CN101693896B

CN101693896B - 醛脱氢酶基因

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Publication number: CN101693896B
Application number: CN2009101755968A
Authority: CN
Inventors: 星野达雄; 宮崎太郎; 杉泽辉秀
Original assignee: DSM IP Assets BV
Current assignee: DSM IP Assets BV
Priority date: 2002-09-27
Filing date: 2003-09-22
Publication date: 2012-07-11
Anticipated expiration: 2023-09-22
Also published as: WO2004029235A3; WO2004029235A2; KR101070110B1; EP1543114A2; CN101693896A; AU2003299104A1; ATE404664T1; US7135315B2; JP4528624B2; CN1688689A; DE60322921D1; US20060127994A1; KR20050052664A; EP1543114B1; JP2006500052A; AU2003299104A8; CN100558886C

Abstract

本发明涉及编码醛脱氢酶(SNDH)的DNA、含有所述DNA的表达载体和含有所述DNA的重组生物。此外，本发明涉及生产重组醛脱氢酶蛋白质的方法，以及用重组醛脱氢酶蛋白质或者用含有所述表达载体的重组生物从L-山梨糖酮来生产L-抗坏血酸(维生素C)和/或2-酮基-L-古洛糖酸(2-KGA)的方法。本发明还提供了用其中编码所述醛脱氢酶的基因已经被破坏掉的微生物来生产2-KGA的方法。

Description

醛脱氢酶基因

本发明涉及从Gluconobacter oxydans DSM 4025中获得的编码醛脱氢酶的新的DNA、含有所述DNA的表达载体和含有所述表达载体的重组微生物。此外，本发明涉及生产重组醛脱氢酶蛋白质的方法，以及用重组醛脱氢酶蛋白质或者用含有所述表达载体的重组微生物从L-山梨糖酮来生产L-抗坏血酸(维生素C)和/或2-酮基-L-古洛糖酸(2-keto-L-gulonic acid，2-KGA)的方法。

维生素C是人类必不可少的营养因子之一，通过Reichstein方法，人们已对其进行了大约60年的商业合成。合成的维生素C还可用于动物饲料，即使畜牧动物能在体内合成维生素C。虽然所述的Reichstein方法对维生素C的工业生产来说有许多的优点，但其仍然有一些人们不欲看到的问题，例如，能量消耗过高以及其中使用了相当大的量的有机溶剂和无机溶剂。因此，在过去的数十年中，人们已研究了多种通过用酶进行转化来制造维生素C的方法，这些方法更为经济、环保。

本发明涉及经过分离的编码醛脱氢酶的核酸分子，所述核酸分子包含与SEQ ID NO：1的核苷酸序列至少95％相同的多核苷酸。

本文中使用的“SNDH”表示醛脱氢酶(aldehyde dehydrogenase)。

本文中使用的“核酸分子”包括DNA和RNA，除非另有指明，其包括双链核酸分子、单链核酸分子以及它们的核苷。其中还包括杂交体，例如DNA-RNA杂交体、DNA-RNA-蛋白质杂交体、RNA-蛋白质杂交体和DNA-蛋白质杂交体。

本文中使用的“突变”指在目标核苷酸序列中的单个碱基对的改变、插入或缺失。

本文中使用的“诱变”表示在DNA中产生突变的方法。“随机”诱变后，突变的具体位置是不确定的，其可能发生于微生物染色体上的任何位置，所述突变是化学处理或辐射等手段所导致的物理损伤的结果。

本文中使用的“启动子”指一段DNA序列，其通常被描述为基因的5’区域，处于邻近起始密码子的位置。其邻近基因的转录在启动子区域得以起始。如果启动子是可诱导型启动子，那么所述转录的速率能响应诱导剂而增加。相反，如果启动子是组成性启动子的话，那么所述转录的速率则不受诱导剂的调控。

本文中使用的“百分比相同(percent identical)”指：与作为比较的核苷酸或氨基酸序列中的相同核苷酸或氨基酸相匹配的核苷酸或氨基酸在目标核苷酸或氨基酸序列中所占的百分比，所述比较是通过后面例举的序列分析程序来进行的。

本发明包括经过分离的编码醛脱氢酶的核酸分子，所述核酸分子包含一段多核苷酸，所述多核苷酸与选自由(a)SEQ ID NO：1中第258-2084位核苷酸、(b)SEQ ID NO：1中第351-2084位核苷酸、(c)SEQ ID NO：1中第258-1955位核苷酸和(d)SEQ ID NO：1中第351-1955位核苷酸所构成的组的多核苷酸至少95％相同。

在本发明的另一个方面，提供了经过分离的编码醛脱氢酶的核酸分子，所述核酸分子包含选自由(a)编码具有SEQ ID NO：2中氨基酸序列的多肽的多核苷酸、(b)编码由SEQ ID NO：2中第32-609位氨基酸所构成的多肽的多核苷酸、(c)编码由SEQ ID NO：2中第1-566位氨基酸所构成的多肽的多核苷酸和(d)编码由SEQ ID NO：2中第32-566位氨基酸所构成的多肽的多核苷酸所构成的组的多核苷酸。本发明中还包括如下蛋白质，所述蛋白质具有SNDH活性，并且是通过在上述氨基酸序列中取代、缺失、插入或增加一个或多个氨基酸从上述蛋白质得到的。

作为本发明的另一个方面，功能衍生物被定义为：在本发明氨基酸序列的基础上，通过增加、插入、缺失和/或取代此类序列中的一个或多个氨基酸残基而获得的，其中，此类衍生物仍然具有SNDH活性，这可用本领域内已知的或本文中特别描述的检测方法检测出来。此类功能衍生物可以通过本领域内已知的化学肽合成方法来制造，或者可以依靠现有技术中已知的方法在本文公布的DNA序列的基础上通过重组手段来制得。在蛋白质和肽中进行的大体上不改变此类分子活性的氨基酸交换在现有技术中是已知的。

在本发明的具体实施方式中，可以发生如下感兴趣的保守替代：示例性替代，Ala到Val/Leu/Ile、Arg到Lys/Gln/Asn、Asn到Gln/His/Lys/Arg、Asp到Glu、Cys到Ser、Gln到Asn、Glu到Asp、Gly到Pro/Ala、His到Asn/Gln/Lys/Arg、Ile到Leu/Val/Met/Ala/Phe/norLeu、Lys到Arg/Gln/Asn、Met到Leu/Phe/Ile、Phe到Leu/Val/Ile/Ala/Tyr、Pro到Ala、Ser到Thr、Thr到Ser、Trp到Tyr/Phe、Tyr到Trp/Phe/Thr/Ser和Val到Ile/Leu/Met/Phe/Ala/norLeu是可行的。Ala到Val、Arg到Lys、Asn到Gln、Asp到Glu、Cys到Ser、Gln到Asn、Glu到Asp、Gly到Ala、His到Arg、Ile到Leu、Leu到Ile、Lys到Arg、Met到Leu、Phe到Leu、Pro到Ala、Ser到Thr、Thr到Ser、Trp到Tyr、Tyr到Phe和Val到Leu的替代作为优选的例子是可行的。如果此类替代导致了生物活性的改变，那么，由上述示例性替代引起的更大的变化就会被引入，产物将被筛选。

另外，本发明涉及编码具有SNDH活性的多肽的多核苷酸以及其互补链，所述多肽如包括序列表中公开的SEQ ID NO：2所示，或包括上述序列的DNA序列或其片段，以及在标准条件下能与此类序列杂交但编码具有完全一样的氨基酸序列的DNA序列。

因此，本发明提供了经过分离的编码具有醛脱氢酶活性的多肽的核酸分子，其中，所述核酸分子的互补体能在标准条件下与上述核酸分子杂交。本发明的一个方面提供了经过分离的编码具有醛脱氢酶活性的多肽的核酸分子，其中，所述核酸分子能在标准条件下与下列核酸分子的互补链杂交：(i)编码醛脱氢酶的核酸分子，其包含与SEQ NO：1的核苷酸序列至少95％相同的多核苷酸；(ii)编码醛脱氢酶的核酸分子，其包含一段多核苷酸，所述多核苷酸与选自由(a)SEQ ID NO：1中第258-2084位核苷酸、(b)SEQ ID NO：1中第351-2084位核苷酸、(c)SEQ ID NO：1中第258-1955位核苷酸和(d)SEQ ID NO：1中第351-1955位核苷酸所构成的组的多核苷酸至少95％相同；以及(iii)编码醛脱氢酶的核酸分子，其包含选自由(a)编码具有SEQID NO：2中氨基酸序列的多肽的多核苷酸、(b)编码由SEQ ID NO：2中第32-609位氨基酸所构成的多肽的多核苷酸、(c)编码由SEQ ID NO：2中第1-566位氨基酸所构成的多肽的多核苷酸和(d)编码由SEQ ID NO：2中第32-566位氨基酸所构成的多肽的多核苷酸所构成的组的多核苷酸。

用于杂交的“标准条件”在上下文中表示本领域的技术人员为了探测特异性杂交信号通常所用的条件，或者优选地，是本领域技术人员所用的所谓严谨杂交条件。

因此，本文中使用的术语“严谨杂交条件”指：序列间95％相同以及优选97％相同的情况下杂交就会发生的条件。严谨杂交条件例如是如下的条件：用经过地高辛(digoxygenin，DIG)标记的DNA探针(通过DIG标记系统构建；Roche Diagnostics GmbH，68298Mannheim，Germany)，在包含50％甲酰胺、5x SSC(150mM NaCl、15mM柠檬酸三钠)、0.2％十二烷基硫酸钠、0.1％N-十二烷基肌氨酸和2％封闭试剂(RocheDiagnostics GmbH)的溶液中，于42℃培养过夜，然后于大约60℃在0.1x SSC中洗杂交膜。

本发明还涉及重组载体，即表达载体，所述载体包含上述核酸分子。本发明的表达载体能在合适的宿主细胞中发挥作用。用于表达本发明核酸分子的优选载体是选自由pQE、pUC、pBluescript II、pACYC177、pACYC184、pVK100和RSF1010所构成的组的载体或其衍生物。

用于表达本发明核苷酸序列的合适的宿主细胞是选自由细菌、酵母和植物细胞所构成的组的重组微生物。优选地，所述微生物选自由Gluconobacter、Acetobacter、Pseudomonas、Acinetobacter、Klebsiella和Escherichia所构成的组。此类优选微生物的一个例子是E.coli。更优选的宿主细胞属于Gluconobacter oxydans，最优选为G.oxydans DSM 4025(FERM BP-3812)，其已按照《布达佩斯条约》的规定，于1987年3月17日被保藏到德国Braunschweig的Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen(DSMZ)。

微生物“Gluconobacter oxydans”还包括：由《国际原核生物命名法规》(International Code of Nomenclature of Prokaryotes)所定义的，此物种的具有相同物理-化学属性的同物异名体(synonym)或基原异名体(basonym)。

因此，本发明涉及经上述表达载体转化的重组微生物，或包含整合到其染色体DNA中的上述核酸分子的重组微生物。

若干种不同的宿主/载体组合可被用于克隆本发明的双链核苷酸序列。鉴于E.coli是优选的宿主细胞，故而通常用于E.coli的任何载体都可用于本发明。此类载体包括但不限于：能表达带有组氨酸标签重组蛋白的pQE载体(QIAGEN K.K.，日本东京)、pBR322或其衍生物包括pUC18和pBluescript II(Stratagene Cloning Systems，California，USA)、pACYC177和pACYC184及其衍生物，以及从广宿主范围的质粒例如RK2和RSF1010所获得的载体。因此，用于本发明的表达载体是从pQE质粒、pUC质粒、pBluescript II、pACYC177、pACYC184及其衍生质粒和广宿主范围的质粒，例如pVK100和RSF1010获得的。

本文中使用的“表达载体”指：在转化到合适的宿主之后，能提高被克隆到该载体中的基因的表达的克隆载体。被克隆的基因通常处于(即，可操作地连接到)某些控制序列例如启动子序列的控制下。启动子序列可以是组成型的或者诱导型的。

本文中使用的“克隆载体”指质粒或噬菌体DNA或其它能在宿主细胞中进行自主复制的DNA序列，其特征是具有单个或少量的限制性内切酶识别位点，可以以确定的方式在这些位点上对此类DNA序列进行切割而所述载体不会丢失必要的生物学功能，还可以向所述载体中导入DNA片段以使所述DNA片段得以被复制及克隆。所述克隆载体可以进一步地含有适于用来鉴定经所述克隆载体转化的细胞的标志(marker)。此类标志提供了例如对四环素或对氨苄青霉素的抗性。

本文中使用的“重组载体”包括任何含有被克隆的目的基因的克隆载体或表达载体。

本文中使用的“表达”指从结构基因产生多肽的过程。该过程涉及所述基因向mRNA的转录和此类mRNA到多肽的翻译。

本文中使用的“重组微生物”包括重组宿主，其可以是任何在表达载体或克隆载体上含有被克隆的目的基因的原核细胞或真核细胞。该术语还包括经过遗传工程改造的在染色体或基因组上含有目的基因的原核细胞或真核细胞。

本文中使用的“宿主”包括任何是可复制的表达载体或克隆载体的受体的原核细胞或真核细胞。本文中作为术语使用的“宿主”还包括经过遗传工程改造的在其染色体或基因组上含有目的基因的原核细胞或真核细胞，所述遗传工程改造是通过公知技术进行的。此类宿主的例子是本领域技术人员所已知的。

为构建携带有重组DNA例如重组载体的重组微生物，可以使用若干种基因转移方法，其包括但不限于转化、转导、接合(conjugal mating)或电穿孔。此类方式都是分子生物学领域内公知的。传统的转化系统可以用于Gluconobacter、Acetobacter、Pseudomonas、Acinetobacter、Klebsiella或Escherichia。转导系统也可用于E.coli。接合系统可以广泛地使用于革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌，包括E.coli、P.putida和Gluconobacter。在WO 89/06,688中公开了一个接合的例子。接合可以发生于液体培养基中或固体表面上。用于生产SNDH的合适的受体实例包括Gluconobacter、Acetobacter、Pseudomonas、Acinetobacter、Klebsiella或Escherichia的微生物。可以向用于接合的受体中加入选择性标志，例如对对萘啶酸或利福平的抗性。天然抗性也可以使用，例如，对多粘菌素B的抗性可用于很多种Gluconobacter。

优选的用于本发明的载体是广宿主范围的载体，例如粘粒载体，例如pVK100及其衍生物和RSF1010。应当对载体的拷贝数和稳定性详加考虑，这是为了使被克隆的核酸分子能稳定有效地表达，也是为了使携带有所述被克隆的分子的宿主细胞能被有效地培养。含有转座元件例如Tn5的核酸分子也可以被用于将目的DNA导入到优选宿主中，尤其是导入到染色体上。含有从优选宿主分离出来的任何DNA和本发明的核苷酸序列的核酸分子也可用于将本发明的核苷酸序列导入到优选宿主中，尤其是导入到染色体上。可用任何传统方法将此类核酸分子转移到优选的宿主中，所述传统方法例如是转化、转导、接合或电穿孔，它们是本领域内公知的，对它们的使用要考虑到宿主细胞和核酸分子的性质。

用本领域内公知的方法，将包括本发明提供的SNDH基因的核苷酸序列连接到合适的含有调控区域的载体上，以制造出合适的表达载体，所述调控区域例如是启动子、核糖体结合位点和转录终止子，所述调控区域在上述宿主细胞中是可操作的。

为有效表达从G.oxydans DSM 4025中分离出的目的基因/核苷酸序列，可以使用若干种启动子；例如：所述基因原来的启动子，抗生素抗性基因例如Tn5的卡那霉素抗性基因、pBR322的氨苄青霉素抗性基因的启动子，E.coli的beta-半乳糖苷酶(lac)、trp-、tac-、trc-启动子，lambda噬菌体的启动子和任何能在宿主细胞中发挥作用的启动子。就此目的而言，宿主细胞可选自由细菌、酵母和植物细胞所构成的组。优选地，所述宿主细胞属于Gluconobacter、Acetobacter、Pseudomonas、Acinetobacter、Klebsiella或Escherichia属。

为完成表达，在宿主细胞(其中导入了编码序列，以提供本发明的重组细胞)中可操作的其它调控元件，例如Shine-Dalgarno(SD)序列(例如，AGGAGG，包括在宿主细胞中可操作的天然序列和合成序列)和转录终止子(反向重复结构，包括任何在宿主细胞中可操作的天然序列和合成序列)可以和上述启动子一起使用。

为表达处于周质空间(periplasmic space)的多肽，例如本发明的SNDH蛋白质，优选要联合通常含有15至50个氨基酸残基的信号肽，所述信号肽是完全疏水的。编码信号肽的DNA可以选自在目的宿主细胞中可操作的任何天然序列或合成序列。在由本发明的SNDH所表达的蛋白质中，也发现了含有SEQ ID NO：2第1-31位氨基酸残基的推断出的信号肽(SEQ ID NO：4)。

除非另有指明，本文中所有通过对经过纯化的SNDH蛋白质进行测序测定出的氨基酸序列都是用自动氨基酸测序仪(例如470A型，Perkin-Elmer Applied Biosystems)来测定的。

除非另外指明，本文中所有通过对DNA分子进行测序测定出的核苷酸序列都是用自动DNA测序仪(例如ALF express II型，AmershamPharmacia Biotech)来测定的，所有由本文中所确定的DNA分子编码的多肽的氨基酸序列都是通过对按照上文所述测定的DNA序列进行翻译来预测的。因此，如本领域内所已知的那样，对任何通过该自动手段来测定的DNA序列而言，本文中测定的任何核苷酸序列都可能含有一些错误。典型地，通过自动操作测定的核苷酸序列与被用来测序的DNA分子的实际核苷酸序列至少约90％相同，更典型地，至少约95％到至少约99.9％相同。可通过其它手段更精确地测定所述的实际序列，所述手段包括本领域中公知的手工DNA测序方法。如本领域中还已知的那样，如果测定出的核苷酸序列较之实际序列存在单个插入或缺失，在该核苷酸进行翻译时就会导致移码(frame shift)，因此，由测定出的核苷酸序列所编码的预测氨基酸序列从插入或缺失点开始，就将完全不同于被用于测序的DNA分子实际编码的氨基酸序列。

本发明提供了经过分离的编码所述酶(SNDH)的核酸分子。为对经过分离的核酸分子进行操作而设计的方法和技术在本领域内是公知的。用于对核酸分子进行分离、纯化及克隆的方法对本领域技术人员来说是已知的，描述了真核和原核宿主细胞的用途及其中核酸和蛋白质表达的方法和技术也是已知的。

简言之，用于本发明的SNDH基因、含有所述基因的DNA分子、重组表达载体和重组微生物可以通过下列步骤获得：

(1)从G.oxydans DSM 4025中分离染色体DNA，在适当的宿主细胞例如E.coli中用所述染色体DNA构建基因文库；

(2)通过菌落杂交、噬菌斑杂交或Southern杂交，PCR(聚合酶链式反应)克隆，western印记分析或本领域内已知的其它技术，从所述染色体DNA中克隆出SNDH基因；

(3)通过传统方法，测定根据上文所述得到的SNDH基因的核苷酸序列，以选出含有所述SNDH基因的DNA分子，构建出其中能有效表达SNDH基因的重组表达载体；

(4)构建携带有SNDH基因的重组微生物，这是通过用于将DNA导入宿主细胞的适当方法来进行的，所述方法例如是转化、转导、接合和/或电穿孔，其中宿主细胞因此成为了本发明的重组微生物。

下面将举例来详细阐述本发明的上述方面中所使用的材料和技术：

可以用本领域内公知的工序来对染色体总DNA进行纯化，典型地，通过下列详细说明的任何方法，可以将目的基因从染色体总DNA克隆到质粒或噬菌体载体中去：

(i)从经过纯化的蛋白质或其肽段来测定部分的氨基酸序列。此类整个的蛋白质或肽段可以通过对整个蛋白质的分离来制备，或者通过在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后对所述凝胶进行肽酶处理来制备。由此获得的蛋白质或其片段被用于蛋白质测序仪，例如Applied Biosystems的自动气相测序仪470A。用DNA合成仪，例如Applied Biosystems的自动DNA测序仪381A，可利用氨基酸序列来设计及制备寡核苷酸探针和/或引物。所述探针可被用于从带有目标基因的菌株的基因文库中分离带有目标基因的克隆，这是通过Southern杂交、菌落杂交或噬菌斑杂交来进行的。

(ii)或者，为着从基因文库中选择出表达目标蛋白质的克隆的目的，可以应用免疫方法以及为目标蛋白质而制备的抗体。

(iii)用一组引物，即根据上述测定的氨基酸序列合成的两条寡核苷酸，通过PCR方法，可以从染色体总DNA中扩增出目标基因的DNA片段。然后，用上面获得的PCR产物作为探针，通过Southern杂交、菌落杂交或噬菌斑杂交，可以从构建的基因文库中分离出携带有整个目标基因的克隆，所述基因文库例如是在E.coli中构建的。

通过PCR制造的DNA也是本发明的一个目的，所述PCR中，使用的引物是通过本领域内已知的方法，在本文中公开的DNA序列的基础上来设计的。

用经过纯化的SNDH蛋白质、经过纯化的重组SNDH蛋白质例如E.coli中表达的加上了组氨酸标签的SNDH或其肽段作为抗原，可以制备出上面提到的抗体。

一旦获得了携带有目的基因的克隆，就可以通过公知的方法，例如M13噬菌体开展双脱氧链终止法来测定目标基因的核苷酸序列。

附图说明：

图1描述了本发明的编码具有醛脱氢酶活性的蛋白质的基因。其中给出了SNDH基因和ORF-A基因的限制性图谱，其中，所述ORF指开放阅读框，信号序列指推断出的SNDH基因的信号序列。

图2描述了克隆到粘粒pVSN5中的SNDH和ORF-A基因的限制性图谱，以及向pUC质粒中插入的不同大小的DNA克隆的限制性图谱，所述pUC质粒例如是pUCSNP4、pUCSNP9、pUCSN19和pUCSN5。在pVSN5的物理图谱中，灰色箭头表示SNDH基因。

图3显示了将来自pVSN5的包括完整SNDH基因的8.0kb的PstI片段克隆到pUC18质粒中的策略，结果产生了pUCSNP4和pUCSNP9。注意：除了插入方向不同，pUCSNP4和pUCSNP9都是一样的。

图4以图表方式显示了通过使用自杀性载体质粒对GOMTR1SN::Km(SNDH-破坏型)进行的构建，所述自杀性载体质粒带有已用卡那霉素盒(kanamycin cassette，Km)破坏掉的SNDH基因。在所述载体质粒和作为亲本菌株的GOMTR1的染色体DNA之间的相应位置发生同源重组，获得了破坏型的菌株。“G.O.”表示Gluconobacter oxydans。

图5展示了pVSN117、pVSN106和pVSN114的插入DNA的物理图谱。质粒pVSN117的插入DNA编码C-末端缺失型的SNDH基因(SEQID NO：1的第258-1955位核苷酸，即SEQ ID NO：2的第1-566位氨基酸)，该基因表达仅55kDa的蛋白质。质粒pVSN106和pVSN114具有编码完整SNDH基因的插入DNA。

如图2所示，本发明的基因编码了具有578个氨基酸残基(SEQ IDNO：5，由SEQ ID NO：2的第32-609位氨基酸组成)的SNDH酶和具有31个氨基酸残基的推断出的信号肽(SEQ ID NO：4，由SEQ ID NO：2的第1-31位氨基酸组成)。在核苷酸序列的方面，SNDH基因的编码区域包含SEQ ID NO：1的第258-2087位核苷酸，其包括推断出的信号肽的编码序列(SEQ ID NO：1的第258-350位核苷酸)和终止密码子(SEQ ID NO：1的第2085-2087位核苷酸)。因此，没有终止密码子的核苷酸序列是SEQ ID NO：1的第258-2084位的核苷酸序列，此外，没有信号肽的情况下，所述核苷酸序列包含SEQ ID NO：1的第351-2084位核苷酸。

本发明中公开的核酸分子可以用于重组微生物中，用于生产2-KGA和/或维生素C。可在有氧条件下，于补充有适当营养物的水性培养基中，培养选自Gluconobacter、Acetobacter、Pseudomonas、Acinetobacter、Klebsiella或Escherichia的重组微生物。所述培养可以进行于4.0至9.0之间的pH下，优选为6.0至8.0。培养时间根据将用到的pH、温度和营养培养基而变化，其优选是大约1至5天。用于开展培养的优选温度范围是大约13℃至大约36℃，更优选是大约18℃至大约33℃。通常要求所述培养基中含有下述营养物：可被吸收的碳源，例如甘油、D-甘露醇、D-山梨糖醇、赤藻糖醇、核糖醇、木糖醇、阿糖醇、肌糖醇、半乳糖醇、D-核糖、D-果糖、D-葡萄糖和蔗糖，优选为D-山梨糖醇、D-甘露醇和甘油；以及可被消化的氮源，例如有机物质，例如蛋白胨、酵母提取物、面包酵母、尿素、氨基酸和玉米浆。若干无机物质也可用作氮源，例如硝酸盐和铵盐。此外，培养基中通常还含有无机盐，例如硫酸镁、磷酸钾和碳酸钙。培养开展于合适的装置中，例如发酵罐、瓶或试管中。重组微生物或者是经含有上述核酸分子的表达载体转化得到的，或者包含整合到其染色体DNA上的本发明核酸分子。

在对2-KGA和/或维生素C的生产中，一种作为底物的合适的糖类化合物是L-山梨糖酮。针对2-KGA和维生素C的代谢途径始自D-山梨糖醇，经过L-山梨糖到L-山梨糖酮，L-山梨糖酮然后再转化为2-KGA和/或维生素C。因此，用于全部两种产物的直接底物是L-山梨糖酮。

因此，本发明的一个方面提供了从L-山梨糖酮来生产2-KGA和/或维生素C的方法，所述方法包括(a)在合适的培养基上，繁殖或培养重组微生物，所述微生物是经含有本发明核酸分子的表达载体转化得到的，或者所述微生物中包含整合到其染色体DNA上的本发明核酸分子；和(b)从所述培养基中回收及分离2-KGA和/或维生素C。

本发明的一种实施方式提供了从L-山梨糖酮生产维生素C和/或2-KGA的方法，所述方法包括(a)在合适的培养基上，繁殖或培养重组生物，其中，本发明中的核酸分子通过异源方式被导入到了所述的重组生物中；和(b)从所述培养基中回收及分离2-KGA和/或维生素C。

本发明提供了重组的SNDH。技术人员可以通过将本发明提供的SNDH基因导入到宿主细胞中来增加SNDH酶的产量，所述宿主细胞包括G.oxydans DSM 4025。技术人员也可以通过使用本发明的SNDH基因在宿主细胞中更有效地生产SNDH蛋白质，所述宿主细胞选自由Gluconobacter、Acetobacter、Pseudomonas、Acinetobacter、Klebsiella或Escherichia所构成的组。可以如上文所述来对微生物进行培养。

下面简要描述一下用于在培养之后从微生物中对重组SNDH进行分离和纯化的实施方式：通过离心或过滤从液体培养液中收获细胞。用水、生理盐水或具有适当pH的缓冲溶液来洗收获得到的细胞。洗过的细胞被悬浮于缓冲溶液中，使用均质机、超声波裂解仪(sonicator)或French press来使细胞破裂，或者用溶菌酶来获得破裂细胞的溶液。从破裂细胞的无细胞提取物中分离和纯化出重组的SNDH，优选从所述微生物的细胞液部分来开展分离和纯化。重组SNDH可固定于固体载体上，用作固相酶反应。

本发明进一步地涉及从L-山梨糖酮生产2-KGA的方法，所述方法包括：(a)在合适的培养基上培养属于Gluconobacter oxydans DSM 4025的微生物，其中，所述微生物中，编码SEQ ID NO：2所展示的醛脱氢酶的基因已被破坏掉；和(b)从所述培养基中回收或分离2-KGA。所述破坏可以发生在基因中的任何能导致所编码的酶失去功能的地方。

因此，本发明提供了从合适的糖类化合物经过L-山梨糖酮来生产2-KGA的方法，所述方法包括(a)在合适的培养基上令属于Gluconobacteroxydans DSM 4025的微生物繁殖，其中，所述微生物中，编码醛脱氢酶的基因已被破坏掉，所述醛脱氢酶由下列物质编码：(i)与SEQ ID NO：1的核苷酸序列至少95％相同的多核苷酸；(ii)与选自由(a)SEQ ID NO：1中第258-2084位核苷酸、(b)SEQ ID NO：1中第351-2084位核苷酸、(c)SEQ ID NO：1中第258-1955位核苷酸和(d)SEQ ID NO：1中第351-1955位核苷酸所构成的组的多核苷酸至少95％相同的多核苷酸；以及

(iii)选自由(a)编码具有SEQ ID NO：2中氨基酸序列的多肽的多核苷酸、(b)编码由SEQ ID NO：2中第32-609位氨基酸所构成的多肽的多核苷酸、(c)编码由SEQ ID NO：2中第1-566位氨基酸所构成的多肽的多核苷酸和(d)编码由SEQ ID NO：2中第32-566位氨基酸所构成的多肽的多核苷酸所构成的组的多核苷酸。从所述培养基中进一步回收和分离得到的2-KGA。

在一种实施方式中，本发明提供了通过经典诱变在体内及体外来破坏SNDH基因的方法，所述经典诱变中使用了UV辐射等手段或通过任何的突变试剂的化学处理，所述试剂例如是N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(N-methyl-N’-nitro-N-nitrosoguanidine，NTG)、ICR170或吖啶橙。

在另一种实施方式中，本发明提供了通过DNA重组技术在体内及体外来破坏SNDH基因的方法，例如插入转座子或通过PCR进行定点诱变。

在另一种实施方式中，本发明提供了通过发酵从合适的底物来生产2-KGA的方法，其中使用了上述破坏型(disruptant)，所述底物即糖类化合物，其选自由L-山梨糖酮、D-葡萄糖、D-山梨糖醇和L-山梨糖所构成的组。该方法开展于适当的装置中，例如发酵罐、瓶或试管中。此外，本发明提供了用上述破坏型的无细胞提取物从合适的底物，例如L-山梨糖酮、D-葡萄糖、L-山梨糖和D-山梨糖醇，来生产2-KGA的方法，所述方法是通过在合适的装置例如生物反应器上进行培养来进行的。

本发明提供了重组的SNDH。此外，本发明涉及生产醛脱氢酶的方法，所述方法包括：(a)培养包含编码醛脱氢酶的核酸分子的重组微生物，所述核酸分子包含(i)与SEQ ID NO：1的核苷酸序列至少95％相同的多核苷酸；(ii)与选自由(a)SEQ ID NO：1中第258-2084位核苷酸、(b)SEQ ID NO：1中第351-2084位核苷酸、(c)SEQ ID NO：1中第258-1955位核苷酸和(d)SEQ ID NO：1中第351-1955位核苷酸所构成的组的多核苷酸至少95％相同的多核苷酸；以及(iii)选自由(a)编码具有SEQ ID NO：2中氨基酸序列的多肽的多核苷酸、(b)编码由SEQ IDNO：2中第32-609位氨基酸所构成的多肽的多核苷酸、(c)编码由SEQID NO：2中第1-566位氨基酸所构成的多肽的多核苷酸和(d)编码由SEQ ID NO：2中第32-566位氨基酸所构成的多肽的多核苷酸所构成的组的多核苷酸；其中，所述微生物被培养于合适的培养基上，和(b)其中，从所述培养基中回收和分离所述醛脱氢酶。

实施例1：对SNDH的N-末端氨基酸进行测序

SNDH蛋白质75kDa亚基N-末端的部分氨基酸序列被测定。将大约10μg经过SDS处理的由75kDa亚基组成的纯化的SNDH用于SDS-PAGE，蛋白质条带被电转印(electroblot)到PVDF膜上。将印到膜上的蛋白质浸泡于消化缓冲液(100mM磷酸钾缓冲液、5mM二硫苏糖醇、10mM EDTA，pH为8.0)中，并和5.04μg的焦谷氨酸氨基肽酶(SIGMA，USA)一起在30℃被培养24小时。培养完成后，用去离子水洗膜，用自动氨基酸测序仪(ABI 490型，Perkin Elmer Corp.，Conn.，USA)对其进行N-末端氨基酸测序。结果获得了如SEQ ID NO：3中所示的所述N-末端氨基酸序列的14个残基。

实施例2：通过PCR克隆部分SNDH基因

使用G.oxydans DSM 4025(FERM BP-3812)的染色体DNA和简并寡核苷酸引物P11(SEQ ID NO：6)和P12(SEQ ID NO：7)，通过PCR来对SNDH基因的部分片段进行扩增。全部两组引物都是简并DNA混合物，并且具有Gluconobacter的密码子使用偏好。所述PCR是用热稳定taq聚合酶(TAKARA Ex Taq^TM，Takara Shuzo Co.，Ltd.，Seta 3-4-1，Otsu，Shiga，520-2193，Japan)和热循环仪(Gene Amp PCR System 2400-R，PEBiosystems，850 Lincoln Centre Drive，Foster City，CA 94404，USA)来开展的。反应混合物(25μl)由缓冲液中的200μM的dNTPs、50pmol的每种引物(简并度为24-48)、5ng的染色体DNA和1.25个单位的DNA聚合酶组成，所述缓冲液是由供给商提供的。反应先进行了5个循环，每个循环包括在94℃进行30秒的变性步骤、在37℃进行30秒的退火步骤、在70℃进行1分钟的合成步骤；然后再进行25个循环，每个循环包括在94℃进行30秒的变性步骤、在50℃进行30秒的退火步骤、在70℃进行1分钟的合成步骤。结果特异性地扩增出了一条41bp的DNA片段，并将该片段克隆到载体pCR 2.1-TOPO(Invitrogen，1600Faraday AvenueCarlsbad，California 92008，USA)中，以获得重组的质粒pMTSN2。通过双脱氧链终止法(F.Sanger et al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，74，5463-5467，1977)来验证被克隆的41bp的DNA片段的核苷酸序列，所述DNA片段编码了成熟的SNDH蛋白质N-末端的部分氨基酸序列。

实施例3：对SNDH基因的完全克隆

(1)构建G.oxydans DSM 4025的基因文库

从已在M琼脂培养基上于27℃生长了4天的细胞来制备G.oxydansDSM 4025的染色体DNA，所述培养基含有5.0％的D-甘露醇、1.75％的玉米浆、5.0％的面包酵母、0.25％的MgSO₄·7H₂O、0.5％的CaCO₃(应用级)、0.5％的尿素和2.0％的琼脂(pH 7.0)。在20μl反应混合物中，用4个单位的EcoR I来对所述染色体DNA(4μg)进行部分的消化。使用1％的琼脂糖凝胶，通过电泳对一部分(8μl)样品进行分离，所述样品中含有经部分消化的DNA片段。15至35kb范围内的片段被切下来，用QIAEX II(QIAGEN Inc.，28159 Avenue Stanford，Valencia，CA 91355，USA)通过化学法融胶来回收所述的片段。回收得到的目的DNA片段被悬浮于H₂O中。另一方面，用EcoR I对2μg的粘粒载体pVK100进行完全的消化，并用细菌的碱性磷酸酶(E.coli C75)(Takara Shuzo)处理来对其5’端去磷酸化。用连接试剂盒(Takara Shuzo)，在36μl的反应混合物中将经过处理的pVK100(220ng)与15-35kb的EcoR I片段(1μg)连接起来。对经连接的DNA进行乙醇沉淀，再将其溶于适当体积的TE缓冲液(10mM的Tris-HCl pH 8.0、1mM的EDTA)中，然后用于体外包装(Gigapack III Cold Packaging Extract，Stratagene，11011 North TorreyPines Road，La Jolla，CA 92037，USA)，以感染用于基因组文库的宿主菌株E.coli VCS257。结果获得了总共400,000-670,000个含有大约25kb的插入DNA片段的克隆。

(2)通过菌落杂交对SNDH基因进行完全克隆

将用于筛选上述粘粒文库的探针构建出来，通过菌落杂交方法进行筛选，以探测携带有完全的SNDH基因的克隆。通过PCR-DIG标记方法(Roche Molecular Systems Inc.，1145Atlantic Avenue，Alabama，CA94501，USA)，扩增并标记了编码SNDH N-末端氨基酸序列的41bp的DNA片段。用质粒pMTSN2DNA作为模板，使用寡核苷酸DNA引物P13(SEQID NO：8)和P14(SEQ ID NO：9)，用热稳定taq聚合酶(TAKARA ExTaq^TM，Takara Shuzo Co.，Ltd.)和热循环仪(Gene Amp PCR System 2400-R，PE Biosystems)来开展PCR。反应进行了25个循环，每个循环包括在94℃进行30秒的变性步骤、在55℃进行30秒的退火步骤、在70℃进行1分钟的合成步骤。按照供给商(Roche Molecular Systems Inc.，USA)提供的方法，使用经过DIG标记的探针，通过菌落杂交和化学发光探测，来开展对所述粘粒文库(大约1,000个克隆)的筛选。结果分离出了3个阳性克隆，其中一个被命名为pVSN5，其在pVK100载体中携带有大约25kb的插入DNA。由此将这25kb DNA插入片段的不同大小的片段再进一步地亚克隆到pUC18载体中(图2)，结果分别是：(1)用包含SNDH基因上游部分(N-末端部分)的3.2kb的EcoR I片段产生了pUCSN19，(2)用包含SNDH基因下游部分(C-末端部分)的7.2kb的EcoR I片段产生了pUCSN5，(3)用包含完整或完全的SNDH基因的1.8kb的Pst I片段产生了pUCSNP4和pUCSNP9。注意：pUCSNP4和pUCSNP9中的插入是同样的，但方向相反。

(3)对SNDH进行核苷酸测序

对质粒pUCSN19、pUCSN5和pUCSNP4的包括SNDH基因或基因片段的区域进行核苷酸测序。测定出的核苷酸序列(3,408bp的SEQ ID NO：1)显示：SNDH基因的ORF(1,827bp，SEQ ID NO：1的第258-2084位核苷酸)编码了具有609个氨基酸残基的多肽(SEQ ID NO：2)。如图1所示，在SNDH ORF的下游发现了额外的ORF，即ORF-A。ORF-A(1,101bp，SEQ ID NO：1的第2214-3312位核苷酸)编码了具有367个氨基酸的多肽。

SNDH基因的ORF中，推断出的氨基酸序列可能包括一段信号肽类似序列(31bp的SEQ ID NO：4)，其含有(i)很多疏水残基，(ii)靠近N-末端的带正电荷的残基和(iii)用于信号序列切割位点的Ala-Xaa-Ala单元。推测出的SNDH基因的核糖体结合位点(Shine-Dalgarno，SD，sequence)是位于起始密码子上游的6bp(在SEQ ID NO：1的第247-252位核苷酸位置上的AGGAGA)。此外，在SEQ ID NO：2的第530-534位发现了被定义为血红素(heme)c结合位点的单元(Cys-Xaa-Xaa-Cys-His)。上述遗传分析显示，SNDH蛋白质可被认为是一种醌血红素蛋白(quinohemoprotein)。

用GCG(Genetics Computer Group，Madison，WI，USA)的FASTA程序对SNDH基因进行的同源搜索显示：SEQ ID NO：5的Arg227、Asn228、Gln230、Gly246和Asp251与Oubrie et al.[J.Mol.Biol.289：319-333(1999)]描述的A.calcoaceticus的GDH-B蛋白的推测活性位点的若干高度保守的残基相应。

实施例4：在E.coli中表达SNDH基因

将质粒pUCSNP4和pUCSNP9(图3)转进E.coli JM109中，以验证SNDH蛋白质的表达和活性，所述质粒含有8.0kb的Pst I片段，其中包括完整的即完全的SNDH基因。用高效液相色谱系统(HPLC)在264nm的波长处，测量依靠酶的活性生产出的维生素C的量，所述HPLC由UV探测器(TOSOH UV8000；Tosoh，Japan)、双泵(TOSOH CCPE；Tosoh)、积分器(Shimaduz C-R6A；Shimadzu，Japan)和柱子(YMC-Packpolyamine II；4.6mm内径[i.d.]x 15cm，YMC，USA)组成。

用重组E.coli的胞质部分来进行的从L-山梨糖酮到维生素C的转化活性被检测出来(表1)。在LB培养基中培养细胞，可选地，所述培养基中补充有10μM的PQQ和1.0mM的CaCl₂。所述胞质部分是通过对50mM磷酸钾缓冲液(pH 7.0)中的无细胞提取物进行超离心(100,000xg，45分钟)来制备的。反应混合物(100μl)由125μg的重组E.coli的胞质部分、50mM的L-山梨糖酮、1.0mM的吩嗪硫酸甲酯(phenazinemesosulfate，PMS)组成，根据情况可以添加或不添加1.0μM的PQQ和1.0mM的CaCl₂作为辅助因子。酶反应在30℃进行30分钟。在含有10μM的PQQ和1.0mM的CaCl₂的LB培养基上培养的细胞中的holo-SNDH，在没有辅助因子PQQ和CaCl₂的如前文定义的反应条件下，确实能生产出维生素C。通过添加辅助因子，用pUCSNP4和pUNSNP9表达的apo-SNDH显示出了与holo-酶差不多一样的活性。

表1：重组SNDH的活性测量

一个单位(U)的酶被定义为在上面定义的反应中能产生1.0mg的维生素C的酶的量。

实施例5：构建和培养G.oxydans菌株的SNDH基因破坏型

图4显示了构建SNDH基因目标载体GOMTR1SN::Km(SNDH破坏型)的计划。首先，通过将自杀型载体pSUP202和8.0kb的Pst I片段连接起来，来构建质粒pSUPSN，所述Pst I片段含有来自质粒pUCSNP4的SNDH基因(参考文献见Simon et al.，A broad host range mobilizationsystem for in vitro genetic engineering：transposon mutagenesis in Gramnegative bacteria，Biotechnology，1，784-791，1983)。接着，将卡那霉素抗性基因盒(Km盒)插入到被克隆到质粒pSUPSN中的SNDH基因的EcoR I位点，以获得质粒GOMTR1SN::Km(Km^rTc^r)。然后，将质粒GOMTR1SN::Km导入GOMTR1，以获得无SNDH的突变体(Km^rRif^rTc^s)，所述GOMTR1是抗利福平的，其是从G.oxydans DSM4025野生型菌株中自发得到的。

在含有50ml T培养液和100μg/ml的利福平的200ml瓶中，于30℃培养GOMTR1过夜，所述T培养液由30g/l的Trypticase Soy Broth(BBL；Becton Dickinson and Company，Cockeysville，MD 21031，USA)和3g/L的酵母提取物(Difco；Becton Dickinson Microbiology Systems，BectonDickinson and Company，Sparks，MD 21152，USA)组成。在含有2m1LB培养基和50μg/ml卡那霉素的试管中，将E.coli HB101(pRK2013)[D.H.Figurski，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，76，1648-1652，1979]和E.coli JM 109(pSUPSN::Km)培养过夜。通过离心将GOMTR1、E.coli HB101(pRK2013)和E.coli JM109(pSUPSN::Km)的培养细胞单独收集起来，分别以10∶1∶1的比例来混合每种细胞在LB培养基中的悬浮液。然后将上述细胞悬浮液以同样的体积混合，将混合物涂到琼脂培养基上放置的0.45μm的硝酸纤维素膜上(PROTRAN，Schleicher&Schuell GmbH，Postfach 4，D-37582Dassel，Germany)，以将来自E.coli供体的自杀性质粒接合转移到作为受体的GOMTR1中，所述琼脂培养基由5.0％的D-甘露醇、0.25％的MgSO₄·7H₂O、1.75％的玉米浆、5.0％的面包酵母、0.5％的尿素、0.5％的CaCO₃和2.0％的琼脂组成。在27℃培养1天后，用T培养液对含有转移接合子(transconjugant)的细胞适当地进行悬浮和稀释，并将其涂到含有100μg/m1的利福平和50μg/m1卡那霉素的筛选用琼脂平板上。最终获得了若干具有被Km盒破坏掉的SNDH基因的转移接合子(Km^rRif^rTc^s)。

在含有8.0％的L-山梨糖、0.25％的MgSO₄·7H₂O、1.75％的玉米浆、5.0％的面包酵母、0.5％的尿素、0.5％的CaCO₃和2.0％的琼脂的琼脂平板上，于27℃将GOMTR1和破坏型GOMTR1SN::Km培养4天。将一接种环的细胞接种到500ml Erlenmeyer瓶中的50m1种子培养基中，并在旋转式摇床上以180rpm在30℃培养1天，所述种子培养基中含有4％的D-山梨糖醇、0.4％的酵母提取物、0.05％的甘油、0.25％的MgSO₄·7H₂O、1.75％的玉米浆、0.1％的尿素和1.5％的CaCO₃。用由此制备出的种子培养物去接种500ml Erlenmeyer瓶中的50m1主培养基，所述主培养基由12.0％的L-山梨糖、2.0％的尿素、0.05％的甘油、0.25％的MgSO₄·7H₂O、3.0％的玉米浆、0.4％的酵母提取物和1.5％的CaCO₃组成。培养在30℃以180rpm进行4天。如实施例4中所述来开展活性试验。用HPLC在340nm的波长处，测量依靠酶的活性生产出的2-KGA的量，所述HPLC由UV探测器(TOSOH UV8000；Tosoh)、双泵(TOSOHCCPE；Tosoh)、积分器(Shimaduz C-R6A；Shimadzu)和柱子(YMC-Pack Pro C18，YMC)组成。如表2所示，SNDH基因破坏型对2-KGA的生产效率要高于其亲本菌株GOMTR1。每mol L-山梨糖对2-KGA的转化率差异为大约3％。

表2：具有被破坏的SNDH基因的G.oxydans菌株对2-KGA的生产

菌株	2-KGA(g/L)	残余的L-山梨糖(g/L)	摩尔转化率^*(mol％)
				GOMTR1SN::Km	96.7	15.3	99.2
GOMTR1	98.8	9.8	95.5

^*摩尔转化率：产生的2-KGA的摩尔数/消耗的L-山梨糖的摩尔数

实施例6：将携带有SNDH基因的质粒导入G.oxydans DSM 4025的 SNDH基因破坏型中

如图5所示，用广宿主范围的载体pVK100来构建若干种SNDH的表达质粒。此类质粒在pVK100的Hind III位点具有不同的插入DNA，具体情况如下所述：pVSN117的插入DNA含有不完全的SNDH基因，所述不完全的SNDH基因编码结束于SEQ ID NO：5的Gly535(SEQ ID NO：2的第566位氨基酸残基)的多肽，即C-末端缺失的SNDH基因，该基因表达仅55kDa的蛋白质。分别地，质粒pVS106和pVSN114的插入DNA都含有完全的SNDH基因。通过接合转移方法将此类质粒导入GOMTR1SN::Km菌株。

在含有10.0％的L-山梨糖、0.25％的MgSO₄·7H₂O、1.75％的玉米浆、5.0％的面包酵母、0.5％的尿素、0.5％的CaCO₃和2.0％的琼脂的琼脂平板上，于27℃对具有如图5所示的质粒的转移接合子进行4天的培养。酶反应混合物由80μg Gluconobacter重组菌株的无细胞提取物、25mM磷酸钾缓冲液(pH 7.0)、50mM的L-山梨糖酮和0.05mM的PMS组成。酶反应在30℃进行30分钟，其中，伴随有1000rpm的振荡。按照实施例4来进行活性试验。结果被展示于表3中。

表3：用不同的SNDH构建体来生产维生素C

序列表

<110>罗奇维生素股份公司

<120>编码醛脱氢酶的基因及其用途

<130>21424

<140>

<141>

<160>9

<170>PatentIn Ver.3.1

<210>1

<211>3408

<212>DNA

<213>氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)

<220>

<221>CDS

<222>(258)..(2087)

<220>

<221>CDS

<222>(2214)..(3317)

<400>1

GCGACTGGCA GCAGCGCAAC TATGACCACT ATGGCCTGCC GCCCTATTGG 50

ATCTAACTGA TCCAGTAAGC CACCATCAGC CGGCCCCTGC GGGGGCCGGC 100

TTTTTGCGCT AGACCCCGCC GAGGTGCTGT CGTAACCTAA GGTCACATCT 150

TTACTTCCAC ATCCGCCCTT GTCAGTTCTG ACGTGACAAA TTGTCGCGGT 200

CATGCTGCTG AATGCGGATG CCAGTCCCAG ATCCAAGCCC GACGCAAGGA 250

GACGTAGATG TTACCCAAAT CATTGAAACA TAAGAATGGC GCCATGCGCC 300

TTGTCGCAGC CTCGACCCTT GCGCTGATGA TCGGCGCGGG TGCCCATGCG 350

CAGGTAAACC CGGTCGAAGT GCCGGTGGGC GCGAACGAGA CCTTTACCTC 400

GCGCGTGCTG ACCACCGGCC TGTCGAACCC TTGGGAAATC ACCTGGGGCC 450

CCGACAATAT GCTGTGGGTG ACCGAGCGAT CTTCCGGCGA AGTGACGCGC 500

GTCGACCCCA ATACCGGCGA GCAGCAGGTC CTGCTGACCC TGACCGATTT 550

CAGCGTCGAT GTGCAACACC AGGGCCTACT TGGCCTCGCG CTGCATCCTG 600

AGTTTATGCA AGAGAGCGGC AACGACTACG TCTATATCGT CTACACTTAT 650

AACACCGGCA CCGAAGAAGC GCCCGATCCG CATCAAAAGC TGGTGCGTTA 700

TGCCTATGAC GCTGCCGCGC AGCAGCTGGT CGATCCGGTT GATCTGGTCG 750

CAGGCATTCC CGCAGGCAAC GACCACAATG GCGGTCGCAT CAAATTCGCC 800

CCCGATGGCC AACACATCTT TTACACGCTG GGCGAGCAAG GCGCGAACTT 850

TGGCGGTAAC TTCCGCCGTC CGAACCACGC GCAACTGCTG CCGACGCAAG 900

AGCAGGTCGA CGCGGGCGAT TGGGTCGCCT ATTCGGGCAA GATCCTGCGC 950

GTGAACCTTG ACGGCACGAT CCCCGAAGAC AACCCCGAGA TCGAGGGCGT 1000

GCGTAGCCAT ATCTTTACCT ATGGCCACCG TAACCCGCAG GGCATCACCT 1050

TTGGCCCCGA CGGCACCATT TATGCCACCG AACACGGCCC CGATACGGAT 1100

GACGAGCTGA ACATCATCGC CGGCGGTGGC AACTATGGGT GGCCGAATGT 1150

GGCCGGCTAT CGCGATGGCA AATCCTATGT CTACGCTGAT TGGAGCCAAG 1200

CGCCCGCTGA CCAGCGTTAC ACCGGTCGCG CCGGTATCCC CGACACCGTG 1250

CCGCAATTCC CCGAGCTGGA ATTCGCGCCC GAGATGGTCG ATCCGCTGAC 1300

AACCTATTGG ACGGTGGATA ATGATTACGA TTTCACCGCC AATTGCGGCT 1350

GGATCTGTAA TCCGACGATC GCGCCTTCGT CTGCCTATTA CTATGCGGCG 1400

GGCGAGAGCG GTATCGCGGC TTGGGATAAT TCGATCCTGA TCCCGACGCT 1450

GAAACATGGC GGCATCTATG TGCAGCACCT CAGCGATGAT GGCCAATCTG 1500

TCGACGGCCT GCCCGAGCTG TGGTTCAGCA CCCAGAACCG CTATCGCGAT 1550

ATCGAGATCA GCCCCGATAA CCATGTTTTT GTGGCGACCG ACAACTTTGG 1600

CACCTCGGCG CAGAAATATG GCGAGACCGG CTTTACCAAC GTGCTGCATA 1650

ACCCCGGCGC GATCCTTGTC TTTAGCTATG TCGGCGAGGA TGCTGCGGGT 1700

CAGACCGGAA TGATGACCGC GCCCGCACCG CAGACGCAAT ACACGCAAGT 1750

GCCCGCCGAG GGTGCAGGCG CGGGCGCGAC TGAGGTTGCG GATGTCGATT 1800

ACGACACGCT GTTCACCGAA GGCCAGACCC TTTATGGCAG CGCATGTGCC 1850

GCGTGCCATG GTGCCGCTGG CCAAGGTGCG CAGGGCCCGA CCTTTGTGGG 1900

CGTGCCGGAT GTGACGGGTG ACAAGGACTA CCTTGCCCGC ACCATCATCC 1950

ACGGTTTTGG CTATATGCCG TCGTTTGCGA CTCGGCTGGA TGACGAGGAG 2000

GTTGCCGCCA TCGCGACCTT TATCCGCAAC AGCTGGGGCA ATGACGAAGG 2050

CATCCTGACC CCGGCCGAGG CCGCTGCCAC CCGCTGAATG CTGTAAAAAC 2100

CACCCTCGCC TGCACATCAG GCGGGGGTAT TTCATTTATT TTCACATCTG 2150

CCTTTGACAT GTGCCGCTAT CACGGTTAAT GCGGCCCTTC GGCTGTTCTG 2200

GGTCTAAGCG GGTGTGTTGC CCGATAAGAG AGACGGTTCA GTCCCTCCCG 2250

CCCTATTTAG GGCCCATTTA GGCAGAATAG TTTTGACTCA TCAAAATATC 2300

GCCGCGCCTC TGGCCGCGGC CCTTTCGCAA CGTGGATATG AAACGCTGAC 2350

CGCCGTGCAG CAAGCTGTGC TTGCGCCCGA GGCTGATGGC CGCGACCTGC 2400

TGGTGTCGGC ACAGACCGGT TCGGGTAAGA CGGTGGCCTT TGGTATCGCA 2450

GTCGCGCCCG ACCTTTTGGG CGACGACAAT ATCCTGCCGC TGAACACGCC 2500

GCCTGTTGCG CTGTTCATCG CCCCCACGCG CGAGCTTGCG CTGCAAGTTG 2550

CTCAGGAACT GACCTGGCTT TACGCCAATG CAGGTGCCCA GATCGCGACC 2600

TGCGTCGGCG GTATGGATTA CCGCACCGAG CGCCGCGCCC TTGCACGTCT 2650

GCCGCAAATC GTTGTCGGCA CGCCCGGCCG TCTGCGCGAC CATATCGACC 2700

GTGGCGGCCT TGACCTGTCC GAATTGCGCG TGACCGTGCT GGACGAAGCG 2750

GATGAGATGC TCGACCTCGG CTTCCGCGAT GATCTGCAAT ATATCTTGCA 2800

AGCCGCGCCC GAAGATCGCC GCACGCTGAT GTTCTCGGCC ACCGTGCCGC 2850

GCGAGATTGA AAAACTGGCC CGCGACTTCC AAAATGACGC CCTGCGTCTG 2900

GAAACCCGTG GCGAGGCCAA GCAGCACAAC GACATCAGCT ACCAAGCTTT 2950

GTCGGTCACC ATGCGCGATC GCGAAAACGC CATTTTCAAC ATGCTGCGTT 3000

TTTATGAATC GCGCACGGCG ATCATCTTCT GCAAGACCCG CGCCAATGTG 3050

AATGATCTGC TGTCGCGGAT GAGCGGTCGT GGCTTCCGCG TGGTGGCCCT 3100

GTCGGGCGAG CTGTCGCAAC AGGAACGCAC CAACGCGCTG CAAGCGCTGC 3150

GTGATGGCCG CGCCAACGTT TGTATCGCGA CCGACGTCGC GGCGCGCGGC 3200

ATTGACTTGC CGGGCCTCGA GCTGGTGATC CACTACGATC TGCCGACCAA 3250

TGCCGAAACC CTGCTGCACC GCTCGGGCCG TACCGGCCGC CGGGTGCCAA 3300

GGGCGTCTCG GCGCTGATCG TCACCCCCGG CGATTTCAAA AAAGCGCAGC 3350

GTTTGCTGAG CTTTGCCAAA GTGACCGCGG AATGGGGCAA GGCGCCTTCG 3400

GCCGAAGA 3408

<210>2

<211>609

<212>PRT

<213>氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)

<220>

<221>SIGNAL

<222>(1)..(31)

<220>

<221>CHAIN

<222>(32)..(609)

<400>2

Met Leu Pro Lys Ser Leu Lys His Lys Asn Gly Ala Met Arg Leu 15

Val Ala Ala Ser Thr Leu Ala Leu Met Ile Gly Ala Gly Ala His 30

Ala Gln Val Asn Pro Val Glu Val Pro Val Gly Ala Asn Glu Thr 45

Phe Thr Ser Arg Val Leu Thr Thr Gly Leu Ser Asn Pro Trp Glu 60

Ile Thr Trp Gly Pro Asp Asn Met Leu Trp Val Thr Glu Arg Ser 75

Ser Gly Glu Val Thr Arg Val Asp Pro Asn Thr Gly Glu Gln Gln 90

Val Leu Leu Thr Leu Thr Asp Phe Ser Val Asp Val Gln His Gln 105

Gly Leu Leu Gly Leu Ala Leu His Pro Glu Phe Met Gln Glu Ser 120

Gly Asn Asp Tyr Val Tyr Ile Val Tyr Thr Tyr Asn Thr Gly Thr 135

Glu Glu Ala Pro Asp Pro His Gln Lys Leu Val Arg Tyr Ala Tyr 150

Asp Ala Ala Ala Gln Gln Leu Val Asp Pro Val Asp Leu Val Ala 165

Gly Ile Pro Ala Gly Asn Asp His Asn Gly Gly Arg Ile Lys Phe 180

Ala Pro Asp Gly Gln His Ile Phe Tyr Thr Leu Gly Glu Gln Gly 195

Ala Asn Phe Gly Gly Asn Phe Arg Arg Pro Asn His Ala Gln Leu 210

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Pro Asp Asn His Val Phe Val Ala Thr Asp Asn Phe Gly Thr Ser 450

Ala Gln Lys Tyr Gly Glu Thr Gly Phe Thr Asn Val Leu His Asn 465

Pro Gly Ala Ile Leu Val Phe Ser Tyr Val Gly Glu Asp Ala Ala 480

Gly Gln Thr Gly Met Met Thr Ala Pro Ala Pro Gln Thr Gln Tyr 495

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<400>3

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<212>PRT

<213>氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)

<220>

<221>SIGNAL

<222>(1)..(31)

<400>4

Met Leu Pro Lys Ser Leu Lys His Lys Asn Gly Ala Met Arg Leu 15

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<210>5

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<212>PRT

<213>氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)

<220>

<221>CHAIN

<222>(1)..(578)

<400>5

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Leu Leu Gly Leu Ala Leu His Pro Glu Phe Met Gln Glu Ser Gly 90

Asn Asp Tyr Val Tyr Ile Val Tyr Thr Tyr Asn Thr Gly Thr Glu 105

Glu Ala Pro Asp Pro His Gln Lys Leu Val Arg Tyr Ala Tyr Asp 120

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Gly Ala Ile Leu Val Phe Ser Tyr Val Gly Glu Asp Ala Ala Gly 450

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Gln Val Pro Ala Glu Gly Ala Gly Ala Gly Ala Thr Glu Val Ala 480

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<212>DNA

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<220>

<223>人工合成的引物序列

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<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工合成的引物序列

<220>

<221>misc_feature

<222>9

<223>n is a or g or c or t

<400>7

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<210>8

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<212>DNA

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cagggtaacc cggtc 15

<210>9

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工合成的引物序列

<400>9

gactcgtttg cgccc 15

Claims

1.一种编码能从L-山梨糖酮生产维生素C、可从Gluconobacteroxydans DSM 4025获得的醛脱氢酶的核酸分子，所述核酸分子选自

(i)SEQ ID NO：1的多核苷酸；

(ii)多核苷酸，所述多核苷酸选自由(a)SEQ ID NO：1中第258-2084位核苷酸、(b)SEQ ID NO：1中第351-2084位核苷酸、(c)SEQID NO：1中第258-1955位核苷酸和(d)SEQ ID NO：1中第351-1955位核苷酸所构成的组；和

(iii)多核苷酸，其选自由(a)编码具有SEQ ID NO：2中氨基酸序列的多肽的多核苷酸、(b)编码由SEQ ID NO：2中第32-609位氨基酸所构成的多肽的多核苷酸、(c)编码由SEQ ID NO：2中第1-566位氨基酸所构成的多肽的多核苷酸和(d)编码由SEQ ID NO：2中第32-566位氨基酸所构成的多肽的多核苷酸所构成的组。

2.一种表达载体，其中包含如权利要求1所述的核酸分子。

3.一种从L-山梨糖酮生产维生素C的方法，所述方法包括：(a)在合适的培养基上培养经权利要求2所述的载体转化的重组微生物；和(b)从所述培养基中回收及分离维生素C，所述微生物在经权利要求2所述的载体转化之前选自Gluconobacter或Acetobacter。

4.权利要求3的方法，其中所述微生物在经权利要求2所述的载体转化之前是Gluconobacter oxydans DSM 4025。