M 수크로오스, 10 ㎎/㎖ 라이소자임, pH 8.0)에 현탁시킨 뒤, 37℃에서 90분 간 처리하였다. 이 세포를 원심분리로 회수하고, 10 ㎖의 수크로오스와 라이소자임이 배제된 동일한 용액에 재현탁시키고, 0.5M EDTA를0.6 ㎖, 4% SDS를 4.4㎖ 넣어 세포를 분해시켰다. 여기에 염화세슘을 ㎖ 당 1g씩 처리하고 2 ㎖의 에티듐 브로마이드 농축액 (10 ㎎/㎖)을 섞어주고, 이 혼합액을 초고속원심분리기를 사용하여 16℃에서 50,000rpm으로 48시간 동안 원심분리시킨 뒤, 주사기를 사용하여 염색체 DNA를 취하였다. 이를 이소프로필 알코올로 3-4회 처리하여 에티듐 브로마이드를 제거한 후, TE완충액(10mM 트리스, 1mM EDTA, pH 8.0)에서 투석하여 염색체 DNA를 분리, 정제하였다.

대장균(Escherichia coli) K-12의 염색체 DNA도 상기와 동일한 방법을 사용하여 도 1에 나타낸 바의 공정도에 따라 분리, 정제하였다.

(2) ATP-재생 관련 유전자의 클로닝

ATP-재생 경로와 관련이 있는 효소의 유전자를 클로닝하기 위하여 우선 유전자의 염기 서열을 확보하고자 Genebank database를 검색하였다. 그 결과, 대장균의 adk 유전자는 x03038, 대장균의 prs 유전자는 M13174, 대장균의 apt 유전자는 M38777, 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) 균주의 pyk 유전자는 L27126의 수탁번호로 염기 서열이 등록되어 있음을 확인할 수 있었다. 각각의 염기 서열들 내에서 구조 유전자 전부와 구조 유전자 상부(upstream)의 프로모터 서열이 포함될 수 있도록 프라이머 DNA들(서열 번호 2 및 3)를 제작한 뒤, 이렇게 하여 제작된 프라이머들과 대장균 또는 코리네박테리움 글루타미쿰 균주의 염색체 DNA를 주형 DNA로 사용하는 PCR 반응을 수행하였다. 이때, 사용한 고온성 DNA 중합 효소는 Vent DNA 폴리머라제(미국 NEB, New England Biolab사로부터 시판됨) 혹은 Pfu DNA 폴리머라제(독일 Boehringer Mannheim사로부터 입수)를 사용하였으며, 반응 조건은 분자클로닝 실험 조작법(Molecular Cloning; Alaboratory manual, 2nd ed,. Sambrrok,J., E.F. Frisch, and T. Maniatis)의 방법에 준하여 실시하였다.

이렇게 하여 얻어진 DNA 단편들을 각각의 대장균의 클로닝 벡터인 pUC18의 SmaI 절단체 DNA와 혼합하여 T4 DNA 리가아제로 처리한 뒤, 대장균에 형질전환시켰다. 그 결과 얻어진 재조합 플라스미드들의 도입 DNA(insert DNA) 각각의 제한 효소절단 지도(restriction map)의 확인에 의해 DNA 단편이 올바른 것인지를 확인하고 또한 DNA 단편의 방향성도 확인하였다. 이렇게 하여 학인된 각각의 도입 DNA 단편들을 제한 효소 BamHI과 KpnI로 절단하여 분리한 뒤, 이 분리된 DNA 단편들을 각각 대한민국 특허출원 공개 제97-43051호(그 전체 내용을 본 명세서에 참조로서 도입함)에 기재된 방법에 따라 제작한 2 복제수(copy)의 guaA 유전자 함유 재조합 플라스미드 pGX1-2를 제한 효소 BamHI과 KpnI로 절단한 혼합체와 혼합하고 T4 DNA 리가아제로 처리한 뒤, 대장균에 형질전환시켰다. 그 결과 얻어진 재조합 플라스미드의 명칭을 pMADE8 (대장균의 adk 유전자 함유), pMAPE18(대장균의 apt 유전자 함유), pMPKC38(코리네박테리움의 pyk 유전자 함유), 및 pMPSE82 (대장균의 prs 유전자 함유)로 각각 명명하였다.

<실시예 2>

브레비박테리움 형질전환 균주에 의한 XMP의 GMP로의 전환 반응

실시예 1에서 얻어진 재조합 플라스미드들을 함유하는 형질전환체들로부터 통상의 방법에 의해 플라스미드 DNA를 분리하여 브레비박테리움 암모니아게네스 변이주 BA 17-2(XMP 아미나아제 강화 변이주, 대한 민국 특허 공고 제78-344호 참조)에 형질전환시켜 얻어진 형질전환체들을 이용하여 XMP의 GMP로의 전환 반응을 수행하였다. C 배지를 종배양 배지로 하여 500 ㎖의 진탕용 삼각 플라스크에 30 ㎖ 씩 분주하고 115 ℃에서 15 분간 가압 살균하여 형질전환주 BA17-2/pMADE8, BA17-2/pMAPE18, BA17-2/pMPKC38, 및 BA17-2/ pMPSE82 균들을 1 백금이씩 식균한 후 30 ℃에서 24시간 동안 배양하여 종균액으로 사용하였다. 또한 발효 배지 1.5ℓ (글루코오스 100 g/ℓ, 인산 제1,2 수소칼륨 각 10g/ℓ, 황산 마그네슘 10 g/ℓ, 염화칼슘 0.1 g/ℓ, 황산철 10 ㎎/ℓ, 황산망간 2 ㎎/ℓ, 효모 추출물 10 g/ℓ, 카세인 가수분해물 10 g/ℓ, d-비오틴 30㎍/ℓ, 아데닌 10 ㎎/ℓ)를 5 ℓ 발효조에 넣고 120 ℃에서 30분간 가압 살균한 후, 종 배양액을 2% 용량으로 식균하여 30 ℃에서 pH 7.0으로 24시간 동안 배양하였다. 이 때 회전 속도는 750 rpm, 공기 첨가 속도는 1vvm으로 하였다.

배양이 완료된 효소 균체 함유액에 XMP를 최종 농도가 40㎎/㎖되도록 살균 처리된 XMP 발효액을 첨가하고, 35 내지 50℃에서 pH를 7.0에서 8.0으로 유지시키면서 24시간 동안 반응시켯으며, 이 때 대조군으로 BA17-2/pGX1-2 균주를 사용하였다. 전환반응에 필요한 마그네슘염, 인산염, 황산암모늄 또는 글루타민 등의 부재료 등을 적당량 첨가하였으며, 효소 균체에 의한 ATP-재생을 위해 아데닌과 글루코오스를 함께 첨가하였다. 전환 반응은 적당량의 계면 활성제(SDS, hyamine 등)을 첨가함으로써 개시하였다. 반응 중 경시적인 GMP의 전환률을 표 1에 나타내었다.

<표 1>

형질전환주들에 의한 경시적 GMP의 전환률

상기 표의 결과로 부터 알수 있는 바와 같이 본 발명에 따라 ATP 생성 경로의 각 단계를 촉매하는 효소를 코딩하는 유전자를 함유하는 백터로 형질전환된 숙주의 경우 반응 중의 XMP -> GMP 전환 반응의 속도가 대조군의 경우에 비해 현저히 (약 50% 정도) 증가됨을 알 수 있다.

본 발명에 따라 개발된 벡터-숙주계는 XMP -> GMP 전환 반응의 속도를 종래의 것에 비하여 현저히 증가시킬 수 있으므로 비용 효율적인 5'-구아닐산의 제조 방법을 제공할 수 있다.

<서열 목록>

도 1은 본 발명에 따른 재조합 플라스미드 pMPSE82의 제작도 및 그의 구조를 나타낸 도면.

Claims (1)

1. guaA 유전자를 함유하는 플라스미드 벡터에 prs(PRPP synthase), apt(adenosine phosphoribosyl transferase), adk(adenylate kinase) 및 pyk(pyruvate kinase) 유전자로 구성된 그룹으로부터 선택되는 ATP-재생 능력을 강화시키는 유전자가 도입되어 있는 재조합 플라스미드 벡터로 형질전환된 코리네형글루타메이트 생산균인 브레비박테리움(Brevibacterium) 또는 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 미생물의 배양액과 XMP를 반응시킴을 특징으로 하는 5'-구아닐산의 제조 방법.