CN104673854A

CN104673854A - 对维生素c的发酵生产

Info

Publication number: CN104673854A
Application number: CN201310048227.9A
Authority: CN
Inventors: 玛丽-加布里埃尔·布泽林奥里夫; 巴斯蒂恩·切弗雷克斯; 马诺拉·达鲁埃格; 玛丽娜·哥德尔范; 马卡斯·戈瑟; 克里纳·豪克; 波图斯·皮埃特·科克曼; 康妮·李; 安妮·弗兰克希斯·梅耶; 安佳·穆利; 奈杰尔·约翰·芒希亚; 迪克·希珀; 新城雅子; 克里斯廷·托佩尔; 阿德里安努斯·维尔赫穆斯·赫曼努斯·沃勒布里吉特
Original assignee: DSM IP Assets BV
Current assignee: DSM IP Assets BV
Priority date: 2005-02-11
Filing date: 2006-02-10
Publication date: 2015-06-03

Abstract

本发明涉及对维生素C的发酵生产。本发明涉及新鉴定出的、能直接生产L-抗坏血酸（下文中也称为维生素C）的微生物。本发明还涉及包含下述基因的多核苷酸序列，所述基因编码维生素C合成中涉及的蛋白质。本发明还涉及：包含该新颖基因的全长多核苷酸序列的多核苷酸及其片段，所述多核苷酸编码的新颖的多肽及其片段，以及它们的功能等同物。本发明还涉及所述多核苷酸和多肽作为生物技术工具在从微生物生产维生素C中的用途，其中对所述多核苷酸和/或被编码的多肽的修饰对微生物中生产所述发酵产物的产率、产量和/或效率有着直接或间接的影响。本发明还包括使用多核苷酸和经修饰的多核苷酸序列转化宿主微生物的方法/工艺。本发明还涉及经过遗传工程改造的微生物及其用于直接生产维生素C的用途。

Description

对维生素C的发酵生产

本发明是申请日为2006年2月10日、申请号为200680011688.7、题为“对维生素C的发酵生产”的申请的分案申请。

本发明涉及多核苷酸和多肽作为生物技术工具在从微生物生产维生素C中的用途，其中所述多核苷酸和/或被编码的多肽对在所述微生物中生产所述发酵产物的产率、产量和/或效率有着直接或间接的影响。本发明还涉及经过遗传工程改造的微生物及其用于直接生产维生素C的用途。

维生素C是对人类来说非常重要且必不可少的营养因子。维生素C还用于动物饲料，尽管一些畜牧动物可自身体内合成维生素C。

在过去的70年中，已通过公知的Reichstein方法从D-葡萄糖对维生素C进行了工业生产。该工艺中的所有步骤都是通过化学方式进行的，只除了其中一个步骤（从D-山梨糖醇到L-山梨糖的转化），其通过微生物转化来进行。从对维生素C的工业生产的最初实践开始，就已使用了多种化学改良和技术改良，来提高Reichstein方法的效率。近来对维生素C生产的发展被概括于Ullmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry,5th Edition,Vol.A27(1996),pp.547ff中。

维生素C生产的不同中间步骤已在微生物或从中分离出的酶的协助下进行。因此，可通过发酵工艺，通过属于例如Ketogulonicigenium属或Gluconobacter属的菌株从L-山梨糖起始来生产2-酮基-L-古洛酸（2-KGA，这是可通过碱性重排反应化学转化为维生素C的中间产物），或者通过属于Gluconobacter属或Pantoea属的重组菌株，从D-葡萄糖起始进行另一种发酵工艺来生产2-酮基-L-古洛酸。

目前用于对维生素进行化学生产的方法具有一些人们不想要的特征，例如高能耗以及要使用大量的有机及无机溶剂。因此，在过去数十年中，人们已在研究更加经济且环保的用微生物转化来制造维生素C的其它方法。

从大量底物（包括D-山梨糖醇、L-山梨糖和L-山梨糖酮）来发酵生产维生素C已在多种微生物中被报道过，所述微生物例如藻类和酵母，其中使用了不同的培养方法。但是，使用这些微生物的缺点在于产生的维生素C的低产率，这是因为已知这些微生物既能生产2-酮基-古洛酸也能生产维生素C，所述微生物更容易合成2-KGA，因此通过微生物生产的维生素C的产率受到相对高的2-KGA生产的限制，例如产生了小于0.1的维生素C与2-KGA浓度比。

因此，人们需要开发出具有更好的工业应用性的生产体系，该体系例如可被操作以获得提高的效价和/或具有减少的发酵时间。一种特别有用的体系运用了编码与膜结合的L-山梨糖酮脱氢酶或与膜结合的PQQ结合D-山梨糖醇脱氢酶的基因。此类体系的一个例子使用了来自GluconobacteroxydansN44-1的编码L-山梨糖酮脱氢酶的基因（下文中称为SNDHai），该酶将L-山梨糖酮转化为L-抗坏血酸。该基因及其同源体已被描述于WO2005/017159中，该公开文本通过引用并入本文。

人们持续需要进一步更优化的发酵体系，用于对维生素C进行微生物生产，以获得比上文描述的体系更高的产率。

令人吃惊地，我们发现，在合适的培养条件下，表达SNDHai的宿主细胞可用于进一步优化对维生素C的直接生产。

这可通过对特定组的基因进行同时操作来达到，在本文中将对这些基因进行进一步描述。此类基因可选自由STS、RCS、SMS或VCS基因构成的组。该组基因/蛋白质以及对每个组的操作将在本文中被进一步描述和举例。

术语“直接发酵”、“直接生产”、“直接转化”等意指微生物能通过一个或多个生物转化步骤将某底物转化为特定的产物，而无需任何额外的化学转化步骤。例如，术语“将D-山梨糖醇直接转化为维生素C”意在描述下述过程，其中，微生物生产维生素C，并且，其中，D-山梨糖醇作为碳源提供，而无需中间产物化学转化步骤。能直接发酵维生素C的单种微生物是优选的。

本文中使用的由遗传改变导致的“提高的”或“维生素C的提高的产率”表示较之没有被遗传改变的微生物而言提高至少5%、10%、25%、30%、40%、50%、75%、100%、200%或者甚至超过500%。此类未被改变的细胞通常也被称为野生型细胞。

因此，在第一个方面，本发明的目的是提供一种对维生素C进行直接发酵生产的方法，所述方法通过在合适的培养条件下培养其基因组已被遗传工程改造的宿主细胞，以及通过从此类细胞或培养基分离维生素C来实现，所述遗传工程改造通过包含下述多核苷酸的DNA序列来进行：

a）编码根据SEQ ID NO：2的L-山梨糖酮脱氢酶或活性片段或其衍生物的多核苷酸，以及

b）编码选自下述组的蛋白质的至少一种多核苷酸，所述组由

1）涉及山梨糖/山梨糖醇代谢系统（Sorbitol/Sorbose MetabolizationSystem，SMS）的蛋白质；

2）涉及穿过细胞膜的糖转运系统（Sugar Transport System，STS）的蛋白质；

3）涉及呼吸链系统（Respiratory Chain System，RCS）的蛋白质；以及

4）显示出与甘露糖-1-磷酸鸟苷酰转移酶/甘露糖-6-磷酸异构酶或肌氨酸氧化酶α亚基或同渗容摩（osmolarity）传感器蛋白envZ rp426或转录调控蛋白OmpR或PetP或肽去甲酰酶或天冬酰胺合酶的相似性的蛋白质

构成。

术语“遗传工程改造”或“遗传改变”表示对活的生物体中遗传物质结构的科学改变。这包括生产和使用重组DNA。更特别地，这用于描述来自天然存在的生物而经遗传工程改造或修饰的生物。遗传工程改造可通过本领域已知的多种方法来进行，例如，基因替换，基因扩增，基因打断，使用质粒、病毒或其它载体进行的转化、转染。经遗传修饰的生物，例如，经遗传修饰的微生物通常还被称作重组生物，例如重组微生物。

SMS蛋白是涉及山梨糖醇/山梨糖代谢系统（Sorbitol/SorboseMetabolization System）的蛋白。多核苷酸和这些多核苷酸编码的蛋白质在本文中被缩写为SMS。SMS蛋白在对D-山梨糖醇或L-山梨糖的直接代谢中发挥作用。

STS蛋白是涉及穿过细胞膜的糖转运系统（Sugar Transport System）的蛋白。多核苷酸和这些多核苷酸编码的蛋白质在本文中被缩写为STS。STS蛋白在对糖、糖醇和相关化合物穿过细胞膜或周质膜的转运中发挥作用。

RCS蛋白是涉及呼吸链系统（Respiratory Chain System）的蛋白。多核苷酸和这些多核苷酸编码的蛋白质在本文中被缩写为RCS。RCS蛋白在生物的公知呼吸链（也被称为电子转移系统）中发挥作用。

根据（b.4）的蛋白涉及维生素C生产系统（Vitamin C productionSystem）。根据本发明的多核苷酸和这些多核苷酸编码的蛋白在本文中被缩写为VCS。迄今为止，人们没有认识到VCS蛋白参与维生素C的生产，也没有认识到其参与与将碳源转化为维生素C相关的生物化学途径。

在一种优选的实施方式中，以下述方式对选自STS、RCS、SMS或VCS蛋白构成的组的蛋白的活性加以操作，所述方式使得所述宿主细胞生产的维生素的产率和/或生产效率较之所述蛋白的野生型副本有所提高。术语“操作”在本文中意欲包括对基因的遗传修饰或改变，包括修饰其表达水平，优选通过分子生物学技术来进行。特别地，该术语意欲包括对蛋白活性的上调或下调，此类调控可通过上调或下调编码该蛋白的基因来达成。上文详细描述的用于上调或下调某蛋白活性的其它方法也可用于本发明的该实施方式。

本发明的另一目的是提供包含此类多核苷酸的载体，特别是表达载体的形式。

此外，本发明还有一个目的是提供生产经遗传工程改造的宿主细胞的方法，例如，用此类DNA序列载体转化的宿主细胞。这可例如通过将本文示例的多核苷酸转移进重组或非重组宿主细胞来实现，所述宿主细胞可以含有或可以不含相应基因的内源等同物。此类经转化的细胞也是本发明的目的。

从从属权利要求显而易见本发明的有利实施方式。本发明的这些方面和其它方面、这些实施方式和其它实施方式对于本领域技术人员来说，应从本文教导显而易见。

用作为外源核酸分子受体的任何细胞可用作为宿主细胞，例如携带可复制表达载体或克隆载体的细胞或者通过公知技术进行了遗传工程改造或遗传改变以在其染色体或基因组上含有想要的基因的细胞。宿主细胞可以是原核来源或真核来源的，例如细菌细胞、动物细胞（包括人类细胞）、真菌细胞（包括酵母细胞）和植物细胞。优选地，宿主细胞是微生物。更优选地，所述微生物属于能体内表达活性形式的L-山梨糖酮脱氢酶的细菌。

在根据本发明改变后能以良好数量直接生产维生素C的已知细菌包括来自Ketogulonicigenium、Pantoea、Pseudomonas或Escherichia或Corynebacterium属和乙酸细菌的菌株。

可用于本发明以提高对维生素C的直接生产的微生物可被公众从不同来源获得，例如，Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen(DSMZ),Mascheroder Weg1B,D-38124Braunschweig,Germany、American Type Culture Collection(ATCC),P.O.Box1549,Manassas,VA20108USA或Culture Collection Division,NITE BiologicalResource Center,2-5-8,Kazusakamatari,Kisarazu-shi,Chiba,292-0818,Japan（以前是Institue for Fermentation,Osaka(IFO),17-85,Juso-honmachi2-chome,Yodogawa-ku,Osaka532-8686,Japan）。保存到IFO的优选的细菌的例子例如是Gluconobacter oxydans（以前被称为G.melanogenus）IFO3293、Gluconobacter oxydans（以前被称为G.melanogenus）IFO3292、Gluconobacter oxydans（以前被称为G.rubiginosus）IFO3244、Gluconobacter frateurii（以前被称为G.industrius）IFO3260、Gluconobacter cerinus IFO3266、Gluconobacter oxydans IFO3287和Acetobacter aceti subsp.orleanus IFO3259，上述这些都于1954年4月5日被保藏；1975年10月22日保藏的Acetobacter aceti subsp.xylinum IFO13693和1977年12月8日保藏的Acetobacter aceti subsp.xylinum IFO13773。菌株Acetobacter sp.ATCC15164也是优选细菌的例子，其被保藏于ATCC。菌株Gluconobacter oxydans（以前被称为G.melanogenus）N44-1是优选细菌的另一个例子，其是菌株IFO3293的衍生物，在Sugisawa et al.,Agric,Biol.Chem.54:1201-1209,1990中对其有所描述。

乙酸细菌在本发明中是优选的，以从大量底物（包括D-山梨糖醇、L-山梨糖和L-山梨糖酮）以高产率直接生产维生素C。来自Gluconobacter,Gluconacetobacter和Acetobacter属的菌株是进一步优选的，已发现它们能从L-山梨糖酮直接生产维生素C，而发现至少Gluconobacter oxydans DSM17078能从D-山梨糖醇、L-山梨糖或L-山梨糖酮直接生产维生素C。已按照《布达佩斯条约》，于2005年1月26日将Gluconobacter oxydans DSM17078（以前称作Gluconobacter oxydans N44-1）保藏至DeutscheSammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen(DSMZ),Mascheroder Weg1B,D-38124Braunschweig,Germany。

特别地，本发明涉及直接生产维生素C的方法，其中将本文公开的多核苷酸的组合或者下文描述的经修饰多核苷酸序列的组合引入合适的维生素，在允许以高生产能力、产率和/或效率生产维生素C的条件下培养重组微生物，从培养集中分离出生产的发酵产物，以及可选地，对其进行进一步纯化。

若干种底物可在上述工艺中用作为碳源。特别适用的碳源是可以容易地从D-葡萄糖或D-山梨糖醇代谢途径获得的那些，例如，D-葡萄糖、D-山梨糖醇、L-山梨糖、L-山梨糖酮、2-酮基-L-古洛糖酸盐/酯、D-葡萄糖酸盐/酯、2-酮基-D-葡萄糖酸盐/酯，或2,5-二酮基-葡萄糖酸盐/酯。优选地，底物选自，例如，D-葡萄糖、D-山梨糖醇、L-山梨糖或L-山梨糖酮，更优选地，选自D-葡萄糖、D-山梨糖醇或L-山梨糖，以及最优选地，选自D-山梨糖醇或L-山梨糖。在涉及使用微生物进行上述工艺时，术语“底物”和“生产底物”在本文中可互换使用。

在涉及上述工艺的方面，使用微生物将底物转化为维生素C表示通过微生物来转化底物，导致产生维生素C，即，可直接将底物转化为维生素C。在允许上文定义的从底物进行的此类转化的条件下培养所述微生物。

在本文中用于使用微生物进行的上述工艺的培养基可以是用于生产维生素C的任何合适的培养基。典型地，该培养基是包含例如盐和（多种）底物，并具有一定pH的水性培养基。其中底物被转化为维生素C的培养基也被称为生产培养基。

本文中使用的“发酵”或“生产”或“发酵工艺”可以是：利用技术人员已知的培养基、条件和方案，使用生长中的细胞或使用非生长中的所谓静止细胞，这在适合于将合适的底物转化为想要的产物（例如维生素C）的条件下，使用技术人员已知的培养基、条件和方案对所述静止细胞进行培养之后进行。

在关于使用微生物进行上述工艺的方面，应当理解，上述微生物还包括此类菌株的具有同样生理属性的异名（synonym）或基原异名（basonym），其如International Code of Nomenclature of Prokaryotes所定义。本文中使用的对微生物的命名是International Committee on Systematicsof Prokaryotes and the Bacteriology and Applied Microbiology Division of theInternational Union of Microbiological Societies官方接受的（在优先权申请的提交日期时），并被其官方出版物International Journal of Systematic andEvolutionary Microbiology(IJSEM)所公开。具体的参考文献是Urbance etal.,IJSEM(2001)vol51:1059-1070，以及IJSEM(2001)vol51:1231-1233上的修订通知，其中描述了对作为Ketogulonicigenium vulgare的G.oxydansDSM4025的分类学上的重新归类。

本文中使用的静止细胞指下述微生物的细胞，所述微生物例如是存活但不能活跃生长的，或者是以低的比生长速率[μ]生长的，例如，低于0.02h^-1的生长速率，优选地，低于0.01h^-1。显示出上述生长速率的细胞被称为“静止细胞模式”。

如上所述使用微生物来进行的本发明的工艺可以以不同的步骤或阶段来进行：优选地，在第一个步骤（也被称为步骤（a）或生长阶段）中，于能够生长的条件下对微生物进行培养。通过改变条件来终止该阶段，其中，所述条件改变使得微生物的生长速率降低，导致静止细胞产生，这也被称为步骤（b），接着是用（b）的静止细胞从底物来生产维生素C，这也被称为生产阶段。

使用微生物的上述工艺中进行的生长阶段和生产阶段可在同样的容器中进行，即，仅有一种容器，或在两种或更多的不同容器中进行，在两个阶段之间具有可选的分离步骤。可通过任何合适的手段从细胞中回收得到产生的维生素C。“回收”指，例如，可将维生素C从生产培养基中分离出来。可选地，可对由此产生的维生素C进行进一步加工。

就关于进行上述工艺的本发明的目的而言，术语“生长阶段”、“生长步骤”和“生长时期”在本文中可互换使用。这同样适用于“生产阶段”、“生产步骤”、“生产时期”。

进行上述工艺的一种途径可以是下述工艺，其中：微生物生长于第一容器（所谓的生长容器）中，它们作为静止细胞的来源，细胞中的至少一部分被转移到第二容器（所谓的生产容器）中。生产容器中的条件可以是：使得从生长容器中转移出的细胞变为上文定义的静止细胞的条件。维生素C在第二容器中产生，并从其中被回收。

在关于进行上述工艺的方面，生长步骤可在水性培养基中进行，即，补充有用于在需氧条件下生长的合适营养物的生长培养基。培养可以以，例如，分批、补料分批、半连续或连续模式来进行。培养时间可以例如随所用的细胞种类、pH、温度和营养培养基而变化，其可以为例如：以分批或补料分批模式进行时，大约10小时至大约10天之间，优选为大约1天至大约10天之间，更优选地，大约1至大约5天，这取决于所述微生物。如果细胞以连续模式被培养，驻留时间可以例如为大约2至大约100小时，优选地，大约2至大约50小时，这取决于所述微生物。如果微生物选自细菌，培养可进行于大约3.0至大约9.0的pH下，优选为大约4.0至大约9.0，更优选地，大约4.0至大约8.0，进一步更优选地，大约5.0至大约8.0。如果使用了藻类或酵母，培养可进行于低于大约7.0的pH下，优选低于大约6.0，更优选低于大约5.5，最优选地，低于大约5.0。用于使用细菌进行培养的合适的温度范围可以为，例如，大约13°C至大约40°C，优选地，大约18°C至大约37°C，更优选地，大约13°C至大约36°C，最优选地，大约18°C至大约33°C。如果使用藻类或酵母，用于进行培养的合适的温度范围可以例如为，大约15°C至大约40°C，优选地，大约20°C至大约45°C，更优选地，大约25°C至大约40°C，进一步更优选地，大约25°C至大约38°C，最优选地，大约30°C至大约38°C。用于进行培养的培养基通常可以含有下述营养物作为可被吸收的碳源，例如，甘油、D-甘露醇、D-山梨糖醇、L-山梨糖、赤藻糖醇、核糖醇、木糖醇、阿糖醇、肌糖、半乳糖醇、D-核糖、D-果糖、D-葡萄糖和蔗糖，优选地，L-山梨糖、D-葡萄糖、D-山梨糖醇、D-甘露醇和甘油；并且含有可消化的氮源，例如，有机物质，例如，蛋白胨、酵母提取物和氨基酸。所述培养基可以含有或不含有尿素和/或玉米浸出液和/或面包酵母。多种无机物质也可被用作为氮源，例如，硝酸盐和铵盐。此外，生长培养基通常含有无机盐，例如，硫酸镁、硫酸锰、磷酸钾和碳酸钙。

在关于进行上述工艺的方面，比生长速率例如为至少0.02h^-1。对于以分批、补料分批或半连续模式生长的细胞而言，生长速率取决于，例如，生长培养基的组成、pH、温度等。通常，生长速率可以例如在大约0.05至大约0.2h^-1的范围内，优选地，在大约0.06至大约0.15h^-1的范围内，最优选地，在大约0.07至大约0.13h^-1的范围内。

在使用微生物进行的上述方法的另一个方面，可通过在琼脂平板（作为生长容器）上对各个微生物进行培养来提供静止细胞，其中使用了基本上相同的条件，例如，如上所述的培养时间、pH、温度、营养培养基，并添加有琼脂。

如果生长和生产阶段进行于两种不同的容器中，那么来自生长阶段的细胞可被收获或浓缩，并转移至第二容器（所谓的生产容器）中。该容器可以含有补充有任何适用的生产底物（可通过细胞被转化为维生素C）的水性培养基。可通过任何合适的操作来收获或浓缩来自生长容器的细胞，所述操作例如，离心、膜横流（membrane crossflow）超滤或微滤、过滤、倾析、絮凝。由此获得的细胞还可以以原始培养液的形式从生长容器转移至生产容器中，而不用被收获、浓缩或洗涤，即，以细胞悬浮液的形式被转移。在一种优选的实施方式中，细胞以细胞悬浮液的形式从生长容器被转移至生产容器，在它们之间没有任何洗涤或分离步骤。

如果生长和生产阶段进行于同样的容器中，细胞可以生长于适当的条件下，以达到理想的细胞密度，接着用含有生产底物的生产培养基来替换生长培养基。此类替换可以例如是，在从容器中收回或收获上清液的同时，并以与之相同的速度，将生产培养基补入到容器中。为将静止细胞保留于容器中，可以使用用于细胞回收或驻留的操作，例如，细胞回收步骤。此类回收步骤，例如包括但不限于如下的方法：使用离心机、过滤器、超滤步骤的膜横流微滤、膜反应器、絮凝或在合适的多孔、非多孔或聚合物基质上的细胞固定。在转移阶段之后，对容器应用下述工艺条件：在此条件下，细胞以如上文定义的静止细胞模式存在，并且，生产底物能有效地转化为维生素C。

在使用微生物进行上述工艺的方面，用于生产步骤中的生产容器中的水性培养基在下文中被称为生产培养基，其可以仅含有将被转化为维生素C的生产底物，或还可以含有额外的无机盐，例如，氯化钠、氯化钙、硫酸镁、硫酸锰、磷酸钾、磷酸钙和碳酸钙。生产培养基还可以含有可消化的氮源，例如有机物质，例如，蛋白胨、酵母提取物、尿素、氨基酸和玉米浸出液；以及无机物质，例如，氨、硫酸铵和硝酸钠，其浓度为使得细胞被保持为上文定义的静止细胞模式的浓度。培养基可以含有或不含有尿素和/或玉米浸出液和/或烘焙酵母。生产步骤可以，例如，以分批、补料分批、半连续或连续模式进行。在补料分批、半连续或连续模式下，来自生长容器和生产培养基的两种细胞都可以以合适的补料速率被连续或间歇地补入到生产容器中。或者，仅生产培养基可被连续或间歇补入到生产容器中，而来自生长容器的细胞被一次性转移至生产容器。来自生长容器的细胞可在生产容器中用作为细胞悬浮液，或者可被用作为：例如，在任何固相（例如，多孔或聚合物基质）上絮凝或固定的细胞。生长时期被定义为从底物进入到生产容器中开始，到收获含有维生素C的上清液（即所谓的收获流）之间的时期，该时期可根据，例如，使用的细胞的浓度和种类、pH、温度和营养培养基而变动，其优选在大约2至大约100小时之间。pH和温度可与生长步骤中的pH和温度不同，但应与生长步骤中的基本上相同。

在一种优选的实施方式中，生产步骤可以以连续模式进行，这意味着，含有来自生长容器的细胞的第一种补料流和含有底物的第二种补料流被连续或间歇补入到生产容器中。第一种流可以仅含有从生长培养基中分离/分开的细胞，或可以含有直接来自生长步骤的细胞悬浮液，即，悬浮于生长培养基中的细胞，而没有任何中间的细胞分离、洗涤和/或分离步骤。在本文中定义的第二种补料流可以包括生产步骤的操作所需要的所有其它补料流，例如，以一种或多种不同的流的形式存在的包含底物的生产培养基、用于稀释的水以及用于控制pH的碱。

在关于进行上述工艺的方面，当两种流都连续补料时，第一种流的补料速率与第二种流的补料速率之比可在大约0.01至大约10之间变动，优选地，在大约0.01至大约5之间变动，最优选地，在大约0.02至大约2之间变动。该比例取决于第一种和第二种流中各自的细胞和底物的浓度。

进行本发明的使用微生物的上述工艺的另一种途径可以是：在生产容器中使用一定细胞密度的静止细胞的工艺。通过技术人员已知的方法，于600nm处，细胞密度作为吸收单位（光学密度）被测得。在一种优选的实施方式中，生产步骤中的细胞密度为至少大约10，更优选地，大约10至大约200之间，进一步更优选地，大约15至大约200之间，进一步更优选地，大约15至大约120之间，最优选地，大约20至大约120之间。

为在生产阶段期间（例如，以连续或半连续模式进行的），以想要的细胞密度将细胞保持于生产容器中，本领域内已知的任何手段都可以使用，例如，通过离心、过滤、微滤的膜横流超滤、倾析、絮凝进行的细胞再利用，通过膜设备进行的细胞驻留，或细胞固定。此外，在生产步骤以连续或半连续模式进行的情况下，从生长容器中连续或间歇补入细胞，生产容器中的细胞密度可被保持于恒定的水平，这例如，通过从生产容器中收获一定量的细胞来进行，所述的量对应于从生长容器中补入的细胞的量。

在关于进行上述工艺的方面，从生产容器中回收/收获在所谓的收获流中含有的产生出的维生素C。收获流可以包括，例如，来自生产容器的不含细胞的水溶液或含有细胞的水溶液，其中含有通过生产容器中的静止细胞从生产底物转化得到的维生素C。可通过本领域内已知的任何操作，将仍处于收获流中的细胞与维生素C分开，例如，过滤、离心、倾析、膜横流超滤或微滤、切线流超滤或微滤或死端（dead end）过滤。在该细胞分离操作之后，收获流中基本不含细胞。

在另一个方面，本发明的工艺可组合有将产生的维生素C与收获流中含有的其它组分分离和/或纯化的额外步骤，即，所谓的下游加工步骤。这些步骤可包括技术人员已知的任何手段，例如，浓缩、结晶、沉淀、吸附、离子交换、电渗析、两极膜电渗析和/或反渗透。维生素C可作为游离酸形式或其已知的任何盐的形式被进一步纯化，这是通过下述操作手段来进行的，例如，用活性炭进行处理、离子交换、吸附和洗脱、浓缩、结晶、过滤和干燥。特别地，将维生素C与收获流中其它组分的第一次分离可通过例如下述方法的任何合适的组合或重复来进行，所述方法例如：两区室或三区室电渗析、两极膜电渗析、反渗透或吸附（其进行于，例如，离子交换树脂上或非离子树脂上）。如果获得的维生素C的形式为维生素C的盐，将该盐形式转化为游离酸形式可通过例如，两极膜电渗析、离子交换、模拟移动床色谱技术等来进行。上述步骤的组合也可使用，例如，将电渗析和两极膜电渗析组合为一个步骤，以及使用模拟移动床色谱方法的多个离子交换步骤的组合。上述任何方案单独或组合就构成了用于分离和纯化产物（即维生素C）的方便的手段。由此获得的产物还可被进一步分离（例如，通过浓缩、结晶、沉淀、对晶体的洗涤和干燥的方式来进行）和/或进一步纯化（用活性炭处理、离子交换和/或重结晶）。

在上述工艺的一种优选的实施方式中，通过一系列上述下游加工步骤来从收获流中纯化维生素C，而不必在该加工中的任何时刻将其转移到非水性溶液中，即，所有步骤都在水性环境中进行。此类优选的下游加工方案可以包括，例如，通过两区室或三区室电渗析对来自生产容器的收获流进行浓缩，通过两极膜电渗析和/或离子交换将浓缩溶液中以其盐的形式存在的维生素C转化为其酸的形式，通过例如用活性炭、离子交换或非离子树脂进行处理等方法来进行纯化，接着进行进一步的浓缩步骤和结晶。这些晶体可被分离、洗涤和干燥。如果必要的话，晶体还可被重新溶解于水中，用活性炭和/或离子交换树脂对其进行处理，并重结晶。然后可对上述晶体进行分离、洗涤和干燥。

根据本发明，携带有根据本发明的SNDHai基因以及至少一种经遗传工程改造的、如本文所示例的选自SMS、STS、RCS和VCS构成的组的基因的宿主细胞（特别是来自Gluconobacter、Gluconacetobacter和Acetobacter属的重组微生物）能从合适的碳源以比其它已知生物显著更高的产率、生产能力和/或效率直接生产维生素C，例如，在静止细胞方法中测量时，20小时的温育期后，从D-山梨糖醇或L-山梨糖分别为300mg/l或更多的量，或800mg/l或更多的量。在静止细胞方法中测量时，20小时的温育期后，从D-山梨糖醇生产的维生素C的产率可以甚至高达400、600、1000mg/l或者甚至超过1.5、2、4、10、20、50、100g/l。在静止细胞方法中测量时，20小时的温育期后，从L-山梨糖生产的维生素C的产率可以甚至高达1000mg/l，或者甚至超过1.5、2、4、10、20、50、100g/l。

SEQ ID NO：2所示以及本文描述的SNDHai蛋白在微生物中的直接维生素C生产中具有重要功能，特别是在细菌中，例如乙酸细菌中，例如Gluconobacter、Gluconacetobacter和Acetobacter中，即其功能较之野生型副本有所增强或提高的微生物中。这意味着：当具有SNDHai活性的蛋白在特别合适的宿主生物中表达或优选过量表达时，对维生素C的直接生产就被增强和/或增加和/或提高。

当至少一种编码选自SMS、STS、RCS或VCS系统构成的组的蛋白的多核苷酸被同时改变时，在此类宿主生物中对维生素C的生产被进一步提高。

SNDHai蛋白可由SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列或与其基本相同的多核苷酸编码，SEQ ID NO：1是从G.oxydans DSM17078分离的。

在本文上下文中，应当注意，关于SNDHai编码序列时提到“与……基本相同的多核苷酸”的表达指选自下述组的多核苷酸序列或此类多核苷酸的互补链，所述组由

a）多核苷酸，其包含根据SEQ ID NO：1的核苷酸序列

b）多核苷酸，其包含可使用来自微生物的DNA作为模板，使用根据SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的引物组，通过核酸扩增，例如聚合酶链式反应获得的核苷酸序列；

c）多核苷酸，其包含编码含有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽的片段或衍生物的核苷酸序列，或包含编码由（a）或（b）中任何多核苷酸编码的多肽的片段或衍生物的核苷酸序列，其中，在所述衍生物或片段中，一个或多个氨基酸残基较之所述多肽而言被保守取代，并且，所述片段或衍生物具有SNDHai多肽的活性；

d）多核苷酸，其编码SNDHai多肽，其互补链在严谨条件下能与编码包含根据SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽的多核苷酸杂交，或与（a）至（c）中任一条定义的多核苷酸杂交；

e）多核苷酸，其编码SNDHai多肽，并且，其与编码包含根据SEQID NO：2的氨基酸序列的多肽的多核苷酸、或与（a）至（c）中任一条定义的多核苷酸至少70%相同，例如85、90或95%相同

构成。

根据SEQ ID NO：2的多核苷酸是按照实施例38所述的方法，从多种不同微生物中分离的，按照实施例39和40所述，在活性试验中证实了针对其指出的功能。

SNDHai活性在本文中被定义为能将L-山梨糖酮直接转化为抗坏血酸的酶活性。

可使用cDNA、mRNA或者基因组DNA作为模板，使用合适的寡核苷酸引物，例如根据SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的核苷酸引物，根据标准PCR扩增技术，通过核酸扩增获得上文定义的核酸。由此扩增的核酸可被克隆进合适的载体，并通过DNA序列分析对其加以表征。

本发明还包括编码保留有从L-山梨糖酮生产维生素C的L-山梨糖酮脱氢酶活性的多肽的部分多肽序列的多核苷酸，例如，SEQ ID NO：12、14、16、18、20、22和27所示的多肽。多肽优选包含选自本申请公开的多肽的氨基酸序列的至少25个连续的氨基酸的部分氨基酸序列。本领域技术人员知道如下事实：多肽的某些小片段是生物活性所必要的。但是，存在其它一些区域，其中可插入、缺失氨基酸或用其它氨基酸进行取代，优选地，与被替换的氨基酸相似的其它氨基酸取代。

本文中使用的“活性片段或衍生物”表示保留有与SEQ ID NO：2所示的多肽基本相同的生物功能或活性的多肽。生物活性的例子可以例如是酶活、信号传递活性或抗体反应活性。术语“相同的生物功能”或“功能等同物”在本文中使用时表示蛋白质与SEQ ID NO：2所示的多肽具有基本相同的生物活性，例如，酶活性、信号传递活性或者抗体反应活性。

D-山梨糖醇或L-山梨糖的代谢包括：一方面，将这些化合物吸收进胞质溶胶，以及进一步转化为可用于吸收途径的代谢物，所述吸收途径例如Embden-Meyerhof-Parnas途径、磷酸戊糖途径、Entner-Doudoroff途径以及三羧酸循环，它们都涉及对于活的细胞的生长和维持来说必要的全部关键的能量形成和合成代谢反应。另一方面，D-山梨糖醇或L-山梨糖的代谢还包括通过所谓的不完全氧化过程将这些化合物转化为经进一步氧化的产物，例如L-山梨糖酮、2-KGA和维生素C。

SMS蛋白在本文中被定义为涉及山梨糖醇/山梨糖代谢系统的蛋白。优选地，SMS蛋白选自与膜结合的PQQ依赖性的D-山梨糖醇脱氢酶、与膜结合的L-山梨糖脱氢酶、与膜结合的L-山梨糖酮脱氢酶、与膜结合的FAD依赖性的D-山梨糖醇脱氢酶、胞质NAD依赖性的D-山梨糖醇脱氢酶、NAD(P)依赖性的D-山梨糖醇脱氢酶（也被称为NADPH依赖性的山梨糖还原酶）、NAD依赖性的木糖醇脱氢酶、NAD依赖性的醇脱氢酶、与膜结合的L-山梨糖脱氢酶、NAD(P)H依赖性的L-山梨糖还原酶、胞质NADP依赖性的山梨糖酮脱氢酶、胞质NAD(P)H依赖性的L-山梨糖酮还原酶、与膜结合的醛脱氢酶、胞质醛脱氢酶、3-磷酸甘油脱氢酶、3-磷酸甘油醛脱氢酶构成的组。进一步更优选的SMS蛋白选自氧化还原酶家族，更优选地，Nomenclature Committee of the International Union ofBiochemistry and Molecular Biology（NC-IUBMB）推荐的氧化还原酶[EC1]。特别优选的是在供体的CH-OH基团上发挥作用的氧化还原酶[EC1.1]，特别是以NAD⁺或NADP⁺作为受体的氧化还原酶[EC1.1.1]以及具有其它受体的氧化还原酶[EC1.1.99]，或者在供体的醛或氧代基团上发挥作用的氧化还原酶[EC1.2]，特别是以NAD⁺或NADP⁺作为受体的氧化还原酶[EC1.2.1]。进一步更优选地，它们选自属于[EC1.1.1.1]、[EC1.1.1.15]或[EC1.2.1.-]的酶组的脱氢酶。

可通过技术人员公知的方法来测定SMS蛋白的生物活性、酶活性或其它活性，所述方法例如：在存在其底物、电子受体或供体（包括吩嗪硫酸甲酯（PMS）、二氯苯酚-吲哚苯酚（DCIP）、NAD、NADH、NADP、NADPH，可通过光度、色度或荧光方法对其消耗进行直接或间接测量）以及其它可能与活性的发展相关的无机组分的情况下，温育含有SMS蛋白的膜级分（membrane fraction）。因此，例如，可在下述试验中测量与膜结合的D-山梨糖醇脱氢酶的活性，所述试验中，在存在pH6的磷酸盐缓冲液、D-山梨糖醇和人工电子受体DCIP和PMS的情况下，温育含有该酶的膜级分。可在600nm处测量DCIP的消耗速率，其与膜级分中存在的D-山梨糖醇脱氢酶活性直接成正比。

因此，例如，通过增加对D-山梨糖醇代谢途径的不完全氧化中涉及的SMS蛋白的活性，我们可以获得从D-山梨糖醇到产物（例如维生素C）的转化产率的增加。在另一例子中，通过降低将D-山梨糖醇吸收进中央代谢所涉及的SMS蛋白的活性，我们也可以获得从D-山梨糖醇到产物（例如维生素C）的转化产率的增加。

STS蛋白通常是与膜结合的，或者与与膜结合的结构相关，并且作为单个蛋白发挥作用，或者作为蛋白复合体（例如透性酶或活性转运蛋白）中的亚基发挥作用。已知STS蛋白作用于选择性促进、协助或使得化合物（例如糖、糖醇、糖酮或糖醛）能够穿过细胞膜或周质膜转运。

STS蛋白可基于其机制被分为三类。第一组转运蛋白使用来自质子推动的力量，以将分子转运经过浓度梯度。这些同向转运和反向转运系统偶联有两种不同分子穿过膜的运动（通过具有两个针对两个不同分子的不同结合位点的透性酶来实现）；在同向转运中，两个分子以同样的方向转运，而在反向转运中，一个分子被运入，而另一个被运出。

第二组转运蛋白，磷酸转移酶系统（PTS），的能量来自磷酸烯醇丙酮酸的高能磷酸基团经由多种蛋白组分向底物的转移，在运入时底物被磷酸化为其磷酸酯形式。

第三组转运蛋白将ATP的水解和底物转运偶联起来。这些系统被称为ATP结合盒（ABC）型转运蛋白。ABC转运系统由底物特异性结合蛋白（其位于革兰氏阴性细菌的周质，或者是与革兰氏阳性相关的膜）、完整膜结构与和胞质面对的ATP水解结构域构成。

关于膜转运蛋白的更为详细的描述可在Bamberg,E.et al.(1993)“Charge transport of ion pumps on lipid bilayer membranes”,Q.Rev.Biophys.26:1-25;Findlay,J.B.C.(1991)“Structure and function of membrane transportsystems”,Curr.Opin.Struct.biol.1:804-810;Higgins,C.F.(1992)“ABCtransporters from microorganism to man”Ann.Rev.Cell Biol.8:67-113;Gennis,R.B.(1989)“Pores,channels and trasnporters”in:Biomembranes,MolecularStructure and Function,Springer,Heidelberg,p.270-322;Nikaido,H.&SaierH.(1992)“Transport proteins in bacteria:common themes in their design”Science258:936-942中找到。

在一种实施方式中，本发明的STS蛋白选自转移酶[EC2]，优选地，转移含磷基团的转移酶[EC2.7]，更优选地，用醇基团作为受体的磷酸转移酶[EC2.7.1]以及用含氮基团作为受体的磷酸转移酶[EC2.7.3]，最优选地，蛋白质-np-磷酸组氨酸-糖磷酸转移酶[EC2.7.1.69]和磷酸烯醇丙酮酸-蛋白质磷酸转移酶[EC2.7.3.9]或者选自水解酶[EC3]，优选地，作用于酸酐的水解酶[EC3.6]。

此外，本发明的STS蛋白可选自糖转运蛋白和/或糖醇转运蛋白，优选地，转运蛋白和周质结合/转移蛋白，更优选地，周质山梨糖醇结合蛋白、周质溶质结合蛋白、周质D-阿洛糖结合蛋白，海藻糖/麦芽糖ABC转运蛋白（包括例如膜组分的亚基），甘露糖醇/山梨糖醇ABC型转运蛋白（包括例如MtlK ATP酶或膜（MtlG或MtlF）组分的亚基）以及涉及PTS的蛋白，包括PtsI酶I、Hpr蛋白、酶IIAMan、P-环ATP酶蛋白家族或Hpr激酶。

可通过技术人员公知的方法来测定STS蛋白的生物活性、酶活性或其它活性，所述方法例如：将含有STS蛋白的膜级分与经放射性标记的、可被STS蛋白主动转运的糖或糖醇温育。包括进细胞物质的放射性与转运蛋白的活性直接成正比。因此，例如，可在下述试验中测量与膜结合的D-山梨糖醇脱氢酶的活性，所述试验中，在存在pH6的磷酸盐缓冲液以及经放射标记的碳源（例如葡萄糖）的情况下，温育含有特定转运蛋白的完整细胞。可通过技术人员已知的方法来测量放射性碳源（例如葡萄糖）被细胞吸收的速率，其与膜级分中存在的STS蛋白活性直接成正比。

因此，例如，通过以使其活性降低的方式修饰涉及D-山梨糖醇、L-山梨糖或L-山梨糖酮的STS基因/蛋白，可以减少这些分子被吸收的数量或者它们被转移至细胞的速率。在这种情况下，依赖于这些化合物在膜水平上的转化的一种或多种发酵产物（例如维生素C）的产量和/生产效率可能被提高。在该例子中，应当以使得对应的STS蛋白具有降低或无效（即，变为没有功能的）的活性的方式来修饰各STS基因/蛋白。

已知RCS蛋白在下述机制中很重要，通过该机制，细胞中通过氧化还原反应产生的电子被进一步转移，这通常通过涉及辅助因子和氧化酶以及最终电子受体的一系列氧化还原反应来进行。

活的生物体用于生产必要活动所需的能量的主要机制是呼吸。在高等生物中，碳水化合物、蛋白质、脂肪酸在胞质中通过糖酵解异化途径以及氧化过程被代谢为乙酰-CoA。乙酰-CoA再通过被称为柠檬酸循环的一系列反应（发生于线粒体中）被进一步代谢。从这些反应获得的能量用于产生以例如FADH₂和NADH的形式贮存的还原能量。然后这些化合物用于所谓的电子转移链，电子转移链是一系列氧化还原链式反应，其中涉及位于线粒体内膜中的不同组分。最终电子受体是氧，其再与从反应链获得的质子反应，形成水。从该过程获得的质子浓度梯度是ATP合成的驱动力。

在细菌中，该基础呼吸过程遵循同样的生理原理，但可能以不同方式进行，并且涉及不同组分、中间产物、酶复合体以及终产物。细菌呼吸过程的效率变化可以很大，这取决于每个物种所表达的功能性生物组分，这进而取决于可获得的遗传机制以及取决于给定的生长条件。

举例而言，乙酸细菌（其是专性需氧的革兰氏阴性微生物，属于Acetobacter、Gluconobacter和Gluconacetobacter属）在能量产生过程的方面呈现出特殊的性质。这些细菌因其能不完全氧化不同的底物（例如醇、糖、糖醇以及醛）而为人们所公知。这些过程为人们所已知并通常被称为氧化发酵，它们已被长时间应用于食品和化学工业中，尤其是对醋和L-山梨糖的生产中。已知使用属于Gluconobacter属的菌株从不完全氧化获得的有用产物是：对从D-山梨糖醇和L-山梨糖起始而言，2-酮基-L-古洛酸（2-KGA）；对从D-葡萄糖起始而言，5-酮基-D-古洛酸（这是用于对D-酒石酸进行生物合成的前体）。对乙酸细菌来说，不完全氧化是产生能量的主要机制。它们通过位于周质空间中、周质膜上以及胞质中的不同的脱氢酶完成这些反应。不同的脱氢酶使用不同的辅助因子，最常见的是用于膜结合酶或周质酶的PQQ和FAD，以及用于胞质酶的NAD/NADP。Gluconobacter/Gluconacetobacter和Acetobacter菌株的电子转移链已知分别包括辅酶Q10（CoQ10）和CoQ9作为用于所有过程的通用电子转移化合物，在一些情况下，所述电子转移链包括某些种类的细胞色素c元件（element）。据报道，Gluconobacter菌株不含细胞色素c氧化酶，但其具有其它类型的末端氧化酶，例如bo类型的。

在一种优选的实施方式中，涉及电子转移的RCS蛋白或蛋白亚基选自呼吸链蛋白，更优选地，它们选自作为载体蛋白发挥作用或在辅助因子和/或辅基（prosthetic group）的生物合成中发挥作用的蛋白，特别是涉及辅助因子和/或它们的前体（例如FAD、NAD、NADP、PQQ、泛醌（包括CoQ10）、细胞色素a、b、c、d以及亚铁血红素的生物合成中发挥作用的蛋白。最优选地，它们选自PQQ生物合成蛋白（例如PQQ生物合成蛋白A、B、C、D、E）或亚铁血红素输出蛋白（例如CcmA或CcmB）。

在另一优选的实施方式中，涉及电子转移的RCS蛋白或蛋白亚基选自Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry andMolecular Biology（NC-IUBMB）推荐的氧化还原酶[EC1]，更优选地在作为供体的联苯酚以及相关物质上发挥作用的氧化还原酶[EC1.10]，特别是用氧作为受体的氧化还原酶[EC1.10.3]或具有其它受体的氧化还原酶[EC1.1.99]，特别是醇脱氢酶（受体）[EC1.1.99.8]。最优选地，它们选自属于氧化酶家族的蛋白，特别是对氰化物不敏感的bd型末端氧化酶亚基I和II，对氰化物敏感的bo型末端氧化酶亚基I、II、III和IV，细胞色素c氧化酶亚基，特别是与膜结合的醇脱氢酶g3-ADH细胞色素c亚基。

可通过技术人员公知的方法来测定RCS蛋白的生物活性、酶活性或其它活性，所述方法例如：在存在辅酶Q2（CoQ2）——一种人工电子受体的情况下，温育含有RCS蛋白的无细胞提取物或膜级分（membranefraction），以及通过例如Clark型氧电极（Rank Brothers,Cambridge,United Kingdom）等方来测量氧的消耗。因此，例如，可以在下述试验中测量泛醌氧化酶bd（一种氰化物抗性末端氧化酶）的活性，该试验中，在存在50mM磷酸盐缓冲液（pH6.5）、0.02%去垢剂Tween20以及100μM氰化物（以使其它氰化物敏感性氧化酶失活）时，温育含有该酶的无细胞提取物或膜级分。然后可通过加入30mM被还原的人工电子受体——CoQ_2red来来起始酶反应，接着测量275nm处吸光度的增加。可在Clark型电极协助下测量耗氧速率，其与膜级分或无细胞提取物中存在的泛醌氧化酶bd活性直接成正比。

因此，例如，通过以使其具有增强的活性的形式修饰涉及对末端氧化酶的生物合成的RCS多核苷酸/蛋白，可增加对依赖于一系列脱氢反应的发酵产物（例如维生素C或2-KGA）的总生产效率。在另一例子中，通过修饰对辅助因子（例如CoQ10或细胞色素c）的生物合成中涉及的RCS多核苷酸/蛋白，使得这些辅助因子可以以更高的水平被合成，可以增加细菌中依赖作为呼吸链重要元件的这些化合物的电子转移系统的总体能力，以及对于依赖氧化还原反应的发酵化合物（例如维生素C或2-KGA）的生产和生长产生正面影响。在另一例子中，以使其活性被增强的方式对涉及对氰化物不敏感的旁路氧化酶（非能量形成形式）的生物合成的RCS多核苷酸/蛋白加以修饰，可能对于细胞对发酵产物的总体生产能力产生正面影响，甚至是细胞处于非生长的状况或者处于低的总体代谢活性的状况下时。

当在也表达SNDHai的微生物中，按照下文所述表达或修饰选自本文公开的STS、RCS、SMS或VCS构成的组的蛋白时，通过直接发酵对维生素C的生产可被大大提高。这在本文中也被称为同时表达。如果同时表达是遗传操作事件的结果，那么这也被称为同时操作。这可例如在表达SNDHai的微生物，例如重组SNDHai的微生物中实现，后一种微生物也被称为重组微生物。

本文示例性给出了8个新颖的VCS基因，它们可对在表达具有SNDHai活性的蛋白的微生物中维生素C的产量提高有作用。这些经过遗传工程改造的基因中的每一个可单独使用，或者与选自同样的组或由STS、RCS和SMS构成的其它组中的至少一种额外的基因组合使用。

术语“基因”在本文中用来表示编码如上文定义的蛋白的多核苷酸。

这8个不同基因编码分别包含根据SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：73和SEQ ID NO：41的氨基酸序列的VCS多肽。

对应的核苷酸序列分别示于SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：52、SEQID NO：56、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：68、SEQID NO：72和SEQ ID NO：40，这是从G.oxydans DSM17078中分离的。本发明还包括与这些序列之一基本相同的多核苷酸。

在本文上下文中，应当注意，与VCS编码序列一起使用的“与……基本相同的多核苷酸”指选自下述组的多核苷酸序列或此类多核苷酸的互补链，所述组由

a）多核苷酸，其分别包含根据SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：72和SEQ ID NO：40的核苷酸序列

b）多核苷酸，其包含可使用来自微生物的DNA作为模板，分别使用根据SEQ ID NO：38和SEQ ID NO：39或SEQ ID NO：54和SEQ IDNO：55或SEQ ID NO：58和SEQ ID NO：59或SEQ ID NO：62和SEQID NO：63或SEQ ID NO：66和SEQ ID NO：67或SEQ ID NO：70和SEQ ID NO：71或SEQ ID NO：74和SEQ ID NO：75或SEQ ID NO：42和SEQ ID NO：43的引物组，通过核酸扩增，例如聚合酶链式反应获得的核苷酸序列；

c）多核苷酸，其包含编码下述多肽的片段或衍生物的核苷酸序列，所述多肽分别包含根据SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：73和SEQ ID NO：41的氨基酸序列，或所述多肽由（a）或（b）中任何多核苷酸编码，其中，在所述衍生物或片段中，一个或多个氨基酸残基较之所述多肽而言被保守取代，并且，所述片段或衍生物具有VCS蛋白质的活性；

d）多核苷酸，其编码VCS蛋白质，其互补链在严谨条件下能与编码分别包含根据SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：57、SEQID NO：61、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：73和SEQID NO：41的氨基酸序列的多肽的多核苷酸杂交，或与（a）至（c）中任一条定义的多核苷酸杂交；

e）多核苷酸，其编码VCS蛋白质，并且，其与编码分别包含根据SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：73和SEQ ID NO：41的氨基酸序列的多肽的多核苷酸、或与（a）至（c）中任一条定义的多核苷酸至少70%相同，例如85、90或95%相同

构成。

上文确定的核苷酸序列和氨基酸序列被用作为“查询序列”，以便用来自National Center for Biotechnology[NCBI]的BLAST或Blast2程序（版本2）针对数据库PRO SW-SwissProt（完全发布版本加上增加的更新）进行搜索。基因VCS01（SEQ ID NO：36）被标注为编码展示出与甘露糖-1-磷酸鸟苷酰转移酶/甘露糖-6-磷酸异构酶的相似性的蛋白（SEQ ID NO：37）。基因VCS02（SEQ ID NO：52）被标注为编码展示出与肌氨酸氧化酶α亚基的相似性的蛋白（SEQ ID NO：53）。基因VCS03（SEQ IDNO：56）被标注为编码展示出与肌氨酸氧化酶α亚基的相似性的蛋白（SEQ ID NO：57）。基因VCS04（SEQ ID NO：60）被标注为编码展示出与同渗容摩传感器蛋白envZ rp426的相似性的蛋白（SEQ ID NO：61）。基因VCS05（SEQ ID NO：64）被标注为编码展示出与转录调控蛋白OmpR的相似性的蛋白（SEQ ID NO：65）。基因VCS06（SEQ IDNO：68）被标注为编码展示出与PetP的相似性的蛋白（SEQ ID NO：69）。基因VCS07（SEQ ID NO：72）被标注为编码展示出与肽去甲酰酶的相似性的蛋白（SEQ ID NO：73）。基因VCS08（SEQ ID NO：40）被标注为编码展示出与天冬酰胺合酶的相似性的蛋白（SEQ ID NO：41）。

可使用cDNA、mRNA或者基因组DNA作为模板，使用合适的寡核苷酸引物，例如分别根据SEQ ID NO：38和SEQ ID NO：39或SEQ IDNO：54和SEQ ID NO：55或SEQ ID NO：58和SEQ ID NO：59或SEQID NO：62和SEQ ID NO：63或SEQ ID NO：66和SEQ ID NO：67或SEQ ID NO：70和SEQ ID NO：71或SEQ ID NO：74和SEQ ID NO：75或SEQ ID NO：42和SEQ ID NO：43的核苷酸引物对，根据标准PCR扩增技术，通过核酸扩增从任何合适的生物获得根据本发明的编码VCS蛋白的核酸。由此扩增的核酸可被克隆进合适的载体，并通过DNA序列分析对其加以表征。

与VCS蛋白/基因相关的不同的SEQ ID NO被概括如下：

本文还示例性给出了12个新颖的STS基因，它们可对在表达SNDHai的微生物中维生素C的产量提高有作用。这些经过遗传工程改造的基因中的每一个可单独使用，或者与选自同样的组或由VCS、RCS和SMS构成的其它组中的至少一种额外的基因组合使用。

这12个不同基因编码分别包含根据SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：105、SEQ ID NO：109、SEQ ID NO：113、SEQ IDNO：117、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：121的氨基酸序列的STS多肽。

对应的核苷酸序列分别示于SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：84、SEQID NO：88、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：96、SEQ ID NO：100、SEQID NO：104、SEQ ID NO：108、SEQ ID NO：112、SEQ ID NO：116、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：120，这些是从G.oxydans DSM17078中分离的。本发明还包括与这些序列之一基本同源的多核苷酸。

在本文上下文中，应当注意，与STS编码序列一起使用的“与……基本相同的多核苷酸”指选自下述组的多核苷酸序列或此类多核苷酸的互补链，所述组由

a）多核苷酸，其分别包含根据SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：96、SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：104、SEQ ID NO：108、SEQ ID NO：112、SEQ ID NO：116、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：120的核苷酸序列

b）多核苷酸，其包含可使用来自微生物的DNA作为模板，分别使用根据SEQ ID NO：82和SEQ ID NO：83或SEQ ID NO：86和SEQ IDNO：87或SEQ ID NO：90和SEQ ID NO：91或SEQ ID NO：94和SEQID NO：95或SEQ ID NO：98和SEQ ID NO：99或SEQ ID NO：102和SEQ ID NO：103或SEQ ID NO：106和SEQ ID NO：107或SEQ IDNO：110和SEQ ID NO：111或SEQ ID NO：114和SEQ ID NO：115或SEQ ID NO：118和SEQ ID NO：119或SEQ ID NO：34和SEQ ID NO：35或SEQ ID NO：122和SEQ ID NO：123的引物组，通过核酸扩增，例如聚合酶链式反应获得的核苷酸序列；

c）多核苷酸，其包含编码下述多肽的片段或衍生物的核苷酸序列，所述多肽分别包含根据SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：105、SEQ ID NO：109、SEQ ID NO：113、SEQ ID NO：117、SEQ IDNO：33、SEQ ID NO：121的氨基酸序列，或所述多肽由（a）或（b）中任何多核苷酸编码，其中，在所述衍生物或片段中，一个或多个氨基酸残基较之所述多肽而言被保守取代，并且，所述片段或衍生物具有STS蛋白质的活性；

d）多核苷酸，其编码STS蛋白质，其互补链在严谨条件下能与编码分别包含根据SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：89、SEQID NO：93、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：105、SEQID NO：109、SEQ ID NO：113、SEQ ID NO：117、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：121的氨基酸序列的多肽的多核苷酸杂交，或与（a）至（c）中任一条定义的多核苷酸杂交；

e）多核苷酸，其编码STS蛋白质，并且，其与编码分别包含根据SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：105、SEQ ID NO：109、SEQ ID NO：113、SEQ ID NO：117、SEQ ID NO：33、SEQ IDNO：121的氨基酸序列的多肽的多核苷酸、或与（a）至（c）中任一条定义的多核苷酸至少70%相同，例如85、90或95%相同

构成。

上文确定的核苷酸序列和氨基酸序列被用作为“查询序列”，以便用来自National Center for Biotechnology[NCBI]的BLAST或Blast2程序（版本2）针对数据库PRO SW-SwissProt（完全发布版本加上增加的更新）进行搜索。基因STS01（SEQ ID NO：80）被标注为编码展示出与Klebsiella pneumoniae的DalT D-阿拉伯糖醇转运蛋白的强烈相似性的蛋白（SEQ ID NO：81）。基因STS06（SEQ ID NO：84）被标注为编码展示出与Thermococcus litoralis的海藻糖/麦芽糖ABC型转运蛋白的MalG膜组分的相似性的蛋白（SEQ ID NO：85）。基因STS07（SEQ ID NO：88）被标注为编码展示出与Agrobacterium tumefaciens的海藻糖/麦芽糖ABC型转运蛋白的MalG膜组分的相似性的蛋白（SEQ ID NO：89）。基因STS15（SEQ ID NO：92）被标注为编码展示出与Pseudomonas fluorescens的甘露糖醇/山梨糖醇ABC型转运蛋白的MtlK ATP酶组分的相似性的蛋白（SEQ ID NO：93）。基因STS16（SEQ ID NO：96）被标注为编码展示出与Pseudomonas fluorescens的甘露糖醇/山梨糖醇ABC型转运蛋白的MtlG膜组分的相似性的蛋白（SEQ ID NO：97）。基因STS17（SEQ IDNO：100）被标注为编码展示出与Pseudomonas fluorescens的甘露糖醇/山梨糖醇ABC型转运蛋白的MtlF膜组分的相似性的蛋白（SEQ ID NO：101）。基因STS18（SEQ ID NO：104）被标注为编码展示出与周质山梨糖醇结合蛋白的相似性的蛋白（SEQ ID NO：105）。基因STS21（SEQID NO：108）被标注为编码展示出与Bacillus subtilis的磷酸转移酶系统的PtsI酶I的相似性的蛋白（SEQ ID NO：109）。基因STS22（SEQ IDNO：112）被标注为编码展示出与Bacillus subtilis的磷酸转移酶系统的Hpr蛋白的相似性的蛋白（SEQ ID NO：113）。基因STS23（SEQ IDNO：116）被标注为编码展示出与Brucella melitensis的磷酸转移酶系统的酶IIAMan的相似性的蛋白（SEQ ID NO：117）。基因STS24（SEQ IDNO：32）被标注为编码展示出与未鉴定的、可能涉及磷酸转移酶系统的、P-环ATP酶蛋白家族的相似性的蛋白（SEQ ID NO：33）。基因STS25（SEQ ID NO：120）被标注为编码展示出与磷酸转移酶系统的Hpr激酶的相似性的蛋白（SEQ ID NO：121）。

可使用cDNA、mRNA或者基因组DNA作为模板，使用合适的寡核苷酸引物，例如分别根据SEQ ID NO：82和SEQ ID NO：83或SEQ IDNO：86和SEQ ID NO：87或SEQ ID NO：90和SEQ ID NO：91或SEQID NO：94和SEQ ID NO：95或SEQ ID NO：98和SEQ ID NO：99或SEQ ID NO：102和SEQ ID NO：103或SEQ ID NO：106和SEQ IDNO：107或SEQ ID NO：110和SEQ ID NO：111或SEQ ID NO：114和SEQ ID NO：115或SEQ ID NO：118和SEQ ID NO：119或SEQ IDNO：34和SEQ ID NO：35或SEQ ID NO：122和SEQ ID NO：123的核苷酸引物对，根据标准PCR扩增技术，通过核酸扩增从任何合适的生物获得根据本发明的编码STS蛋白的核酸。由此扩增的核酸可被克隆进合适的载体，并通过DNA序列分析对其加以表征。

与STS蛋白/基因相关的不同的SEQ ID NO被概括如下：

本文还示例性给出了7个新颖的SMS基因，它们可对在表达SNDHai的微生物中维生素C的产量提高有作用。这些经过遗传工程改造的基因中的每一个可单独使用，或者与选自同样的组或由STS、VCS和RCS构成的其它组中的至少一种额外的基因组合使用。

这7个不同基因编码分别包含根据SEQ ID NO：125、SEQ ID NO：129、SEQ ID NO：133、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：137、SEQ IDNO：141、SEQ ID NO：145的氨基酸序列的SMS多肽。

对应的核苷酸序列分别示于SEQ ID NO：124、SEQ ID NO：128、SEQ ID NO：132、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：136、SEQ ID NO：140、SEQ ID NO：144，这些是从G.oxydans DSM17078中分离的。本发明还包括与这些序列之一基本同源的多核苷酸。

在本文上下文中，应当注意，与SMS编码序列一起使用的“与……基本相同的多核苷酸”指选自下述组的多核苷酸序列或此类多核苷酸的互补链，所述组由

a）多核苷酸，其分别包含根据SEQ ID NO：124、SEQ ID NO：128、SEQ ID NO：132、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：136、SEQ IDNO：140、SEQ ID NO：144的核苷酸序列

b）多核苷酸，其包含可使用来自微生物的DNA作为模板，分别使用根据SEQ ID NO：126和SEQ ID NO：127或SEQ ID NO：130和SEQ IDNO：131或SEQ ID NO：134和SEQ ID NO：135或SEQ ID NO：46和SEQ ID NO：47或SEQ ID NO：138和SEQ ID NO：139或SEQ ID NO：142和SEQ ID NO：143或SEQ ID NO：146和SEQ ID NO：147的引物组，通过核酸扩增，例如聚合酶链式反应获得的核苷酸序列；

c）多核苷酸，其包含编码下述多肽的片段或衍生物的核苷酸序列，所述多肽分别包含根据SEQ ID NO：125、SEQ ID NO：129、SEQ IDNO：133、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：137、SEQ ID NO：141、SEQID NO：145的氨基酸序列，或所述多肽由（a）或（b）中任何多核苷酸编码，其中，在所述衍生物或片段中，一个或多个氨基酸残基较之所述多肽而言被保守取代，并且，所述片段或衍生物具有SMS蛋白质的活性；

d）多核苷酸，其编码SMS蛋白质，其互补链在严谨条件下能与编码分别包含根据SEQ ID NO：125、SEQ ID NO：129、SEQ ID NO：133、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：137、SEQ ID NO：141、SEQ ID NO：145的氨基酸序列的多肽的多核苷酸杂交，或与（a）至（c）中任一条定义的多核苷酸杂交；

e）多核苷酸，其编码SMS蛋白质，并且，其与编码分别包含根据SEQ ID NO：125、SEQ ID NO：129、SEQ ID NO：133、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：137、SEQ ID NO：141、SEQ ID NO：145的氨基酸序列的多肽的多核苷酸、或与（a）至（c）中任一条定义的多核苷酸至少70%相同，例如85、90或95%相同

构成。

上文确定的核苷酸序列和氨基酸序列被用作为“查询序列”，以便用来自National Center for Biotechnology[NCBI]的BLAST或Blast2程序（版本2）针对数据库PRO SW-SwissProt（完全发布版本加上增加的更新）进行搜索。基因SMS02（SEQ ID NO：124）被标注为编码展示出与Bacillus subtilis的NAD(P)依赖性D-山梨糖醇脱氢酶的相似性的蛋白（SEQ ID NO：125）。基因SMS03（SEQ ID NO：128）被标注为编码Bacillus subtilis的NAD(P)依赖性山梨糖醇脱氢酶的蛋白（SEQ ID NO：129）。基因SMS04（SEQ ID NO：132）被标注为编码NAD(P)H依赖性L-山梨糖还原酶（SEQ ID NO：133）。基因SMS05（SEQ ID NO：44）被标注为编码NAD(P)依赖性山梨糖酮脱氢酶（SEQ ID NO：45）。基因SMS12（SEQ ID NO：136）被标注为编码与膜结合的L-山梨糖脱氢酶（SDH）（SEQ ID NO：137）。基因SMS13（SEQ ID NO：140）被标注为编码与膜结合的PQQ-依赖性D-山梨糖醇脱氢酶的亚基A（SEQ IDNO：141）。基因SMS14（SEQ ID NO：144）被标注为编码与膜结合的PQQ-依赖性D-山梨糖醇脱氢酶的亚基B（SEQ ID NO：145）。

可使用cDNA、mRNA或者基因组DNA作为模板，使用合适的寡核苷酸引物，例如分别根据SEQ ID NO：126和SEQ ID NO：127或SEQ IDNO：130和SEQ ID NO：131或SEQ ID NO：134和SEQ ID NO：135或SEQ ID NO：46和SEQ ID NO：47或SEQ ID NO：138和SEQ ID NO：139或SEQ ID NO：142和SEQ ID NO：143或SEQ ID NO：146和SEQID NO：147的核苷酸引物对，根据标准PCR扩增技术，通过核酸扩增从任何合适的生物获得根据本发明的编码SMS蛋白的核酸。由此扩增的核酸可被克隆进合适的载体，并通过DNA序列分析对其加以表征。

与SMS蛋白/基因相关的不同的SEQ ID NO被概括如下：

本文还示例性给出了15个新颖的RCS基因，它们可对在表达SNDHai的微生物中维生素C的产量提高有作用。这些经过遗传工程改造的基因中的每一个可单独使用，或者与选自同样的组或由VCS、RCS和SMS构成的其它组中的至少一种额外的基因组合使用。

这15个不同基因编码分别包含根据SEQ ID NO：149、SEQ ID NO：153、SEQ ID NO：157、SEQ ID NO：161、SEQ ID NO：165、SEQ IDNO：169、SEQ ID NO：173、SEQ ID NO：177、SEQ ID NO：181、SEQID NO：185、SEQ ID NO：189、SEQ ID NO：193、SEQ ID NO：197、SEQ ID NO：201、SEQ ID NO：49的氨基酸序列的RCS多肽。

对应的核苷酸序列分别示于SEQ ID NO：148、SEQ ID NO：152、SEQ ID NO：156、SEQ ID NO：160、SEQ ID NO：164、SEQ ID NO：168、SEQ ID NO：172、SEQ ID NO：176、SEQ ID NO：180、SEQ IDNO：184、SEQ ID NO：188、SEQ ID NO：192、SEQ ID NO：196、SEQID NO：200、SEQ ID NO：48，这是从G.oxydans DSM17078中分离的。本发明还包括与这些序列之一基本同源的多核苷酸。

在本文上下文中，应当注意，与RCS编码序列一起使用的“与……基本相同的多核苷酸”指选自下述组的多核苷酸序列或此类多核苷酸的互补链，所述组由

a）多核苷酸，其分别包含根据SEQ ID NO：148、SEQ ID NO：152、SEQ ID NO：156、SEQ ID NO：160、SEQ ID NO：164、SEQ IDNO：168、SEQ ID NO：172、SEQ ID NO：176、SEQ ID NO：180、SEQID NO：184、SEQ ID NO：188、SEQ ID NO：192、SEQ ID NO：196、SEQ ID NO：200、SEQ ID NO：48的核苷酸序列

b）多核苷酸，其包含可使用来自微生物的DNA作为模板，分别使用根据SEQ ID NO：150和SEQ ID NO：151或SEQ ID NO：154和SEQ IDNO：155或SEQ ID NO：158和SEQ ID NO：159或SEQ ID NO：162和SEQ ID NO：163或SEQ ID NO：166和SEQ ID NO：167或SEQ IDNO：170和SEQ ID NO：171或SEQ ID NO：174和SEQ ID NO：175或SEQ ID NO：178和SEQ ID NO：179或SEQ ID NO：182和SEQ IDNO：183或SEQ ID NO：186和SEQ ID NO：187或SEQ ID NO：190和SEQ ID NO：191或SEQ ID NO：194和SEQ ID NO：195或SEQ IDNO：198和SEQ ID NO：199或SEQ ID NO：202和SEQ ID NO：203或SEQ ID NO：50和SEQ ID NO：51的引物组，通过核酸扩增，例如聚合酶链式反应获得的核苷酸序列；

c）多核苷酸，其包含编码下述多肽的片段或衍生物的核苷酸序列，所述多肽分别包含根据SEQ ID NO：149、SEQ ID NO：153、SEQ IDNO：157、SEQ ID NO：161、SEQ ID NO：165、SEQ ID NO：169、SEQID NO：173、SEQ ID NO：177、SEQ ID NO：181、SEQ ID NO：185、SEQ ID NO：189、SEQ ID NO：193、SEQ ID NO：197、SEQ ID NO：201、SEQ ID NO：49的氨基酸序列，或所述多肽由（a）或（b）中任何多核苷酸编码，其中，在所述衍生物或片段中，一个或多个氨基酸残基较之所述多肽而言被保守取代，并且，所述片段或衍生物具有RCS蛋白质的活性；

d）多核苷酸，其编码RCS蛋白质，其互补链在严谨条件下能与编码分别包含根据SEQ ID NO：149、SEQ ID NO：153、SEQ ID NO：157、SEQ ID NO：161、SEQ ID NO：165、SEQ ID NO：169、SEQ ID NO：173、SEQ ID NO：177、SEQ ID NO：181、SEQ ID NO：185、SEQ IDNO：189、SEQ ID NO：193、SEQ ID NO：197、SEQ ID NO：201、SEQID NO：49的氨基酸序列的多肽的多核苷酸杂交，或与（a）至（c）中任一条定义的多核苷酸杂交；

e）多核苷酸，其编码RCS蛋白质，并且，其与编码分别包含根据SEQ ID NO：149、SEQ ID NO：153、SEQ ID NO：157、SEQ ID NO：161、SEQ ID NO：165、SEQ ID NO：169、SEQ ID NO：173、SEQ IDNO：177、SEQ ID NO：181、SEQ ID NO：185、SEQ ID NO：189、SEQID NO：193、SEQ ID NO：197、SEQ ID NO：201、SEQ ID NO：49的氨基酸序列的多肽的多核苷酸、或与（a）至（c）中任一条定义的多核苷酸至少70%相同，例如85、90或95%相同

构成。

上文确定的核苷酸序列和氨基酸序列被用作为“查询序列”，以便用来自National Center for Biotechnology[NCBI]的BLAST或Blast2程序（版本2）针对数据库PRO SW-SwissProt（完全发布版本加上增加的更新）进行搜索。基因RCS01（SEQ ID NO：148）被标注为编码展示出与CydA对氰化物不敏感的bd型末端氧化酶亚基I的强烈相似性的蛋白（SEQ IDNO：149）。基因RCS02（SEQ ID NO：152）被标注为编码展示出与CydA对氰化物不敏感的bd型末端氧化酶亚基I的强烈相似性的蛋白（SEQ ID NO：153）。基因RCS03（SEQ ID NO：156）被标注为编码展示出与CydB氰化物不敏感的bd型末端氧化酶亚基II的强烈相似性的蛋白（SEQ ID NO：157）。基因RCS04（SEQ ID NO：160）被标注为编码展示出与bo型泛醌氧化酶亚基II的强烈相似性的蛋白（SEQ ID NO：161）。基因RCS05（SEQ ID NO：164）被标注为编码展示出与bo型泛醌氧化酶亚基I的强烈相似性的蛋白（SEQ ID NO：165）。基因RCS06（SEQ ID NO：168）被标注为编码展示出与bo型泛醌氧化酶亚基III的强烈相似性的蛋白（SEQ ID NO：169）。基因RCS07（SEQ ID NO：172）被标注为编码展示出与bo型泛醌氧化酶亚基IV的强烈相似性的蛋白（SEQ ID NO：173）。基因RCS08（SEQ ID NO：176）被标注为编码展示出与g3-ADH与膜结合的醇脱氢酶细胞色素c亚基的强烈相似性的蛋白（SEQ ID NO：177）。基因RCS21（SEQ ID NO：180）被标注为编码辅酶PQQ生物合成蛋白A（SEQ ID NO：181）。基因RCS22（SEQ IDNO：184）被标注为编码辅酶PQQ生物合成蛋白B（SEQ ID NO：185）。基因RCS23（SEQ ID NO：188）被标注为编码辅酶PQQ生物合成蛋白C（SEQ ID NO：189）。基因RCS24（SEQ ID NO：192）被标注为编码辅酶PQQ生物合成蛋白D（SEQ ID NO：193）。基因RCS25（SEQ ID NO：196）被标注为编码辅酶PQQ生物合成蛋白E（SEQ IDNO：197）。基因RCS27（SEQ ID NO：200）被标注为编码展示出与涉及细胞色素c生物合成的Bradyrhizobium japonicum的亚铁血红素输出蛋白CycW的强烈相似性的蛋白（SEQ ID NO：201）。基因RCS28（SEQ IDNO：48）被标注为编码展示出与涉及细胞色素c生物合成的亚铁血红素输出蛋白CcmA的强烈相似性的蛋白（SEQ ID NO：49）。

可使用cDNA、mRNA或者基因组DNA作为模板，使用合适的寡核苷酸引物，例如分别根据SEQ ID NO：150和SEQ ID NO：151或SEQ IDNO：154和SEQ ID NO：155或SEQ ID NO：158和SEQ ID NO：159或SEQ ID NO：162和SEQ ID NO：163或SEQ ID NO：166和SEQ IDNO：167或SEQ ID NO：170和SEQ ID NO：171或SEQ ID NO：174和SEQ ID NO：175或SEQ ID NO：178和SEQ ID NO：179或SEQ IDNO：182和SEQ ID NO：183或SEQ ID NO：186和SEQ ID NO：187或SEQ ID NO：190和SEQ ID NO：191或SEQ ID NO：194和SEQ IDNO：195或SEQ ID NO：198和SEQ ID NO：199或SEQ ID NO：202和SEQ ID NO：203或SEQ ID NO：50和SEQ ID NO：51的核苷酸引物对，根据标准PCR扩增技术，通过核酸扩增从任何合适的生物获得根据本发明的编码RCS蛋白的核酸。由此扩增的核酸可被克隆进合适的载体，并通过DNA序列分析对其加以表征。

与RCS蛋白/基因相关的不同的SEQ ID NO被概括如下：

在进一步阐述同时表达之前，将基于SNDHai更为详细地描述对单个基因/多核苷酸的构建和表达以及在上文示例的宿主细胞的基因组中进行的改变。除非另有指明，该描述还可应用于构建和表达本文公开的STS、RCS、SMS和VCS基因。

在对双链DNA的克隆中，可以使用一系列宿主/克隆载体的组合。用于在E.coli中表达本发明的基因（即，SNDHai基因）的优选载体可以选自通常用于E.coli的任何载体，例如能表达加上His标签的重组蛋白质的pQE载体（QIAGEN AG Switzerland）、pBR322或其衍生物（包括，例如pUC18和pBluescript II（Stratagene Cloning Systems,Calif.,USA））、pACYC177和pACYC184及其衍生物和来自广宿主范围质粒的载体，例如RK2和RSF1010。用于在细菌（包括Gluconobacter、Gluconacetobacter、Acetobacter和Pseudomonas）中表达本发明的核苷酸序列的优选载体选自可在Gluconobacter、Acetobacter和Pseudomonas以及优选的克隆生物（例如E.coli）中复制的任何载体。优选的载体是广宿主范围载体，例如，粘粒载体（例如pVK100）及其衍生物和RSF1010。为使克隆的基因稳定且有效地表达，还为了对携带有克隆基因的宿主细胞进行高效地培养，应对载体的拷贝数和稳定性进行仔细考虑。含有例如可转座元件（例如Tn5）的核酸分子也可用作为载体，以将想要的基因引入到优选宿主中，尤其是染色体上。含有从优选宿主中分离出的任何DNA和本发明的SNDHai基因的核酸分子还可用于将该基因引入优选的宿主细胞，尤其是染色体上。可通过使用本领域公知的任何传统方法，例如，转化、转导、接合交配或电穿孔，在考虑宿主细胞和核酸分子性质的情况下，将此类核酸分子转移至优选的宿主中。

可用本领域公知的方法，将L-山梨糖酮脱氢酶基因/核苷酸序列连接到合适的载体上以产生表达载体，所述载体含有在上述宿主细胞中可操作的调控区域，例如，启动子、核糖体结合位点和转录终止子。

本发明的多肽和多核苷酸优选以经分离的形式提供，优选地，被纯化至均质。

术语“经分离的”表示：物质被移出其原来的环境（例如，如果其天然存在的话，就是天然环境）。例如，活的微生物中存在的天然存在的多核苷酸或多肽不是经分离的，但与天然系统中的一些或全部共存物质分开的同样的多核苷酸或多肽就是经分离的。此类多核苷酸可以是载体的一部分和/或此类多核苷酸或多肽可以是组合物的一部分，但仍然是经分离的，因为此类载体或组合物并非其天然环境的一部分。

本文中使用的经分离的多核苷酸或核酸可以是这样的DNA或RNA，它们与从中获得该多核苷酸或核酸的生物的天然存在的基因组中紧密相邻的两条编码序列（5’末端一条，3’末端一条）并非紧密相邻。因此，在一种实施方式中，核酸包括与编码序列紧密相邻的5’非编码（例如，启动子）序列的一些或全部。术语“经分离的多核苷酸”因此包括，例如，加入到载体中、加入到自主复制质粒或病毒中，或者加入到原核生物或真核生物的基因组DNA中的重组DNA，或者作为独立于其它序列的单独分子（例如，通过PCR或限制性内切酶处理产生的cDNA或基因组DNA片段）存在的重组DNA。其还包括是杂合体基因的一部分的重组DNA，所述基因编码基本不含细胞物质、病毒物质或培养基（当通过重组DNA技术生产时）或化学前体或其它化学物质（当通过化学方式合成时）的额外多肽。此外，“经分离的核酸片段”是这样的核酸片段：其天然并不作为片段存在，并且将不会在天然状态被发现。

本文中使用的术语“多核苷酸”、“基因”和“重组基因”指可与染色体DNA分离开的、包括编码蛋白质（例如，G.oxydans DSM17078SNDHai蛋白）的开放读码框的核酸分子。多核苷酸可包括，例如，SEQID NO：1所示的多核苷酸序列或其片段以及基因序列上游或下游的区域，所述区域可包括，例如，对于由其获得的多肽的适当表达和稳定来说重要的启动子区域、调控子区域和终止子区域。

基因可包括编码序列、非编码序列（例如，位于基因编码区域3’末端和5’末端的非翻译序列）和调控序列。此外，基因指本文定义的经分离的核酸分子。技术人员还将理解，导致SNDHai蛋白氨基酸序列的变化的DNA序列多态性可存在于种群（population）中，例如，Gluconobacteroxydans种群中。SNDHai基因中的此类遗传多态性可由于天然变异存在于种群的个体间，或者存在于不同种群的细胞中。典型地，此类天然变异可导致SNDHai基因核苷酸序列中1-5%的变化度。作为天然变异结果的、并且不会改变SNDHai蛋白的功能活性的SNDHai中的任何以及全部此类核苷酸变异和由此得到的氨基酸多态性也包括在本发明的范围内。

本文中使用的术语“多核苷酸”或“核酸分子”意欲包括DNA分子（例如，cDNA或基因组DNA）和RNA分子（例如mRNA）以及使用核苷酸类似物产生的DNA或RNA的类似物。核酸分子可以是单链或双链的，但优选是双链DNA。可使用寡核苷酸类似物或衍生物（例如，肌苷或磷硫酰核苷酸）来合成核酸。此类寡核苷酸可用于：例如，制备具有改变的碱基配对能力或增加的对核酸酶的抗性的核酸。

本文中提供的序列信息不应被狭义理解为需要包括进被错误鉴定的碱基。本文公开的特定序列可以很容易地用于从能将给定碳源直接转化为维生素C的重组或非重组微生物（特别是Gluconobacter oxydans，优选地，Gluconobacter oxydans DSM17078）中分离出完整基因，随后可容易地对该基因进行进一步的序列分析，由此鉴定出测序错误。

除非特别指明，本文中通过对DNA分子进行测序来确定的所有核苷酸序列都是用自动DNA测序仪（测定的，并且，本文测定的DNA分子编码的多肽的所有氨基酸序列都是通过对按照上文所述测定的DNA序列进行翻译来推测的。因此，如本领域所已知的，对由该自动方法所测定的任何DNA序列而言，本文所测定的任何核苷酸序列都可能含有一些错误。典型地，通过自动方法测出的核苷酸序列与被测序的DNA分子的实际核苷酸序列至少大约90%同源，更典型地，至少大约95%至至少大约99.9%相同。通过其它方法，包括本领域内公知的人工DNA测序方法，可对实际序列进行更为精确的测定。也如本领域所已知的，测得的核苷酸序列中较之实际序列的单个插入或缺失将会导致核苷酸序列翻译中的读码框位移，使得：从此类插入或缺失的点开始，测得的核苷酸序列编码的预计氨基酸序列完全不同于被测序的DNA分子实际编码的氨基酸序列。

本领域技术人员能鉴定出此类被错误鉴定的碱基，并且知道如何改正此类错误。

根据本发明的核酸分子可以仅包含本发明提供的核酸序列（例如，SEQ ID NO：1示出的序列）的一部分或片段，例如，可用作为探针或引物的片段（例如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO：4）或编码根据本发明的蛋白的一部分的片段。从对SNDHai基因的克隆测定的核苷酸序列允许产生被设计来鉴定和/或克隆SNDHai家族其它成员以及来自其它物种的SNDHai同源体的探针和引物。典型地，该探针/引物包含基本纯化的寡核苷酸，其典型地包含与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列或其片段或衍生物的至少大约12或15个、优选大约18或20个、更优选大约22或25个、进一步更优选大约30、35、40、45、50、55、60、65或75个或更多个连续核苷酸杂交（优选地，在高度严谨条件下杂交）的核苷酸序列区域。

还可通过聚合酶链式反应（PCR），使用基于本文含有的序列信息设计的合成寡核苷酸引物，分离出包含SEQ ID NO：1的核苷酸序列的全部或一部分的核酸分子。

可按照标准PCR扩增技术，用cDNA、mRNA或者基因组DNA作为模板，使用合适的寡核苷酸引物，来扩增本发明的核酸。由此扩增的核酸可被克隆进合适的载体，并通过DNA序列分析加以表征。

多核苷酸的片段还可包含不编码功能多肽的多核苷酸。此类多核苷酸可作为探针或引物用于PCR反应。

不管其编码功能或非功能多肽，核酸都可用作为杂交探针或聚合酶链式反应（PCR）引物。不编码具有SNDHai活性的多肽的本发明核酸分子的用途包括：（1）从cDNA文库（例如来自除Gluconobacter oxydans外的其它生物）分离编码本发明蛋白的基因或其等位变体，以及（2）用于探测特定细胞中所述蛋白的mRNA的表达的Northern印迹分析，或（3）用于增强和/或提高同源SNDHai基因在所述其它生物中的功能或活性。

基于本文提供的核苷酸序列的探针可用于检测编码同样或同源蛋白（例如，其它生物中的）的转录本或基因组序列。可基于其与本文公开的G.xoydans SNDHai核酸的同源性，使用G.oxydans DNA或其一部分作为杂交探针，按照标准杂交技术，优选在高度严谨杂交条件下，分离出对应于本发明的G.xoydans SNDHai DNA的天然变体或非G.oxydans同源体的核酸分子，它们也包括在本发明内。

在优选的实施方式中，探针还包含与其附着的标记基团，例如，标记基团可以是放射性同位素、荧光化合物、酶或酶的辅助因子。

例如，可使用基于本文教导的核苷酸序列设计的两套简并寡核苷酸引物库，进行PCR来分离同源基因序列或基本相同的基因序列。

用于反应的模板可以是通过对从已知能表达或怀疑能表达根据本发明的多核苷酸的菌株制备的mRNA进行逆转录获得的cDNA。PCR产物可被亚克隆及测序，以确保扩增出的序列代表本文所述的新的核酸序列或其功能等同物的序列。

然后可通过多种已知方法，用PCR片段分离全长cDNA克隆。例如，可标记扩增出的片段，用其筛选噬菌体或粘粒cDNA文库。或者，经标记的片段可用于筛选基因组文库。

PCR技术还可用于从其它生物分离全长cDNA。例如，可按照标准方案，从合适的细胞或组织来源分离RNA。可在RNA上进行逆转录反应，其中使用与扩增片段的5’最末端具有特异性的寡核苷酸引物，以引导第一链合成。

然后可使用标准的末端转移酶反应，对得到的RNA/DNA杂交体“加尾”（例如，用鸟嘌呤），可用RNaseH消化杂交体，然后可（例如，用poly-C引物）引导第二链合成。由此，可容易地分离扩增的片段上游的cDNA序列。关于有用的克隆策略的综述，参见，例如上文所述的Sambrook et al.和上文所述的Ausubel et al.。

本文示例的基因（例如根据SEQ ID NO：1的SNDHai基因）的同源体、基本相同的序列、功能等同物和直向同源体可从多种不同的微生物获得。用于分离特定基因和/或其片段的流程在本文中有所示例。根据这些流程，已从Gluconobacter oxydans IFO3292、Gluconobacter oxydans IFO3287、Acetobacter sp.ATCC15164和Gluconobacter oxydans IFO3244成功地分离出SNDHai基因。因此，编码SNDHai家族其它成员、具有与根据SEQ ID NO：1的核苷酸序列不同的核苷酸序列的核酸也在本发明的范围内。此外，编码来自其它物种的SNDHai蛋白、具有与SEQ ID NO：1示出的核苷酸序列不同的核苷酸序列的核酸也在本发明的范围内。

本发明还涉及经分离的多核苷酸，其可在严谨条件下（优选地，高度严谨条件下）与本发明的多核苷酸（例如，SEQ ID NO：1所示的多核苷酸）杂交。有利地，此类多核苷酸可从能将给定的碳源直接转化为维生素C的微生物（特别是Gluconobacter oxydans，优选地，Gluconobacteroxydans DSM17078）中获得。

本文中用到的术语“杂交”被用来描述杂交和洗涤，在所述杂交和洗涤条件下，典型地，互相之间同源性为至少约50%、至少约60%、至少约70%、更优选为至少约80%、进一步优选为至少约85%到90%、最优选为至少95%的核苷酸序列保持相互杂交的状态。

在一种实施方式中，本发明的核酸与SEQ ID NO：1所示的核酸序列或其互补序列至少40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%同源或更同源。

此类严谨杂交条件的一个优选的非限制的例子是在6x氯化钠/柠檬酸钠（SSC）中，大约45°C下杂交，随后在1x SSC、0.1%SDS中，50°C下进行一次或多次洗涤，洗涤优选在55°C下，更优选在60°C下，进一步优选在65°C下进行。

高度严谨条件包括，例如，在溶液中，例如含或不含100μg/ml的鲑鱼精DNA的DigEasyHyb溶液（Roche Diagnostics GmbH）中，或包含50%甲酰胺、5x SSC（150mM NaCl、15mM柠檬酸三钠）、0.02%十二烷基磺酸钠、0.1%N-月桂酰肌氨酸和2%封闭试剂（Roche DiagnosticsGmbH）的溶液中，使用地高辛（DIG）标记的DNA探针（例如通过用Roche Diagnostics GmbH,68298Mannheim,Germany的DIG标记系统来制备的）在42°C温育2小时至4天，接着在2x SSC和0.1%SDS中，于室温下，洗两次膜，每次5至15分钟，然后在65-68°C，于0.5x SSC和0.1%SDS或0.1x SSC和0.1%SDS中洗两次，每次15-30分钟。

优选地，与本发明的核苷酸序列杂交（优选在高度严谨条件下杂交）的本发明的经分离的核酸对应于天然存在的核酸分子。本文中使用的“天然存在的”核酸分子指具有天然存在的核苷酸序列的RNA或DNA分子（例如，编码天然蛋白质）。在一种实施方式中，核酸编码天然的G.oxydans SNDHai蛋白。

技术人员知道何种条件适合用于严谨杂交条件及高度严谨杂交条件。本领域中易于获得关于此类条件的其它指导，例如，在Sambrook et al.,1989,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press,N.Y.;和Ausubel et al.(eds.),1995,Current Protocols in Molecular Biology,(John Wiley&Sons,N.Y.)中。当然，仅与poly(A)序列（例如mRNA的3’末端poly(A)区）或仅与T（或U）残基的互补性延伸区段（stretch）杂交的多核苷酸将不会被包括在用于与本发明核酸的一部分特异性杂交的本发明多核苷酸中，因为此类多核苷酸将与任何含有poly(A)延伸区段的核酸分子或其互补序列（例如，实际上是任何双链的cDNA克隆）杂交。

采用典型手段，可以对从其它生物，例如能将给定碳源（例如D-山梨糖醇、L-山梨糖或L-山梨糖酮）直接转化为维生素C的微生物（特别是其它Gluconobacter物种）构建的基因组DNA文库或cDNA文库进行筛选。

例如，可以通过Northern印迹分析来对Gluconobacter的菌株进行筛选。在探测到与本发明多核苷酸同源的转录本之后，可以利用本领域技术人员公知的标准技术，由分离自合适菌株的RNA来构建DNA文库。或者，可以使用能与本发明多核苷酸杂交的探针来对全基因组DNA文库进行筛选。

可使用标准的分子生物学技术以及本文提供的序列信息，来分离本发明的核酸序列，例如SEQ ID NO：1所示的核酸分子或其片段或衍生物。例如，可使用标准杂交和克隆技术（例如，Sambrook,J.,Fritsh,E.F.,和Maniatis,T.Molecular Cloning:A Laboratory Manual.2nd,ed.,Cold SpringHarbor Laboratory,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,1989所述），使用SEQ ID NO：1所示的核酸分子的全部或一部分作为杂交探针，分离根据本发明的核酸分子。

此外，可通过标准合成技术（例如，使用自动DNA合成仪）来制备对应于本发明的核苷酸序列的寡核苷酸或可与本发明的核苷酸序列杂交的寡核苷酸。

术语“同源性”或“相同性百分比”在本文中可互换使用。就本发明的目的而言，在此定义：为确定两条氨基酸序列或两条核酸序列的相同性百分比，本着最优比较的目的（例如，可以在第一条氨基酸序列或核苷酸序列上引入缺口，以与第二条氨基酸序列或核苷酸序列达到最佳的比对），对序列进行比对。然后对相应氨基酸位置或核苷酸位置上的氨基酸残基或核苷酸进行比较。如果第一条序列上某位置的氨基酸残基或核苷酸与第二条序列上相应位置的相同，那么这些分子在此位置就是相同的。两条序列间的相同性百分比是所述序列共有的相同位置的数量的函数（即，%相同性=相同位置的数量/位置（即重叠位置）总数x100）。优选地，这两条序列长度相同。

技术人员会知道有若干计算机程序可被用于确定两条序列间的同源性。例如，可以使用数学算法来完成对序列的比对和对两条序列间相同性百分比的确定。在一种优选的实施方式中，使用Needleman和Wunsch（J.Mol.Biol.(48):444-453(1970)）算法来确定两条氨基酸序列间的相同性百分比，所述算法已被合并到GCG软件包（可从http://www.accelrys.com获得）的GAP程序中，其中使用Blossom62矩阵或PAM250矩阵，缺口权重为16、14、12、10、8、6或4，长度权重为1、2、3、4、5或6。技术人员会意识到：上述的所有不同参数将导致有细微区别的结果，但是使用不同算法时两条序列的总体%相同性不会有显著改变。

在又一种实施方式中，使用GCG软件包（可从http://www.accelrys.com获得）的GAP程序来确定两条核苷酸序列间的相同性百分比，其中使用NWSgapdna.CMP矩阵，缺口权重为40、50、60、70或80，长度权重为1、2、3、4、5或6。在另一种实施方式中，使用E.Meyers和W.Miller（CABIOS,4:11-17(1989)）的算法来确定两条氨基酸序列或核苷酸序列的相同性百分比，所述算法已被合并到ALIGN程序（2.0版）（可从http://vega.igh.cnrs.fr/bin/align-guess.cgi获得）中，其中使用PAM120权重残基表，缺口长度惩罚（penalty）为12，缺口惩罚为4。

本发明的核酸和蛋白质序列可以进一步地被用作“查询序列”来进行针对公众数据库的搜索，例如，去鉴定相关序列或家族中其它成员。可以使用Altschul,et al.(1990)J.Mol.Biol.215:403-10的BLASTN和BLASTX程序（2.0版）来进行此类搜索。可以用BLASTN程序，以分数=100，字长（word length）=12来进行BLAST核苷酸搜索，以获得与本发明的核酸分子同源的核苷酸序列。可以用BLASTX程序，以分数=50，字长=3来进行BLAST蛋白质搜索，以获得与本发明的蛋白质分子同源的氨基酸序列。本着比较的目的，为获得有缺口的比对，可以利用Altschul et al.,(1997)Nucleic Acids Res.25(17):3389-3402中描述的Gapped BLAST。当利用BLAST和Gapped BLAST程序时，可以使用各个程序（例如BLASTX和BLASTN）的缺省参数。见http://www.ncbi.nlm.nih.gov。

在另一种优选的实施方式中，本发明的经分离的核酸分子包含是本发明的核苷酸序列（例如，SEQ ID NO：1所示的序列）的互补序列的核酸分子。与本文公开的核苷酸序列互补的核酸分子是这样的序列：其与SEQID NO：1所示的核苷酸序列足够互补，从而其可与所述核苷酸序列杂交，由此形成稳定的双链体（duplex）。

在另一种优选的实施方式中，SEQ ID NO：1所示的本发明的核酸或其互补序列含有至少一处突变，所述突变导致基因产物具有经修饰的功能/活性。所述至少一处突变可通过本领域已知的方法或本文所述的方法引入。在关于SNDHai的方面，所述至少一处突变导致产生这样的SNDHai蛋白：其功能较之野生型副本而言有所增强或提高。SNDHai蛋白的活性也由此增加。用于引入此类突变的方法是本领域公知的。

具有增加的SNDHai活性的细胞是优选的，因为此类细胞将能生产更多的维生素C，特别是当选自SMS、RCS、STS或VCS基因构成的组的任何其它基因按照本文所述被遗传工程改造后。

另一方面涉及载体，所述载体含有编码本发明蛋白质的核酸或其功能等同物或一部分。在本文中使用的术语“载体”指能运送连接到其上的另一个核酸分子的核酸分子。一种载体类型是“质粒”，“质粒”指环状的双链DNA环，另外的DNA片断可以连接到所述的环上。另一种载体的类型是病毒载体，其中，另外的DNA片断可以连接到病毒基因组中。某些载体能在其被引入的宿主细胞中进行自主复制（例如，具有细菌的复制起点的细菌载体）。其它载体在被引入宿主细胞之后就被整合进宿主细胞的基因组中，因此它们与宿主基因组一同复制。

此外，某些载体能指导可操作地连接到其上的基因的表达。此类载体在本文中被称为“表达载体”。一般而言，在重组DNA技术中用到的表达载体通常是质粒的形式。在本文中术语“质粒”和“载体”可以互换使用，因为质粒是最常用到的载体形式。然而，本发明也包括其它形式的表达载体，例如病毒载体（例如，复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒），它们能提供等同的功能。

本发明的重组表达载体包含本发明的核酸，所述核酸存在的形式适合于该核酸在宿主细胞中的表达，这意味着该重组表达载体包括一段或多段调控序列，所述调控序列是基于将用于表达的宿主细胞来选择的，其被可操作地连接到将要表达的核酸序列上。在重组表达载体中，“可操作地连接”被用来表示：人们感兴趣的核苷酸序列被连接到调控序列上，所述的连接以允许该核苷酸序列表达（例如，在体外转录/翻译系统中表达，或者当载体被引入宿主细胞中时，在该宿主细胞中的表达）的方式进行。术语“调控序列”将包括启动子、增强子和其它表达控制元件（例如，弱化子）。例如，在Goeddel;Gene Expression Technology:Methods inEnzymology185,Academic Press,San Diego,CA(1990)中对此类调控序列进行了描述。调控序列包括在很多种宿主细胞中指导核苷酸序列的组成型或诱导型表达的调控序列，也包括仅在某些宿主细胞中指导核苷酸序列表达的调控序列（例如，组织特异性调控序列）。本领域的技术人员将意识到，对表达载体的设计可能取决于以下因素：例如：对将被转化的宿主细胞的选择，期望获得的蛋白质的表达水平等。本发明的表达载体可以被引入宿主细胞，由此生产本文所述的核酸编码的蛋白质或肽，其包括但不限于：本文所述的核酸编码的突变体蛋白、其片段、其变体或功能等同物以及融合蛋白，例如，SNDHai蛋白、SNDHai蛋白的突变体形式、融合蛋白等。

本文示例的多肽的功能等同物也是本发明的一部分，其定义基于本发明的氨基酸序列，通过对此类序列的一个或多个氨基酸残基进行添加、插入、缺失和/或取代来获得，其中，通过本领域已知的试验或本文特别描述的试验测量时，此类衍生物优选仍具有L-山梨糖酮脱氢酶活性。可通过本领域已知的化学肽合成或者通过重组技术，基于本文公开的DNA序列，用本领域已知的方法，来制造此类功能衍生物。蛋白质和肽中通常不影响此类分子活性的氨基酸交换是已知的。

为了在合适的微生物中表达SNDHai蛋白，可对本发明的重组表达载体加以设计。例如，根据本发明的蛋白可在细菌细胞中表达，例如，在属于Gluconobacter、Gluconacetobacter或Acetobacter属的菌株中表达。在本发明中有用的表达载体包括源自染色体、游离体和病毒的载体，例如源自细菌质粒、噬菌体的载体和源自上述物质的组合的载体，例如源自质粒和噬菌体遗传元件的载体，例如粘粒和噬菌粒（phagemid）。

DNA插入应当被可操作地连接到合适的启动子上，启动子可以是组成型启动子或可诱导的启动子。技术人员知道如何选择合适的启动子。表达构建体可以含有用于转录起始、终止的位点，还可在转录区域含有核糖体结合位点，以用于翻译。由构建体表达的成熟转录本的编码部分可优选包括处于起点的起始密码子，以及恰当地定位于待翻译的多肽末尾的终止密码子。

可通过传统的转化或转染技术将载体DNA引入合适的宿主细胞。本文中使用的术语“转化”、“转桥联（transconjugation）”和“转染”意指本领域内已知的、用于将外源核酸（例如DNA）引入到宿主细胞中的多种技术，包括磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、转导、感染、脂质转染、阳离子脂介导的转染或电穿孔。用于对宿主细胞进行转化和转染的合适方法可在Sambrook,et al.（上文所述的），Davis et al.,Basic Methods in Molecular Biology(1986)及其它实验手册中找到。

为对已将外源DNA整合进它们基因组的细胞进行鉴定和选择，通常，将编码选择标记（例如，对抗生素的抗性）的基因与感兴趣的基因一起引入宿主细胞。优选的选择标记包括赋予对药物（例如卡纳霉素、四环素、氨苄青霉素和链霉素）抗性的那些。编码选择标记的核酸优选在与编码根据本发明的蛋白的载体相同的载体上引入宿主细胞，或者其可在单独的载体上引入，该载体例如是自杀性载体，其不能在宿主细胞中复制。可通过药物选择鉴定出经过引入的核酸稳定转染的细胞（例如，已合并有选择标记基因的细胞将存活，而其它细胞会死亡）。

本发明还提供了经分离的多肽，其具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列或可通过在合适的宿主中表达本发明的多核苷酸（例如，SEQ IDNO：1所示的多核苷酸序列）获得的氨基酸序列。

根据本发明的多肽可仅含对SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列中一个或多个氨基酸的保守取代，或对非关键氨基酸的取代、插入或缺失。因此，非关键氨基酸是SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列中可被改变、且不会对生物功能造成实质性影响的残基。例如，在本发明的蛋白质之间保守的氨基酸残基被预计为对改变特别不敏感。此外，在根据本发明的蛋白质和其它SNDHai蛋白之间保守的氨基酸也对改变不太敏感。

术语“保守取代”用于表示下述取代，其中，氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基所取代。这些家族是本领域已知的，其包括具有碱性侧链（例如，赖氨酸、精氨酸和组氨酸）、酸性侧链（例如，天冬氨酸和谷氨酸）、不带电荷的极性侧链（例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸）、非极性侧链（例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸）、带beta支链侧链（例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸）和芳香族侧链（例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸）的氨基酸。

如上所述，本发明的多核苷酸可用于对合适的宿主细胞进行遗传工程改造，使其在发酵中更好且更有效，例如，在对维生素C的直接发酵工艺中更好且更有效。

因此，本发明还涉及对编码SNDHai多肽或其活性片段或其衍生物的基因以及编码具有SMS、STS、RCS或VCS活性的多肽或其活性片段或其衍生物的基因的同时使用，用于制备重组宿主细胞。此类宿主细胞从而将显示出提高的直接生产维生素C的能力。

微生物基因组中的改变可例如通过单交叉重组或多交叉重组用经改变的DNA序列替换野生型DNA序列来进行。为了能方便地选择出基因组被改变的微生物转化子，该改变可以例如是编码抗生素抗性基因的DNA序列，或者编码补足微生物可能的营养缺陷型的基因的DNA序列。突变可包括但不限于：缺失-插入突变。

还可通过下述方法获得微生物基因组中导致功能更强的多肽的改变：使用例如化学诱变剂、辐射或转座子对微生物基因组进行随机诱变，以及选择或筛选出是一种或多种发酵产物的更好的或更有效的生产菌株的突变体。用于筛选和选择的标准方法是技术人员已知的。

在一种特定实施方式中，人们需要敲除或遏制本发明SNDHai基因的阻遏子，即，其中，当引入合适的宿主细胞时，其阻遏子基因的表达被人工遏制，以提高对发酵产物生产的产率、生产能力和/或效率。用于提供敲除的方法以及提供携带此类被遏制基因的微生物的方法是本领域公知的。本文中使用的“对基因表达的遏制”包括完全和部分遏制，以及在特定条件下的遏制，还包括对两个等位基因中任何一个的表达的遏制。

用于SNDHai蛋白的上述诱变策略可导致想要的化合物（特别是维生素C）的产率增加。这些策略的列出并不意味着限制；对这些诱变策略的变化对于本领域普通技术人员来说将是显而易见的。可通过这些机制，用本发明的核酸和蛋白质分子产生出微生物，例如表达经突变SNDHai核酸和蛋白分子的Gluconobacter oxydans或细菌的相关菌株，使得对想要的化合物（例如维生素C）的生产的产率、生产能力和/或产量被提高。

本文所述的核酸分子、多肽、载体、引物和重组微生物可用于下述方法中的一种或多种：鉴定Gluconobacter oxydans以及相关的生物；绘制与Gluconobacter oxydans相关的生物的基因组图谱；对感兴趣的Gluconobacter oxydans序列进行鉴定和定位；进化研究；测定功能所需的SNDHai蛋白区域；调节SNDHai蛋白活性或功能；调节SNDHai途径的活性；以及调节对想要的化合物（例如，维生素C）的细胞内生产。

SNDHai肽的活性可通过本领域已知的方法以及本文将进一步示例的方法来测定。

为更进一步地展示本发明的细节，本文提供了多个实施例，其中，非常详细地示例性描述了对选自STS、RCS、SMS或VCS基因构成的组的基因的操作。选择编码选自STS、RCS、SMS或VCS蛋白构成的组的蛋白的其它基因并按照本文提供的教导对它们加以操作，以获得产生产率提高的维生素C的微生物对于技术人员来说将是显而易见的。

为提供上述方法的更多指导，提供了下表，其中，更为详细地描述了如何操作选自STS、RCS、SMS或VCS基因构成的组的基因。本文中，表达“上”和“下”指蛋白分别优选过量表达和欠表达，例如可通过分别对相应基因的上调和下调来实现。通过除了遗传操作之外的任何其它方法增强或降低了相应蛋白的活性，也可获得等同的结果。

技术人员将知道如何增强和/或提高蛋白（例如SNDHai或醇脱氢酶）的活性。这些可以例如通过对宿主生物进行遗传修饰来完成，所述遗传修饰以较之野生型生物产生更多或更稳定的的拷贝的方式来进行。这还可以通过增加蛋白的比活性来完成。

在下述说明书中，详细描述了达到此目的方案，即，通过增加（上调）特定蛋白，例如SNDHai的活性，增加从D-山梨糖醇或L-山梨糖直接生产的维生素C的产率和/或产量。在进行必要修正后，这些方案可应用于功能较之野生型副本将被增强或提高的RCS、SMS和STS蛋白。

为使生物产生更多拷贝的SNDHai基因（即，过量表达该基因）和/或蛋白，所进行的修饰包括：使用强启动子，或者对SNDHai基因（的部分）或其调控元件加以突变（例如，插入、缺失或点突变）。这还可包括将多个拷贝的基因插入到合适的微生物中。SNDHai蛋白比活性的增加也可通过本领域已知的方法来完成。此类方法可包括对SNDHai基因（的部分）的突变（例如，插入、缺失或点突变）。

本文中使用的突变可以是导致功能更强或更稳定的多肽（例如，功能更强或更稳定的SNDHai基因产物）的任何突变。这可包括，例如，在微生物基因组中的下述改变：其提高了SNDHai的合成，或者导致SNDHai蛋白以改变的氨基酸序列表达，该改变使得该蛋白的功能较之具有未被改变的氨基酸序列的野生型副本而言被提高和/或增强。干扰可在转录水平、翻译水平或翻译后水平上发生。

本领域中还已知可以通过将SNDHai蛋白与特定增强子相接触或与能与SNDHai蛋白发生特异性相互作用的其它物质相接触，来增强给定蛋白质活性的方法。为鉴定出此类特定增强子，可表达SNDHai蛋白，并对存在怀疑能增强SNDHai蛋白活性的化合物时的活性加以测试。还可通过对编码SNDHai的信使RNA进行稳定化来增加SNDHai蛋白的活性。此类方法也是本领域已知的，见，例如Sambrook et al.,1989,Molecular Cloning,ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Press,N.Y.和Ausubel et al.(eds.),1995,Current Protocols in Molecular Biology,(John Wiley&Sons,N.Y.)。

本文中使用的术语——活性的“增加”包括：增加生产生物中一种或多种多肽的活性，所述多肽是本文所述的相应的多核苷酸编码的。本领域中可获得用于增加给定蛋白（在本文的情况下是SNDHai蛋白）活性的多种方法。通常，可增加蛋白质的比活性或者可以增加蛋白质的拷贝数。术语“增加活性”或者类似表述还包括下述情形：其中，SNDHai蛋白活性被引入以前不含该活性的细胞，这例如通过将编码SNDHai的基因引入以前不含该基因等同物的细胞或以前不能表达相应蛋白的活性形式的细胞来实现。

为协助这种增加，对应于本文所述多核苷酸的基因的拷贝数可被增加。或者，可使用强启动子来指导多核苷酸的表达。在另一种实施方式中，基因的启动子、调控区域和/或核糖体结合位点可被改变，以增加表达。还可以通过增加信使RNA的相对半寿期来增强或强加表达。在另一种实施方式中，还可以通过在多肽氨基酸序列中利用能增加活性的一处或多处突变来增加多肽自身的活性。例如，改变多肽与其相应底物的相对Km可导致活性提高。类似地，可增加肽的相对半寿期。在基因表达增强或者比活性增加的情况下，可通过改变细胞培养基的组成和/或用于培养的方法来达成这种提高。本文中使用的“增强的表达”或“提高的活性”表示较之野生型蛋白、多核苷酸、基因、或多核苷酸或多肽被增强和/或提高之前存在的蛋白的活性和/或浓度而言，至少5%、10%、25%、50%、75%、100%、200%或者甚至超过500%的增加。还可通过将蛋白与其活性的特异性或一般性增强剂相接触来增加SNDHai蛋白的活性。

在本文公开的其它一些情况下，SMS、STS、RCS或VCS多肽的活性将被降低或消失，使得从D-山梨糖醇或L-山梨糖直接生产的维生素C的产率额外增加。

在进行必要修正后，关于减少（下调）SMS05蛋白活性的下述流程可应用于RCS、SMS、STS和VCS蛋白，特别是本文示例的、其功能较之野生型副本将有所减少的那些。

为协助这种减少，对应于本文所述多核苷酸的基因的拷贝数可被减少，例如，通过基因的欠表达或者对基因的打断来实现。如果基因的转录水平较之野生型基因降低，所述基因就被说成是“欠表达”。这可以通过例如Northern印迹杂交分析来测量，Northern印迹杂交分析对作为基因表达指示的mRNA的量进行定量。在本文中，如果产生的mRNA的量较之野生型基因产生的mRNA的量减少了至少1%、2%、5%、10%、25%、50%、75%或100%，那么该基因就是欠表达的。或者，可使用弱启动子来指导多核苷酸的表达。在另一种实施方式中，基因的启动子、调控区域和/或核糖体结合位点可被改变，以获得对表达的负调。还可以通过减少信使RNA的相对半寿期来降低表达。

在另一种实施方式中，还可以通过在编码多肽的基因序列中利用一处或多处突变来减少多肽自身的活性，这导致多肽氨基酸序列中的至少一处突变，从而减少了活性。例如，改变多肽与其相应底物的亲和性可导致活性降低。类似地，可减少肽的相对半寿期。

在基因表达降低或者活性降低的情况下，可通过改变细胞培养基的组成和/或用于培养的方法来达成这种降低。本文中使用的“降低的表达”或“降低的活性”表示较之野生型蛋白、多核苷酸或基因而言，至少5%、10%、25%、50%、75%或100%的减少。还可通过将蛋白与其活性的特异性或一般性抑制剂相接触来降低给定蛋白的活性。术语“降低的活性”、“减少的或消失的活性”在本文中可互换使用。

为提高某重组宿主细胞对维生素C的产生，可在该生物中抑制SMS05基因的表达，这例如通过靶向与SMS05核苷酸序列的调控区域（例如，SMS05启动子和/或增强子）互补的核苷酸序列，以形成三螺旋结构，阻止靶细胞中SMS05基因的转录来实现。一般而言，见Helene,C.(1991)Anticancer DrugDes.6(6):569-84;Helene,C.et al.(1992)Ann.N.YAcad Sci.660:27-36和Maher,L.J.(1992)Bioassays14(12):807-15。

还可通过对SMS05基因加以修饰来抑制或阻止基因表达，例如，通过向SMS05基因中引入一处或多处突变来实现，其中所述突变导致产生较之野生型蛋白而言功能显著降低的SMS05蛋白。

本文中使用的突变可以是导致功能更弱或更不稳定的多肽（例如，功能更弱或更不稳定的SMS05基因产物）的任何突变。这可包括，例如，在微生物基因组中的下述改变：其干扰了SMS05的合成，或者导致SMS05蛋白以改变的氨基酸序列表达，该改变使得该蛋白的功能较之具有未被改变的氨基酸序列的野生型副本而言被完全或部分破坏。干扰可在转录水平、翻译水平或翻译后水平上发生。

微生物基因组中的改变可例如通过单交叉重组或多交叉重组用经改变的DNA序列替换野生型DNA序列来进行。为了能方便地选择出基因组被改变的微生物转化子，该改变可以例如是编码抗生素抗性基因的DNA序列，或者编码补足微生物可能的营养缺陷型的基因的DNA序列。突变可包括但不限于：缺失-插入突变。此类改变的例子包括基因打断，即对基因加以扰乱，使得通常由该基因生产的产物不以功能性形式产生。这可通过完全缺失、选择性标记的缺失和插入、选择性标记的插入、读码框位移突变、同框（in-frame）缺失或者导致成熟前终止的点突变导致。在这些情况中的一些中，基因的整条mRNA不存在，在另一些中，产生的mRNA的量有所变化。在所有情况下，所述基因编码的多肽都不以功能性形式产生，其或者不存在或者以经突变形式存在，例如，具有本文定义的降低的活性的蛋白。

还可通过下述方法获得微生物基因组中导致功能更弱或没有功能的多肽的改变：使用例如化学诱变剂、辐射或转座子对微生物基因组进行随机诱变，以及选择或筛选出是一种或多种发酵产物的更好的或更有效的生产菌株的突变体。用于筛选和选择的标准方法是技术人员已知的。

在一种特定实施方式中，需要敲除本发明的SMS05基因，即，其中，当引入合适的宿主细胞时，其基因表达被人工遏制，以提高对发酵产物生产的产率、生产能力和/或效率。用于提供敲除的方法以及提供携带此类被遏制基因的微生物的方法是本领域公知的。可通过缺失掉基因或其调控区域的至少一部分，来诱导对内源SMS05基因的遏制。本文中使用的“对基因表达的遏制”包括完全遏制和部分遏制，以及在特定条件下的遏制，还包括对两个等位基因中任何一个的表达的遏制。

为制造其中SMS05基因的表达被人工遏制的敲除微生物，首先可克隆SMS05基因，然后可使用该基因来构建用于同源重组的载体，以在靶标微生物中失活内源SMS05基因。用于同源重组的载体含有设计来使靶标微生物中内源SMS05基因失活的核酸序列。此核酸序列可以是：例如，含有至少部分缺失突变的SMS05基因或其调控区域（例如，将被失活的基因侧翼存在的区域（顺式情况下）或单独存在的（反式情况下））的核酸序列，或者其可以是含有其它基因的SMS05基因或其调控区域。优选地，选择还可用作为标记发挥作用的基因作为将被插入进SMS05基因或其调控区域的基因。将使用的插入基因包括，例如，前文定义的药物抗性基因。对于基因可插入到SMS05基因中的位置没有特别限制，只要在该位置的插入能导致对靶标中内源SMS05基因表达的遏制即可。为避免插入的极性作用，可通过使用例如sacB系统，或通过长侧翼同源性PCR来引入同框沉默缺失。这些技术是本领域技术人员公知的。

用于SMS05蛋白的上述诱变策略可导致想要的化合物（特别是维生素C）的产率增加。这些策略的列出并不意味着限制；对这些诱变策略的变化对于本领域普通技术人员来说将是显而易见的。可通过这些机制，用本发明的核酸和蛋白质分子产生出微生物，例如表达经突变SMS05核酸和蛋白分子的Gluconobacter oxydans或细菌的相关菌株，使得对想要的化合物（例如维生素C）的生产的产率、生产能力和/或产量被提高。

在本文公开的其它一些情况下，SMS、STS或RCS多肽的活性将被增加，使得从D-山梨糖醇或L-山梨糖直接生产的维生素C的产率额外增加。

在进行必要修正后，关于增加（上调）STS01蛋白活性的下述流程可应用于RCS、SMS或STS蛋白，特别是本文示例的、其功能较之野生型副本将有所增加的那些。

本发明还涉及下述微生物，其中，给定多肽（例如STS01多肽）的活性增强和/或提高，使得从D-山梨糖醇或L-山梨糖直接生产的维生素C的产率增加，优选地，在过量表达SNDHai或其活性片段或其衍生物的微生物中。这可例如通过将根据本发明的多核苷酸转入重组或非重组微生物来完成，所述微生物可以含有STS01基因的内源等同物，或者可以不含。

技术人员将知道如何增强和/或提高给定蛋白（例如STS01蛋白）的活性。这些可以例如通过增加蛋白的比活性，或者通过对宿主生物进行遗传修饰来完成，所述遗传修饰以较之野生型生物产生更多或更稳定的蛋白（例如，STS01蛋白）的拷贝的方式来进行。

在下述说明书中，详细描述了达到此目的方案，即，通过增加STS01蛋白的活性，增加从D-山梨糖醇或L-山梨糖直接生产的维生素C的产率和/或产量。在进行必要修正后，这些方案可应用于其它STS、RCS或SMS蛋白。

为使生物产生更多拷贝的STS01基因（即，过量表达该基因）和/或蛋白，所进行的修饰包括：使用强启动子，或者对STS01基因（的部分）或其调控元件加以突变（例如，插入、缺失或点突变）。这还可包括将多个拷贝的基因插入到合适的微生物中。STS01蛋白比活性的增加也可通过本领域已知的方法来完成。此类方法可包括对STS01基因（的部分）的突变（例如，插入、缺失或点突变）。如果基因的转录水平较之野生型基因有所增强，那么认为该基因被“过量表达”。这可通过例如对mRNA的量加以定量的Northern印迹分析来测量，mRNA的量被用作为对基因表达的指示。在本文中，如果产生的mRNA的量较之野生型基因产生的mRNA的量增加至少1%、2%、5%、10%、25%、50%、75%、100%、200%或者甚至超过500%，那么基因就是过量表达的。

本领域中还已知可以通过将STS01蛋白与特定增强子相接触或与能与STS01蛋白发生特异性相互作用的其它物质相接触，来增强给定蛋白质活性。为鉴定出此类特定增强子，可表达STS01蛋白，并对存在怀疑能增强STS01蛋白活性的化合物时的活性加以测试。还可通过对编码STS01的信使RNA进行稳定化来增加STS01蛋白的活性。此类方法也是本领域已知的，见，例如Sambrook et al.,1989,Molecular Cloning,A LaboratoryManual,Cold Spring Harbor Press,N.Y.和Ausubel et al.(eds.),1995,CurrentProtocols in Molecular Biology,(John Wiley&Sons,N.Y.)。

更详细地，当以下述方式转化过量表达SNDHai的重组微生物时，获得了特别好的结果，所述方式使得编码展示出与未鉴定的、可能涉及磷酸转移酶系统的、P-环ATP酶蛋白家族的相似性的蛋白（SEQ ID NO：33）的内源基因STS24（SEQ ID NO：32）按照实施例15-18所述被敲除。

此外，当以下述方式转化过量表达SNDHai的重组微生物时，获得了特别好的结果，所述方式使得内源基因VCS01（SEQ ID NO：36）按照实施例19-24所述被敲除，该基因编码展示出与甘露糖-1-磷酸鸟苷酰转移酶/甘露糖-6-磷酸异构酶的相似性的蛋白（SEQ ID NO：37）。

此外，当以下述方式转化过量表达SNDHai的重组微生物时，获得了特别好的结果，所述方式使得内源基因VCS08（SEQ ID NO：40）按照实施例25-28所述被敲除，该基因编码展示出与天冬酰胺合酶（谷氨酰胺水解）的相似性的蛋白（SEQ ID NO：41）。

此外，当以下述方式转化过量表达SNDHai的重组微生物时，获得了特别好的结果，所述方式使得编码NAD(P)依赖性山梨糖酮脱氢酶（SEQID NO：45）的内源基因SMS05（SEQ ID NO：44）按照实施例29-33所述被敲除。

此外，当以下述方式转化过量表达SNDHai的重组微生物时，获得了特别好的结果，所述方式使得编码D-阿拉伯糖醇转运蛋白（SEQ ID NO：81）的内源基因STS01（SEQ ID NO：80）按照实施例34和35所述被敲除。

此外，当以下述方式转化过量表达SNDHai的重组微生物时，获得了特别好的结果，所述方式使得编码PQQ生物合成涉及的蛋白（pqqA）（SEQ ID NO：181）的内源基因（SEQ ID NO：180）RCS21按照实施例36和37所述被敲除。

将通过下述实施例进一步阐述本发明，所述实施例不应被理解为起限制作用。本文提到的所有参考文献、专利申请、专利和公开的专利申请的内容都通过引用并入本文。

实施例

实施例1制备染色体DNA以及通过PCR扩增DNA片段

在由25g/l甘露糖醇、5g/l酵母提取物（Difco）和3g/l细菌蛋白胨（Bactopeptone）（Difco）构成的甘露糖醇培养基型（MB）液体培养基中，于30°C对Gluconobacter oxydans DSM17078的细胞进行一天的培养，通过Sambrook et al(1989)"Molecular Cloning:A LaboratoryManual/Second Edition",Cold Spring Harbor Laboratory Press所述的方法，从培养的细胞制备Gluconobacter oxydans DSM17078的染色体DNA。

使用按照上文所述制备的染色体DNA以及一组引物——Pf（SEQ IDNO：3）和Pr（SEQ ID NO：4），通过PCR来制备DNA片段。按照厂商说明书，用Expand High Fidelity PCR试剂盒（Roche Diagnostics）和10ng染色体DNA以100μl的总体积来进行反应，获得了含有SNDHai DNA序列（SEQ ID NO：1）的PCR产物。从反应体系中回收PCR产物，并验证了其正确序列。

实施例2用在甘露糖醇培养基型琼脂培养基上培养的静止细胞从L-山梨糖酮来生产维生素C

IFO菌株3293、3292、3244、3260、3266、3287、3259、13693和13773以及Acetobacter sp.ATCC15164和Gluconobacter oxydans DSM17078，菌株IFO3293的衍生物，被用于从L-山梨糖酮生产维生素C。

在含有5g/l细菌蛋白胨（Difco）、5g/l酵母提取物（Difco）、5g/l葡萄糖、5g/l甘露糖醇、1g/l MgSO₄·7H₂O、5ml/l乙醇和15g/l琼脂的No.350培养基上，于27°C，对菌株IFO13693和IFO13773进行3天的培养。在含有25g/l甘露糖醇、5g/l酵母提取物（Difco Laboratories,Detroit,Mich.,USA）、3g/l细菌蛋白胨（Difco）和18g/l琼脂（Difco）的甘露糖醇培养基（MB）琼脂培养基上，于27°C，对所有其它Acetobacter菌株和所有Gluconobacter菌株进行3天的培养。

从琼脂平板上刮下细胞，将其悬浮于蒸馏水中，用于静止细胞反应，所述反应进行于30°C，230rpm振荡下，5ml试管中，进行20小时。反应混合物（0.5ml）含有1%的L-山梨糖酮、0.3%NaCl、1%CaCO₃和终浓度为600纳米下（OD600）10个吸光率单位的细胞。在培养阶段的最后，用具有与Aminex-HPX-78H（300x7.8mm）柱（Biorad,Reinach,Switzerland）相连的Lichrospher-100-RP18（125x4.6mm）柱（Merck,Darmstadt,Germany）的Agilent1100HPLC系统（Agilent Technologies,Wilmington,USA），通过高效液相色谱（HPLC）来对反应混合物进行分析。流动相为0.004M硫酸，流速为0.6ml/分钟。用UV探测器（波长254nm）组合折射系数探测器，记录下两个信号。此外，用氨基柱（YMC-Pack Polyamine-II,YMC,Inc.,Kyoto,Japan）在254nm处的UV探测来进行对维生素C的鉴定。流动相为50mM NH₄H₂PO₄和乙腈（40：60）。

Agilent Series1100HPLC-质谱（MS）系统被用于鉴定维生素C。用电喷雾界面在阳离子模式下来操作MS。用LUNA-C8(2)柱（100x4.6mm）（Phenomenex,Torrance,USA）来进行分离。流动相为0.1%蚁酸和甲醇（96：4）的混合物。维生素C在驻留时间为3.1分钟时被洗脱出来。通过驻留时间和该化合物的分子量来确认维生素C的身份。

为排除D-异抗坏血酸的存在，用氨基柱（YMC-Pack Polyamine-II,YMC,Inc.,Kyoto,Japan）在254nm处的UV探测通过驻留时间对维生素C进行额外的鉴定。流动相为50mM NH₄H₂PO₄和乙腈（40：60）。

如表1所示，Gluconobacter和Acetobacter菌株能从L-山梨糖酮产生维生素C。

表1.从L-山梨糖酮生产维生素C

菌株	维生素C（mg/L）
		G.oxydans IFO3293	1740
G.oxydans DSM17078	570
		G.oxydans IFO3292	410
G.oxydans IFO3244	1280
		G.frateurii IFO3260	50
G.cerinus IFO3266	140
		G.oxydans IFO3287	60
A.aceti subsp.Orleanus IFO3259	30
		A.aceti subsp.Xylinum IFO13693	40
A.aceti subsp.Xylinum IFO13693	120
		Acetobacter sp.ATCC15164	310
空白对照	未探测到

空白对照：反应在没有细胞的反应混合物中进行。

实施例3在试管和瓶中发酵从L-山梨糖和D-山梨糖醇来生产维生素C

将G.oxydans DSM17078的细胞用于接种4ml No.3BD液体培养基，并在220rpm振荡下，于30°C在试管（18mm直径）中对其进行3天的培养。在培养时期的末尾，收集到20mg/l的维生素C。

在200rpm振荡下，30°C时，在500ml带挡板摇瓶中的50ml No.5培养基中，对菌株DSM17078的细胞（重复三份）进行培养，所述培养基含有100g/l D-山梨糖醇、0.5g/l甘油、15g/l酵母提取物（Difco）、2.5g/lMgSO₄·7H₂O和15g/l的CaCO₃。72小时的培养后，在三个瓶中通过HPLC检测到的维生素C的量为400、500和680mg/l。

实施例4在补料分批发酵中从D-山梨糖醇来生产维生素C

在180rpm振荡下，30°C时，在2升带挡板摇瓶中的200ml No.5培养基中，对G.oxydans DSM17078的细胞进行培养，所述培养基含有100g/l D-山梨糖醇、0.5g/l甘油、15g/l酵母提取物（Fluka Biochemika,Buchs,Switzerland）、2.5g/l MgSO₄·7H₂O和15g/l的CaCO₃。48小时后，用150ml该培养物去接种10升的生物反应器（B.Braun ED10,Melsungen,Germany），所述反应器中已预先装有5.3升的培养基（含有20g/l D-山梨糖醇、0.5g/l甘油、15g/l酵母提取物（Fluka Biochemika,Buchs,Switzerland）和2.5g/l MgSO₄·7H₂O），并装备有温度、pH和溶解氧传感器和控制线圈。温度被控制为30°C，通过加入28％氨溶液将pH控制为6.0，气流为4.5升/分钟，通过搅拌速度（最小300rpm）级联将溶解氧控制为30％。6小时的反应时间后，以25g/h的速率，在44小时的时期内，补加入500g/l的山梨糖醇溶液。96小时的反应时间后，上清液中仅留有1％的底物，并已产生了950mg/l的维生素C。

实施例5在细胞膜部分中从L-山梨糖酮或L-山梨糖来生产维生素C

在500ml带挡板瓶中100ml No.3BD液体培养基中，220rpm的振荡下，于30°C对G.oxydans DSM17078的细胞进行3天的培养。在500rpm对得到的培养物进行离心，以去除CaCO₃。然后在5,000rpm对来自该步骤的上清液进行离心，以使细胞沉淀。将收集的细胞悬浮于3ml的50mM磷酸钾缓冲液（pH7.0）中，通过在900psi.两次经过French PressureCell（SIM-AMINCO Spetronic Instruments,USA）来使细胞破碎。先在5,000rpm下对得到的均匀混合物进行离心，以去除细胞残骸。然后，将上清液稀释为最终的蛋白质浓度为3mg蛋白质/ml。将该经过稀释的样品称为不含细胞的提取物（CFE）。在100,000x g对CFE进行60分钟的离心。弃去上清液，收集沉淀，作为膜部分。

在220rpm振荡下，于30°C，在50mM磷酸钾缓冲液（pH7.0）中，用膜部分（100μl）来进行15小时的反应（200μl）。待测底物为L-山梨糖酮（1％终浓度）和L-山梨糖（2％终浓度）。用于反应的最终蛋白质浓度为1.5mg/ml。在培养时期的末尾，从1％L-山梨糖酮和2％L-山梨糖分别产生了680mg/l和10mg/l的维生素C。

实施例6用生长于3BD琼脂培养基上的静止细胞，从D-山梨糖醇、L-山梨糖或L-山梨糖酮来生产维生素C

在含有70g/l L-山梨糖、0.5g/l甘油、7.5g/l酵母提取物（Difco）、2.5g/l MgSO₄·7H₂O、10g/l CaCO₃和18g/l琼脂（Difco）的No.3BD琼脂培养基上，于27°C对G.oxydans DSM17078的细胞进行3天的培养。如实施例2所述，用2%D-山梨糖醇、2%L-山梨糖或1%L-山梨糖酮于30°C来进行24小时静止细胞反应（10ml试管中，1ml反应混合物）。菌株DSM17078分别从D-山梨糖醇、L-山梨糖和L-山梨糖酮生产出了280、400和1780mg/l的维生素C。

如实施例2所述，在含有2%D-山梨糖醇、2%L-山梨糖或2%L-山梨糖酮的反应混合物中，用No.3BD琼脂培养基上生长的DSM17078细胞来进行其它反应（10ml试管中，0.5ml反应混合物），进行2天。菌株DSM17078分别从D-山梨糖醇、L-山梨糖和L-山梨糖酮生产出了1.8、2.0和5.1g/l的维生素C。

按照上文所述，用2%L-山梨糖酮，用G.oxydans IFO3293的细胞来进行反应。菌株IFO3293在2天内生产出了5.7g/l的维生素C。

实施例7用生长于液体培养基中的静止细胞来从D-山梨糖醇生产维生素 C

G.oxydans DSM17078的细胞被培养于200ml No.5培养基上，所述培养基含有100g/l D-山梨糖醇、0.5g/l甘油、15g/l酵母提取物（FlukaBiochemika,Buchs,Switzerland）、2.5g/l MgSO₄·7H₂O和15g/l CaCO₃，培养在2升带挡板摇瓶中，于30°C下在180rpm的振荡下进行。24小时后，在3220g下对培养物进行离心（Eppendorf5810R,Hamburg,Germany），并将细胞重新悬浮于0.9%NaCl溶液中，再在3220g下离心，细胞沉淀被用于接种一只含有50ml完全生长培养基（100g/l D-山梨糖醇、0.5g/l甘油、15g/l酵母提取物、2.5g/l MgSO₄·7H₂O、15g/lCaCO₃）的带挡板500ml摇瓶以及另一只含有50ml生产培养基（100g/lD-山梨糖醇、3g/l NaCl、10g/l CaCO₃）的带挡板500ml摇瓶。在两只瓶中，作为600nm处测量的光密度（OD₆₀₀）的初始细胞密度均为10。在180rpm振荡下，于30°C对两只瓶进行培养。48小时后，生长培养基和生产培养基中的细胞悬浮液分别已经积累了1.06和1.18g/l的维生素C。培养期间在完全培养基中没有观察到额外的生长。

实施例8对能从L-山梨糖酮生产维生素C的细菌进行Southern印迹分析

从Gluconobacter oxydans IFO3293、IFO3292、IFO3244、IFO3287，Gluconobacter frateurii IFO3260和IFO3265，Gluconobacter cerinusIFO3266和IFO3269，Acetobacter aceti subsp.orleanus IFO3259，Acetobacter aceti subsp.xylinum IFO13693和IFO13773，Acetobacter sp.ATCC15164和Escheichia coli K-12的细胞来制备染色体DNA。在含有5g/l细菌蛋白胨（Difco）、5g/l酵母提取物（Difco）、5g/L葡萄糖、5g/l甘露醇、1g/l MgSO₄·7H₂O、5ml/L乙醇和15g/l琼脂的No.350培养基上，于27°C对菌株IFO13693和IFO13773进行3天的培养。在含有25g/l甘露醇、5g/l酵母提取物（Difco Laboratories,Detroit,Mich.,USA）、3g/l细菌蛋白胨（Difco）和18g/l琼脂（Difco）的甘露醇培养基（MB）琼脂培养基上，于27°C对所有其它的Acetobacter菌株和所有Gluconobacter菌株进行3天的培养。E.coli K-12被培养于Luria Broth琼脂培养基上。染色体DNA制备物被用于在严谨条件下进行Southern印迹杂交。用ClaI（当分析N-结构域区域时）或EcoRI（当分析C-结构域区域时）对染色体DNA制备物进行消化，通过琼脂糖凝胶电泳（1％琼脂糖）分离出1μg的DNA片段。用0.25N的HCl对凝胶进行15分钟的处理，然后用0.5N NaOH进行30分钟的处理，然后将其按照厂商说明书印到Vacuum Blotter Model785（BIO-RAD Laboratories AG,Switzerland）的尼龙膜上。使用表2中所述的引物组，用PCR-DIG标记试剂盒（RocheDiagnostics）来制备探针。PCR产物P1对应于SNDHai的被称为N-结构域的区域（可能的跨膜区域），而PCR产物P2则对应于SNDHai的被称为C-结构域的区域（可能的主要脱氢酶区域）。

表2.用于PCR以产生用于Southern杂交的经过标记的探针的引物

表2显示了Southern印迹杂交实验的结果。在用P1（N-结构域）探针进行的杂交中，观察到了关于G.oxydans IFO3293、IFO3293、IFO3244、IFO3287和A.sp.ATCC15164的清楚的阳性条带。在用P2（C-结构域）探针进行的杂交中，观察到了关于菌株IFO3293、IFO3292、IFO3244、IFO3287和A.sp.ATCC15164的清楚的阳性条带，而对菌株IFO3260、IFO3265、IFO3266、IFO3269和IFO13773只观察到了模糊的条带。对照菌株E.coli K-12对于这两种结构域都没有显示出可被探测到的信号。

表3.对用针对SNDHai的N-和C-结构域的探针（探针P1和P2）进行Southern印迹杂交在不同菌株中获得的杂交信号的探测

菌株	P1	P2
			G.oxydans IFO3293	+	+
G.oxydans IFO3292	+	+
			G.oxydans IFO3244	+	+

G.frateurii IFO3260	nd	tr
			G.frateurii IFO3265	nd	tr
G.cerinus IFO3266	nd	tr
			G.oxydans IFO3269	nd	tr
G.oxydans IFO3287	+	+
			A.aceti subsp.orleanus IFO3259	nd	nd
A.aceti subsp.xylinum IFO13693	nd	nd
			A.aceti subsp.xylinum IFO13773	nd	tr
Acetobacter sp.ATCC15164	+	+
			E.coli K-12	nd	nd

tr，痕量；nd，未探测到。探针P1和P2是表2中列出的引物组合成的（作为DIG标记的PCR产物）。

实施例9对Gluconobacter oxydans DSM17078SNDHai基因的直向同源体的PCR扩增和测序

染色体DNA制备物（按照实施例8中所示来制备）被用作为PCR的模板，其中使用表2中所示的四对引物组。每份反应（总体积，50μl）中使用5至100ng的染色体DNA。除非另有指明，使用Expand HighFidelity PCR系统（Roche Diagnostics）。PCR条件如下所示：

在94°C温育2分钟；30个如下循环：（i）94°C变性步骤，15秒，（ii）60°C退火步骤，30秒，（iii）72°C合成步骤，45至120秒（对引物组P1、P2、P3和P4而言，用于合成步骤的时间分别为45秒、120秒、90秒和90秒）；在72°C延伸7分钟。

通过琼脂糖凝胶电泳分离出PCR反应的样品，用溴化乙啶染色后，用透照器（transilluminator）来观察条带。PCR反应的结果被概括于表4中。

表4.对用表2的引物组在不同菌株中获得的PCR产物P1、P2、P3和P4的探测（通过琼脂糖凝胶电泳来观察产物）

菌株	P1	P2	P3	P4
					G.oxydans IFO3293	+	+*	nt	+
G.oxydans IFO3292	+	nd	nd	+
					G.oxydans IFO3244	+	+	+	+
G.frateurii IFO3260	nd	nd	nd	nd
					G.cerinus IFO3266	nd	nd	nd	nd
G.oxydans IFO3287	+	+	nd	+
					A.aceti subsp.orleanus IFO3259	nd	nd	nd	nd
A.aceti subsp.xylinum IFO13693	nd	nd	nd	nd
					A.aceti subsp.xylinum IFO13773	nd	nd	nd	nd
Acetobacter sp.ATCC15164	+	+	nd	nd
					E.coli K-12	nd	nd	nt	nd

+，探测到；nd，未探测到；nt，未检测。*用与用于Expand HighFidelity PCR系统相同的反应循环，用GC-rich PCR系统（RocheDiagnostics）来进行该PCR。

当在琼脂糖凝胶上观察到清楚的PCR条带时，PCR产物被直接用于使用标准方法的核苷酸测序。将针对不同PCR产物获得的核苷酸序列及其所编码的肽的相应的氨基酸序列，与来自G.oxydans DSM17078的SNDHai基因和蛋白质的全长序列进行比较。

Gluconobacter oxydans IFO3292SNDHai直向同源体

用来自G.oxydans IFO3292的染色体DNA作为模板，用引物SNDH1391F（SEQ ID NO：10）和SNDH2364R（SEQ ID NO：8）进行扩增，获得了PCR产物（大约1kb），将其用于用SNDH1391F（SEQ IDNO：10）进行的测序。测得的771bp的核苷酸序列（SEQ ID NO：11）显示出了与来自G.oxydans DSM17078的SNDHai的序列（SEQ ID NO：1）的1431-2201位核苷酸的98.7％（761/771）的同源性。推断出的256个氨基酸的氨基酸序列（SEQ ID NO：12）显示出：与来自G.oxydansDSM17078的SNDH的氨基酸序列（SEQ ID NO：2）的478-733位具有100％的相同性。

Gluconobacter oxydans IFO3287SNDHai直向同源体

用来自G.oxydans IFO3287的染色体DNA作为模板，用引物SNDH1F（SEQ ID NO：5）和SNDH420R（SEQ ID NO：6）进行扩增，获得了PCR产物（大约0.4kb），将其用于用SNDH420R（SEQ ID NO：6）进行的测序。测得的350bp的核苷酸序列（SEQ ID NO：13）显示出了与SEQ ID NO：1的31-380位核苷酸的97.4％（341/350）的同源性。推断出的116个残基的氨基酸序列（SEQ ID NO：14）显示出了与SEQ IDNO：2的11-126位氨基酸的100％的相同性。

用引物SNDH501F（SEQ ID NO：7）和SNDH2364R（SEQ ID NO：8）扩增获得的PCR产物（大约1.9kb）被用于用SNDH501F（SEQ IDNO：7）进行的测序。测得的808bp的核苷酸序列（SEQ ID NO：15）显示出了与SEQ ID NO：1的578-1385位核苷酸的98.0％（745/808）的同源性。推断出的268个残基的氨基酸序列（SEQ ID NO：16）显示出了与SEQ ID NO：2的194-461位氨基酸的100％的相同性。

用引物SNDH1391F（SEQ ID NO：10）和SNDH2364R（SEQ IDNO：8）扩增获得的PCR产物（大约1kb）被用于用SNDH1391F（SEQID NO：10）进行的测序。测得的800bp的核苷酸序列（SEQ ID NO：17）显示出了与SEQ ID NO：1的1469-2268位核苷酸的98.8％（790/800）的同源性。推断出的266个残基的氨基酸序列（SEQ ID NO：18）显示出了与SEQ ID NO：2的491-756位氨基酸的100％的相同性。

Acetobacter sp.ATCC15164SNDHai直向同源体

用来自A.sp.ATCC15164的染色体DNA作为模板，用引物SNDH1F（SEQ ID NO：5）和SNDH420R（SEQ ID NO：6）进行扩增，获得了PCR产物（大约0.4kb），将其用于用SNDH420R（SEQ ID NO：6）进行的测序。测得的360bp的核苷酸序列（SEQ ID NO：19）显示出了与SEQID NO：1的31-390位核苷酸的97.8％（352/360）的同源性。推断出的120个残基的氨基酸序列（SEQ ID NO：20）显示出了与SEQ ID NO：2的11-130位氨基酸的100％的相同性。

用引物SNDH501F（SEQ ID NO：7）和SNDH2364R（SEQ ID NO：8）扩增获得的PCR产物（大约1.9kb）被用于用SNDH501F（SEQ IDNO：7）进行的测序。测得的760bp的核苷酸序列（SEQ ID NO：21）显示出了与SEQ ID NO：1的563-1322位核苷酸的98.0％（745/760）的同源性。推断出的252个残基的氨基酸序列（SEQ ID NO：22）显示出了与SEQ ID NO：2的189-440位氨基酸的100％的相同性。

Gluconobacter oxydans IFO3244SNDHai直向同源体

通过使用用G.oxydans IFO3244的染色体作为模板和下述引物组获得的PCR产物，来测定G.oxydans IFO3244的SNDHai直向同源体基因的完全核苷酸序列，所述引物组为：SNDH1F（SEQ ID NO：5）和SNDH420R（SEQ ID NO：6）；SNDH501F（SEQ ID NO：7）和SNDH1530R（SEQID NO：9）；SNDH1391F（SEQ ID NO：10）和SNDH2364R（SEQ IDNO：8）；SNDH382（SEQ ID NO：23）和SNDH1530R（SEQ ID NO：9）；SNDH1F（SEQ ID NO：5）和SNDH689R（SEQ ID NO：24）。用BglII和BamHI消化过并被连接的染色体DNA被用于使用下述引物组的另外两种PCR：SNDH420R（SEQ ID NO：6）和SNDH501F（SEQ ID NO：7）和SNDH1530R（SEQ ID NO：9）和IS-50.3（SEQ ID NO：25）。完整的核苷酸序列（SEQ ID NO：26）显示出：与来自G.oxydans DSM17078的SNDHai的核苷酸序列（SEQ ID NO：1）具有98.4%的同源性。推断出的氨基酸序列（SEQ ID NO：27）显示出了与SEQ ID NO：2的氨基酸序列的100%的相同性。

实施例10通过增加SNDHai基因剂量增加从L-山梨糖酮到维生素C的生产

用菌株DSM17078的染色体DNA作为模版，用引物组N1（SEQ IDNO：28）和N2（SEQ ID NO：29）来进行PCR，扩增具有上游和下游侧翼序列的SNDHai基因。

按照厂商说明书，用GC-rich PCR系统（Roche Diagnostics）来进行PCR。将扩增得到的DNA片段插入到载体pCR2.1-TOPO（Invitrogen,Carlsbad,CA,USA）中。然后用HindIII和XhoI去消化得到的质粒。将包括有SNDHai基因的HindIII-XhoI片段连接到预先用HindIII和XhoI处理过的载体pVK100（可从American Type Culture Collection获得，目录号ATCC37156）上。连接混合物被用于转化E.coli TG1。想要的质粒被命名为pVK-P-SNDHai-T，将其从E.coli中分离出来，并通过使用标准方法进行的电转化（Electrocell manipulator ECM600,BTX Inc.,San Diego,CA,USA）将其引入到G.oxydans菌株DSM17078中。

在200rpm的振荡下，于30°C，在500ml带挡板摇瓶中的50mlNo.5培养基中，对G.oxydans菌株DSM17078和携带有质粒pVK-P-SNDHai-T的G.oxydans菌株DSM17078的细胞进行培养，所述培养基含有100g/l D-山梨糖醇、0.5g/l甘油、15g/l酵母提取物（Difco）、2.5g/lMgSO₄·7H₂O和15g/l CaCO₃。48小时的培养之后，通过HPLC对两只瓶中的上清液进行测量，其中维生素C的含量分别为110mg/l和200mg/l。

实施例11通过具有增加的SNDHai基因剂量的重组微生物静止细胞，从 L-山梨糖酮或D-山梨糖醇来生产维生素C

通过用菌株DSM17078的染色体DNA作为模板，用引物组N1（SEQID NO：28）和N2（SEQ ID NO：29）进行PCR，来扩增具有上游和下游侧翼序列的G.oxydans DSM17078（SEQ ID NO：1）的SNDHai基因。

按照厂商说明书，用GC-rich PCR系统（Roche Diagnostics GmbH）来进行PCR。扩增出的片段被插入到载体pCR2.1-TOPO（Invitrogen,Carlsbad,CA,USA）中。然后用HindIII和XhoI来消化得到的质粒。包括有SNDHai基因的HindIII-XhoI片段被连接到之前用HindIII和XhoI处理过的载体pVK100（可从American Type Culture Collection获得，目录号为ATCC37156）上。连接混合物被用于转化E.coli TG1。想要的质粒被命名为pVK-P-SNDHai-T，将其从E.coli中分离出来，并使用标准方法进行电转化（Electrocell manipulator ECM600,BTX Inc.,San Diego,CA,USA）将其引入到G.oxydans菌株DSM17078中。

三种独立的转化子，被命名为DSM17078（pVK-P-SNDHai-T）克隆1号、2号和3号，它们与亲本菌株G.oxydans DSM17078一起，每种都被培养于3BD琼脂和MB琼脂培养基上。从平板上刮下细胞，将其用于静止细胞反应（1%L-山梨糖酮作为底物），如实施例9所述。在No.3BD琼脂上培养之后，在静止细胞测试中，菌株DSM17078产生出了2.5g/l的维生素C，而菌株DSM17078（pVK-P-SNDHai-T）克隆1号、2号和3号则分别产生出了4.2、4.1和4.2g/l的维生素C。在MB琼脂上培养之后，在静止细胞测试中，菌株DSM17078产生出了0.12g/l的维生素C，而菌株DSM17078（pVK-P-SNDHai-T）克隆1号、2号和3号则分别产生出了1.8、2.5和0.94g/l的维生素C。

用G.oxydans DSM17078和克隆2号（见上）的细胞来进行另一项反应，所述细胞在220rpm振荡下于30°C，分别在双份500ml带挡板摇瓶中的50ml No.5培养基（100g/l D-山梨糖醇、0.5g/l甘油、15g/l酵母提取物、2.5g/l MgSO₄·7H₂O、15g/l CaCO₃）中培养了3天。对每种菌株而言，在500rpm对一瓶中得到的培养物进行离心，以去除CaCO₃。然后再在5,000rpm下对来自该步的上清液进行离心，以沉淀细胞。将收集到的细胞重新悬浮于10ml0.9%的NaCl溶液中，再在5,000rpm下进行离心以沉淀细胞。再将收集到的细胞重新悬浮于水中，并用于接种1ml生产培养基（20g/l D-山梨糖醇、3g/l NaCl、10g/l CaCO₃），所述培养基处于10ml反应试管中，最终的静止细胞密度相当于600nm处的5OD单位。在30°C和220rpm下，20小时反应时间后，对菌株DSM17078和过量表达SNDHai的DSM17078而言，从生产瓶中收获的上清液中分别含有360和760mg/l的维生素C。相反，72小时后，从剩下的生长培养基中收获的上清液分别含有0和440mg/l的维生素C。

实施例12在E.coli的静止细胞中从L-山梨糖酮来生产维生素C

没有终止密码子的SNDHai基因被命名为SNDHai-1，其对应于SEQID NO：1的1-2364位核苷酸，用引物对SNDHai-Nde（SEQ ID NO：30）和SNDHaiHis-X（SEQ ID NO：31），通过PCR（Roche High Fidelity试剂盒）从菌株DSM17078的染色体DNA对其进行了扩增。

扩增出的DNA被克隆进pCR2.1-TOPO（Invitrogen,Carlsbad,CA,USA），以获得pCR2.1-TOPO-SNDHai-1，其SNDHai序列通过核苷酸测序被验证为是正确的。然后用NdeI和XhoI切出来SNDHai-1基因，将其连接到pET-21b(+)（Novagen，Madison，WI，USA）的NdeI和XhoI位点之间，以产生出pET21b-SNDHaiHis；6xHis被加到SNDHai的C-末端。pET21b-SNDHaiHis被引入到E.coli BL21（DE3）中。

从在添加有50μg/ml羧苄青霉素的LB中培养的E.coli BL21（DE3）/pET21b-SNDHaiHis的过夜培养物中取5ml，接种到200ml同样的培养基中。在230rpm下于37°C对细胞进行2小时的培养，然后用1mM IPTG诱导，继续在230rpm下于25°C培养3小时。对得到的培养物进行离心，然后用盐水洗两次，将细胞沉淀悬浮于2ml水中。细胞被用于静止细胞反应，其中使用的反应混合物（5ml试管中，500μl）含有OD600=10的细胞，1%的单水合山梨糖酮、5μM PQQ、5mM MgCl₂、0.3%NaCl和1%CaCO₃，反应在30°C下进行15小时。在温育15小时后，生产出了0.14g/l的维生素C。当用1μM PQQ来进行静止细胞反应时（其它条件都与上文所述相同），在温育3小时后生产出了0.05g/l的维生素C。

实施例13通过具有增加的SNDHai基因剂量的重组微生物的静止细胞从D-山梨糖醇来生产维生素C

在180rpm的振荡下，于30°C，在500ml带挡板摇瓶中的50ml No.5培养基中，对过量表达SNDHai的G.oxydans DSM17078细胞进行培养，所述培养基含有100g/l D-山梨糖醇、0.5g/l甘油、15g/l酵母提取物（Fluka BioChemika,Buchs,Switzerland）、2.5g/l MgSO₄·7H₂O和15g/lCaCO₃，培养48小时。得到的细胞悬浮液被用于接种2L的生物反应器，所述反应器被称为生长容器（Biostat-MD,B.Braun Melsungen,Melsungen,Germany），其中含有1.25升的培养基，所述培养基由100g/l D-山梨糖醇、15g/l酵母提取物（Fluka BioChemika,Buchs,Switzerland）、2.5g/lMgSO₄·7H₂O、0.3g/l KH₂PO₄和0.12g/l CaSO₄组成。细胞被培养于30°C，1升/分钟通气速率下，用25%的Na₂CO₃溶液将pH控制为5.7，通过改变搅拌速率将溶解氧控制为10%的饱和度。24小时后，作为600nm处吸光率单位测得的细胞密度为20。在该时间点，将含有100g/l D-山梨糖醇、15g/l酵母提取物（Fluka BioChemika,Buchs,Switzerland）、2.5g/lMgSO₄·7H₂O、0.3g/l KH₂PO₄和0.12g/l CaSO₄的补料溶液以125ml/小时的补料速率补入到生长容器中，以125ml/小时的收获速率连续收获培养物。通过该方法，生长容器中的体积被保持恒定为1.25升。按照上文所述对其它工艺参数进行连续控制。

该培养物以125ml/小时的速率被连续补入到第二反应器中，该反应器被称为生产容器，其中装有5升生产培养基，其中含有100g/l D-山梨糖醇、0.3g/l NaCl和0.12g/l CaSO₄，温度被保持为30°C，通过20%的NaOH溶液将pH控制为7.0。通气速率被保持恒定为10升/分钟，通过变化搅拌器速率将溶解氧控制为20%。具有相同组成的生产培养基还被连续补入到生产容器中，补料速率为375ml/小时。通过以500ml/小时的速率持续收获上清液，使容器体积保持恒定，得到来自具有500kDa孔径的横流超滤模块（UFP-500-E-9A，Amersham Biosciences）的过滤流，用Masterflex泵，以50升/小时，通过其从生产容器中收获细胞悬浮液。渗余物被泵回到容器中。一旦生产容器中的细胞密度达到600nm下的吸光率为100，就开始以25ml/小时的速率从流回到生产容器中的经过浓缩的细胞流中收获细胞，以保持生产容器中的细胞密度恒定。

不含细胞的上清液的收获流含有4g/l的维生素C，其以500ml/小时的速率被持续补入到具有双夹套（double jacket）的收集容器中，这在30°C下进行（Ecoline Re112,Lauda,Lauda-Koenigshofen,Germany）。该容器持续将上清液以180升/小时的速率补入到两区室电渗析单元（含有10对具有阳离子交换膜CMX-S和阴离子交换膜ASM的堆叠，膜的总面积为0.2m²，来自Eurodia Industries，Wissous，France）的稀释区室中，持续的流被泵出容器以保持其体积恒定为2升。另一具有双夹套（最初含有去离子水，30°C）容器被持续补入新鲜的去离子水，速率为62.5ml/小时，其以200升/小时地速率向电渗析单元的浓缩区室中持续泵入水性溶液，持续的收获流被从容器中泵出。用蠕动泵（7518-00,Masterflex,USA）将补料溶液泵到电渗析夹套中，在旋转式泵（MD-20，IWAK，Tokyo，Japan）的协助下，使溶液通过每个电渗析区室流通。在整个过程中，对电渗析堆叠应用14V（电源FuMATech TS001/5，St.Ingbert，Germany）。收获流中维生素C的浓度为16g/l。

实施例14通过下游加工步骤对用静止细胞反应生产的维生素C进行纯化

将实施例14中含有16g/l维生素C的收获流补入到螯合树脂（Amberlite IRC748,Rohm and Haas,Philadelphia,PA,USA）中，以从流中除去二价阳离子。然后在经过冷却的容器（补料容器）中对其进行收集，当收集到10升是，通过两极膜电渗析单元（含有7对Neosepta BP1/CMB膜，膜的总面积为0.14m²，来自Eurodia Industries，Wissous，France）以分批模式对它们进行加工。以200升/小时将该溶液泵过电渗析单元的补料区室，并回收到补料容器中。最初含有5升的2g/l NaOH溶液的另一经过冷却的容器（浓缩容器）被以100升/小时泵过两极膜电渗析单元的浓缩区室。通过应用25V的最大电压，以及20A的最大电流，将来自补料区室的钠离子转移到浓缩区室中，因此在补料流中存在的维生素C的钠盐形式被转化为相应的游离酸形式。达到90%的转化产率后，该过程被终止。在浓缩容器中，6升含有7.5g/l NaOH的溶液被收集于稀释容器中，9升含有大约16g/l游离酸形式维生素C和1.6g/l钠盐形式的维生素C的溶液被通过阳离子交换树脂（Amberlite FPC21H,Rohm and Hass,Philadelphia,PA,USA）进行进一步的加工，以将从钠盐到游离酸形式的转化产率提高到大约99%。或者，通过阳离子交换树脂，对来自电渗析步骤的10升含有16g/l钠盐形式的维生素C的溶液进行直接地处理，将其以99%的产率转化为游离酸形式。然后通过下述一系列步骤，对通过上述任何方法获得的、以游离酸形式存在的维生素C的流进行加工，所述步骤为：阴离子交换、活性炭处理、浓缩、结晶、晶体过滤和干燥。获得的晶体的终纯度为98%，用组合下游加工步骤获得的产率为80%。

实施例15制备染色体DNA以及通过PCR扩增STS24DNA片段

在由25g/l甘露糖醇、5g/l酵母提取物（Difco）和3g/l细菌蛋白胨（Difco）构成的甘露糖醇培养基型（MB）液体培养基中，于30°C对Gluconobacter oxydans DSM17078的细胞进行一天的培养，通过Sambrooket al(1989)"Molecular Cloning:A Laboratory Manual/Second Edition",ColdSpring Harbor Laboratory Press所述的方法，从培养的细胞制备Gluconobacter oxydans DSM17078的染色体DNA。

使用按照上文所述制备的染色体DNA以及一组引物——Pf（SEQ IDNO：34）和Pr（SEQ ID NO：35），通过PCR来制备DNA片段。按照厂商说明书，用Expand High Fidelity PCR试剂盒（Roche Diagnostics）和10ng染色体DNA以100μl的总体积来进行反应，获得了含有STS24DNA序列（SEQ ID NO：32）的PCR产物。从反应体系中回收PCR产物，并验证了其正确序列。

实施例16在G.oxydans DSM17078中打断STS24基因

将实施例15中获得的PCR产物克隆进E.coli载体pCR2.1-TOPO，并用于转化E.coli TG1，以获得携带有pCR2.1-STS24的Apr转化子。然后，用连接酶将从pUC-4K（Amersham Bioscience，编号X06404）分离的Kmr盒插入目标基因的限制性位点之一，用连接产物转化E.coli TG1，以获得携带有pCR2.1-STS24::Km的Apr Kmr转化子。用选自载体部分的多克隆位点的两种限制性酶消化从转化子制备的pCR2.1-STS24::Km质粒，以分离出含有STS24::Km的DNA片段。通过电转化，用得到的DNA片段转化G.oxydans DSM17078，得到基因打断子——G.oxydans DSM17078-STS24::Km。

实施例17使用在含有7%L-山梨糖的3BD琼脂培养基上培养的静止细胞从D-山梨糖醇、L-山梨糖或L-山梨糖酮生产维生素C

在含有70g/l L-山梨糖、0.5g/l甘油、7.5g/l酵母提取物（Difco）、2.5g/l MgSO₄·7H₂O、10g/l的CaCO₃和18g/l琼脂（Difco）的No.3BD琼脂培养基上，于27°C对G.oxydans DSM17078、G.oxydans DSM17078-STS24::Km的细胞进行3天的培养。

从琼脂平板上刮下细胞，将其悬浮于蒸馏水中，用于在30°C，220rpm振荡下进行的静止细胞反应。在温育期结束时，按照实施例2所述，通过高效液相色谱（HPLC）来对反应混合物样品进行分析。

用2%D-山梨糖醇、2%L-山梨糖或1%L-山梨糖酮来进行第一系列的静止细胞反应（1.5ml反应管中0.2ml反应混合物），所有反应混合物都还含有0.3%NaCl、1%CaCO₃以及终浓度为600纳米处10个吸光度单位（OD₆₀₀）的细胞。20小时温育后，G.oxydans DSM17078从D-山梨糖醇、L-山梨糖和L-山梨糖酮分别生产出了145、212和1130mg/l的维生素C。相比之下，G.oxydans DSM17078-STS24::Km分别生产出了1070、1470和3230mg/l的维生素C。

在额外一项实验中，用反应混合物（含有0.3%NaCl、1%CaCO₃）中的2%L-山梨糖酮与终浓度为OD₆₀₀=5的细胞一起温育15小时。对上清液的分析显示：G.oxydans DSM17078积累了1.4g/l的维生素C，G.oxydans DSM17078-STS24::Km积累了6.6g/l的维生素C。

还用反应混合物（还含有0.3%NaCl、1%CaCO₃）中的2%D-山梨糖醇或2%L-山梨糖以及终浓度为OD₆₀₀=5的细胞进行了其它一些实验（5ml反应管中1ml反应混合物）。20小时的温育时间之后，G.oxydansDSM17078从D-山梨糖醇和L-山梨糖分别生产出了0.44和0.36g/l的维生素C；G.oxydans DSM17078-STS24::Km分别生产出了1.32和1.33g/l的维生素C。

当在10ml反应管中，用1.5ml反应混合物（具有上文所述的组成）中的5%D-山梨糖醇与终浓度为OD₆₀₀=5的细胞温育20小时的情况下，G.oxydans DSM17078生产出了0.18g/l的维生素C，G.oxydans DSM17078-STS24::Km生产出了1.42g/l的维生素C。45小时的温育后，同样的反应混合物中维生素C的浓度分别为0.72g/l和2.94g/l。

实施例18同时诱变编码SNDHai和STS24的基因导致从D-山梨糖醇、 L-山梨糖或L-山梨糖酮对维生素C的生产被提高

通过电转化将pVK-P-SNDHai-T质粒引入G.oxydans DSM17078和G.oxydans DSM17078-STS24::Km。在含有70g/l D-山梨糖醇、0.5g/l甘油、7.5g/l酵母提取物（Difco）、2.5g/l MgSO₄·7H₂O、10g/l的CaCO₃和18g/l琼脂（Difco）的No.3BD琼脂培养基上，于27°C对G.oxydansDSM17078、G.oxydans DSM17078/pVK-P-SNDHai-T、G.oxydans DSM17078-STS24::Km和G.oxydans DSM17078-STS24::Km/pVK-P-SNDHai-T的细胞进行3天的培养。

在含有70g/l L-山梨糖、0.5g/l甘油、7.5g/l酵母提取物（Difco）、2.5g/l MgSO₄·7H₂O、10g/l的CaCO₃和18g/l琼脂（Difco）的No.3BD琼脂培养基上，于27°C对G.oxydans DSM17078、G.oxydans DSM17078/pVK-P-SNDHai-T、G.oxydans DSM17078-STS24::Km和G.oxydansDSM17078-STS24::Km/pVK-P-SNDHai-T的细胞进行3天的培养。从琼脂平板上刮下细胞，将其悬浮于蒸馏水中，用于在30°C，220rpm振荡下进行的静止细胞反应。

用细胞悬浮液制备一系列反应体系（5ml反应管中0.5ml反应混合物），其中用反应混合物（还含有0.3%NaCl、1%CaCO₃）中的2%L-山梨糖与终浓度为OD₆₀₀=5的细胞一起温育。20小时的温育时间之后，在上清液中测量到下述浓度的维生素C：

菌株	维生素C（mg/l）
		G.oxydans DSM17078	360
G.oxydans DSM17078/pVK-P-SNDHai-T	760

G.oxydans DSM17078-STS24::Km	1330
		G.oxydans DSM17078-STS24::Km/pVK-P-SNDHai-T	2080

在使用从含7%D-山梨糖的no.3BD琼脂平板上培养的细胞获得的细胞上清液的另外一系列反应中，用含有5%D-山梨糖醇或2%L-山梨糖酮、0.3%NaCl和1%CaCO₃的反应混合物与终浓度为OD₆₀₀=5的细胞进行温育（15ml反应管中1ml反应混合物）。20小时的温育时间之后，在上清液中测量到下述浓度的维生素C：

实施例19制备染色体DNA以及通过PCR扩增VCS01DNA片段

使用按照上文所述制备的染色体DNA以及一组引物——Pf（SEQ IDNO：38）和Pr（SEQ ID NO：39），通过PCR来制备DNA片段。按照厂商说明书，用Expand High Fidelity PCR试剂盒（Roche Diagnostics）和10ng染色体DNA以100μl的总体积来进行反应，获得了含有VCS01DNA序列（SEQ ID NO：36）的PCR产物。从反应体系中回收PCR产物，并验证了其正确序列。

实施例20在G.oxydans DSM17078中打断VCS01基因

将实施例19中获得的PCR产物克隆进E.coli载体pCR2.1-TOPO，并用于转化E.coli TG1，以获得携带有pCR2.1-VCS01的Ap^r转化子。然后，用连接酶将从pUC-4K（Amersham Bioscience，编号X06404）分离的Km^r盒插入目标基因的限制性位点之一，用连接产物转化E.coli TG1，以获得携带有pCR2.1-VCS01::Km的Ap^r Km^r转化子。用选自载体部分的多克隆位点的两种限制性酶消化从转化子制备的pCR2.1-VCS01::Km，以分离出含有VCS01::Km的DNA片段。通过电转化，用得到的DNA片段转化G.oxydans DSM17078，得到基因打断子——G.oxydans DSM17078-VCS01::Km。

实施例21使用在含有7%L-山梨糖的3BD琼脂培养基上培养的静止细胞从D-山梨糖醇、L-山梨糖或L-山梨糖酮生产维生素C

在含有70g/l L-山梨糖、0.5g/l甘油、7.5g/l酵母提取物（Difco）、2.5g/l MgSO₄·7H₂O、10g/l的CaCO₃和18g/l琼脂（Difco）的No.3BD琼脂培养基上，于27°C对G.oxydans DSM17078、G.oxydans DSM17078-VCS01::Km的细胞进行3天的培养。

用2%D-山梨糖醇、2%L-山梨糖或1%L-山梨糖酮来进行第一系列的静止细胞反应（1.5ml反应管中0.2ml反应混合物），所有反应混合物都还含有0.3%NaCl、1%CaCO₃以及终浓度为600纳米处10个吸光度单位（OD₆₀₀）的细胞。20小时温育后，G.oxydans DSM17078从D-山梨糖醇、L-山梨糖和L-山梨糖酮分别生产出了145、212和1130mg/l的维生素C。相比之下，G.oxydans DSM17078-VCS01::Km分别生产出了1490、2220和2830mg/l的维生素C。

在另一项反应（5ml反应管中的0.5ml反应混合物）中，将静止细胞悬浮于含有2%山梨糖酮、0.3%NaCl和1%CaCO₃的培养基中，达到OD₆₀₀=5的终浓度。20小时的温育后，G.oxydans DSM17078积累了1.1g/l的维生素C，G.oxydans DSM17078-VCS01::Km积累了4.4g/l的维生素C。

实施例22在液体培养物中从D-山梨糖醇生产维生素C

在180rpm振荡下，30°C时，在2升带挡板摇瓶中的50ml No.5培养基中，对G.oxydans DSM17078和G.oxydans DSM17078-VCS01::Km的细胞进行培养，所述培养基含有100g/l D-山梨糖醇、0.5g/l甘油、15g/l酵母提取物（Fluka Biochemika,Buchs,Switzerland）、2.5g/lMgSO₄·7H₂O和15g/l的CaCO₃。48小时后，测量两份培养物的光密度OD₆₀₀，用获得的值计算对每种菌株而言加入到含有50ml No.5培养基的两只另外的摇瓶（两份重复实验）中的接种体的体积，以获得经标准化的对应于OD₆₀₀=0.12的第二次培养物中的接种体密度。在180rpm振荡下，30°C时对摇瓶进行温育。96小时后，使用实施例2所述的HPLC方法，进行取样分析。虽然在来自G.oxydans DSM17078的两份上清液中没有探测到维生素C，但在来自G.oxydans DSM17078-VCS01::Km的两份上清液中积累了大约220和320mg/l的维生素C（平均值为270mg/l）。

实施例23同时诱变编码SNDHai和VCS01的基因导致从D-山梨糖醇对维生素C的生产被提高

通过电转化将pVK-P-SNDHai-T质粒引入G.oxydans DSM17078和G.oxydans DSM17078-VCS01::Km。在含有70g/l D-山梨糖醇、0.5g/l甘油、7.5g/l酵母提取物（Difco）、2.5g/l MgSO₄·7H₂O、10g/l的CaCO₃和18g/l琼脂（Difco）的No.3BD琼脂培养基上，于27°C对G.oxydansDSM17078、G.oxydans DSM17078/pVK-P-SNDHai-T和G.oxydans DSM17078-VCS01::Km/pVK-P-SNDHai-T的细胞进行3天的培养。

从琼脂平板上刮下细胞，将其悬浮于蒸馏水中，用于在30°C，220rpm振荡下进行的静止细胞反应。用2%D-山梨糖醇，在还含有0.3%NaCl和1%CaCO₃与终浓度为OD₆₀₀=5的细胞的反应混合物中进行一系列反应（5ml反应管中0.5ml反应混合物）。20小时的温育时间之后，按照实施例2所述，通过高效液相色谱（HPLC）来对反应混合物样品进行分析。

在上清液中测量到下述浓度的维生素C：

菌株	维生素C（mg/l）
		G.oxydans DSM17078	240
G.oxydans DSM17078/pVK-P-SNDHai-T	640
		G.oxydans DSM17078-VCS01::Km/pVK-P-SNDHai-T	1100

实施例24同时诱变编码SNDHai和VCS01的基因导致在液体培养物中从D-山梨糖醇对维生素C的生产被提高

在180rpm振荡下，30°C时，在2升带挡板摇瓶中的50ml No.5培养基中，对G.oxydans DSM17078、G.oxydans DSM17078-VCS01::Km和G.oxydans DSM17078-VCS01::Km/pVK-P-SNDHai-T的细胞进行培养，所述培养基含有100g/l D-山梨糖醇、0.5g/l甘油、15g/l酵母提取物（FlukaBiochemika,Buchs,Switzerland）、2.5g/l MgSO₄·7H₂O和15g/l的CaCO₃。48小时后，测量两份培养物的光密度OD₆₀₀，用获得的值计算对每种菌株而言加入到含有50ml No.5培养基的两只另外的摇瓶（两份重复实验）中的接种体的体积，以获得经标准化的对应于OD₆₀₀=0.12的第二次培养物中的接种体密度。在180rpm振荡下，30°C时对摇瓶进行温育。72小时和96小时后，按照上文所述的HPLC方法，进行取样分析。在上清液中测量到了下述浓度的维生素C：

实施例25制备染色体DNA以及通过PCR扩增VCS08DNA片段

使用按照上文所述制备的染色体DNA以及一组引物——Pf（SEQ IDNO：42）和Pr（SEQ ID NO：43），通过PCR来制备DNA片段。按照厂商说明书，用Expand High Fidelity PCR试剂盒（Roche Diagnostics）和10ng染色体DNA以100μl的总体积来进行反应，获得了含有VCS08DNA序列（SEQ ID NO：40）的PCR产物。从反应体系中回收PCR产物，并验证了其正确序列。

实施例26在G.oxydans DSM17078中打断VCS08基因

将实施例25中获得的PCR产物克隆进E.coli载体pCR2.1-TOPO，并用于转化E.coli TG1，以获得携带有pCR2.1-VCS08的Apr转化子。然后，用连接酶将从pUC-4K（Amersham Bioscience，编号X06404）分离的Kmr盒插入目标基因的限制性位点之一，用连接产物转化E.coli TG1，以获得携带有pCR2.1-VCS08::Km的Apr Kmr转化子。用选自载体部分的多克隆位点的两种限制性酶消化从转化子制备的pCR2.1-VCS08::Km，以分离出含有VCS08::Km的DNA片段。通过电转化，用得到的DNA片段转化G.oxydans DSM17078，得到基因打断子——G.oxydans DSM17078-VCS08::Km。

实施例27使用在3BD琼脂培养基上培养的静止细胞从D-山梨糖醇、L- 山梨糖或L-山梨糖酮生产维生素C

在含有70g/l L-山梨糖、0.5g/l甘油、7.5g/l酵母提取物（Difco）、2.5g/l MgSO₄·7H₂O、10g/l的CaCO₃和18g/l琼脂（Difco）的No.3BD琼脂培养基上，于27°C对G.oxydans DSM17078、G.oxydans DSM17078-VCS08::Km的细胞进行3天的培养。

在第一项实验中，用反应混合物（含有0.3%NaCl、1%CaCO₃）中的2%L-山梨糖酮与终浓度为OD₆₀₀=5的细胞一起温育15小时。对上清液的分析显示：G.oxydans DSM17078积累了1.4g/l的维生素C，G.oxydansDSM17078-VCS08::Km积累了4.6g/l的维生素C。

还用反应混合物（还含有0.3%NaCl、1%CaCO₃）中的2%D-山梨糖醇或2%L-山梨糖以及终浓度为OD₆₀₀=5的细胞进行了其它一些实验（5ml反应管中1.0ml反应混合物）。20小时的温育时间之后，G.oxydansDSM17078从D-山梨糖醇和L-山梨糖分别生产出了0.44和0.36g/l的维生素C；G.oxydans DSM17078-VCS08::Km分别生产出了1.39和1.05g/l的维生素C。

当在10ml反应管中，用1.5ml反应混合物（具有上文所述的组成）中的5%D-山梨糖醇与终浓度为OD₆₀₀=5的细胞温育20小时的情况下，G.oxydans DSM17078生产出了0.18g/l的维生素C，G.oxydans DSM17078-VCS08::Km生产出了1.42g/l的维生素C。45小时的温育后，同样的反应混合物中维生素C的浓度分别为0.65g/l和1.74g/l。

实施例28同时诱变编码SNDHai和VCS08的基因导致从D-山梨糖醇、 L-山梨糖或L-山梨糖酮对维生素C的生产被提高

通过电转化将pVK-P-SNDHai-T质粒引入G.oxydans DSM17078和G.oxydans DSM17078-VCS08::Km。在含有70g/l D-山梨糖醇、0.5g/l甘油、7.5g/l酵母提取物（Difco）、2.5g/l MgSO₄·7H₂O、10g/l的CaCO₃和18g/l琼脂（Difco）的No.3BD琼脂培养基上，于27°C对G.oxydansDSM17078、G.oxydans DSM17078/pVK-P-SNDHai-T、G.oxydans DSM17078-VCS08::Km和G.oxydans DSM17078-VCS08::Km/pVK-P-SNDHai-T的细胞进行3天的培养。

从琼脂平板上刮下细胞，将其悬浮于蒸馏水中，用于在30°C，220rpm振荡下进行的静止细胞反应。在反应混合物（还含有0.3%NaCl、1%CaCO₃）中的2%L-山梨糖中进行一系列反应（5ml反应管中0.5ml反应混合物），其中与终浓度为OD₆₀₀=5的细胞一起温育。20小时的温育期末尾，按照实施例2所述的方法，通过高效液相色谱对反应混合物进行分析。在上清液中测量到了下述浓度的维生素C：

菌株	维生素C（mg/l）
		G.oxydans DSM17078	360
G.oxydans DSM17078/pVK-P-SNDHai-T	760
		G.oxydans DSM17078-VCS08::Km	1050
G.oxydans DSM17078-VCS08::Km/pVK-P-SNDHai-T	2440

在另外一系列反应（15ml反应管中1ml反应混合物）中，用含有5%D-山梨糖醇或2%L-山梨糖酮的反应混合物（还含有0.3%NaCl和1%CaCO₃）与终浓度为OD₆₀₀=5的细胞进行温育。20小时的温育时间之后，在上清液中测量到下述浓度的维生素C：

实施例29制备染色体DNA以及通过PCR扩增SMS05DNA片段

使用按照上文所述制备的染色体DNA以及一组引物——Pf（SEQ IDNO：46）和Pr（SEQ ID NO：47），通过PCR来制备DNA片段。按照厂商说明书，用Expand High Fidelity PCR试剂盒（Roche Diagnostics）和10ng染色体DNA以100μl的总体积来进行反应，获得了含有SMS05DNA序列（SEQ ID NO：44）的PCR产物。从反应体系中回收PCR产物，并验证了其正确序列。

实施例30在G.oxydans DSM17078中打断SMS05基因

将实施例29中获得的PCR产物克隆进E.coli载体pCR2.1-TOPO，并用于转化E.coli TG1，以获得携带有pCR2.1-SMS05的Ap^r转化子。然后对pCR2.1-SMS05进行两次PCR反应：（i）用引物组Psms5No（SEq IDNO：78）和Psms5Ni（SEQ ID NO：79）进行PCR1，得到片段SMS5No-Ni，以及（ii）用引物组Psms5Ci（SEQ ID NO：76）和Psms5Co（SEQID NO：77）进行PCR2。使用引物组Psms5No和Psms5Co，用得到的两种PCR产物进行第三次PCR反应——PCR3，产生SMS5dNo-Co。然后，用PstI和HindIII消化片段，与经PstI和HindIII消化过的pK19mobsacB（A.Pühler et al.Gene145,69-73,1994）连接，用于转化E.coli TG，以获得携带有pK19mobsacB-dSMS05的Km^r菌落。通过电转化，用该质粒转化G.oxydans DSM17078。

在MB+Km50μg/ml（MK）平板上用1个Km^r菌落划线，然后再MK和MB+蔗糖10%（MSuc）平板上检查Km抗性和蔗糖敏感性，分别验证Km^r和蔗糖^s。然后，再在MB琼脂平板上培养一个Km^r和蔗糖^s菌落，刮下得到的培养细胞，适当稀释，涂布到MB琼脂上。在MB、MK和MSuc琼脂平板上，用得到的100个菌落进行划线，以分离Km^s蔗糖^r菌落。得到的菌株之一被命名为G.oxydans DSM17078-dSMS05。

实施例31使用在含有7%L-山梨糖的3BD琼脂培养基上培养的静止细胞从D-山梨糖醇、L-山梨糖或L-山梨糖酮生产维生素C

在含有70g/l L-山梨糖、0.5g/l甘油、7.5g/l酵母提取物（Difco）、2.5g/l MgSO₄·7H₂O、10g/l的CaCO₃和18g/l琼脂（Difco）的No.3BD琼脂培养基上，于27°C对G.oxydans DSM17078、G.oxydans DSM17078-dSMS05的细胞进行3天的培养。

用2%D-山梨糖醇或2%L-山梨糖来进行一系列静止细胞反应（5ml反应管中0.5ml反应混合物），所有反应混合物都还含有0.3%NaCl、1%CaCO₃以及终浓度为600纳米处5个吸光度单位（OD₆₀₀）的细胞。20小时温育后，G.oxydans DSM17078从2%D-山梨糖醇或2%L-山梨糖分别生产出了270mg/l或670mg/l的维生素C。相比之下，菌株G.oxydansDSM17078-dSMS05分别生产出了1540mg/l和1990mg/l的维生素C。

实施例32同时诱变编码SNDHai和SMS05的基因导致从L-山梨糖酮对维生素C的生产被提高

通过电转化将pVK-P-SNDHai-T质粒引入G.oxydans DSM17078-dSMS05。在含有70g/l D-山梨糖醇、0.5g/l甘油、7.5g/l酵母提取物（Difco）、2.5g/l MgSO₄·7H₂O、10g/l的CaCO₃和18g/l琼脂（Difco）的No.3BD琼脂培养基上，于27°C对G.oxydans DSM17078-dSMS05和G.oxydans DSM17078-dSMS05/pVK-P-SNDHai-T的细胞进行3天的培养。

从琼脂平板上刮下细胞，将其悬浮于蒸馏水中，用于在30°C，220rpm振荡下进行的静止细胞反应。在反应混合物（还含有0.3%NaCl和1%CaCO₃）中的2%L-山梨糖酮进行一系列反应（5ml反应管中0.5ml反应混合物），其中与终浓度为OD₆₀₀=5的细胞一起温育。5小时、20小时和30小时的温育时间之后，按照实施例2所述，通过高效液相色谱（HPLC）来进行取样分析。在上清液中测量到下述浓度的维生素C：

实施例33同时诱变编码SNDHai和SMS05的基因导致在液体培养物中从D-山梨糖醇对维生素C的生产被提高

在180rpm振荡下，30°C时，在2升带挡板摇瓶中的50ml No.5培养基中，对G.oxydans DSM17078、G.oxydans DSM17078/pVK-P-SNDHai-T、G.oxydans DSM17078-dSMS05和G.oxydans DSM17078-dSMS05/pVK-P-SNDHai-T的细胞进行培养，所述培养基含有100g/l D-山梨糖醇、0.5g/l甘油、15g/l酵母提取物（Fluka Biochemika,Buchs,Switzerland）、2.5g/l MgSO₄·7H₂O和15g/l的CaCO₃。48小时后，测量两份培养物的光密度OD₆₀₀，用获得的值计算对每种菌株而言加入到含有50ml No.5培养基的两只另外的摇瓶（两份重复实验）中的接种体的体积，以获得经标准化的对应于OD₆₀₀=0.12的第二次培养物中的接种体密度。在180rpm振荡下，30°C时对摇瓶进行温育。48小时和96小时后，按照上文所述的HPLC方法，进行取样分析。在上清液中测量到了下述浓度的维生素C：

实施例34使用整合系统在G.oxydans DSM17078中过量表达STS01

为过量表达STS01基因，可用强组成型的经修饰P_sndh启动子（SEQID NO：204）替换STS01的基因。为达到此目的，通过长侧翼同源性（LFH）-PCR来构建由STS01基因的500bp的上游区域、卡纳霉素抗性盒、与经修饰的核糖体结合位点融合的P_sndh启动子以及STS01基因的最开始500bp构成的DNA片段。为构建该DNA片段，首先使用GC-richPCR试剂盒（Roche Molecular Biochemicals）通过PCR扩增出各个单独的部分。使用引物对STS01US+1（SEQ ID NO：205）和KmSTS01US-1（SEQ ID NO：206）（在5’末端含有互补性的卡纳霉素抗性盒重叠序列），扩增出STS01DNA上游区域。使用引物对KmPsndh+1（SEQ IDNO：207）（在5’末端含有互补性的卡纳霉素抗性盒重叠序列）和STS01Psndh-1（SEQ ID NO：208）（在5’末端含有互补性的STS01DNA重叠序列），扩增出P_sndh启动子片段。使用引物对Psndh STS01+1（SEQ IDNO：209）（在5’末端含有互补性的P_sndh启动子重叠序列）和STS01-1（SEQ ID NO：210），扩增出STS01基因的最开始500个bp。在这些情况下，都用G.oxydans DSM17078基因组DNA作为模板。使用质粒pUC4K（Amersham Bioscience，编号X06404）作为模板，用引物对Km+1（SEQ ID NO：211）和Km-1（SEQ ID NO：212），扩增出卡纳霉素抗性盒。PCR条件由35个循环的94°C变性30秒、50°C退火30秒和72°C延伸1分钟组成。对各条PCR片段进行凝胶纯化、混合，用引物对STS01US+1/STS01-1再次扩增，扩增出全长产物，由此将P_sndh启动子插入到STS01基因的上游。用于第二轮反应的PCR反应条件是这样的：94°C2分钟，然后10个循环的[94°C30秒，63°C30秒，68°C6分钟]，接着是20个循环的[94°C30秒，63°C30秒，68°C6分钟以及每个循环额外的20秒]以及在68°C最后延伸10分钟。

将PCR产物直接转化进感受态G.oxydans DSM17078细胞，在含有终浓度为50μg/ml的卡纳霉素的甘露糖醇培养基型琼脂培养基上对转化子加以选择。可观察到若干个可能的转化子，再使用引物对STS01US+1/STS01-1通过PCR对其中一些进行分析，以验证DNA序列已通过双交叉插入基因组。显示出正确PCR产物大小的菌株的PCR产物被用于测序。具有正确序列的菌株被命名为G.oxydans DSM17078-STS01up1以及G.oxydans DSM17078-STS01up2。

实施例35同时诱变编码SNDHai和STS01的基因导致从D-山梨糖醇对维生素C的生产被提高

通过电转化将pVK-P-SNDHai-T质粒引入G.oxydans DSM17078和G.oxydans DSM17078-STS01up1。在含有70g/l D-山梨糖醇、0.5g/l甘油、7.5g/l酵母提取物（Difco）、2.5g/l MgSO₄·7H₂O、10g/l的CaCO₃和18g/l琼脂（Difco）的No.3BD琼脂培养基上，于27°C对G.oxydans DSM17078/pVK-P-SNDHai-T和G.oxydans DSM17078-STS01up1/pVK-P-SNDHai-T的细胞进行3天的培养。

从琼脂平板上刮下细胞，将其悬浮于蒸馏水中，用于在30°C，220rpm振荡下进行的静止细胞反应。在反应混合物（还含有0.3%NaCl和1%CaCO₃）中的2%L-山梨糖醇进行一系列反应（5ml反应管中0.5ml反应混合物），其中与终浓度为OD₆₀₀=5的细胞一起温育。24小时的温育时间之后，按照实施例2所述，通过高效液相色谱（HPLC）来进行取样分析。

用G.oxydans DSM17078-STS01up1/pVK-P-SNDHai-T的细胞温育的反应混合物上清液含有的维生素C比用G.oxydans DSM17078/pVK-P-SNDHai-T温育的反应混合物上清液要多至少20%。

实施例36使用整合系统在G.oxydans DSM17078中过量表达RCS21

为过量表达RCS21基因，可用强组成型的经修饰P_sndh启动子（SEQID NO：204）替换RCS21的基因。为达到此目的，通过长侧翼同源性（LFH）-PCR来构建由RCS21基因的500bp的上游区域、卡纳霉素抗性盒、与经修饰的核糖体结合位点融合的P_sndh启动子以及RCS21基因的最开始500bp构成的DNA片段。为构建该DNA片段，首先使用GC-richPCR试剂盒（Roche Molecular Biochemicals）通过PCR扩增出各个单独的部分。使用引物对RCS21US+1（SEQ ID NO：213）和KmRCS21US-1（SEQ ID NO：214）（在5’末端含有互补性的卡纳霉素抗性盒重叠序列），扩增出RCS21DNA上游区域。使用引物对KmPsndh+1（SEQ IDNO：207）（在5’末端含有互补性的卡纳霉素抗性盒重叠序列）和RCS21Psndh-1（SEQ ID NO：217）（在5’末端含有互补性的RCS21DNA重叠序列），扩增出P_sndh启动子片段。使用引物对Psndh RCS21+1（SEQID NO：215）（在5’末端含有互补性的P_sndh启动子重叠序列）和RCS21-1（SEQ ID NO：216），扩增出RCS21基因的最开始500个bp。在这些情况下，都用G.oxydans DSM17078基因组DNA作为模板。使用质粒pUC4K（Amersham Bioscience，编号X06404）作为模板，用引物对Km+1（SEQ ID NO：211）和Km-1（SEQ ID NO：212），扩增出卡纳霉素抗性盒。PCR条件由35个循环的94°C变性30秒、50°C退火30秒和72°C延伸1分钟组成。对各条PCR片段进行凝胶纯化、混合，用引物对RCS21US+1/RCS21-1再次扩增，扩增出全长产物，由此将P_sndh启动子插入到RCS21基因的上游。用于第二轮反应的PCR反应条件是这样的：94°C2分钟，然后10个循环的[94°C30秒，63°C30秒，68°C6分钟]，接着是20个循环的[94°C30秒，63°C30秒，68°C6分钟以及每个循环额外的20秒]以及在68°C最后延伸10分钟。

将PCR产物直接转化进感受态G.oxydans DSM17078细胞，在含有终浓度为50μg/ml的卡纳霉素的甘露糖醇培养基型琼脂培养基上对转化子加以选择。可观察到若干个可能的转化子，再使用引物对RCS21US+1/RCS21-1通过PCR对其中一些进行分析，以验证DNA序列已通过双交叉插入基因组。显示出正确PCR产物大小的菌株的PCR产物被用于测序。具有正确序列的菌株被命名为G.oxydans DSM17078-RCS21up1以及G.oxydans DSM17078-RCS21up2。

实施例37同时诱变编码SNDHai和RCS21的基因导致从D-山梨糖醇对维生素C的生产被提高

通过电转化将pVK-P-SNDHai-T质粒引入G.oxydans DSM17078和G.oxydans DSM17078-RCS21up1。在含有70g/l D-山梨糖醇、0.5g/l甘油、7.5g/l酵母提取物（Difco）、2.5g/l MgSO₄·7H₂O、10g/l的CaCO₃和18g/l琼脂（Difco）的No.3BD琼脂培养基上，于27°C对G.oxydans DSM17078/pVK-P-SNDHai-T和G.oxydans DSM17078-RCS21up1/pVK-P-SNDHai-T的细胞进行3天的培养。

用G.oxydans DSM17078-RCS21up1/pVK-P-SNDHai-T的细胞温育的反应混合物上清液含有的维生素C比用G.oxydans DSM17078/pVK-P-SNDHai-T温育的反应混合物上清液要多至少20%。

实施例38纯化SNDHai

将通过补料分批发酵（关于培养，见实施例3）能生产SNDHai的微生物悬浮于25ml磷酸缓冲液（20mM，pH7.0）中，所述缓冲液中含有2mM的MgCl₂、1mM二硫苏糖醇（DTT）和2－3片不含EDTA的蛋白酶抑制剂药片（Roche Diagnostics GmbH）。用French Pressure Cell对细胞悬浮液进行三次处理。随后，加入25ml磷酸缓冲液（20mM，pH7.0，其中含有2mM的MgCl₂、1M NaCl），对悬浮液进行超离心（30000rpm，60分钟，4°C）。用磷酸缓冲液（20mM，pH7.0，其中含有2mM的MgCl₂、500mM NaCl）对含有膜部分的沉淀进行洗涤，然后将其悬浮于适当量的磷酸缓冲液（20mM，pH7.0，其中含有2mM的MgCl₂）中。然后加入N-辛基葡糖苷（Fluka），至终浓度为2％（w/v），在冰上轻微搅拌下将悬浮液培养90分钟。离心（20000rpm，60分钟，4°C）后，收集澄清的、略带红色的上清液，加入终浓度为15％（w/v）的聚乙二醇6000（Fluka）。在4°C轻微振荡下培养60分钟后，接着进行离心（10000rpm，30分钟，4°C），将沉淀溶解于Tris-HCl缓冲液（20mM，pH7.6，含有2mM的MgCl₂和0.5％（w/v）月桂基磺基甜菜碱（Fluka））中。在4°C轻微振荡下过夜后，对溶液进行离心（20000rpm，30分钟，4°C）。收集上清液，按照下述方法对其进行进一步纯化。

下述纯化步骤进行于4°C，其在 Explorer10S-系统（AmershamBiosciences）上进行，其中使用软件UNICORN3.1。用于离子交换色谱的典型流速在1-2ml/分钟的范围内。在280nm处对蛋白质洗脱进行监测，用标准的光度检测，在纯化的所有阶段（见下文）对SNDHai活性部分进行测定，或对纯化部分进行产物检测。

用20mM Tris-HCl缓冲液（pH7.6，含有2mM的MgCl₂和0.5％（w/v）月桂基磺基甜菜碱），在Sephadex G25-凝胶过滤柱（空体积：2.5ml）上，对澄清的上清液IV进行脱盐，所述上清液以2.5ml为一份。

收集SNDHai阳性部分，将其中一份（大约10ml）置于强阴离子交换柱（例如，Mono-Q HR,Amersham Biosciences,柱体积：8ml）上，所述柱在使用之前已用缓冲液A1（10mM Tris、10mM BisTris、10mMMES、2mM MgCl₂、0.5％月桂基磺基甜菜碱，pH7.6）平衡过。用100％的缓冲液A1来洗脱未结合的蛋白质，四份柱体积之后，应用在6份柱体积内至100％缓冲液B1（Tris，10mM；BisTris，10mM；MES，10mM；MgCl₂，2mM和月桂基磺基甜菜碱，0.5％，pH4.7）的线性pH梯度，接着是8份柱体积的100％缓冲液B1。在大约6.5的pH值（其非常接近于从氨基酸序列计算出的6.52的pI值）洗脱出了SNDHai。收集活性部分，用等量的HEPES-缓冲液（50mM，pH8.0，其中含有2mM MgCl₂和0.5％月桂基磺基甜菜碱，终体积为15-20ml）进行稀释，将其用于另一强阴离子交换柱（例如，Mono-Q HR，Amersham Biosciences，柱体积：1ml），其已经过了缓冲液A2（15mM HEPES，2mM MgCl₂，0.5％月桂基磺基甜菜碱，pH7.6）的平衡。用100％的缓冲液A2来洗脱未结合的蛋白质，四份柱体积之后，应用在20份柱体积内至40％缓冲液B2（HEPES，15mM；MgCl₂，2mM；LiCl，1M和月桂基磺基甜菜碱，0.5％，pH7.6）的线性盐梯度，接着是至100％缓冲液B2的梯度。SNDHai在大约150mM LiCl处洗脱出。活性部分在SDS凝胶电泳上显示为大约85kDa的单条带。

实施例39用于SNDHai的光度检测

用于对SNDHai活性进行光度测量的反应混合物由0.196mM氯化硝基四氮唑蓝（NBT）、0.137mM吩嗪硫酸甲酯（PMS）、20.4mM L-山梨糖酮和处于终体积为1.0ml的0.1M的磷酸钠缓冲液（pH7.5）中的酶溶液构成。所述反应从加入酶开始，在具有1-cm光路的小管中，于570nm处，对作为NBT还原速率的酶活性进行测量（T=25°C）。酶活性的一个单位被定义为：每分钟催化1μM NBT还原的酶的量。pH7.5处NBT的的消光系数被取为100mM^-1cm^-1。两种参照小管被用于活性测定：其中一种含有除了L-山梨糖酮之外的上述成分，另一种含有除了酶溶液之外的所有成分。

实施例40用于SNDHai的产物检测

用下述组合物（0.5ml的总体积）的检测，针对从L-山梨糖酮对L-抗坏血酸的生产，直接对含有纯的SNDHai的部分（见上）进行分析，所述组合物包括：0.14mg/ml的纯化并脱盐的SNDHai、50mM磷酸缓冲液（pH6.5）、8mg/ml牛血清清蛋白（BSA）、100mM L-山梨糖酮、1mMPMS、5mM CaCl₂、50μM PQQ-K₂。检测于25°C，充分振荡下（台上振荡器上，900rpm），没有光的情况下，在合适的反应试管中进行。

用具有与Aminex-HPX-78H（300x7.8mm）柱（Biorad,Reinach,Switzerland）相连的LiChrospher-100-RP18（125x4.6mm）柱（Merck,Darmstadt,Germany）的Agilent1100HPLC系统（Agilent Technologies,Wilmington,USA），通过高效液相色谱（HPLC）对样品进行分析。流动相为0.004M硫酸，流速为0.6ml/分钟。用UV探测器（波长254nm）组合折射率探测器来记录两种信号。此外，用氨基柱（YMC-PackPolyamine-II,YMC,Inc.,Kyoto,Japan）和254nm处的UV探测来进行对L-抗坏血酸的鉴定。流动相为50mM NH₄H₂PO₄和乙腈（40：60）。

实施例41SMS、STS、RCS和VCS基因和等同物在其它生物中的存在

可通过简单的DNA杂交实验来测定其它生物（而非本文前面公开的那些）中SMS、STS、RCS和VCS和/或展示出与这些序列的相似性/相同性的等同物的存在。基因组DNA提取自例如属于Gluconobacter、Acetobacter、Pseudomonas、Paracoccus、Rhodopseudomonas、Pantoea、Escherichia、Saccharomyces、Aspergillus或鼠类的生物，特别是表B和C中提到的生物。

在含有5g/l细菌蛋白胨（Difco）、5g/l酵母提取物（Difco）、5g/l葡萄糖、5g/l甘露糖醇、1g/l MgSO₄·7H₂O、5ml/l乙醇和15g/l琼脂的No.350培养基上，于27°C，对菌株Acetobacter aceti subsp.xylinum IFO13693和IFO13773进行3天的培养。在含有25g/l甘露糖醇、5g/l酵母提取物（Difco）、3g/l细菌蛋白胨（Difco）和18g/l琼脂（Difco）的甘露糖醇培养基（MB）型琼脂培养基上，于27°C，对所有其它Acetobacter、Gluconacetobacter菌株和所有Gluconobacter菌株进行3天的培养。在Luria Broth琼脂培养基上培养E.coli K-12。在厂商推荐的培养基上或者按照本领域已知的方法培养其它菌株。按照例如Sambrook et al,1989,"Molecular Cloning:A Laboratory Manual/Second Edition",Cold SpringHarbor Laboratory Press所述，从合适的生物（例如表B和C中提到的）提取基因组DNA。

用限制性酶（例如EcoRI或HindIII）消化基因组DNA制备物，通过琼脂糖凝胶电泳（1％琼脂糖）分离出1μg的DNA片段。用0.25N HCl对凝胶进行15分钟的处理，接着再用0.5N NaOH处理30分钟，然后按照厂商说明书，用Vacuum Blotter Model785（BIO-RAD Laboratories AG,Switzerland）将凝胶印到硝酸纤维素或尼龙膜上。然后用得到的印迹与含有SMS、STS、RCS或VCS DNA探针的溶液接触或杂交，探针是用PCR-DIG标记试剂盒（Roche Diagnostics）以及针对每种基因的特定引物组（如表A所公开的）来制备的。此印迹杂交结果分别示于表B和表C中。

表A：引物对的SEQ ID NO

杂交可在严谨条件或高度严谨条件下进行。此类条件的一个优选的非限制性的例子是在6x氯化钠/柠檬酸钠（SSC）中，大约45°C下杂交，随后在1x SSC、0.1%SDS中，50°C下进行一次或多次洗涤，洗涤优选在55°C下，更优选在60°C下，进一步优选在65°C下进行。高度严谨条件包括，例如，在溶液中，例如在含或不含100μg/ml的鲑鱼精DNA的DigEasyHyb溶液（Roche Diagnostics GmbH）的溶液中，或包含50%甲酰胺、5x SSC（150mM NaCl、15mM柠檬酸三钠）、0.02%十二烷基磺酸钠、0.1%N-月桂酰肌氨酸和2%封闭试剂（Roche Diagnostics GmbH）的溶液中，于42°C温育2小时至4天，接着在2x SSC和0.1%SDS中，于室温下，洗两次膜，每次5至15分钟，然后在65-68°C，于0.5x SSC和0.1%SDS或0.1x SSC和0.1%SDS中洗两次，每次15-30分钟。为检测出与探针DNA具有较低相同性的DNA片段，最后的洗涤步骤可在较低温度（例如50-65°C）进行较短的洗涤时间（例如1-15分钟）。

可通过本领域公知的PCR方法，对表B或C所示各生物中阳性信号对应的基因加以克隆，这使用此生物的基因组DNA与合适的引物组（例如，对STS01而言，SEQ ID NO：82和SEQ ID NO：83）在下述条件下进行：每个反应使用5至100ng基因组DNA（总体积50μl）。可用Expand High Fidelity PCR系统（Roche Diagnostics），采用下述反应条件：94°C2分钟；30个循环的（i）94°C15秒的变性步骤，（ii）60°C30秒的退火步骤，（iii）72°C0.5至5分钟（取决于目标DNA长度，1分钟/1kb）的合成步骤；72°C延伸7分钟。或者，可以用简并引物来进行PCR，对简并引物的设计可基于本文公开的相应SMS、STS、RCS或VCS蛋白的氨基酸序列（例如，对STS01而言是SEQ ID NO：81）或基于作为共有序列的氨基酸序列（通过对由序列搜索程序（例如BLASTP，或当核苷酸序列被用作“查询序列”时，BLASTX）获得的若干氨基酸序列进行比对选出的），以找到与特定蛋白序列相似的蛋白。对使用简并引物进行的PCR而言，第二个退火步骤的温度（见上文）可被降低至55°C，或者甚至50-45°C。此实验的结果分别如表B和C的第2和3栏所示。

通过琼脂糖凝胶电泳来分离PCR反应的样品，在用例如溴化乙啶染色后，用透照器（transilluminator）来观察条带，从凝胶对条带进行分离，验证正确的序列。

上文提到的共有序列可以是属于若干蛋白质结构域/家族数据库的某些类的氨基酸序列，所述数据库例如PROSITE（蛋白质家族和结构域的数据库）、COGs（直向同源体组的簇）、CDD（保守结构域数据库）、pfam（多重序列比对和隐Markov模型的大集合，覆盖很多常见的蛋白质结构域和家族）。一旦可从含有此类数据库的结构域或家族的蛋白中选出与本发明的蛋白具有相同/相近功能的某些蛋白，即可使用蛋白序列或其核苷酸序列（当可从公众数据库获得时）通过PCR来扩增编码该蛋白的对应DNA。

在其它生物中打断基因和等同物，用于生产维生素C

为在合适的微生物（能从给定碳源直接生产维生素C）中提高维生素C的生产，可按照实施例25-28和29-33，破坏选定的基因（例如STS06）和等同物（例如，按照上文段落所述获得的PCR产物），以产生携带等同物基因::Km的敲除突变体。用于产生此类敲除突变体的合适的宿主细胞可选自，例如，表B列出的Gluconobacter菌株，特别是G.oxydansIFO3293、G.oxydans IFO3292、G.oxydans IFO ATCC621H、G.oxydansIFO12528、G.oxydans IFO3291、G.oxydans IFO3255、G.oxydans IFO3244、G.cerinus IFO3266、G.frateurii IFO3260、G.oxydans IFO3287、Acetobacter aceti subsp.orleanus IFO3259、Acetobacter aceti subsp.xylinumIFO13693、Acetobacter aceti subsp.xylinum IFO13773和Acetobacter sp.ATCC15164。

可以按照下文所述来产生敲除突变体：将按照上文所述获得的PCR产物克隆进E.coli载体pCR2.1-TOPO，并用于转化E.coli TG1，以获得携带pCR2.1-基因X的Apr转化子。然后，用连接酶将从pUC-4K（AmershamBioscience,编号X06404）分离的Kmr盒插入目标基因的限制性位点之一，用得到的连接产物转化E.coli TG1，以获得携带pCR2.1-基因X::Km的Apr Kmr转化子。用选自载体部分的多克隆位点的两种限制性酶消化从转化子制备的pCR2.1-基因X::Km质粒，以分离出含有基因X::Km的DNA片段。通过电穿孔用得到的DNA片段转化携带有所述等同物基因的宿主菌株，以获得基因打断子（disruptant）。

可产生进一步的修饰，包括对所述菌株中的SNDHai以及涉及将D-山梨糖醇、L-山梨糖和/或L-山梨糖酮转化为维生素C的基因进行的修饰，以根据本发明提高此类菌株的维生素C产量。

在用1%L-山梨糖酮作为底物的静止细胞反应中，突变体菌株生产的维生素C可比野生型菌株多至少20%。

使用可被上调的基因的等同物来生产维生素C

可根据实施例34-37或者根据用RCS21示例的下述流程，将按上文所述获得的PCR产物用于SNDHai过量表达系统。这一流程也适用于RCS、SMS和STS基因的突变体。

为在合适的微生物（能从给定碳源直接生产维生素C）中提高维生素C的生产，可在本文描述的过量表达系统中使用RCS21基因和等同物（例如，前述段落中获得的PCR产物，其在本文中被称为基因X），或者可将上述RCS21基因和等同物克隆进pCR2.1-TOPO（Invitrogen,Carlsbad,CA,USA），并用于转化E.coli TG1，以获得携带pCR2.1-TOPO-基因X的Apr转化子，即携带PCR产物的Apr转化子。用引物组——PfNdeI[SEQ ID NO：182，但在5’末端具有CCCAT]和PrHindIII[SEQ IDNO：183，但在5’末端具有CCAAGCTT]通过PCR来扩增该插入物。用NdeI和HindIII消化得到的PCR产物，将片段与用XhoI和NdeI消化过的PcrtE-SD（Shine-Dalgarno）片段（WO02/099095）一起插入进pVK100（ATCC37156）的XhoI和HindIII位点之间。用连接产物转化E.coliTG1，以获得携带有质粒pVK-PcrtE-SD-基因X的Tc^r转化子，然后再通过电转化用其转化合适的宿主（例如G.oxydans DSM17078），获得，例如，Tc^r G.oxydans DSM17078/pVK-PcrtE-SD-基因X。

可按照本文前文所述，用SNDHai额外转化使用重组细胞（例如G.oxydans菌株DSM17078）和相应的野生型菌株对维生素C的生产。

在用1%L-山梨糖酮作为底物的静止细胞反应中，重组细胞生产的维生素C可比野生型菌株多至少20%。

对下表B和C而言：

信号1：在使用不同菌株的基因组DNA在印迹杂交试验中对DNA的探测。信号2：使用引物对在PCR反应中对不同菌株DNA的探测。信号3：使用简并引物进行的PCR反应中对不同菌株DNA的探测。

表B：其它生物中STS06基因的等同物

菌株	信号1	信号2	信号3
				G.oxydans DSM17078	+	+	+
G.oxydans IFO3293	+	+	+
				G.oxydans IFO3292	+	+	+
G.oxydans ATCC621H	+	+	+
				G.oxydans IFO12528	+	+	+
G.oxydans G624	+	+	+
				G.oxydans T-100	+	+	+
G.oxydans IFO3291	+	+	+
				G.oxydans IFO3255	+	+	+
G.oxydans ATCC9937	+	+	+
				G.oxydans IFO3244	+	+	+
G.cerinus IFO3266	+	+	+
				G.frateurii IFO3260	+	+	+
G.oxydans IFO3287	+	+	+
				Acetobacter aceti subsp.orleanus IFO3259	+	+	+
Acetobacter aceti subsp.xylinum IFO13693	+	+	+
				Acetobacter aceti subsp.xylinum IFO13773	+	+	+
Acetobacter sp.ATCC15164	+	+	+
				G.thailandicus NBRC100600	+	+	+
Gluconacetobacter liquefaciens ATCC14835	+	+	+
				Gluconacetobacter polyoxogenes NBI1028	+	+	+
Gluconacetobacter diazotrophicus ATCC49037	+	+	+
				Gluconacetobacter europaeus DSM6160	+	+	+
Acetobacter aceti1023	-	-	+
				Acetobacter pasteurianus NCI1193	-	-	+
Pseudomonas putida ATCC21812	-	-	+
				Pseudomonas aeruginosa PAO1	-	-	+
Pseudomonas fluorescens DSM50106	-	-	+
				Pseudomonas syringae B728a	-	-	+
Paracoccus denitrificans strain Pd1222	-	-	+
				Rhodopseudomonas palustris CGA009	-	-	+
E.coli	-	-	-
				Saccharomyces cerevisiae	-	-	-
Aspergillus niger	-	-	-
				小鼠	-	-	-

表B续：其它生物中STS07基因的等同物

表B续：其它生物中STS21基因的等同物

菌株	信号1	信号2	信号3
				G.oxydans DSM17078	+	+	+
G.oxydans IFO3293	+	+	+
				G.oxydans IFO3292	+	+	+
G.oxydans ATCC621H	+	+	+
				G.oxydans IFO12528	+	+	+
G.oxydans G624	+	+	+
				G.oxydans T-100	+	+	+
G.oxydans IFO3291	+	+	+
				G.oxydans IFO3255	+	+	+
G.oxydans ATCC9937	+	+	+
				G.oxydans IFO3244	+	+	+
G.cerinus IFO3266	+	+	+
				G.frateurii IFO3260	+	+	+
G.oxydans IFO3287	+	+	+
				Acetobacter aceti subsp.orleanus IFO3259	+	+	+
Acetobacter aceti subsp.xylinum IFO13693	+	+	+
				Acetobacter aceti subsp.xylinum IFO13773	+	+	+
Acetobacter sp.ATCC15164	+	+	+
				G.thailandicus NBRC100600	+	+	+
Gluconacetobacter liquefaciens ATCC14835	+	+	+
				Gluconacetobacter polyoxogenes NBI1028	+	+	+
Gluconacetobacter diazotrophicus ATCC49037	+	+	+
				Gluconacetobacter europaeus DSM6160	+	+	+
Acetobacter aceti1023	-	-	+
				Acetobacter pasteurianus NCI1193	-	-	+
Zymomonas mobilis ATCC31821	-	-	+
				Bacillus cereus ATCC14579	-	-	+
Bacillus subtilis168	-	-	+
				Bacillus thuringiensis serovar konkukian97-27	-	-	+
Bradyrhizobium japonicum USDA110	-	-	+
				Sinorhizobium meliloti1021	-	-	+
Burkholderia mallei ATCC23344	-	-	+
				Ralstonia solanacearum GMI1000	-	-	+
Brucella suis1330	-	-	+
				Brucella melitensis16M	-	-	+
Azotobacter vinelandii AvOP	-	-	+
				Azotobacter chroococcum MCD1	-	-	+
E.coli	-	-	-
				Saccharomyces cerevisiae	-	-	-
Aspergillus niger	-	-	-
				小鼠	-	-	-

表B续：其它生物中STS22基因的等同物

菌株	信号1	信号2	信号3
				G.oxydans DSM17078	+	+	+
G.oxydans IFO3293	+	+	+
				G.oxydans IFO3292	+	+	+
G.oxydans ATCC621H	+	+	+
				G.oxydans IFO12528	+	+	+
G.oxydans G624	+	+	+
				G.oxydans T-100	+	+	+
G.oxydans IFO3291	+	+	+
				G.oxydans IFO3255	+	+	+
G.oxydans ATCC9937	+	+	+
				G.oxydans IFO3244	+	+	+
G.cerinus IFO3266	+	+	+
				G.frateurii IF03260	+	+	+
G.oxydans IFO3287	+	+	+
				Acetobacter aceti subsp.orleanus IFO3259	+	+	+
Acetobacter aceti subsp.xylinum IFO13693	+	+	+
				Acetobacter aceti subsp.xylinum IFO13773	+	+	+
Acetobacter sp.ATCC15164	+	+	+
				G.thailandicus NBRC100600	+	+	+
Gluconacetobacter liquefaciens ATCC14835	+	+	+
				Gluconacetobacter polyoxogenes NBI1028	+	+	+
Gluconacetobacter diazotrophicus ATCC49037	+	+	+
				Gluconacetobacter europaeus DSM6160	+	+	+
Acetobacter aceti1023	-	-	+
				Acetobacter pasteurianus NCI1193	-	-	+
Zymomonas mobilis ATCC31821	-	-	+
				Bacillus cereus ATCC14579	-	-	+
Bacillus subtilis168	-	-	+
				Bacillus thuringiensis serovar konkukian97-27	-	-	+
Bradyrhizobium japonicum USDA110	-	-	+
				Sinorhizobium meliloti1021	-	-	+
Burkholderia mallei ATCC23344	-	-	+
				Ralstonia solanacearum GMI1000	-	-	+
Brucella suis1330	-	-	+
				Brucella melitensis16M	-	-	+
Azotobacter vinelandii AvOP	-	-	+
				Azotobacter chroococcum MCD1	-	-	+
E.coli	-	-	-
				Saccharomyces cerevisiae	-	-	-
Aspergillus niger	-	-	-
				小鼠	-	-	-

表B续：其它生物中STS23基因的等同物

菌株	信号1	信号2	信号3
				G.oxydans DSM17078	+	+	+
G.oxydans IFO3293	+	+	+
				G.oxydans IFO3292	+	+	+
G.oxydans ATCC621H	+	+	+
				G.oxydans IFO12528	+	+	+
G.oxydans G624	+	+	+
				G.oxydans T-100	+	+	+
G.oxydans IFO3291	+	+	+
				G.oxydans IFO3255	+	+	+
G.oxydans ATCC9937	+	+	+
				G.oxyddns IFO3244	+	+	+
G.cerinus IFO3266	+	+	+
				G.frateurii IFO3260	+	+	+
G.oxydans IFO3287	+	+	+
				Acetobacter aceti subsp.orleanus IFO3259	+	+	+
Acetobacter aceti subsp.xylinum IFO13693	+	+	+
				Acetobacter aceti subsp.xylinum IFO13773	+	+	+
Acetobacter sp.ATCC15164	+	+	+
				G.thailandicus NBRC100600	+	+	+
Gluconacetobacter liquefaciens ATCC14835	+	+	+
				Gluconacetobacter polyoxogenes NBI1028	+	+	+
Gluconacetobacter diazotrophicus ATCC49037	+	+	+
				Gluconacetobacter europaeus DSM6160	+	+	+
Acetobacter aceti1023	-	-	+
				Acetobacter pasteurianus NCI1193	-	-	+
Zymomonas mobilis ATCC31821	-	-	+
				Bacillus cereus ATCC14579	-	-	+
Bacillus subtilis168	-	-	+
				Bacillus thuringiensis serovar konkukian97-27	-	-	+
Bradyrhizobium japonicum USDA110	-	-	+
				Sinorhizobium meliloti1021	-	-	+
Burkholderia mallei ATCC23344	-	-	+
				Ralstonia solanacearum GMI1000	-	-	+
Brucella suis1330	-	-	+
				Brucella melitensis16M	-	-	+
Azotobacter vinelandii AvOP	-	-	+
				Azotobacter chroococcum MCD1	-	-	+
E.coli	-	-	-
				Saccharomyces cerevisiae	-	-	-
Aspergillus niger	-	-	-
				小鼠	-	-	-

表B续：其它生物中STS24基因的等同物

菌株	信号1	信号2	信号3
				G.oxydans DSM17078	+	+	+
G.oxydans IFO3293	+	+	+
				G.oxydans IFO3292	+	+	+
G.oxydans ATCC621H	+	+	+
				G.oxydans IFO12528	+	+	+
G.oxydans G624	+	+	+
				G.oxydans T-100	+	+	+
G.oxydans IFO3291	+	+	+
				G.oxydans IFO3255	+	+	+
G.oxydans ATCC9937	+	+	+
				G.oxydans IFO3244	+	+	+
G.cerinus IFO3266	+	+	+
				G.frateurii IFO3260	+	+	+
G.oxydans IFO3287	+	+	+
				Acetobacter aceti subsp.orleanus IFO3259	+	+	+
Acetobacter aceti subsp.xylinum IFO13693	+	+	+
				Acetobacter aceti subsp.xylinum IFO13773	+	+	+
Acetobacter sp.ATCC15164	+	+	+
				G.thailandicus NBRC100600	+	+	+
Gluconacetobacter liquefacienss ATCC14835	+	+	+
				Gluconacetobacter polyoxogenes NBI1028	+	+	+
Gluconacetobacter diazotrophicus ATCC49037	+	+	+
				Gluconacetobacter europaeus DSM6160	+	+	+
Acetobacter aceti1023	-	-	+
				Acetobacter pasteurianus NCI1193	-	-	+
Zymomonas mobilis ATCC31821	-	-	+
				Bacillus cereus ATCC14579	-	-	+
Bacillus subtilis168	-	-	+
				Bacillus thuringiensis serovar konkukian97-27	-	-	+
Bradyrhizobium japonicum USDA110	-	-	+
				Sinorhizobium meliloti1021	-	-	+
Burkholderia mallei ATCC23344	-	-	+
				Ralstonia solanacearum GMI1000	-	-	+
Brucella suis1330	-	-	+
				Brucella melitensis16M	-	-	+
Azotobacter vinelandii AvOP	-	-	+
				Azotobacter chroococcum MCD1	-	-	+
E.coli	-	-	-
				Saccharomyces cerevisiae	-	-	-
Aspergillus niger	-	-	-
				小鼠	-	-	-

表B续：其它生物中STS25基因的等同物

菌株	信号1	信号2	信号3
				G.oxydans DSM17078	+	+	+
G.oxydans IFO3293	+	+	+
				G.oxydans IFO3292	+	+	+
G.oxydans ATCC621H	+	+	+
				G.oxydans IFO12528	+	+	+
G.oxydans G624	+	+	+
				G.oxydans T-100	+	+	+
G.oxydans IFO3291	+	+	+
				G.oxydans IFO3255	+	+	+
G.oxydans ATCC9937	+	+	+
				G.oxydans IFO3244	+	+	+
G.cerinus IFO3266	+	+	+
				G.frateurii IFO3260	+	+	+
G.oxydans IFO3287	+	+	+
				Acetobacter aceti subsp.orleanus IFO3259	+	+	+
Acetobacter aceti subsp.xylinum IFO13693	+	+	+
				Acetobacter aceti subsp.xylinum IFO13773	+	+	+
Acetobacter sp.ATCC15164	+	+	+
				G.thailandicis NBRC100600	+	+	+
Gluconacetobacter liquefaciens ATCC14835	+	+	+
				Gluconacetobacter polyoxogenes NBI1028	+	+	+
Gluconacetobacter diazotrophicus ATCC49037	+	+	+
				Gluconacetobacter europaeus DSM6160	+	+	+
Acetobacter aceti1023	-	-	+
				Acetobacter pasteurianus NCI1193	-	-	+
Zymomonas mobilis ATCC31821	-	-	+
				Bacillus cereus ATCC14579	-	-	+
Bacillus subtilis168	-	-	+
				Bacillus thuringiensis serovar konkukian97-27	-	-	+
Bradyrhizobium japonicum USDA110	-	-	+
				Sinorhizobium meliloti1021	-	-	+
Burkholderia mallei ATCC23344	-	-	+
				Ralstonia solanacearum GMI1000	-	-	+
Brucella suis1330	-	-	+
				Brucella melitensis16M	-	-	+
Azotobacter vinelandii AvOP	-	-	+
				Azotobacter chroococcum MCD1	-	-	+
E.coli	-	-	-
				Saccharomyces cerevisiae	-	-	-
Aspergillus niger	-	-	-
				小鼠	-	-	-

表B续：其它生物中VCS02基因的等同物

菌株	信号1	信号2	信号3
				G.oxydans DSM17078	+	+	+
G.oxydans IFO3293	+	+	+
				G.oxydans IFO3292	+	+	+
G.oxydans ATCC621H	-	-	-
				G.oxydans IFO12528	-	-	-
G.oxydans G624	-	-	+
				G.oxydans T-100	-	-	+
G.oxydans IFO3291	-	-	+
				G.oxydans IFO3255	-	-	+
G.oxydans ATCC9937	-	-	+
				G.oxydans IFO3244	-	-	+
G.cerinus IFO3266	-	-	+
				G.frateurii IFO3260	-	-	+
G.oxydans IFO3287	-	-	+
				Acetobacter aceti subsp.xylinum IFO13773	-	-	+
Acetobacter sp.ATCC15164	-	-	+
				G.thailandicus NBRC100600	-	-	+
E.coli	-	-	-
				Saccharomyces cerevisiae	-	-	-
Aspergillus niger	-	-	-
				小鼠	-	-	-

表B续：其它生物中VCS03基因的等同物

菌株	信号1	信号2	信号3
				G.oxydans DSM17078	+	+	+
G.oxydans IFO3293	+	+	+
				G.oxydans IFO3292	+	+	+
G.oxydans AICC621H	-	-	-
				G.oxydans IFO12528	-	-	-
G.oxydans G624	-	-	+
				G.oxydans T-100	-	-	+
G.oxydans IFO3291	-	-	+
				G.oxydans IFO3255	-	-	+
G.oxydans ATCC9937	-	-	+
				G.oxydans IFO3244	-	-	+
G.cerinus IFO3266	-	-	+
				G.frateurii IFO3260	-	-	+
G.oxydans IFO3287	-	-	+
				Acetobacter acetisubsp.xylinum IFO13773	-	-	+
Acetobacter sp.ATCC15164	-	-	+
				G.thailandicus NBRC100600	-	-	+
E.coli	-	-	-
				Saccharomyces cerevisiae	-	-	-
Aspergillus niger	-	-	-
				小鼠	-	-	-

表B续：其它生物中RCS27基因的等同物

菌株	信号1	信号2	信号3
				G.oxydans DSM17078	+	+	+
G.oxydans IFO3293	+	+	+
				G.oxydans IFO3292	+	+	+
G.oxydans ATCC621H	+	+	+
				G.oxydans IFO12528	+	+	+
G.oxydans G624	+	+	+
				G.oxydans T-100	+	+	+
G.oxydans IFO3291	+	+	+
				G.oxydans IFO3255	+	+	+
G.oxydans ATCC9937	+	+	+
				G.oxydans IFO3244	+	+	+
G.cerinus IFO3266	+	+	+
				G.frateurii IFO3260	+	+	+
G.oxydans IFO3287	+	+	+
				Acetobacter aceti subsp.orleanus IFO3259	+	+	+
Acetobacter aceti subsp.xylinum IFO13693	+	+	+
				Acetobacter aceti subsp.xylinum IFO13773	+	+	+
Acetobacter sp.ATCC15164	+	+	+
				G.thailandicus NBRC100600	+	+	+
Gluconacetobacter liquefaciens ATCC14835	+	+	+
				Gluconacetobacter polyoxogenes NBI1028	+	+	+
Gluconacetobacter diazotrophicus ATCC49037	+	+	+
				Gluconacetobacter europaeus DSM6160	+	+	+
Acetobacter aceti1023	+	-	+
				Acetobacter pasteurianus NCI1193	+	-	+
Pseudomonas putida ATCC21812	-	-	+
				Pseudomonas aeroginosa PAO1	-	-	+
Pseudomonas fluorescens DSM50106	-	-	+
				Pseudomonas syringae B728a	-	-	+
Paracoccus denitrificans strain Pd1222	-	-	+
				Azotobacter vinelandii AvOP	-	-	+
Azotobacter chroococcum MCD1	-	-	+
				Pantoea citrea1056R	-	-	+
E.coli	-	-	+
				Saccharomyces cerevisiae	-	-	-
Aspergillus niger	-	-	-
				小鼠	-	-	-

表B续：其它生物中RCS28基因的等同物

表B续：其它生物中SMS02基因的等同物

菌株	信号1	信号2	信号3
				G.oxydans DSM17078	+	+	+
G.oxydans IFO3293	+	+	+
				G.oxydans IFO3292	+	+	+
G.oxydans ATCC621H	+	+	+
				G.oxydans IFO12528	+	+	+
G.oxydans G624	+	+	+
				G.oxydans T-100	+	+	+
G.oxydans IFO3291	+	+	+
				G.oxydans IFO3255	+	+	+
G.oxydans ATCC9937	+	+	+
				G.oxydans IFO3244	+	+	+
G.cerinus IFO3266	+	+	+
				G.frateurii IFO3260	+	+	+
G.oxydans IFO3287	+	+	+
				Acetobacter aceti subsp.orleanus IFO3259	+	+	+
Acetobacter aceti subsp.xylinum IFO13693	+	+	+
				Acetobacter aceti subsp.xylinum IFO13773	+	+	+
Acetobacter sp.ATCC15164	+	+	+
				G.thailandicus NBRC100600	+	+	+
Gluconacetobacter liquefaciens ATCC14835	+	+	+
				Gluconacetobacter polyoxogenes NBI1028	+	+	+
Gluconacetobacter diazotrophictus ATCC49037	+	+	+
				Gluconacetobacter europaeus DSM6160	+	+	+
Acetobacter aceti1023	+	-	+
				Acetobacter pasteurianus NCI1193	+	-	+
Bacillus cereus ATCC14579	-	-	+
				Bacillus subtilis168	-	-	+
Bacillus thuringiensis serovar konkukian97-27	-	-	+
				Brucella suis1330	+	-	+
Brucella melitensis16M	+	-	+
				Azotobacter vinelandii AvOP	-	-	+
Azotobacter chroococcum MCD1	-	-	+
				E.coli	-	-	-
Saccharomyces cerevisiae	-	-	-
				Aspergillus niger	-	-	-
小鼠	-	-	-

表B续：其它生物中SMS03基因的等同物

菌株	信号1	信号2	信号3
				G.oxydans DSM17078	+	+	+
G.oxydans IFO3293	+	+	+
				G.oxydans IFO3292	+	+	+
G.oxydans ATCC621H	+	+	+
				G.oxydans IFO12528	+	+	+
G.oxydans G624	+	+	+
				G.oxydans T-100	+	+	+
G.oxydans IFO3291	+	+	+
				G.oxydans IFO3255	+	+	+
G.oxydans ATCC9937	+	+	+
				G.oxydans IFO3244	+	+	+
G.cerinus IFO3266	+	+	+
				G.frateurii IFO3260	+	+	+
G.oxydans IFO3287	+	+	+
				Acetobacter aceti subsp.orleanus IFO3259	+	+	+
Acetobacter aceti subsp.xylinum IFO13693	+	+	+
				Acetobacter aceti subsp.xylinum IFO13773	+	+	+
Acetobacter sp.ATCC15164	+	+	+
				G.thailandicus NBRC100600	+	+	+
Gluconacetobacter liquefaciens ATCC14835	+	+	+
				Gluconacetobacter polyoxogenes NBI1028	+	+	+
Gluconacetobacter diazotrophicus ATCC49037	+	+	+
				Gluconacetobacter europaeus DSM6160	+	+	+
Acetobacter aceti1023	+	-	+
				Acetobacter pasteurianus NCI1193	+	-	+
Bacillus cereus ATCC14579	-	-	+
				Bacillus subtilis168	-	-	+
Bacillus thuringiensis serovar konkukian97-27	-	-	+
				Brucella suis1330	+	-	+
Brucella melitensis16M	+	-	+
				Azotobacter vinelandii AvOP	-	-	+
Azotobacter chroococcum MCD1	-	-	+
				E.coli	-	-	-
Saccharomyces cerevisiae	-	-	-
				Aspergillus niger	-	-	-
小鼠	-	-	-

表B续：其它生物中SMS04基因的等同物

菌株	信号1	信号2	信号3
				G.oxydans DSM17078	+	+	+
G.oxydans IFO3293	+	+	+
				G.oxydans IFO3292	+	+	+
G.oxydans ATCC621H	+	+	+
				G.oxydans IFO12528	+	+	+
G.oxydans G624	+	+	+
				G.oxydans T-100	+	+	+
G.oxydans IFO3291	+	+	+
				G.oxydans IFO3255	+	+	+
G.oxydans ATCC9937	+	+	+
				G.oxydans IFO3244	+	+	+
G.cerinus IFO3266	+	+	+
				G.frateurii IFO3260	+	+	+
G.xyydans IFO3287	+	+	+
				Acetobacter aceti subsp.orleanus IFO3259	+	+	+
Acetobacter aceti subsp.xylinum IFO13693	+	+	+
				Acetobacter aceti subsp.xylinum IFO13773	+	+	+
Acetobacter sp.ATCC15164	+	+	+
				G.thailandicus NBRC100600	+	+	+
Gluconacetobacter liquefaciens ATCC14835	+	+	+
				Gluconacetobacter polyoxogenes NBI1028	+	-	+
Gluconacetobacter diazotophicus ATCC49037	+	-	+
				Gluconacetobacter europaeus DSM6160	+	-	+
Acetobacter aceti1023	+	-	+
				Acetobacter pasteurianus NCI1193	+	-	+
Zymomonas mobilis ATCC31821	-	-	+
				E.coli	-	-	-
Saccharomyces cerevisiae	-	-	-
				Aspergillus niger	-	-	-
小鼠	-	-	-

表B续：其它生物中SMS05基因的等同物

菌株	信号1	信号2	信号3
				G.oxydans DSM17078	+	+	+
G.oxydans IFO3293	+	+	+
				G.oxydans IFO3292	+	+	+
G.oxydans ATCC621H	+	+	+
				G.oxydans IFO12528	+	+	+
G.oxydans G624	+	+	+
				G.oxydans T-100	+	+	+
G.oxydans IFO3291	+	+	+
				G.oxydans IFO3255	+	+	+
G.oxydans ATCC9937	+	+	+
				G.oxydans IFO3244	+	+	+
G.cerinus IFO3266	+	+	+
				G.frateurii IFO3260	+	+	+
G.oxydans IFO3287	+	+	+
				Acetobacter aceti subsp.orleanus IFO3259	+	+	+
Acetobacter aceti subsp.xylinum IFO13693	+	+	+
				Acetobacter aceti subsp.xylinum IFO13773	+	+	+
Acetobacter sp.ATCC15164	+	+	+
				G.thailandicus NBRC100600	+	+	+
Gluconacetobacter liquefaciens ATCC14835	+	+	+
				Sinorhizobium meloloti1021	-	-	+
Brucella suis1330	-	-	+
				Brucella melitensis16M	-	-	+
E.coli	-	-	-
				Saccharomyces cerevisiae	-	-	-
Aspergillus niger	-	-	-
				小鼠	-	-	-

表C：其它生物中RCS01基因的等同物

菌株	信号1	信号2	信号3
				G.oxydans DSM17078	++++	+	+
G.oxydans IFO3293	++++	+	+
				G.oxydans IFO3292	++++	+	+
G.oxydans ATCC621H	++++	+	+
				G.oxydans IFO12528	++++	+	+
G.oxydans G624	++++	+	+
				G.oxydans T-100	++++	+	+
G.oxydans IFO3291	++++	+	+
				G.oxydans IFO3255	++++	+	+
G.oxydans ATCC9937	++++	+	+
				G.oxydans IFO3244	++++	+	+
G.cerinus IFO3266	+++	+	+
				G.frateurii IFO3260	+++	+	+
G.oxydans IFO3287	++++	+	+
				Acetobacter aceti subsp.orleanus IFO3259	-	-	-
Acetobacter aceti subsp.xylinum IFO13693	-	-	-
				Acetobacter aceti subsp.xylinum IFO13773	-	-	-
Acetobacter sp.ATCC15164	-	-	-
				G.thailandicus NBRC100600	+++	+	+
Gluconacetobacter liquefaciens ATCC14835	++	+	+
				Gluconacetobacter poyoxogenes NBI1028	+	+	+
Gluconacetobacter diazotrophicus ATCC49037	+	+	+
				Gluconacetobacter europaeus DSM6160	+	+	+
Acetobacter aceti 1023	-	-	-
				Acetobacter pasteurianus NCI1193	-	-	-
Pseudomonas putida ATCC21812	-	-	+
				Pseudomonas aeruginosa PAO1	+	-	+
Pseudomonas fluorescens DSM50106	+	-	+
				Pseudomonas syringae B728a	+	-	+
Azotobacter vinelandii AvOP	-	-	+
				Azotobacter chroococcum MCD1	-	-	+
Paracoccus denitrificans strain Pd1222	-	-	-
				Rhodopseudomonas palustris CGA009	+	-	-
Pantoea citrea1056R	-	-	-
				E.coli K-12	-	-	+
Saccharomyces cerevisiae	-	-	-
				Aspergillus niger	-	-	-
小鼠	-	-	-

表C续：其它生物中RCS02基因的等同物

菌株	信号1	信号2	信号3
				G.oxydans DSM17078	++++	+	+
G.oxydans IFO3293	++++	+	+
				G.oxydans IFO3292	++++	+	+
G.oxydans ATCC621H	++++	+	+
				G.oxydans IFO12528	++++	+	+
G.oxydans G624	++++	+	+
				G.oxydans T100	++++	+	+
G.oxydans IFO3291	++++	+	+
				G.oxydans IFO3255	++++	+	+
G.oxydans ATCC9937	++++	+	+
				G.oxydans IFO3244	++++	+	+
G.cerinus IFO3266	+++	+	+
				G.frateurii IFO3260	+++	+	+
G.oxydans IFO3287	++++	+	+
				Acetobacter aceti subsp.orleanus IFO3259	-	-	-
Acetobacter aceti subsp.xylinum IFO13693	-	-	-
				Acetobacter aceti subsp.xylinum IFO13773	-	-	-
Acetobacter sp.ATCC15164	-	-	-
				G.thailandicus NBRC100600	+++	+	+
Gluconacetobacter liquefaciens ATCC14835	++	+	+
				Gluconacetobacter polyoxogenes NBI1028	+	+	+
Gluconacetobacter diazotrophicus ATCC49037	+	+	+
				Gluconacetobacter europaeus DSM6160	+	+	+
Acetobacter aceti1023	-	-	-
				Acetobacter pasteurianus NCI1193	-	-	-
Pseudomonas putida ATCC21812	-	-	+
				Pseudomonas aeruginosa PAO1	+	-	+
Pseudomonas fluorescers DSM50106	+	-	+
				Pseudomonas syringae B728a	+	-	+
Azotobacter vinelandii AvOP	-	-	+
				Azotobacter chroococcum MCD1	-	-	+
Paracoccus denitrificans strain Pd1222	-	-	-
				Rhodopseudomonas palustris CGA009	+	-	-
Pantoea citrea1056R	-	-	-
				E.coli K-12	-	-	+
Saccharomyces cerevisiae	-	-	-
				Aspergillus niger	-	-	-
小鼠	-	-	-

表C续：其它生物中RCS03基因的等同物

菌株	信号1	信号2	信号3
				G.oxydans DSM17078	++++	+	+
G.oxtdans IFO3293	++++	+	+
				G.oxydans IFO3292	++++	+	+
G.oxydans ATCC621H	++++	+	+
				G.oxydans IFO12528	++++	+	+
G.oxydans G624	++++	+	+
				G.oxydans T-100	++++	+	+
G.oxydans IFO3291	++++	+	+
				G.oxydans IFO3255	++++	+	+
G.oxydans ATCC9937	++++	+	+
				G.oxydans IFO3244	++++	+	+
G.cerinus IFO3266	+++	+	+
				G.frateurii IFO3260	+++	+	+
G.oxydans IFO3287	++++	+	+
				Acetobacter aceti subsp.orleanus IFO3259	-	-	-
Acetobacter aceti subsp.xylinum IFO13693	-	-	-
				Acetobacter aceti subsp.xylinum IFO13773	-	-	-
Acetobacter sp.ATCC15164	-	-	-
				G.thailandicus NBRC100600	+++	+	+
Gluconacetobacter liquefaciens ATCC14835	++	+	+
				Gluconacetobacter polyoxogenes NBI1028	+	+	+
Gluconacetobacter diazotrophicus ATCC49037	+	+	+
				Gluconacetobacter europaeus DSM6160	+	+	+
Acetobacter aceti1023	-	-	-
				Acetobacter pasteurianus NCI1193	-	-	-
Pseudomonas putida ATCC21812	-	-	+
				Pseudomonas aeruginosa PAO1	+	-	+
Pseudomonas fluorescens DSM50106	+	-	+
				Pseudomonas syringae B728a	+	-	+
Azotobacter vinelandii AvOP	-	-	+
				Azotobacter chroococcum MCD1	-	-	+
Paracoccus denitrificans strain Pd1222	-	-	-
				Rhodopseudomonas palustris CCA009	+	-	-
Pantoea citrea1056R	-	-	-
				E.coli K-12	-	-	+
Saccharomyces cerevisiae	-	-	-
				Aspergillus niger	-	-	-
小鼠	-	-	-

表C续：其它生物中RCS04基因的等同物

菌株	信号1	信号2	信号3
				G.oxydans DSM17078	++++	+	+
G.oxydans IFO3293	++++	+	+
				G.oxydans IFO3292	++++	+	+
G.oxydans ATCC621H	++++	+	+
				G.oxydans IFO12528	++++	+	+
G.oxydans G624	++++	+	+
				G.oxydans T-100	++++	+	+
G.oxydans IFO3291	++++	+	+
				G.oxydans IFO3255	++++	+	+
G.oxydans ATCC9937	++++	+	+
				G.oxydans IFO3244	++++	+	+
G.cerinus IFO3266	+++	+	+
				G.frateurii IFO3260	+++	+	+
G.oxydans IFO3287	++++	+	+
				Acetobacter aceti subsp.orleanus IFO3259	+	-	+
Acetobacter aceti subsp.xylinum IFO13693	+	-	+
				Acetobacter aceti subsp.xylinum IFO13773	+	-	+
Acetobacter sp.ATCC15164	+	-	+
				G.thailandicus NBRC100600	+++	+	+
Gluconacetobacter liquefaciens ATCC14835	++	+	+
				Gluconacetobacter polyoxogenes NBI1028	+	+	+
Gluconacetobacter diazotrophicus ATCC49037	+	+	+
				Gluconacetobacter europaeus DSM6160	+	+	+
Acetobacter aceti1023	+	-	+
				Acetobacter pasteurianus NCI1193	+	-	+
Pseudomonas putida ATCC21812	-	-	-
				Pseudomonas aeruginosa PAO1	-	-	-
Pseudomonas fluorescens DSM50106	-	-	-
				Pseudomonas syringae B728a	-	-	-
Azotobacter vinelandii AvOP	-	-	+
				Azotobacter chroococcum MCD1	-	-	+
Paracoccus denitrificans strain Pd1222	-	-	-
				Rhodopseudomonas palustris CGA009	-	-	-
Pantoea citrea1056R	-	-	-
				E.coli K-12	-	-	-
Saccharomyces cerevisiae	-	-	-
				Aspergillus niger	-	-	-
小鼠	-	-	-

表C续：其它生物中RCS05基因的等同物

表C续：其它生物中RCS06基因的等同物

表C续：其它生物中RCS07基因的等同物

菌株	信号1	信号2	信号3
				G.oxydans DSM17078	++++	+	+
G.oxydans IFO3293	++++	+	+
				G.oxydans IFO3292	++++	+	+
G.oxydans ATCC621H	++++	+	+
				G.oxydans IFO12528	++++	+	+
G.oxydans G624	++++	+	+
				G.oxydans T-100	++++	+	+
G.oxydans IFO3291	++++	+	+
				G.oxydans IFO3255	++++	+	+
G.oxydans ATCC9937	++++	+	+
				G.oxydans IFO3244	++++	+	+
G.cerinus IFO3266	+++	+	+
				G.frateurii IFO3260	+++	+	+
G.oxydans IFO3287	++++	+	+
				Acetobacter aceti subsp.orleanus IFO3259	+	-	+
Acetobacter aceti subsp.xylinum IFO13693	+	-	+
				Acetobacter aceti subsp.xylinum IFO13773	+	-	+
Acetobacter sp.ATCC15164	+	-	+
				G.thailandicus NBRC100600	+++	+	+
Gluconacetobacter liquefaciens ATCC14835	++	+	+
				Gluconacetobacter polyoxogenes NBI1028	+	+	+
Gluconacetobacter diazotrophicus ATCC49037	+	+	+
				Gluconacetobacter europaeus DSM6160	+	+	+
Acetobacter acgti1023	+	-	+
				Acetobacter pasteurianus NCI1193	+	-	+
Pseudomonas putida ATCC21812	-	-	-
				Pseudomonas aeruginosa PAO1	-	-	-
Pseudomonas fluor escens DSM50106	-	-	-
				Pseudomonas syringae B728a	-	-	-
Azotobacter vinelandii AvOP	-	-	+
				Azotobacter chroococcum MCD1	-	-	+
Paracoccus denitrificans strain Pd1222	-	-	-
				Rhodopseudomonas palustris CGA009	-	-	-
Pantoea citrea1056R	-	-	-
				E.coli K-12	-	-	-
Saccharomyces cerevisiae	-	-	-
				Aspergillus niger	-	-	-
小鼠	-	-	-

表C续：其它生物中RCS08基因的等同物

菌株	信号1	信号2	信号3
				G.oxydans DSM17078	++++	+	+
G.oxydans IFO3293	++++	+	+
				G.oxydans IFO3292	++++	+	+
G.oxydans ATCC621H	++++	+	+
				G.oxydans IFO12528	++++	+	+
G.oxydans G624	++++	+	+
				G.oxydans T-100	++++	+	+
G.oxydans IFO3291	++++	+	+
				G.oxydans IFO3255	++++	+	+
G.oxydans ATCC9937	++++	+	+
				G.oxydans IFO3244	++++	+	+
G.cerinus IFO3266	+++	+	+
				G.frateurii IFO3260	+++	+	+
G.oxydans IFO3287	++++	+	+
				Acetobacter aceti subsp.orleanus IFO3259	+	-	+
Acetobacter aceti subsp.xylinum IFO13693	+	-	+
				Acetobacter aceti subsp.xylinum IFO13773	+	-	+
Acetobacter sp.ATCC15164	+	-	+
				G.thailandicus NBRC100600	+++	+	+
Gluconacetobacter liquefaciens ATCC14835	++	+	+
				Gluconacetobacter polyoxogenes NBI1028	+	+	+
Gluconacetobacter diazotrophicus ATCC49037	+	+	+
				Gluconacetobactr europaeus DSM6160	+	+	+
Acetobacter aceti1023	+	-	+
				Acetobacter pasteurianus NCI1193	+	-	+
Pseudomonas putida ATCC21812	-	-	+
				Pseudomonas aeruginosa PAO1	-	-	+
Pseudomonas fluorescens DSM50106	-	-	+
				Pseudononasyringae B728a	-	-	+
Paracoccus denitrificans srtain Pd1222	-	-	+
				Rhodopseudomonas palustris CGA009	-	-	+
Pantoea citrea1056R	-	-	-
				E.coli K-12	-	-	-
Saccharomyces cerevisiae	-	-	-
				Aspergillus niger	-	-	-
小鼠	-	-	-

表C续：其它生物中RCS21基因的等同物

菌株	信号1	信号2	信号3
				G.oxydans DSM17078	++++	+	+
G.oxydans IFO3293	++++	+	+
				G.oxydans IFO3292	++++	+	+
G.oxydans ATCC621H	++++	+	+
				G.oxydans IFO12528	++++	+	+
G.oxydans G624	++++	+	+
				G.oxydans T-100	++++	+	+
G.oxydans IFO3291	++++	+	+
				G.oxydans IFO3255	++++	+	+
G.oxydans ATCC9937	++++	+	+
				G.oxydans IFO3244	++++	+	+
G.cerinus IFO3266	+++	+	+
				G.frateurii IFO3260	+++	+	+
G.oxydans IFO3287	++++	+	+
				Acetobacter aceti subsp.orleanus IFO3259	++	-	+
Acetobacter aceti subsp.xylinum IFO13693	++	-	+
				Acetobacter aceti subsp.xylinumIFO13773	++	-	+
Acetobacter sp.ATCC15164	++	-	+
				G.thailandicus NBRC100600	+++	+	+
Gluconacetobacter liquefaciens ATCC14835	++	+	+
				Gluconacetobacter polyoxogenes NBI1028	++	+	+
Gluconacetobacter diazotrophicus ATCC49037	++	+	+
				Gluconacetobacter europaeus DSM6160	++	+	+
Acetobacter aceti 1023	++	-	+
				Acetobacter pasteurianus NCI1193	++	-	+
Pseudomonas putida ATCC21812	+	-	+
				Pseudomonas aeruginosa PAO1	+	-	+
Pseudomonas fluorescens DSM50106	+	-	+
				Pseudomonas syringae B728a	+	-	+
Paracoccus denitrificans strain Pd1222	+	-	+
				Rhodopseudomonas palustris CGA009	+	-	+
Pantoea citrea1056R	-	-	-
				E.coli K-12	-	-	-
Saccharomyces cerevisiae	-	-	-
				Aspergillus niger	-	-	-
小鼠	-	-	-

表C续：其它生物中RCS22基因的等同物

菌株	信号1	信号2	信号3
				G.oxydans DSM17078	++++	+	+
G.oxydans IFO3293	++++	+	+
				G.oxydans IFO3292	++++	+	+
G.oxydans ATCC621H	++++	+	+
				G.oxydans IFO12528	++++	+	+
G.oxydans G624	++++	+	+
				G.oxydans T-100	++++	+	+
G.oxydans IFO3291	++++	+	+
				G.oxydans IFO3255	++++	+	+
G.oxydans ATCC9937	++++	+	+
				G.oxydans IFO3244	++++	+	+
G.cerinus IFO3266	+++	+	+
				G.frateurii IFO3260	+++	+	+
G.oxydans IFO3287	++++	+	+
				Acetobacter aceti subsp.orleanus IFO3259	++	-	+
Acetobacter aceti subsp.xylinum IFO13693	++	-	+
				Acetobacter aceti subsp.xylinum IFO13773	++	-	+
Acetobacter sp.ATCC15164	++	-	+
				G.thailandicus NBRC100600	+++	+	+
Gluconacetobacter liquefaciens ATCC14835	++	+	+
				Gluconacetobacter polyoxogenes NBI1028	++	+	+
Gluconacetobacter diazotrophicus ATCC49037	++	+	+
				Gluconacetobacter europaeus DSM6160	++	+	+
Acetobacter aceti1023	++	-	+
				Acetobacter pasteurianus NCI1193	++	-	+
Pseudomonas putida ATCC21812	+	-	+
				Pseudomonas aeruginosa PAO1	+	-	+
Pseudomonas fluorescens DSM50106	+	-	+
				Pseudomonas syringae B728a	+	-	+
Paracoccus denitrificans strain Pd1222	+	-	+
				Rhodopseudomonas palustris CGA009	+	-	+
Pantoea citrea1056R	-	-	-
				E.coli K-12	-	-	-
Saccharomyces cerevisiae	-	-	-
				Aspergillus niger	-	-	-
小鼠	-	-	-

表C续：其它生物中RCS23基因的等同物

表C续：其它生物中RCS24基因的等同物

菌株	信号1	信号2	信号3
				G.oxydans DSM17078	++++	+	+
G.oxydans IFO3293	++++	+	+
				G.oxydans IFO3292	++++	+	+
G.oxydans ATCC621H	++++	+	+
				G.oxydans IFO12528	++++	+	+
G.oxydans G624	++++	+	+
				G.oxydans T-100	++++	+	+
G.oxydans IFO3291	++++	+	+
				G.oxydans IFO3255	++++	+	+
G.oxydans ATCC9937	++++	+	+
				G.oxydans IFO3244	++++	+	+
G.cerinus IFO3266	+++	+	+
				G.frateurii IFO3260	+++	+	+
G.oxydans IFO3287	++++	+	+
				Acetobacter aceti subsp.orleanus IFO3259	++	-	+
Acetobacter aceti subsp.xylinum IFO13693	++	-	+
				Acetobacter aceti subsp.xylinum IFO13773	++	-	+
Acetobacter sp.ATCC15164	++	-	+
				G.thailandicus NBRC100600	+++	+	+
Gluconacetobacter liquefaciens ATCC14835	++	+	+
				Gluconacetobacter polyoxogenes NBI1028	++	+	+
Gluconacetobacter diazotrophicus ATCC49037	++	+	+
				Gluconacetobacter europaeus DSM6160	++	+	+
Acetobacter aceti1023	++	-	+
				Acetobacter pasteurianus NCI1193	++	-	+
PsPudomonas putida ATCC21812	+	-	+
				Pseudomonas aeruginosa PAO1	+	-	+
Pseudomonas fluorescens DSM50106	+	-	+
				Pseudomonas syringae B728a	+	-	+
Paracoccus denitrificans strain Pd1222	+	-	+
				Rhodopseudomonas palustris CGA009	+	-	+
Pantoea citrea1056R	-	-	-
				E.coli K-12	-	-	-
Saccharomyces cerevisiae	-	-	-
				Aspergillus niger	-	-	-
小鼠	-	-	-

表C续：其它生物中RCS25基因的等同物

表C续：其它生物中STS01基因的等同物

菌株	信号1	信号2	信号3
				G.oxydans DSM17078	++++	+	+
G.oxydans IFO3293	++++	+	+
				G.oxydans IFO3292	++++	+	+
G.oxydans ATCC621H	++++	+	+
				G.oxydans IFO12528	++++	+	+
G.oxydans G624	++++	+	+
				G.oxydans T-100	++++	+	+
G.oxydans IfO3291	++++	+	+
				G.oxydans IFO3255	++++	+	+
G.oxydans ATCC9937	++++	+	+
				G.oxydans IFO3244	++++	+	+
G.cerinus IFO3266	+++	+	+
				G.frateurii IFO3260	+++	+	+
G.oxydans IfO3287	++++	+	+
				Acetibacter aceti subsp.orleanus IFO3259	-	-	+
Acetobacter aceti subsp.xylinum IFO13693	-	-	+
				Acetobacter aceti subsp.xylinum IFO13773	-	-	+
Acetobacter sp.ATCC15164	-	-	+
				G.thailandicus NBRC100600	+++	+	+
Gluconacetobacter liquefaciens ATCC14835	++	+	+
				Gluconacetobacter polyoxogenes NBI1028	+	+	+
Gluconacetobacter diazotrophicus ATCC49037	+	+	+
				Gluconacetobacter europaeus DSM6160	+	+	+
Acetobacter aceti1023	-	-	+
				Acetobacter pasteurianus NCI1193	-	-	+
Pseudomonas putida ATCC21812	-	-	+
				Pseudomonas asruginosa PAO1	-	-	+
Pseudomonas fluorescens DSM50106	-	-	+
				Pseudomonas syringae B728a	-	-	+
Paracoccus denitrificans strain Pd1222	-	-	+
				Rhodopseudomonas palustris CGA009	-	-	+
Pantoea citrea1056R	-	-	-
				E.coli	-	-	-
Saccharomyces cerevisiae	-	-	-
				Aspeygillus niger	-	-	-
小鼠	-	-	-

表C续：其它生物中STS15基因的等同物

菌株	信号1	信号2	信号3
				G.oxydans DSM 17078	++++	+	+
G.oxydans IFO 3293	++++	+	+
				G.oxydans IFO 3292	++++	+	+
G.oxydans ATCC 621H	++++	+	+
				G.oxydans IFO 12528	++++	+	+
G.oxydans G624	++++	+	+
				G.oxydans T-100	++++	+	+
G.oxydans IFO 3291	++++	+	+
				G.oxydans IFO 3255	++++	+	+
G.oxydans ATCC 9937	++++	+	+
				G.oxydans IFO 3244	++++	+	+
G.cerinus IFO 3266	+++	+	+
				G.frateurii IFO 3260	+++	+	+
G.oxydans IFO 3287	++++	+	+
				Acetobacter aceti subsp.orleanus IFO3259	+	-	+
Acetobacter aceti subsp.xylinum IFO13693	+	-	+
				Acetobacter aceti subsp.xylinum IFO13773	+	-	+
Acetobacter sp.ATCC15164	+	-	+
				G.thailandicus NBRC100600	+++	+	+
Gluconacetonacter liquefaciens ATCC14835	++	+	+
				Gluconacetobacter polyoxogenes NBI1028	+	+	+
Gluconacetobacter diazotriophicus ATCC49037	+	+	+
				Gluconacetobacter europaeus DSM6160	+	+	+
Acetobacter aceti1023	+	-	+
				Acetobacter pasteurianus NCI1193	+	-	+
Pseudomonas putida ATCC 21812	-	-	+
				Pseudomonas aeruginosa PAO1	+	-	+
Pseudomonas fluorescens DSM50106	+	-	+
				Pseudomonas syringae B728a	+	-	+
Paracoccus denitrificans strain Pd1222	-	-	+
				Rhodopseudomonas palustris CGA009	-	-	+
Pantoea citrea1056R	-	-	-
				E.coli	-	-	-
Saccharomyces cerevisiae	-	-	-
				Aspergillus niger	-	-	-
小鼠	-	-	-

表C续：其它生物中STS16基因的等同物

菌株	信号1	信号2	信号3
				G.oxydans DSM17078	++++	+	+
G.oxydans IFO3293	++++	+	+
				G.oxydans IFO3292	++++	+	+
G.oxydans ATCC621H	++++	+	+
				G.oxydans IFO12528	++++	+	+
G.oxydans G624	++++	+	+
				G.oxydans T-100	++++	+	+
G.oxydans IFO3291	++++	+	+
				G.oxydans IFO3255	++++	+	+
G.oxydans ATCC9937	++++	+	+
				G.oxydans IFO3244	++++	+	+
G.cerinus IFO3266	+++	+	+
				G.frateurii IFO3260	+++	+	+
G.oxydans IFO3287	++++	+	+
				Acetobacter aceti subsp.orleanus IFO3259	+	-	+
Acetobacter aceti subsp.xylinum IFO13693	+	-	+
				Acetobacter aceti subsp.xylinum IFO13773	+	-	+
Acetobacter sp.ATCC15164	+	-	+
				G.thailandicus NBRC100600	+++	+	+
Gluconacetobacter liquefaciens ATCC14835	++	+	+
				Gluconacetobacter polyoxogenes NBI1028	+	+	+
Gluconacetobacter diazotrophicus ATCC49037	+	+	+
				Gluconacetobacter europaeus DSM6160	+	+	+
Acetobacter aceti1023	+	-	+
				Acetobacter pasteurianus NCI1193	+	-	+
Pseudomonas putida ATCC21812	-	-	+
				Pseudomonas aeruginosa PAO1	+	-	+
Pseudomonas fluorescens DSM50106	+	-	+
				Pseudomonas syringae B728a	+	-	+
Paracoccus denitriificans strain Pd1222	-	-	+
				Rhodopseudomonas palustris CGA009	-	-	+
Pantoea citrea1056R	-	-	-
				E.coli	-	-	-
Saccharomyces cerevisiae	-	-	-
				Aspergillus niger	-	-	-
小鼠	-	-	-

表C续：其它生物中STS17基因的等同物

菌株	信号1	信号2	信号3
				G.oxydans DSM17078	++++	+	+
G.oxydans IFO3293	++++	+	+
				G.oxydans IFO3292	++++	+	+
G.oxydans ATCC621H	++++	+	+
				G.oxydans IFO12528	++++	+	+
G.oxydans G624	++++	+	+
				G.oxydans T-100	++++	+	+
G.oxydans IFO3291	++++	+	+
				G.oxydans IFO3255	++++	+	+
G.oxydans ATCC9937	++++	+	+
				G.oxydans IFO3244	++++	+	+
G.cerinus IFO3266	+++	+	+
				G.frateurii IFO3260	+++	+	+
G.oxydans IFO3287	++++	+	+
				Acetobacter aceti subsp.orleanus IFO3259	+	-	+
Acetobacter aceti subsp.xylinum IFO13693	+	-	+
				Acetobacter aceti subsp.xylinum IFO13773	+	-	+
Acetobacter sp.ATCC15164	+	-	+
				G.thailandicus NBRC100600	+++	+	+
Gluconacetobacter liquefaciens ATCC14835	++	+	+
				Gluconacetobacter polyoxogenes NBI1028	+	+	+
Gluconacetobacter diazotrophicus ATCC49037	+	+	+
				Gluconacetobacter europaeus DSM6160	+	+	+
Acetobacter aceti1023	+	-	+
				Acetobacter pasteurianus NCI1193	+	-	+
Pseudomonas putida ATCC21812	-	-	+
				Pseudomonas aeruginosa PAO1	+	-	+
Pseudomonas fluorescens DSM50106	+	-	+
				Pseudomonas syringae B728a	+	-	+
Paracoccus denitrificans strain Pd1222	-	-	+
				Rhodopseudomonas palustris CGA009	-	-	+
Pantoea citrea1056R	-	-	-
				E.coli	-	-	-
Saccharomyces cerevisiae	-	-	-
				Aspergillus niger	-	-	-
小鼠	-	-	-

表C续：其它生物中STS18基因的等同物

菌株	信号1	信号2	信号3
				G.oxydans DSM17078	++++	+	+
G.oxydans IFO3293	++++	+	+
				G.oxydans IFO3292	+++	+	+
G.oxydans ATCC621H	+++	+	+
				G.oxydans IFO12528	+++	+	+
G.oxydans G624	+++	+	+
				G.oxydans T-100	+++	+	+
G.oxydans IFO3291	+++	+	+
				G.oxydans IFO3255	+++	+	+
G.oxydans ATCC9937	+++	+	+
				G.oxydans IFO3244	+++	+	+
G.cerinus IFO3266	+++	+	+
				G.frateurii IFO3260	+++	+	+
G.oxydans IFO3287	+++	+	+
				Acetobaeter aceti subsp.orleanus IFO3259	+	-	+
Acetobacter aceti subsp.xylinum IFO13693	+	-	+
				Acetobacter aceti subsp.xylinum IFO13773	+	-	+
Acetobacter sp.ATCC15164	+	-	+
				G.thailandicus NBRC100600	+++	+	+
Gluconacetobacter liquefaciens ATCC14835	++	+	+
				Gluconacetobacter polyoxogenes NBI1028	+	+	+
Gluconacetobacter diazotrophicus ATCC49037	+	+	+
				Gluconacetobaeter europaeus DSM6160	+	+	+
Acetobacter aceti1023	+	-	+
				Acetobacter pasteurianus NCI1193	+	-	+
Pseudomonas putida ATCC21812	-	-	+
				Pseudomonas aeruginosa PAO1	+	-	+
Pseudomonas fluorescens DSM50106	+	-	+
				Pseudomonas syringae B728a	+	-	+
Paracoccus denitrificans strain Pd1222	-	-	+
				Rhodopseudomonas palustris CGA009	-	-	+
Pantoea citrea1056R	-	-	-
				E.coli	-	-	-
Saccharomyces cerevisiae	-	-	-
				Aspergillus niger	-	-	-
小鼠	-	-	-

表C续：其它生物中SMS12基因的等同物

菌株	信号1	信号2	信号3
				G.oxydans DSM17078	++++	+	+
G.oxydans IFO3293	++++	+	+
				G.oxydans IFO3292	++++	-	+
G.oxydans ATCC621H	-	-	-
				G.oxydans IFO12528	-	-	-
G.oxydans G624	+	+	+
				G.oxydans T-100	++++	+	+
G.oxydans IFO3291	+	+	+
				G.oxydans IFO3255	+	+	+
G.oxydans ATCC9937	+	+	+
				G.oxydans IFO3244	+	+	+
G.cerinus IFO3266	+	+	+
				G.frateurii IFO3260	+	+	+
G.oxydans IFO3287	+	+	+
				Acetobacter aceti subsp.orleanus IFO3259	-	-	-
Acetobacter aceti subsp.xylinum IFO13693	-	-	-
				Acetobacter aceti subsp.xylinum IFO13773	-	-	-
Acetobacter sp.ATCC15164	-	-	-
				G.thailandicus NBRC100600	+	+	+
Gluconacetobacter liquefaciens ATCC14835	++	+	+
				Gluconacetobacter polyoxogenes NBI1028	-	-	+
Gluconacetobacter diazotrophicus ATCC49037	-	-	+
				Gluconacetobacter europaeus DSM6160	-	-	+
Acetobacter aceti1023	-	-	-
				Acetobacter pasteurianus NCI1193	-	-	-
Pseudomonas putida ATCC21812	-	-	-
				Pseudomonas aeruginosa PAO1	-	-	-
Pseudomofas fluorescens DSM50106	-	-	-
				Pseudomonas syringae B728a	-	-	-
Azotobacter vinelandii AvOP	-	-	-
				Azotobacter chroococcum MCD1	-	-	-
Paracoccus denitrificans strain Pd1222	-	-	-
				Rhodopseudomonas palustris CGA009	-	-	-
Pantoea citrea1056R	-	-	-
				E.coli K-12	-	-	-
Saccharomyces cerevisiae	-	-	-
				Aspergillus niger	-	-	-
小鼠	-	-	-

表C续：其它生物中SMS13基因的等同物

菌株	信号1	信号2	信号3
				G.oxydans DSM17078	++++	+	+
G.oxydans IFO3293	++++	+	+
				G.oxydans IF3292	++++	+	+
G.oxydans ATCC621H	++++	+	+
				G.oxydans IFO12528	++++	+	+
G.oxydans G624	++++	+	+
				G.oxydans T-100	++++	+	+
G.oxydans IFO3291	++++	+	+
				G.oxydans IFO3255	++++	+	+
G.oxydans ATCC9937	++++	+	+
				G.oxydans IFO3244	++++	+	+
G.cerinus IFO3266	+++	+	+
				G.frateurii IFO3260	+++	+	+
G.oxydans IFO3287	+++	+	+
				Acetobacter aceti subsp.orleanus IFO3259	-	-	-
Acetobacter aceti subsp.xylinum IFO13693	-	-	-
				Acetobacter aceti subsp.xylinum IFO13773	-	-	-
Acetobacter sp.ATCC15164	-	-	-
				G.thailandicus NBRC100600	+++	+	+
Gluconacetobacter liquefaciens ATCC14835	++	+	+
				Gluconacetobacter polyoxogenes NBI1028	-	-	+
Gluconacerobacter diazotrophicus ATCC49037	-	-	+
				Gluconacetobacter europaeus DSM6160	-	-	+
Acetobacter aceti1023	-	-	-
				Acetobacter pasteurianus NCI1193	-	-	-
Pseudomonas putida ATCC21812	-	-	-
				Pseudomonas aeuginosa PAO1	-	-	-
Pseudomonas fluorescens DSM50106	-	-	-
				Pseudomonas syringae B728a	-	-	-
Azotobacter vinelandii AvOP	-	-	-
				Azotobacter chroococcum MCD1	-	-	-
Paracoccus denitrificans strain Pd1222	-	-	-
				Rhodopseudomonas palustris CGA009	-	-	-
Pantoea citrea1056R	-	-	-
				E.coli	-	-	-
Saccharomyces cerevisiae	-	-	-
				Aspergillus niger	-	-	-
小鼠	-	-	-

表C续：其它生物中SMS14基因的等同物

菌株	信号1	信号2	信号3
				G.oxydans DSM17078	++++	+	+
G.oxydans IFO3293	++++	+	+
				G.oxydans IFO3292	++++	+	+
G.oxydans ATCC621H	++++	+	+
				G.oxydans IFO12528	++++	+	+
G.oxydans G624	++++	+	+
				G.oxydans T-100	++++	+	+
G.oxydans IFO3291	++++	+	+
				G.oxydans IFO3255	++++	+	+
G.oxydans ATCC9937	++++	+	+
				G.oxydans IFO3244	++++	+	+
G.cerinus IFO3266	+++	+	+
				G.frateurii IfO3260	+++	+	+
G.osydans IFO3287	+++	+	+
				Acetobacter aceti subsp.orleanus IFO3259	-	-	-
Acetobacter aceti subsp.xylinum IFO13693	-	-	-
				Acetobacter aceti subsp.xylinum IFO13773	-	-	-
Acetobacter sp.ATCC15164	-	-	-
				G.thailandicus NBRC100600	+++	+	+
Gluconacetobacter liquefaciens ATCC14835	++	+	+
				Gluconacetobacter polyoxogenes NBI1028	-	-	+
Gluconacetobacter diazotrophicus ATCC49037	-	-	+
				Gluconacetobacter europaeus DSM6160	-	-	+
Acetobacter aceti1023	-	-	-
				Acetobacter pasteurianus NCI1193	-	-	-
Pseudomonas putida ATCC21812	-	-	-
				Pseudomonas aeruginosa PAO1	-	-	-
Pseudomonas fluorescens DSM50106	-	-	-
				Pseudomonas syringae B728a	-	-	-
Azotobacter vinelandii AvOP	-	-	-
				Azotobacter chroococcum MCD1	-	-	-
Paracoccus denitrificans strain Pd1222	-	-	-
				Rhodopseudomonas palustris CGA009	-	-	-
Pantoea citrea1056R	-	-	-
				E.coli	-	-	-
Saccharomyces cerevisiae	-	-	-
				Aspergillus niger	-	-	-
小鼠	-	-	-

Claims

1.对维生素C进行发酵生产的方法，其中，在允许从能够从D-葡萄糖或D-山梨糖醇代谢途径获得的碳源直接生产维生素C的合适培养条件下，培养宿主细胞，并且，其中，所述宿主细胞的基因组被包含下述多核苷酸的DNA序列进行了遗传工程改造：

a）编码根据SEQ ID NO：2的L-山梨糖酮脱氢酶或其活性片段或其衍生物的多核苷酸，以及

b）编码选自下述组的蛋白质的至少一种多核苷酸，所述组由

1）涉及山梨糖/山梨糖醇代谢系统（SMS）的蛋白质；

2）涉及穿过细胞膜的糖转运系统（STS）的蛋白质；

3）涉及呼吸链系统（RCS）的蛋白质；以及

4）显示出与甘露糖-1-磷酸鸟苷酰转移酶/甘露糖-6-磷酸异构酶或肌氨酸氧化酶α亚基或同渗容摩传感器蛋白envZ rp426或转录调控蛋白OmpR或PetP或肽去甲酰酶或天冬酰胺合酶的相似性的蛋白质构成；

以及可选地，从此类细胞或所述培养基分离维生素C。

2.如权利要求1所述的方法，其中，根据1a）的多核苷酸的表达指与SEQ ID NO：1基本相同的多核苷酸序列和/或选自下述组的多核苷酸序列或此类多核苷酸的互补链，所述组由

a）多核苷酸，其包含根据SEQ ID NO：1的核苷酸序列

b）多核苷酸，其包含可使用来自微生物的基因组DNA作为模板，使用根据SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的引物组，通过核酸扩增，例如聚合酶链式反应，获得的核苷酸序列；

c）多核苷酸，其包含编码含有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽的片段或衍生物的核苷酸序列，或包含编码由（a）或（b）中任何多核苷酸编码的多肽的片段或衍生物的核苷酸序列，其中，在所述衍生物或片段中，一个或多个氨基酸残基较之所述多肽而言被保守取代，并且，所述片段或衍生物具有其副本多肽的活性；

d）多核苷酸，其编码具有L-山梨糖酮脱氢酶活性的多肽，其互补链在严谨条件下能与编码包含根据SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽的多核苷酸杂交，或与（a）至（c）中任一条定义的多核苷酸杂交；

e）多核苷酸，其编码具有L-山梨糖酮脱氢酶活性的多肽，并且，其与编码包含根据SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽的多核苷酸、或与（a）至（c）中任一条定义的多核苷酸至少70%相同，例如85、90或95%相同

构成。

3.如权利要求1或2所述的方法，其中，所述宿主细胞含有编码STS蛋白的多核苷酸，所述STS蛋白选自糖转运蛋白和/或糖醇转运蛋白构成的组。

4.如权利要求1至3中任意一项所述的方法，其中，所述宿主细胞含有编码RCS蛋白的多核苷酸，所述RCS蛋白选自在辅助因子和辅基的生物合成中发挥作用的蛋白以及作为载体蛋白发挥作用的蛋白构成的组；特别是涉及辅助因子和/或它们的前体，例如FAD，NAD，NADP，PQQ，CoQ10，细胞色素a、b、c、d以及亚铁血红素的生物合成或成熟的蛋白。

5.如权利要求1至4中任意一项所述的方法，其中，所述宿主细胞含有编码RCS蛋白的多核苷酸，所述RCS蛋白选自在作为供体的联苯酚以及相关物质上发挥作用的氧化还原酶[EC1.10]和具有其它受体的氧化还原酶[EC1.1.99]构成的组，特别是醇脱氢酶（受体）[EC1.1.99.8]。

6.如权利要求1至5中任意一项所述的方法，其中，所述宿主细胞含有编码SMS蛋白的多核苷酸，所述SMS蛋白选自氧化还原酶[EC1]构成的组，特别是在供体的CH-OH基团上发挥作用的氧化还原酶[EC1.1]。

7.如权利要求1至6中任意一项所述的方法，其中，所述宿主细胞含有至少一种选自下述多核苷酸的多核苷酸：

-由SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：96、SEQ IDNO：100、SEQ ID NO：104及其功能等同物或同源物构成的STS组；

-由SEQ ID NO：136、SEQ ID NO：140、SEQ ID NO：144及其功能等同物或同源物构成的SMS组；

-由SEQ ID NO：148、SEQ ID NO：152、SEQ ID NO：156、SEQ IDNO：160、SEQ ID NO：164、SEQ ID NO：168、SEQ ID NO：172、SEQID NO：176、SEQ ID NO：180、SEQ ID NO：184、SEQ ID NO：188、SEQ ID NO：192、SEQ ID NO：196及其功能等同物或同源物构成的RCS组。

8.如权利要求1至7中任意一项所述的方法，其中，所述多核苷酸被至少一种选自下述多核苷酸的多核苷酸进行了遗传功能改造：

-由SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：56、SEQ IDNO：60、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：72和SEQ IDNO：40及其功能等同物或同源物构成的VCS组；

-由SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：108、SEQ IDNO：112、SEQ ID NO：116、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：120及其功能等同物或同源物构成的STS组；

-由SEQ ID NO：124、SEQ ID NO：128、SEQ ID NO：132、SEQ IDNO：44及其功能等同物或同源物构成的SMS组；

-由SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：200及其功能等同物或同源物构成的RCS组；

其中，所述多核苷酸欠表达或被打断。

9.如权利要求1至8中任意一项所述的方法，其中，在允许从D-山梨糖醇或L-山梨糖直接生产维生素C的条件下，在水性营养培养基中培养所述宿主细胞。

10.如权利要求1至8中任意一项所述的方法，其中，所述经遗传工程改造的宿主细胞是原核细胞，其选自Pseudomonas、Pantoea、Escherichia、Corynebacterium、Ketogulonicigenium以及乙酸细菌，例如Gluconobacter、Acetobacter或Gluconacetobacter，优选地，Acetobactersp.、Acetobacter aceti、Gluconobacter frateurii、Gluconobacter cerinus、Gluconobacter thailandicus、Gluconobacter oxydans构成的组，优选地，Gluconobacter oxydans，更优选地，Gluconobacter oxydans DSM17078。

11.一种宿主细胞，其表达具有根据SEQ ID NO：2的氨基酸序列且具有L-山梨糖酮脱氢酶活性的多肽或其功能等同物，所述宿主细胞被至少一种多核苷酸进行了遗传工程改造，所述多核苷酸编码选自下述组的蛋白质：

1）涉及山梨糖/山梨糖醇代谢系统（SMS）的蛋白质；

2）涉及穿过细胞膜的糖转运系统（STS）的蛋白质；

3）涉及呼吸链系统（RCS）的蛋白质；以及

4）显示出与甘露糖-1-磷酸鸟苷酰转移酶/甘露糖-6-磷酸异构酶或肌氨酸氧化酶α亚基或同渗容摩传感器蛋白envZ rp426或转录调控蛋白OmpR或PetP或肽去甲酰酶或天冬酰胺合酶的相似性的蛋白质。

12.如权利要求11所述的宿主细胞，其中，所述宿主细胞被至少一种如权利要求2至8中任意一项定义的多核苷酸进行了遗传工程改造。

13.如权利要求11或12所述的宿主细胞，其中，表达了选自下述组的蛋白或其功能等同物或其同源物，所述组由

-SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：105

-SEQ ID NO：137、SEQ ID NO：141、SEQ ID NO：145

-SEQ ID NO：149、SEQ ID NO：153、SEQ ID NO：157、SEQ IDNO：161、SEQ ID NO：165、SEQ ID NO：169、SEQ ID NO：173、SEQID NO：177、SEQ ID NO：181、SEQ ID NO：185、SEQ ID NO：189、SEQ ID NO：193、SEQ ID NO：197

构成。

14.如权利要求11至13中任意一项所述的宿主细胞，其中，选自下述组的蛋白或其功能等同物或其同源物欠表达或被打断，所述组由

-SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：73和SEQ ID NO：41

-SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：109、SEQ IDNO：113、SEQ ID NO：117、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：121

-SEQ ID NO：125、SEQ ID NO：129、SEQ ID NO：133、SEQ IDNO：45

-SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：201

构成。

15.如权利要求11至14中任意一项所述的宿主细胞，当在20小时的温育时间后，在静止细胞方法中测量时，其能以300mg/l或更多的量从D-山梨糖醇直接生产维生素C。

16.如权利要求11至14中任意一项所述的宿主细胞，当在20小时的温育时间后，在静止细胞方法中测量时，其能以800mg/l或更多的量从L-山梨糖直接生产维生素C。

17.如权利要求11至16中任意一项所述的宿主细胞，其是原核细胞，其选自Pseudomonas、Pantoea、Escherichia、Corynebacterium、Ketogulonicigenium以及乙酸细菌，例如Gluconobacter、Acetobacter或Gluconacetobacter，优选地，Acetobacter sp.、Acetobacter aceti、Gluconobacter frateurii、Gluconobacter cerinus、Gluconobacterthailandicus、Gluconobacter oxydans构成的组，优选地，Gluconobacteroxydans，更优选地，Gluconobacter oxydans DSM17078。

18.一种方法，用于生产如权利要求11所述的细胞，所述方法包括如下步骤：用权利要求2至8中任意一项定义的多核苷酸对细胞进行遗传工程改造。

19.如权利要求18所述的方法，其中，以下述方式改变这些多核苷酸序列中的至少一种，所述方式使得所述微生物生产的维生素C的产率和/或生产效率提高。