ES2339974T3 - Nuevo gen sms37. - Google Patents
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Abstract
Un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en: (a) polinucleótidos que codifican un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO:2; (b) polinucleótidos que comprenden la secuencia nucleotídica según SEQ ID NO:1; (c) polinucleótidos que son al menos 70% idénticos a un polinucleótido como se define en uno cualquiera de (a) a (b), y que codifican un exportador de azúcar y/o un exportador de alcohol de azúcar, o la hebra complementaria de tal polinucleótido.
Description
Nuevo gen SMS 37.
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La presente invención se refiere a genes
recientemente identificados que codifican proteínas que están
implicadas en la síntesis de ácido L-ascórbico (en
lo sucesivo también denominado como vitamina C). La invención
también se refiere a polinucleótidos que comprenden las secuencias
polinucleotídicas de longitud completa de los nuevos genes y sus
fragmentos, a los nuevos polipéptidos codificados por los
polinucleótidos y sus fragmentos, así como a sus equivalentes
funcionales. La presente invención también se refiere al uso de
dichos polinucleótidos y polipéptidos como herramientas
biotecnológicas en la producción de vitamina C a partir de
microorganismos, con lo que una modificación de dichos
polinucleótidos y/o polipéptidos codificados tiene un impacto
directo o indirecto en el rendimiento, producción y/o eficiencia de
producción del producto de fermentación en dicho organismo. También
se incluyen métodos/procedimientos para usar los polinucleótidos y
las secuencias polinucleotídicas modificadas para transformar
microorganismos hospedantes. La invención también se refiere a
microorganismos manipulados mediante ingeniería genética, y a su
uso para la producción directa de vitamina C.
La vitamina C es uno de los factores nutrientes
muy importantes e indispensables para seres humanos. La vitamina C
también se usa en alimentación animal incluso aunque algunos
animales de granja pueden sintetizarla en su propio organismo.
Durante los 70 años pasados, la vitamina C se ha
producido industrialmente a partir de D-glucosa
mediante el método bien conocido de Reichstein. Todas las etapas en
el proceso son químicas excepto una (la conversión de
D-sorbitol en L-sorbosa), que se
lleva a cabo mediante conversión microbiana. Desde su implementación
inicial para la producción industrial de vitamina C, se han usado
varias modificaciones químicas y técnicas para mejorar la
eficiencia del método de Reichstein. Los recientes desarrollos de la
producción de vitamina C se resumen en Ullmann's Encyclopedia of
Industrial Chemistry, 5ª Edición, Vol. A27 (1996), p. 547ff.
Se han llevado a cabo diferentes etapas
intermedias de producción de vitamina C con la ayuda de
microorganismos o enzimas aisladas de ellos. De este modo, el ácido
2-ceto-L-gulónico
(2-KGA), un compuesto intermedio que se puede
convertir químicamente en vitamina C por medio de una reacción de
transposición alcalina, se puede producir mediante un proceso de
fermentación partiendo de L-sorbosa o
D-sorbitol, por medio de cepas que pertenecen,
por ejemplo, a los géneros Ketogulonicigenium o
Gluconobacter, o mediante un proceso de fermentación
alternativa partiendo de D-glucosa, por medio de
cepas recombinantes que pertenecen a los géneros
Gluconobacter o Pantoea.
Los métodos actuales de producción químicos para
la vitamina C tienen algunas características indeseables tales como
el consumo de gran cantidad de energía y el uso de grandes
cantidades de disolventes orgánicos e inorgánicos. Por lo tanto,
durante las pasadas décadas, se han investigado otros enfoques para
fabricar vitamina C usando conversiones microbianas, que fuesen más
económicos así como ecológicos.
La producción directa de vitamina C a partir de
un número de sustratos, incluyendo D-sorbitol,
L-sorbosa y L-sorbosona, se ha dado
a conocer en varios microorganismos, tales como algas, levaduras y
bacterias de ácido acético, usando diferentes métodos de cultivo.
Los ejemplos de bacterias conocidas capaces de producir directamente
vitamina C incluyen, por ejemplo, las cepas de los géneros de
Gluconobacter, Gluconacetobacter, Acetobacter,
Ketogulonicigenium, Pantoea, Pseudomonas o Escherichia. Los
ejemplos de algas o levaduras conocidas incluyen, por ejemplo,
Candida, Saccharomyces, Zygosaccharomyces, Schizosaccharomyces,
Kluyveromyces or Chlorella.
El documento WO 2004/029235 A2 describe un gen
que codifica una denominada aldehidodeshidrogenasa que está
implicada en la conversión directa de L-sorbosona en
vitamina C. Dicho gen se ha aislado de Ketogulonicigenium vulgare
DSM 4025 (conocido antiguamente como Gluconobacter oxydans DSM
4025). La producción de vitamina C se podría potenciar con la
expresión de dicho gen en cepas mutantes en las que el gen natural
se ha destruido.
Los microorganismos capaces de asimilar
D-sorbitol para el crecimiento poseen habitualmente
enzimas capaces de oxidar este compuesto en un sustrato de
asimilación universal tal como D-fructosa. También,
los microorganismos capaces de crecer en L-sorbosa
poseen una enzima, la L-sorbosa reductasa
dependiente de NAD(P)H, que es capaz de reducir este
compuesto a D-sorbitol, que entonces se oxida
posteriormente a D-fructosa. La
D-fructosa es un excelente sustrato para el
crecimiento de muchos microorganismos, después de que se ha
fosforilado por medio de una D-fructosa cinasa.
Por ejemplo, en el caso de bacterias de ácido
acético, que son microorganismos gramnegativos, aerobios forzados
que pertenecen al género Acetobacter, Gluconobacter, y
Gluconacetobacter, estos microorganismos son capaces de
transportar D-sorbitol al citosol y convertirlo en
D-fructosa por medio de una
D-sorbitol deshidrogenasa citosólica dependiente de
NAD. Algunas cepas individuales, tales como Gluconobacter
oxydans IFO 3292, e IFO 3293, son capaces igualmente de
transportar L-sorbosa al citosol y reducirla a
D-sorbitol por medio de una
L-sorbosa reductasa citosólica dependiente de
NAD(P)H, que entonces se oxida posteriormente a
D-fructosa. En estas bacterias, la ruta de
Embden-Meyerhof-Parnas, así como el
ciclo del ácido tricarboxílico, no están completamente activos, y
la ruta principal que canaliza azúcares al metabolismo central es la
ruta de las pentosas fosfato. La
D-fructosa-6-fosfato,
obtenida a partir de D-fructosa mediante una
reacción de fosforilación, entra en la ruta de las pentosas
fosfato, metabolizándose posteriormente y produciendo un poder
reductor en forma de NAD(P)H y compuestos
tricarboxílicos necesarios para el crecimiento y mantenimiento.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Las bacterias de ácido acético son bien
conocidas por su capacidad para oxidar de forma incompleta
diferentes sustratos tales como alcoholes, azúcares, alcoholes de
azúcares, y aldehídos. Estos procedimientos son generalmente
conocidos como fermentaciones oxidativas u oxidaciones incompletas,
y están bien consolidados desde hace mucho tiempo en la industria
alimentaria y química, especialmente en la producción de vinagre y
en la producción de L-sorbosa. Un producto útil que
se sabe que se obtiene a partir de oxidaciones incompletas de
D-sorbitol o L-sorbosa usando cepas
que pertenecen al género Gluconobacter es
2-KGA.
Las bacterias de ácido acético logran estas
reacciones de oxidación completa por medio de diferentes
deshidrogenasas localizadas en el espacio periplásmico, en la
membrana periplásmica así como en el citoplasma. Se emplean
diferentes cofactores mediante las diferentes deshidrogenasas,
siendo el más habitual PQQ y FAD para enzimas unidas a membrana o
periplásmicas, y NAD/NADP para enzimas citoplásmicas.
Aunque todos los productos de estas reacciones
de oxidación se difunden nuevamente al entorno acuoso externo a
través de la membrana exterior, algunos de ellos pueden ser
transportados pasiva o activamente a la célula se pueden usar
posteriormente en rutas metabólicas responsables del crecimiento y
formación de energía. Dentro de la célula, los productos oxidados
se pueden reducir nuevamente muchas veces a su sustrato original por
medio de reductasas, y después se pueden canalizar nuevamente al
metabolismo central.
Las proteínas, en particular enzimas y
transportadores, que son activas en la metabolización de
D-sorbitol o L-sorbosa, se citan
aquí como implicadas en el Sistema de Metabolización
de Sorbitol/Sorbosa. Tales proteínas se abrevian aquí
como proteínas del SMS, y funcionan en la metabolización directa de
D-sorbitol o L-sorbosa.
La metabolización de D-sorbitol
o L-sorbosa incluye por un lado la asimilación de
estos compuestos en el citosol y la conversión posterior en
metabolitos útiles para las rutas de asimilación tales como la ruta
de Embden-Meyerhof-Parnas, la ruta
de las pentosas fosfato, la ruta de
Entner-Doudoroff, y el ciclo del ácido
tricarboxílico, todos ellos implicados en todas las reacciones
vitales formadoras de energía y anabólicas necesarias para el
crecimiento y mantenimiento de las células vivas. Por otro lado, la
metabolización de D-sorbitol o
L-sorbosa también incluye la conversión de estos
compuestos en productos oxidados adicionales tales como
L-sorbosona, 2-KGA y vitamina C
mediante los procesos de oxidación incompleta.
Un objeto de la presente invención es mejorar
los rendimientos y o productividad de la producción de vitamina
C.
Sorprendentemente, ahora se ha encontrado que
las proteínas del SMS o subunidades de tales proteínas que tienen
actividad con respecto, o que están implicadas en, la asimilación o
conversión de D-sorbitol, L-sorbosa
o L-sorbosona desempeñan un papel importante en la
producción biotecnológica de vitamina C y/o
2-KGA.
En una realización, las proteínas del SMS de la
presente invención se seleccionan de oxidorreductasas [EC 1],
preferiblemente oxidorreductasas que actúan sobre el grupo
CH-OH de dadores [EC 1.1], más preferiblemente
oxidorreductasas con NAD^{+} o NADP^{+} como aceptor [EC 1.1.1]
y oxidorreductasas con otros aceptores [EC 1.1.99], más
preferiblemente se seleccionan de oxidorreductasas que pertenecen a
las clases de enzimas [EC 1.1.1.1], [EC 1.1.1.15] o [EC 1.2.1.-], o
preferiblemente oxidorreductasas que actúan sobre el grupo aldehído
u oxo de dadores [EC 1.2], más preferiblemente oxidorreductasas con
NAD^{+} o NADP^{+} como aceptor [EC 1.2.1].
Adicionalmente, las proteínas del SMS de la
presente invención se pueden seleccionar del grupo que consiste en
D-sorbitol deshidrogenasa dependiente de PQQ unida a
membrana, L-sorbosa deshidrogenasa unida a membrana,
L-sorbosona deshidrogenasa unida a membrana,
D-sorbitol deshidrogenasa dependiente de FAD unida a
membrana, D-sorbitol deshidrogenasa dependiente de
NAD citosólica, D-sorbitol deshidrogenasa
dependiente de NAD(P) (también denominada como sorbosa
reductasa dependiente de NADPH), xilitol deshidrogenasa dependiente
de NAD, alcohol deshidrogenasa dependiente de NAD,
L-sorbosa deshidrogenasa unida a membrana,
L-sorbosa reductasa dependiente de
NAD(P)H, sorbosona deshidrogenasa dependiente de NADP
citosólica, L-sorbosona reductasa dependiente de
NAD(P)H citosólica, aldehído deshidrogenasa unida a
membrana, aldehído deshidrogenasa citosólica,
glicerol-3-fosfato deshidrogenasa,
gliceraldehído-3-fosfato
deshidrogenasa, y otras implicadas en el SMS, incluyendo proteínas
implicadas en el transporte de azúcar y/o alcoholes de azúcares, en
particular simportadores, preferiblemente simportador de
galactosa-protón, o exportadores de azúcar o
alcoholes de azúcares, preferiblemente exportador de sorbosona.
En particular, ahora se ha encontrado que las
proteínas del SMS codificadas por polinucleótidos que tienen una
secuencia nucleotídica que se hibrida preferiblemente en condiciones
muy restrictivas a una secuencia mostrada en SEQ ID NO:1 desempeñan
un papel importante en la producción biotecnológica de vitamina C.
También se ha encontrado que alterando genéticamente el nivel de
expresión de nucleótidos según la invención en un microorganismo
capaz de producir directamente vitamina C, tal como por ejemplo
Gluconobacter, se puede incluso mejorar enormemente la
fermentación directa de vitamina C mediante dicho
microorganismo.
En consecuencia, la invención se refiere a un
polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en:
(a) polinucleótidos que codifican un polipéptido
que comprende la secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO:2;
(b) polinucleótidos que comprenden la secuencia
nucleotídica según SEQ ID NO:1;
(c) polinucleótidos que son al menos 70%
idénticos a un polinucleótido como se define en uno cualquiera de
(a) a (b), y que codifican un exportador de azúcar y/o un exportador
de alcoholes de azúcares, preferiblemente un polipéptido de SMS
37;
o
la hebra complementaria de tal
polinucleótido.
Se encontró que la proteína del SMS como se
aísla de Gluconobacter oxydans DSM 17078, mostrada en SEQ ID
NO:2 y descrita aquí, es una proteína del SMS muy útil, ya que
parece que realiza una función crucial en la producción directa de
vitamina C en microorganismos, en particular en bacterias, tales
como bacterias de ácido acético, tales como Gluconobacter,
Acetobacter y Gluconacetobacter. En consecuencia, la
invención se refiere a un polinucleótido que codifica un
polipéptido según SEQ ID NO:2. Esta proteína puede ser codificada
por una secuencia nucleotídica como se muestra en SEQ ID NO:1. Por
lo tanto, la invención también se refiere a polinucleótidos que
comprenden la secuencia nucleotídica según SEQ ID NO:1.
Las secuencias nucleotídicas y de aminoácidos
determindas anteriormente se usaron como una "secuencia de
búsqueda" para llevar a cabo una búsqueda con el programa Blast2
(versión 2 o BLAST de National Center for Biotechnology [NCBI]
frente a la base de datos PRO SW-SwissProt (versión
completa más actualizaciones progresivas). A partir de las
búsquedas, se señala que el polinucleótido SMS 37 según SEQ ID NO:1
codifica una proteína que tiene actividad de simportador de
galactosa-protón.
Sorprendentemente, ahora se ha encontrado además
que la proteína codificada por el polinucleótido SMS 37 según SEQ
ID NO:1 está implicada en la exportación de azúcares y/o alcoholes
de azúcares, en particular sorbosona. A este respecto,
"exportar" significa el transporte activo de un compuesto
respectivo desde el citoplasma al periplasma o el medio
extracelular.
Se ha aislado de Gluconobacter oxydans
621H (Prust et al., Nature Biotechnology, Nature Publishing
Group, New York, NY, US, Vol. 23, No. 2, febrero de 2005, páginas
195-200) una proteína denominada GOX0649 que
comparte una identidad de 60% en un solapamiento de 457 aa con el
polipéptido según SEQ ID NO:2. Sin embargo, no se ha señalado
ninguna función ni ninguna relación con la producción de vitamina
C.
La invención también se refiere a
polinucleótidos que son al menos 70% idénticos a un polinucleótido
como se define aquí y que codifican un polipéptido del SMS; y la
invención también se refiere a polinucleótidos que son la hebra
complementaria de un polinucleótido como se define aquí
anteriormente.
La invención también se refiere a cebadores,
sondas y fragmentos que se pueden usar para amplificar o detectar
un ADN según la invención y para identificar especies relacionadas o
familias de microorganismos que también poseen tales genes.
La presente invención también se refiere a
vectores que incluyen polinucleótidos de la invención y a
microorganismos que están manipulados mediante ingeniería genética
con los polinucleótidos o dichos vectores.
La invención también se refiere a procedimientos
para producir microorganismos capaces de expresar un polipéptido
codificado por el polinucleótido definido anteriormente y un
polipéptido codificado por un polipéptido como se define
anteriormente.
La invención también se refiere a
microorganismos en los que la actividad de un polipéptido del SMS,
preferiblemente un polipéptido SMS 37, está potenciada y/o
mejorada, de forma que el rendimiento de vitamina C que es producido
directamente a partir de D-sorbitol o
L-sorbosa está incrementado. Esto se puede lograr,
por ejemplo, transfiriendo un polinucleótido según la invención a
un microorganismo recombinante o no recombinante que puede contener
o no un equivalente endógeno del gen de SMS 37.
La persona experta sabrá cómo potenciar y/o
mejorar la actividad de una proteína del SMS, preferiblemente una
proteína SMS 37. Por ejemplo, tal hecho se puede lograr modificando
genéticamente el organismo hospedante de forma que produzca más
copias de la proteína del SMS, preferiblemente la proteína SMS 37, o
más estables que el organismo de tipo natural, o incrementando la
actividad específica de la proteína del SMS, preferiblemente la
proteína SMS 37.
En la siguiente descripción, se detallan
procedimientos para lograr este fin, es decir, el incremento
del rendimiento y/o producción de vitamina C que es directamente
producida a partir de D-sorbitol o
L-sorbosa incrementando la actividad de una
proteína SMS 37. Estos procedimientos se aplican mutatis
mutandis a otras proteínas del SMS.
Las modificaciones a fin de que el organismo
produzca más copias del gen de SMS 37, es decir,
sobreexpresar el gen, y/o la proteína pueden incluir el uso de un
promotor potente, o la mutación (por ejemplo inserción,
supresión o mutación puntual) del (partes del) gen de SMS 37 o sus
elementos reguladores. También pueden implicar la inserción de
múltiples copias del gen en un microorganismo adecuado. También se
puede lograr mediante métodos conocidos en la técnica un incremento
en la actividad específica de una proteína SMS 37. Tales métodos
pueden incluir la mutación (por ejemplo inserción, supresión
o mutación puntual) del (partes del) gen de SMS 37. Se afirma que
un gen está "sobreexpresado" si el nivel de transcripción de
dicho gen está potenciado en comparación con el gen de tipo
natural. Esto se puede medir, por ejemplo, mediante análisis de
transferencia Northern, cuantificando la cantidad de ARNm como una
indicación de la expresión génica. Como se usa aquí, un gen está
sobreexpresado si la cantidad de ARNm generado aumenta en al menos
1%, 2%, 5% 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 200% o incluso más de 500%, en
comparación con la cantidad de ARNm generado a partir de un gen de
tipo natural.
También se conocen en la técnica métodos para
incrementar la actividad de una proteína dada poniendo en contacto
la proteína SMS 37 con potenciadores específicos u otras sustancias
que interaccionan específicamente con la proteína SMS 37. A fin de
identificar tales potenciadores específicos, la proteína SMS 37 se
puede expresar y ensayar para determinar la actividad en presencia
de compuestos que se sospecha que potencian la actividad de la
proteína SMS 37. La actividad de la proteína SMS 37 también se puede
incrementar estabilizando el ARN mensajero que codifica SMS 37.
Tales métodos son conocidos en la técnica; véase, por ejemplo, en
Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory
Manual, Cold Spring Harbor Press, N. Y.; y Ausubel et al.
(eds.), 1995, Current Protocols in Molecular Biology, (John Wiley
& Sons, N.Y.).
La invención se puede llevar a cabo en/con
cualquier microorganismo que posea un gen de SMS 37 o un equivalente
u homólogo del mismo. Los microorganismos adecuados se pueden
seleccionar del grupo que consiste en levaduras, algas y bacterias,
ya sea como cepas de tipo natural, cepas mutantes derivadas de
métodos de mutagénesis y de selección clásicos, o como cepas
recombinantes. Los ejemplos de tales levaduras pueden ser, por
ejemplo, Candida, Saccharomyces, Zygosaccharomyces,
Schizosaccharomyces, o Kluyveromyces. un ejemplo de tales
algas puede ser, por ejemplo, Chlorella. Los ejemplos
de tales bacterias pueden ser, por ejemplo,
Gluconobacter, Acetobacter, Gluconacetobacter,
Ketogulonicigenium, Pantoea, Pseudomonas, tales como, por
ejemplo, Pseudomonas putida, y Escherichia, tales
como, por ejemplo, Escherichia coli. Se prefieren
Gluconobacter o Acetobacter aceti, tales como por
ejemplo G. oxydans, G. cerinus, G. frateurii, A. aceti subsp.
xylinum o A. aceti subsp. orleanus, preferiblemente G.
oxydans DSM 17078. Gluconobacter oxydans DSM 17078
(antiguamente conocida como Gluconobacter oxydans
N44-1) se ha depositado en Deutsche Sammlung von
Mikroorganismen and Zellkulturen (DSMZ), Mascheroder Weg 1B,
D-38124 Braunschweig, Alemania, según el Tratado de
Budapest, el 26 de enero de 2005.
Los microorganismos que se pueden usar para la
presente invención pueden estar públicamente disponibles de
diferentes fuentes, por ejemplo, Deutsche Sammlung von
Mikroorganismen and Zellkulturen (DSMZ), Mascheroder Weg 1 B,
D-38124 Braunschweig, Alemania, American Type
Culture Collection (ATCC), P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108 USA o
Culture Collection Division, NITE Biological Resource Center,
2-5-8, Kazusakamatari, Kisarazushi,
Chiba, 292-0818, Japón (antiguamente: Institute for
Fermentation, Osaka (IFO), 17-85,
Juso-honmachi
2-chome,Yodogawa-ku, Osaka
532-8686, Japón). Los ejemplos de bacterias
preferidas depositadas con IFO son por ejemplo Gluconobacter
oxydans (antiguamente conocida como G. melanogenus) IFO
3293, Gluconobacter oxydans (antiguamente conocida como
G. melanogenus) IFO 3292, Gluconobacter oxydans
(antiguamente conocida como G. rubiginosus) IFO 3244,
Gluconobacter frateurii (antiguamente conocida como G.
industrius) IFO 3260, Gluconobacter cerinus IFO 3266,
Gluconobacter oxydans IFO 3287, y Acetobacter aceti subsp.
orleanus IFO 3259, que se depositaron todas el 5 de abril de
05, 1954; Acetobacter aceti subsp. xylinum IFO 13693
depositada el 22 de octubre de 1975, y Acetobacter aceti subsp.
xylinum IFO 13773 depositada el 8 de diciembre de 1977. La cepa
Acetobacter sp. ATCC 15164, que también es un ejemplo de una
bacteria preferida, se depositó en ATCC. La cepa Gluconobacter
oxydans (antiguamente conocida como G. melanogenus) N
44-1, como otro ejemplo de una bacteria preferida,
es un derivado de la cepa IFO 3293, y se describe en Sugisawa et
al., Agric. Biol. Chem. 54: 1201-1209,
1990.
Un microorganismo de la presente invención puede
poseer modificaciones adicionales ya sea a nivel del ADN o a nivel
proteico (véase anteriormente), en tanto que tal modificación tenga
un impacto directo sobre el rendimiento, producción y/o eficiencia
de la producción directa de vitamina C a partir de sustratos tales
como, por ejemplo D-sorbitol o
L-sorbosa. Tales modificaciones adicionales pueden
afectar por ejemplo a otros genes que codifican proteínas del SMS
como se describe anteriormente, en particular genes que codifican
L-sorbosona deshidrogenasas unidas a membrana, tales
como L-sorgosona deshidrogenasa SNDHai, o
D-sorbitol deshidrogenasas dependientes de PQQ
unidas a membrana. Los métodos para llevar a cabo tales
modificaciones son conocidos en la técnica, describiéndose
adicionalmente aquí algunos ejemplos. Para el uso de SNDHai para la
producción directa de vitamina C, así como la secuencia nucleotídica
y de aminoácidos de la misma, se hace referencia al documento WO
2005/017159 que se incorpora aquí como referencia. Adicionalmente,
tal modificación puede por ejemplo afectar a genes implicados en la
metabolización de D-sorbitol y/o
L-sorbosa, tales commo por ejemplo el gen o
un homólogo del mismo como se muestra en SEQ ID NO:9, que actúa como
un represor del gen de SMS 37, en particular una modificación que
conduce a una actividad reducida o anulada de dicho represor como
por ejemplo según SEQ ID NO:9.
La persona experta sabrá cómo reducir o anular
la actividad de dicho represor, preferiblemente una proteína según
SEQ ID NO:10. Tal hecho se puede lograr por ejemplo modificando
genéticamente el organismo hospedante de forma que produzca menos o
ninguna copia de dicho represor, preferiblemente la proteína según
SEQ ID NO:10, que el organismo de tipo natural, o disminuyendo o
anulando la actividad específica de dicho represor, preferiblemente
la proteína según SEQ ID NO:10.
Las modificaciones a fin de que el organismo
produzca menos copias o ninguna de tal gen represor, preferiblemente
un gen según SEQ ID NO:9, y/o una proteína según SEQ ID NO:10
pueden incluir el uso de un promotor débil, o la mutación (por
ejemplo, inserción, supresión o mutación puntual) del (partes
del) gen según SEQ ID NO:9 o sus elementos reguladores. La
disminución o anulación de la actividad específica de una proteína
según SEQ ID NO:10 también se puede lograr mediante métodos
conocidos en la técnica. Tales métodos pueden incluir la mutación
(por ejemplo inserción, supresión o mutación puntual) de
(partes de) un gen según SEQ ID NO:9. Esto puede afectar por
ejemplo a la interacción con ADN que está mediada por la región
N-terminal de una proteína según SEQ ID NO:10, o la
interacción con otras moléculas efectoras.
En la técnica también se conocen métodos para
reducir o anular la actividad de una proteína dada poniendo en
contacto la proteína según SEQ ID NO:10 con inhibidores específicos
u otras sustancias que interaccionan específicamente con dicha
proteína. A fin de identificar tales inhibidores específicos, dicha
proteína se puede expresar y ensayar para determinar la actividad
en presencia de compuestos que se sospecha que inhiben la actividad
de dicha proteína. Los compuestos inhibidores potenciales pueden ser
por ejemplo anticuerpos monoclonales o policlonales contra dicha
proteína. Tales anticuerpos se pueden obtener mediante protocolos
habituales de inmunización de animales de laboratorio adecuados.
Según un objeto adicional de la presente
invención, se proporciona el uso de un polinucleótido como se define
anteriormente o un microorganismo que se manipula mediante
ingeniería genética usando tales polinucleótidos en la producción
de vitamina C.
La invención también se refiere a procedimientos
para la expresión de genes endógenos en un microorganismo, a
procedimientos para la producción de polipéptidos como se definen
anteriormente, en un microorganismo, y a procedimientos para la
producción de microorganismos capaces de producir vitamina C. Todos
estos procedimientos pueden comprender la etapa de alterar un
microorganismo, en los que "alterar", como se usa aquí, engloba
el proceso de "alterar genéticamente" o "alterar la
composición del medio de cultivo celular y/o métodos usados para el
cultivo" de tal manera que el rendimiento y/o la productividad
del producto de fermentación se pueden mejorar en comparación con
el organismo de tipo natural. Como se usa aquí, "rendimiento
mejorado de vitamina C" significa un incremento de al menos 5%,
10%, 25%, 30%, 40%, 50%, 75%, 100%, 200% o incluso más de 500%, en
comparación con un organismo de tipo natural, es decir, un
microorganismo que no está alterado genéticamente.
La expresión "manipulado mediante ingeniería
genética" o "alterado genéticamente" significa la alteración
científica de la estructura de material genético en un organismo
vivo. Implica la producción y uso de ADN recombinante. Más en
particular, se usa para delinear el organismo genéticamente
manipulado por ingeniería o modificado a partir del organismo de
origen natural. La manipulación mediante ingeniería genética se
puede realizar mediante un número de técnicas conocidas en la
técnica, tales como, por ejemplo, sustitución génica,
amplificación génica, disrupción génica, transfección,
transformación usando plásmidos, virus, u otros vectores. Un
organismo genéticamente modificado, por ejemplo un
microorganismo genéticamente modificado, también se denomina a
menudo como un organismo recombinante, por ejemplo un
microorganismo recombinante.
De este modo, la presente invención puede
incluir (1) un microorganismo recombinante que posee, además de su
gen natural, por ejemplo el gen que codifica SMS 37, copias
adicionales de dicho gen introducidas mediante ingeniería genética
de dicho microorganismo mediante técnicas conocidas en la técnica y
tales como se ejemplifican aquí, o (2) un microorganismo
recombinante manipulado mediante ingeniería genética como antes pero
que no posee naturalmente al gen, tal como, por ejemplo, el gen que
codifica SMS 37. Preferiblemente, un microorganismo recombinante de
la presente invención se modifica de forma que posea más copias de
ADN que codifica SMS 37 que el microorganismo de tipo natural, en
particular como resultado de la transformación con un plásmido que
posee una o más copias de un ADN que codifica SMS 37, o de la
integración de tal ADN que codifica SMS 37 en su genoma.
Según todavía otro aspecto de la invención, se
proporciona un procedimiento para la producción de vitamina C
mediante fermentación directa.
En particular, la presente invención proporciona
un procedimiento para la producción directa de vitamina C, que
comprende convertir un sustrato en vitamina C.
Se pueden usar varios sustratos como fuente de
carbono en un procedimiento de la presente invención, es
decir, un procedimiento para la conversión directa de un
sustrato dado en vitamina C tal como, por ejemplo, se
menciona anteriormente. Las fuentes de carbono particularmente
adecuadas son aquellas que se pueden obtener fácilmente a partir de
la ruta de metabolización de D-glucosa o
D-sorbitol, tales como, por ejemplo,
D-glucosa, D-sorbitol,
L-sorbosa, L-sorbosona,
2-ceto-L-gulonato,
D-gluconato,
2-ceto-D-gluconato o
2,5-diceto-gluconato.
Preferiblemente, el sustrato se selecciona por ejemplo de
D-glucosa, D-sorbitol,
L-sorbosa o L-sorbosona, más
preferiblemente de D-glucosa,
D-sorbitol o L-sorbosa, y muy
preferiblemente de D-sorbitol,
L-sorbosa o L-sorbosona. Los
términos "sustrato" y "sustrato de producción", en
relación con el procedimiento anterior que usa un microorganismo,
se usan de forma intercambiable aquí.
Un medio, como se usa aquí para el procedimiento
anterior que usa un microorganismo, puede ser cualquier medio
adecuado para la producción de vitamina C. Típicamente, el medio es
un medio acuoso que comprende por ejemplo sales, sustrato o
sustratos, y un cierto pH. El medio en el que el sustrato se
convierte en vitamina C también se denomina como el medio de
producción.
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"Fermentación" o "producción" o
"procedimiento de fermentación", como se usa aquí, puede ser el
uso de células en crecimiento usando medios, condiciones y
procedimientos conocidos por la persona experta, o el uso de células
denominadas en reposo que no crecen, después de que se han
cultivado usando medios, condiciones y procedimientos conocidos por
la persona experta, en condiciones apropiadas para la conversión de
sustratos adecuados en productos deseados tales como vitamina C.
Preferiblemente, se usan células en reposo para la producción de
vitamina C.
La expresión "fermentación directa",
"producción directa", "conversión directa" y similar
quiere decir que un microorganismo es capaz de convertir un cierto
sustrato en un producto específico por medio de una o más etapas de
conversión biológicas, sin la necesidad de ninguna etapa de
conversión química adicional. Por ejemplo, la expresión
"conversión directa de D-sorbitol en vitamina
C" pretende describir un procedimiento en el que un
microorganismo está produciendo vitamina C, y en el que se ofrece
D-sorbitol como fuente de carbono, sin la necesidad
de una etapa de conversión química intermedia. Se prefiere un único
microorganismo capaz de fermentar directamente la vitamina C. Dicho
microorganismo se cultiva en condiciones que permiten tal conversión
a partir del sustrato como se define anteriormente.
En relación con el procedimiento anterior que
usa un microorganismo, se entiende que los microorganismos
mencionados anteriormente también incluyen sinónimos o basónimos de
tales especies que tienen las mismas propiedades fisiológicas, como
se define mediante el Código Internacional de Nomenclatura de
Procariotas. La nomenclatura de los microorganismos como se usa
aquí es la aceptada oficialmente (en la fecha de presentación de la
Solicitud de prioridad) por el International Committee on
Systematics of Prokaryotes y la Bacteriology and Applied
Microbiology Division de la International Union of Microbiological
Societies, y publicada por su vehículo de publicación oficial
International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology
(IJSEM). Se hace referencia particular a Urbance et al.,
IJSEM (2001) vol 51:1059-1070, con una notificación
de corrección en IJSEM (2001) vol 51:1231-1233, que
describe la reclasificación taxonómicamente de G. oxydans DSM
4025 como Ketogulonicigenium vulgare.
Como se usa aquí, células en reposo se refiere a
células de un microorganismo que son por ejemplo viables pero que
no crecen activamente, o que están creciendo a tasas de crecimiento
específicas bajas, por ejemplo tasas de crecimiento que son menores
de 0,02 h^{-1}, preferiblemente menores de 0,01 h^{-1}. Las
células que muestran las tasas de crecimiento anteriores se dice
que están en un "modo de célula en reposo".
El procedimiento de la presente invención según
lo anterior que usa un microorganismo se puede llevar a cabo en
diferentes etapas o fases: preferiblemente, el microorganismo se
cultiva en una primera etapa (también denominada como etapa (a) o
fase de crecimiento) en condiciones que permiten el crecimiento.
Esta fase se termina cambiando las condiciones, de forma que la
tasa de crecimiento del microorganismo se reduce, conduciendo a
células en reposo, también denominadas como etapa (b), seguido de la
producción de vitamina C a partir del sustrato usando (b), también
denominado como fase de producción.
La fase de crecimiento y de producción, como se
lleva a cabo en el procedimiento anterior usando un microorganismo,
se puede llevar a cabo en la misma vasija, es decir, sólo en
una vasija, o en dos o más vasijas diferentes, con una etapa de
separación celular opcional entre las dos fases. La vitamina C
producida se puede recuperar de las células por cualquier medio
adecuado. Recuperar significa, por ejemplo, que la vitamina C
producida se puede separar del medio de producción. Opcionalmente,
la vitamina C así producida se puede procesar posteriormente.
Para los fines de la presente invención que se
refiere al procedimiento anterior que usa un microorganismo, las
expresiones "fase de crecimiento", "etapa de crecimiento",
"etapa de crecimiento" y "período de crecimiento" se usan
aquí de forma intercambiable. Lo mismo se aplica para las
expresiones "fase de producción", "etapa de producción",
"período de producción".
Una manera de llevar a cabo el procedimiento
anterior que usa un microorganismo de la presente invención puede
ser un procedimiento en el que el microorganismo se hace crecer en
una primera vasija, la denominada vasija de crecimiento, como una
fuente para las células en reposo, y al menos parte de las células
se transfieren a una segunda vasija, la denominada vasija de
producción. Las condiciones en la vasija de producción pueden ser
tales que las células transferidas desde la vasija de crecimiento se
conviertan en células en reposo como se define anteriormente. La
vitamina C se produce en la segunda vasija y se recupera de
ella.
En relación con el procedimiento anterior que
usa un microorganismo, en un aspecto, la etapa de crecimiento se
puede llevar a cabo en un medio acuoso, es decir, el medio de
crecimiento, suplementado con nutrientes apropiados para el
crecimiento en condiciones aerobias. El cultivo se puede realizar,
por ejemplo, en modo discontinuo, discontinuo alimentado,
semicontinuo o continuo. El período de cultivo puede variar
dependiendo de, por ejemplo, el hospedante, el pH, la temperatura y
el medio nutriente a usar, y puede ser por ejemplo alrededor de 10
h hasta alrededor de 10 días, preferiblemente alrededor de 1 hasta
alrededor de 10 días, más preferiblemente alrededor de 1 hasta
alrededor de 5 días cuando se lleva a cabo en modo discontinuo o
discontinuo alimentado, dependiendo del microorganismo. Si las
células se hacen crecer en el modo continuo, el tiempo de
permanencia puede ser por ejemplo de alrededor de 2 a alrededor de
100 h, preferiblemente de alrededor de 2 a alrededor de 50 h,
dependiendo del microorganismo. Si el microorganismo se selecciona
de bacterias, el cultivo se puede realizar por ejemplo a un pH de
alrededor de 3,0 a alrededor de 9,0, preferiblemente alrededor de
4,0 a alrededor de 9,0, más preferiblemente alrededor de 4,0 a
alrededor de 8,0, incluso más preferiblemente alrededor de 5,0 a
alrededor de 8,0. Si se usan algas o levaduras, el cultivo se puede
realizar, por ejemplo, a un pH por debajo de alrededor de 7,0,
preferiblemente por debajo de alrededor de 6,0, más preferiblemente
por debajo de alrededor de 5,5, y lo más preferible por debajo de
alrededor de 5,0. Un intervalo de temperaturas adecuado para llevar
a cabo el cultivo usando bacterias puede ser por ejemplo de
alrededor de 13ºC hasta alrededor de 40ºC, preferiblemente desde
alrededor de 18ºC hasta alrededor de 37ºC, más preferiblemente desde
alrededor de 13ºC hasta alrededor de 36ºC, y lo más preferible
desde alrededor de 18ºC hasta alrededor de 33ºC. Si se usan algas o
levaduras, un intervalo adecuado de temperaturas para llevar a cabo
el cultivo puede ser por ejemplo desde alrededor de 15ºC hasta
alrededor de 40ºC, preferiblemente desde alrededor de 20ºC hasta
alrededor de 45ºC, más preferiblemente desde alrededor de 25ºC
hasta alrededor de 40ºC, incluso más preferiblemente desde
alrededor de 25ºC hasta alrededor de 38ºC, y lo más preferible desde
alrededor de 30ºC hasta alrededor de 38ºC. El medio de cultivo para
crecer puede contener habitualmente nutrientes tales como fuentes de
carbono asimilables, por ejemplo, glicerol,
D-manitol, D-sorbitol,
L-sorbosa, eritritol, ribitol, xilitol, arabitol,
inositol, dulcitol, D-ribosa,
D-fructosa, D-glucosa, sacarosa, y
etanol, preferiblemente L-sorbosa,
D-glucosa, D-sorbitol,
D-manitol, glicerol y etanol; y fuentes de nitrógeno
digeribles tales como sustancias orgánicas, por ejemplo,
peptina, extracto de levadura y aminoácidos. Los medios pueden tener
o no urea y/o licor de maíz fermentado y/o levadura de cocina.
También se pueden usar diversas sustancias inorgánicas como fuentes
nitrogenadas, por ejemplo, nitratos y sales de amonio.
Además, el medio de crecimiento puede contener habitualmente sales
inorgánicas, por ejemplo, sulfato de magnesio, sulfato de
manganeso, fosfato de potasio, y carbonato de calcio. Las células
obtenidas usando los procedimientos descritos anteriormente se
pueden cultivar entonces adicionalmente a esencialmente los mismos
modos, condiciones de temperatura y de pH como se describen
anteriormente, en presencia de sustratos tales como
D-sorbitol, L-sorbosa, o
D-glucosa, de tal manera que convierten
directamente estos sustratos en vitamina C. La incubación se puede
realizar en un medio rico en nitrógeno, que contiene, por ejemplo,
fuentes de nitrógeno orgánicas, por ejemplo, peptona,
extracto de levadura, levadura de cocina, urea, aminoácidos, y
licor de maíz fermentado, o fuentes de nitrógeno inorgánicas,
por ejemplo, nitratos y sales de amonio, en cuyo caso las
células serán capaces de crecer adicionalmente a la vez que
producen vitamina C. Como alternativa, la incubación se puede
realizar en un medio pobre en nitrógeno, en cuyo caso las células
no crecerán sustancialmente, y estarán en un modo de células en
reposo, o en un modo de biotransformación. En todos los caos, el
medio de incubación puede contener también sales inorgánicas,
por ejemplo, sulfato de magnesio, sulfato de manganeso,
fosfato de potasio, y cloruro de calcio.
En relación con el procedimiento anterior que
usa un microorganismo, en la fase de crecimiento las tasas de
crecimiento específicas son por ejemplo al menos 0,02 h^{-1}. Para
células que crecen en modo discontinuo, discontinuo alimentado o
semicontinuo, la tasa de crecimiento depende por ejemplo de la
composición del medio de crecimiento, del pH, de la temperatura, y
similar. En general, las tasas de crecimiento pueden estar por
ejemplo en un intervalo desde alrededor de 0,05 hasta alrededor de
0,2 h^{-1}, preferiblemente desde alrededor de 0,06 hasta
alrededor de 0,15 h^{-1}, y lo más preferible desde alrededor de
0,07 hasta alrededor de 0,13 h^{-1}.
En otro aspecto del procedimiento anterior que
usa un microorganismo, las células en reposo se pueden proporcionar
mediante cultivo del microorganismo respectivo sobre placas de agar
que sirven así como vasija de crecimiento, usando esencialmente las
mismas condiciones, por ejemplo, período de cultivo, pH,
temperatura, medio nutriente como se describe anteriormente, con la
adición de agar agar.
En relación con el procedimiento anterior que
usa un microorganismo, si la fase de crecimiento y de producción se
llevan a cabo en dos vasijas distintas, entonces las células
procedentes de la fase de crecimiento se pueden cosechar o
concentrar y se pueden transferir a una segunda vasija, la
denominada vasija de producción. Esta vasija puede contener un
medio acuoso suplementado con cualquier sustrato de producción
aplicable que puede ser convertido en vitamina C por las células.
Las células procedentes de la vasija de crecimiento se pueden
cosechar o concentrar mediante cualquier operación adecuada, tal
como por ejemplo centrifugación, ultrafiltración o microfiltración
tangencial a través de membrana, filtración, decantación,
floculación. Las células así obtenidas también se pueden transferir
a la vasija de producción en forma del caldo original procedente de
la vasija de crecimiento, sin ser cosechadas, concentradas o
lavadas, es decir, en forma de una suspensión celular. En
una realización preferida, las células se transfieren desde la
vasija de crecimiento a la vasija de producción en forma de una
suspensión celular sin ninguna etapa de lavado o aislamiento entre
medias.
De este modo, en una realización preferida del
procedimiento anterior que usa un microorganismo, la etapa (a) y
(c) del procedimiento de la presente invención como se describe
anteriormente no están separadas por ninguna etapa de lavado ni de
separación.
En relación con el procedimiento anterior que
usa un microorganismo, si la fase de crecimiento y de producción se
llevan a cabo en la misma vasija, las células se pueden hacer crecer
en condiciones apropiadas hasta la densidad celular deseada,
seguido de una sustitución del medio de crecimiento por el medio de
producción que contiene el sustrato de producción. Tal sustitución
puede ser, por ejemplo, alimentar el medio de producción a la
vasija al mismo tiempo y velocidad que la retirada o cosecha del
sobrenadante de la vasija. Para mantener las células en reposo en
la vasija, se pueden usar operaciones para el reciclado o retención
de las células, tales como por ejemplo etapas de reciclado de las
células. Tales etapas de reciclado, por ejemplo, incluyen pero no
se limitan a métodos que usan centrifugadoras, filtros,
microfiltración tangencial a través de membranas de etapas de
ultrafiltración, reactores de membrana, floculación, o
inmovilización celular en matrices porosas, no porosas o
poliméricas apropiadas. Después de una fase de transición, la vasija
se lleva a las condiciones del proceso en las cuales las células
están en un modo de células en reposo como se define anteriormente,
y el sustrato de producción se convierte eficazmente en vitamina
C.
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El medio acuoso en la vasija de producción como
se usa para la etapa de producción en relación con el procedimiento
anterior que usa un microorganismo, en lo sucesivo denominado medio
de producción, puede contener sólo el sustrato o sustratos de
producción que se van a convertir en vitamina C, o puede contener
por ejemplo sales inorgánicas adicionales, por ejemplo,
cloruro de sodio, cloruro de calcio, sulfato de magnesio, sulfato
de manganeso, fosfato de potasio, fosfato de calcio, y carbonato de
calcio. El medio de producción también puede contener fuentes de
nitrógeno digeribles, tales como por ejemplo sustancias orgánicas,
por ejemplo, peptona, extracto de levadura, urea,
aminoácidos, y licor de maíz fermentado, y sustancias inorgánicas,
por ejemplo amoníaco, sulfato de amonio, y nitrato de sodio,
a concentraciones tales que las células se mantengan en un modo de
célula en reposo como se define anteriormente. El medio puede tener
o no urea y/o licor de maíz fermentado y/o levadura de cocina. La
etapa de producción se puede llevar a cabo por ejemplo en modo
discontinuo, discontinuo alimentado, semicontinuo o continuo. En
caso de modo discontinuo alimentado, semicontinuo o continuo, tanto
las células procedentes de la vasija de crecimiento como el medio de
producción se pueden alimentar continua o intermitentemente a la
vasija de producción a velocidades apropiadas de alimentación. Como
alternativa, sólo el medio de producción se puede alimentar
continua o intermitentemente a la vasija de producción, mientras
que las células que provienen de la vasija de crecimiento se
transfieren de una sola vez a la vasija de producción. Las células
que provienen de la vasija de crecimiento se pueden usar como una
suspensión celular en la vasija de producción, o se pueden usar por
ejemplo como células floculadas o inmovilizadas en cualquier fase
sólida tal como matrices porosas o poliméricas. El período de
producción, definido como el período transcurrido entre la entrada
del sustrato a la vasija de producción y la cosecha del sobrenadante
que contiene vitamina C, la denominada corriente de cosecha, puede
variar dependiendo por ejemplo del tipo y concentración de células,
del pH, de la temperatura y del medio nutriente a usar, y es
preferiblemente alrededor de 2 a alrededor de 100 h. El pH y la
temperatura pueden ser diferentes del pH y la temperatura de la
etapa de crecimiento, pero esencialmente es el mismo que para la
etapa de crecimiento.
En una realización preferida del procedimiento
anterior que usa un microorganismo, la etapa de producción se lleva
a cabo en modo continuo, queriendo decir que una primera corriente
de alimentación que contiene las células procedentes de la vasija
de crecimiento, y una segunda corriente de alimentación que contiene
el sustrato, se alimentan continua o intermitentemente a la vasija
de producción. La primera corriente puede contener sólo las células
aisladas/separadas del medio de crecimiento o una suspensión
celular, proveniente directamente de la etapa de crecimiento, es
decir, células suspendidas en medio de crecimiento, sin ninguna
etapa intermedia de separación, lavado y/o aislamiento celular. La
segunda corriente de alimentación como se define aquí puede incluir
todas las otras corrientes de alimentación necesarias para el
funcionamiento de la etapa de producción, por ejemplo el
medio de producción que comprende el sustrato en forma de una o
varias corrientes diferentes, agua para dilución, y base para el
control del
pH.
pH.
En relación con el procedimiento anterior que
usa un microorganismo, cuando ambas corrientes se alimentan
continuamente, la relación de la velocidad de alimentación de la
primera corriente a la velocidad de alimentación de la segunda
corriente puede variar entre alrededor de 0,01 y alrededor de 10,
preferiblemente entre alrededor de 0,01 y alrededor de 5, lo más
preferible entre alrededor de 0,02 y alrededor de 2. Esta relación
depende de la concentración de células y sustrato en la corriente
primera y segunda, respectivamente.
Otra manera de llevar a cabo el procedimiento
según lo anterior que usa un microorganismo de la presente invención
puede ser un procedimiento que usa una cierta densidad celular de
células en reposo en la vasija de producción. La densidad celular
se mide como unidades de absorbancia (densidad óptica) a 600 nm
mediante métodos conocidos por la persona experta. En una
realización preferida, la densidad celular en la etapa de producción
es al menos alrededor de 10, más preferiblemente entre alrededor de
10 y alrededor de 200, incluso más preferiblemente entre alrededor
de 15 y alrededor de 200, incluso más preferiblemente entre
alrededor de 15 y alrededor de 120, y lo más preferible entre
alrededor de 20 y alrededor de 120.
En relación con el procedimiento anterior que
usa un microorganismo, a fin de mantener las células en la vasija
de producción a la densidad celular deseada durante la fase de
producción como se lleva a cabo, por ejemplo, en modo continuo o
semicontinuo, se puede usar cualquier medio conocido en la técnica,
tal como por ejemplo el reciclaje celular mediante centrifugación,
filtración, ultrafiltración tangencial en membrana de
microfiltración, decantación, floculación, retención celular en la
vasija mediante dispositivos membránicos, o inmovilización celular.
Además, en el caso de que la etapa de producción se lleve a cabo en
modo continuo o semicontinuo y las células se alimenten continua o
intermitentemente desde la vasija de crecimiento, la densidad
celular en la vasija de producción se puede mantener a un nivel
constante, por ejemplo, cosechando una cantidad de células desde la
vasija de producción que corresponde a la cantidad de células que se
alimenta desde la vasija de crecimiento.
En relación con el procedimiento anterior que
usa un microorganismo, la vitamina C producida, contenida en la
denominada corriente de cosecha, se recupera/cosecha desde la vasija
de producción. La corriente de cosecha puede incluir, por ejemplo,
una disolución acuosa libre de células o que contiene células que
proviene de la vasija de producción, la cual contiene vitamina C
como resultado de la conversión del sustrato de producción mediante
las células en reposo en la vasija de producción. Las células
todavía presentes en la corriente de cosecha se pueden separar de
la vitamina C mediante cualesquiera operaciones conocidas en la
técnica, tales como por ejemplo filtración, centrifugación,
decantación, ultrafiltración o microfiltración tangencial en
membrana, ultrafiltración o microfiltración tangencial, o filtración
frontal. Después de esta operación de separación celular, la
corriente de cosecha está esencialmente libre de células.
En un aspecto adicional, el procedimiento de la
presente invención se puede combinar con otras etapas de separación
y/o purificación de la vitamina C producida de los otros componentes
contenidos en la corriente de cosecha, es decir, con las
denominadas etapas de procesamiento aguas abajo. Estas etapas pueden
incluir cualquier medio conocido por una persona experta, tal como,
por ejemplo, concentración, cristalización, precipitación,
adsorción, intercambio iónico, electrodiálisis, electrodiálisis con
membranas bipolares, y/u ósmosis inversa. La vitamina C se puede
purificar posteriormente como la forma de ácido libre o cualquiera
de sus formas salinas conocidas por medio de operaciones tales
como, por ejemplo, tratamiento con carbón activo, intercambio
iónico, adsorción y elución, concentración, cristalización,
filtración y secado. Específicamente, una primera separación de
vitamina C de los otros componentes en la corriente de cosecha se
pueden llevar a cabo mediante cualquier combinación o repetición
adecuada de, por ejemplo, los siguientes métodos: electrodiálisis de
dos o tres compartimientos, electrodiálisis con membranas
bipolares, ósmosis inversa o adsorción sobre, por ejemplo, resinas
de intercambio iónico o resinas no iónicas. Si la forma resultante
de la vitamina C es una sal de ácido L-ascórbico, la
conversión de la forma salina en la forma de ácido libre se puede
llevar a cabo por ejemplo mediante electrodiálisis con membranas
bipolares, intercambio iónico, técnicas cromatográficas en lecho
móvil simulado, y similares. También se puede usar la combinación
de las etapas mencionadas, por ejemplo, electrodiálisis y
electrodiálisis con membranas bipolares, en una sola etapa, así
como la combinación de las etapas mencionadas, por ejemplo,
varias etapas de intercambio iónico, usando métodos cromatográficos
de lecho móvil simulado. Cualquiera de estos procedimientos solos o
en combinación constituyen un medio conveniente para aislar y
purificar el producto, es decir, vitamina C. El producto así
obtenido se puede aislar adicionalmente de una manera tal como,
por ejemplo, mediante concentración, cristalización,
precipitación, lavado y secado de los cristales, y/o se puede
purificar adicionalmente, por ejemplo, mediante tratamiento con
carbón activo, intercambio iónico y/o recristalización.
En una realización preferida, la vitamina C se
purifica de la corriente de cosecha mediante una serie de etapas de
procesamiento aguas abajo como se describe anteriormente sin tener
que ser transferida a una disolución no acuosa en ningún momento de
este procesamiento, es decir, todas las etapas se llevan a
cabo en un entorno acuoso. Tal procedimiento de procesamiento aguas
abajo preferido puede incluir por ejemplo la concentración de la
corriente de cosecha que proviene de la vasija de producción por
medio de electrodiálisis de dos o tres compartimientos, la
conversión de la vitamina C en su forma salina presente en la
disolución concentrada en su forma ácida por medio de
electrodiálisis con membranas bipolares y/o intercambio iónico, la
purificación mediante métodos tales como por ejemplo tratamiento
con carbón activo, intercambio iónico o resinas no iónicas, seguido
de una etapa de concentración adicional y cristalización. Estos
cristales se pueden separar, lavar y secar. Si es necesario, los
cristales se pueden resolubilizar nuevamente en agua, se pueden
tratar con carbón activo y/o resinas de intercambio iónico, y se
pueden recristalizar. Estos cristales se pueden entonces separar,
lavar y secar.
Realizaciones ventajosas de la invención serán
evidentes a partir de las reivindicaciones dependientes. Estos y
otros aspectos y realizaciones de la presente invención deberían de
ser manifiestos para los expertos en la técnica a partir de las
enseñanzas aquí.
La secuencia del gen que comprende una secuencia
nucleotídica según SEQ ID NO:1 que codifica una proteína SMS 37 se
determinó secuenciando un clon genómico obtenido de Gluconobacter
oxydans DSM 17078.
La invención también se refiere a un
polinucleótido que codifica al menos un fragmento biológicamente
activo o derivado de un polipéptido SMS 37 como se muestra en SEQ
ID NO:2.
Como se usa aquí, "fragmento biológicamente
activo o derivado" significa un polipéptido que retiene
esencialmente la misma función o actividad biológica que el
polipéptido mostrado en SEQ ID NO:2. Los ejemplos de actividad
biológica pueden ser por ejemplo actividad enzimática, actividad de
señalización o reactividad a anticuerpos. La expresión "misma
función biológica" o "equivalente funcional", como se usa
aquí, significa que la proteína tiene esencialmente la misma
actividad biológica, por ejemplo enzimática, de señalización
o de reactividad a anticuerpos, que un polipéptido mostrado en SEQ
ID NO:2.
Los polipéptidos y polinucleótidos de la
presente invención se proporcionan preferiblemente en una forma
aislada, y preferiblemente se purifican hasta homogeneidad.
El término "aislado" significa que el
material se elimina de su entorno original (por ejemplo, el
entorno natural si es de origen natural). Por ejemplo, un
polinucleótido o polipéptido de origen natural presente en un
microorganismo vivo no está aislado, pero el mismo polinucleótido o
polipéptido, separado de algunos o todos los materiales
coexistentes en el sistema natural, sí está aislado. Tales
polinucleótidos podrían ser parte de un vector, y/o tales
polinucleótidos o polipéptidos podrían ser parte de una composición
y todavía estar aislados por cuanto tal vector o composición no es
parte de su entorno natural.
Un polinucleótido o ácido nucleico aislado como
se usa aquí puede ser un ADN o ARN que no es inmediatamente
contiguo a ambas de las secuencias codificantes con las que sí es
inmediatamente contiguo (una en el extremo 5' y la otra en el
extremo 3') en el genoma de origen natural del organismo del que
deriva. De este modo, en una realización, un ácido nucleico incluye
algunas o todas las secuencias no codificantes (por ejemplo,
promotoras) en 5' que son inmediatamente contiguas a la secuencia
codificante. La expresión "polinucleótido aislado" incluye por
lo tanto, por ejemplo, un ADN recombinante que se incorpora en un
vector, en un plásmido o virus que se replica autónomamente, o en
el ADN genómico de una procariota o eucariota, o que existe como
una molécula separada (por ejemplo, un ADNc o un fragmento de
ADN genómico producido mediante PCR o tratamiento con endonucleasas
de restricción) independiente de otras secuencias. También incluye
un ADN recombinante que es parte de un gen híbrido que codifica un
polipéptido adicional que está sustancialmente libre de material
celular, material vírico, o medio de cultivo (cuando se produce
mediante técnicas de ADN recombinante), o precursores químicos u
otros compuestos químicos (cuando se sintetiza químicamente).
Además, un "fragmento de ácido nucleico aislado" es un
fragmento de ácido nucleico que no se produce de origen natural como
un fragmento, y no se encontraría en el estado natural.
Como se usa aquí, las expresiones
"polinucleótido", "gen" y "gen recombinante" se
refieren a moléculas de ácido nucleico que se pueden aislar a
partir de ADN cromosómico, que incluye un marco de lectura abierto
que codifica una proteína, por ejemplo proteínas STS de
G. oxydans DSM 17078. Un polinucleótido puede incluir una
secuencia polinucleotídica como se muestra en SEQ ID NO:1 o sus
fragmentos, y regiones en dirección 5' y en dirección 3' de las
secuencias génicas, que pueden incluir, por ejemplo, regiones
promotoras, regiones reguladoras y regiones terminadoras,
importantes para la expresión y estabilización apropiadas del
polipéptido derivado del mismo.
Un gen puede incluir secuencias codificantes,
secuencias no codificantes tales como, por ejemplo, secuencias no
traducidas localizadas en los extremos 3' y 5' de la región
codificante de un gen, y secuencias reguladoras. Además, un gen se
refiere a una molécula de ácido nucleico aislada como se define
aquí. Se aprecia además por la persona experta que pueden existir
dentro de la población, por ejemplo, la población de
Gluconobacter oxydans, polimorfismos de secuencia de ADN que
conducen a cambios en las secuencias de aminoácidos de las
proteínas del SMS. Tal polimorfismo genético en el gen de SMS 37
puede existir entre individuos en una población debido a variación
natural, o en células procedentes de diferentes poblaciones. Tales
variaciones naturales pueden dar como resultado típicamente una
varianza de 1-5% en la secuencia nucleotídica del
gen de SMS 37. Cualquiera y todas las tales variaciones
nucleotídicas y el polimorfismo de aminoácidos resultante en SMS
37, que son el resultado de la variación natural y que no alteran la
actividad funcional de las proteínas del SMS están destinados a
estar dentro del alcance de la
invención.
invención.
Como se usa aquí, las expresiones
"polinucleótido" o "molécula de ácido nucleico" pretenden
incluir moléculas de ADN (por ejemplo, ADNc o ADN genómico)
y moléculas de ARN (por ejemplo, ARNm) y análogos del ADN o
ARN generados usando análogos nucleotídicos. La molécula de ácido
nucleico puede ser monocatenaria o bicatenaria, pero es
preferiblemente ADN bicatenario. El ácido nucleico se puede
sintetizar usando análogos oligonucleotídicos o derivados (por
ejemplo, nucleótidos de inosina o de fosforotioato). Tales
oligonucleótidos se pueden usar, por ejemplo, para preparar ácidos
nucleicos que tienen capacidades alteradas de emparejamiento de
bases, o resistencia aumentada a nucleasas.
La información de secuencias como se proporciona
aquí no se debería de interpretar de forma tan estrecha como para
necesitar la inclusión de bases erróneamente identificadas. Las
secuencias específicas descritas aquí se pueden usar fácilmente
para aislar el gen completo a partir de un microorganismo
recombinante o no recombinante capaz de convertir una fuente de
carbono dada directamente en vitamina C, en particular
Gluconobacter oxydans, preferiblemente Gluconobacter
oxydans DSM 17078, las cuales a su vez se pueden someter fácilmente
a análisis de secuencia adicionales, identificando de ese modo
errores de secuenciación.
Excepto que se indique de otro modo, todas las
secuencias nucleotídicas determinadas secuenciando una molécula de
ADN aquí se determinaron usando un secuenciador de ADN automatizado,
y todas las secuencias de aminoácidos de polipéptidos codificados
por moléculas de ADN determinadas aquí se predijeron mediante
traducción de una secuencia de ADN determinada como antes. Por lo
tanto, como es sabido en la técnica, para cualquier secuencia de
ADN determinada mediante este enfoque automatizado, cualquier
secuencia nucleotídica determinada aquí puede contener algunos
errores. Las secuencias nucleotídicas determinadas mediante
automatización son típicamente al menos alrededor de 90% idénticas,
más típicamente al menos alrededor de 95% a al menos alrededor de
99,9% idénticas a la secuencia nucleotídica real de la molécula de
ADN secuenciada. La secuencia real se puede determinar de forma más
precisa mediante otros enfoques, incluyendo métodos de secuenciación
de ADN manuales bien conocidos en la técnica. Como también es
sabido en la técnica, una inserción o supresión individual en una
secuencia nucleotídica determinada, en comparación con la secuencia
real, provocará un desplazamiento del marco en la traducción de la
secuencia nucleotídica, de forma que la secuencia de aminoácidos
predicha, codificada por una secuencia nucleotídica determinada,
será completamente diferente de la secuencia de aminoácidos
realmente codificada por la molécula de ADN secuenciada, comenzando
en el punto de tal inserción o supresión.
La persona experta en la técnica es capaz de
identificar tales bases erróneamente identificadas, y sabe cómo
corregir tales errores.
Una molécula de ácido nucleico que engloba toda
o una porción de la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:1
también se puede aislar mediante reacción en cadena de la polimerasa
(PCR) usando cebadores oligonucleotídicos sintéticos diseñados
basándose en la información de secuencias contenida aquí.
Un ácido nucleico de la invención se puede
amplificar usando como molde ADNc, ARNm, o, como alternativa, ADN
genómico, y cebadores oligonucleotídicos apropiados según técnicas
de amplificación mediante PCR estándar. El ácido nucleico así
amplificado se puede clonar en un vector apropiado, y se puede
caracterizar mediante análisis de secuencia de ADN.
Los fragmentos de un polinucleótido según la
invención también pueden comprender polinucleótidos que no codifican
polipéptidos funcionales. Tales polipéptidos pueden funcionar como
sondas o cebadores para una reacción de PCR.
Los ácidos nucleicos según la invención,
independientemente de si codifican polipéptidos funcionales o no
funcionales, se pueden usar como sondas de hibridación o cebadores
para la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Los usos de las
moléculas de ácido nucleico de la presente invención que no
codifican un polipéptido que tiene una actividad de SMS 37
incluyen, entre otros, (1) aislar el gen que codifica la proteína de
la presente invención, o sus variantes alélicas, a partir de una
librería de ADNc, por ejemplo, a partir de organismos
distintos de Gluconobacter oxydans, y (2) el análisis de
transferencia Northern para detectar la expresión de ARNm de dicha
proteína en células específicas, o (3) el uso en potenciar y/o
mejorar la función o actividad de genes de SMS 37 homólogos en
dichos otros organismos.
Las sondas basadas en las secuencias
nucleotídicas proporcionadas aquí se pueden usar para detectar
transcriptos o secuencias genómicas que codifican las mismas
proteínas o proteínas homólogas, por ejemplo, en otros organismos.
Las moléculas de ácido nucleico que corresponden a variantes
naturales y homólogos no G. oxydans del ADN de SMS 37 de
G. oxydans de la invención, que también están abarcadas por
la presente invención, se pueden aislar basándose en su homología
con el ácido nucleico de SMS 37 de G. oxydans descrito aquí
usando como sonda de hibridación el ADN de G. oxydans, o una
porción del mismo, según técnicas de hibridación estándar,
preferiblemente en condiciones de hibridación muy restrictivas.
En realizaciones preferidas, la sonda comprende
además un grupo marcador unido a ella, por ejemplo, el grupo
marcador puede ser un radioisótopo, un compuesto fluorescente, una
enzima, o un cofactor enzimático.
Las secuencias génicas homólogas se pueden
aislar, por ejemplo, llevando a cabo una PCR usando dos conjuntos
de cebadores oligonucleotídicos degenerados diseñados en base a las
secuencias nucleotídicas como se enseñan
aquí.
aquí.
El molde para la reacción puede ser ADNc
obtenido mediante transcripción inversa de ARNm preparado a partir
de cepas que se sabe o se sospecha que expresan un polinucleótido
según la invención. El producto de la PCR se puede subclonar y
secuenciar para asegurarse de que las secuencias amplificadas
representan las secuencias de una nueva secuencia de ácido nucleico
como se describe aquí, o un equivalente funcional de la misma.
El fragmento de la PCR se puede usar entonces
para aislar un clon de ADNc de longitud completa mediante una
variedad de métodos conocidos. Por ejemplo, el fragmento amplificado
se puede marcar y usar para escoger una genoteca de ADNc de
bacteriófago o de cósmido. Como alternativa, el fragmento marcado se
puede usar para escoger una genoteca genómica.
La tecnología de la PCR también se puede usar
para aislar secuencias de ADNc de longitud completa procedentes de
otros organismos. Por ejemplo, el ARN se puede aislar, siguiendo
procedimientos estándar, a partir de una fuente celular o tisular
apropiada. Una reacción de transcripción inversa se puede llevar a
cabo sobre el ARN usando un cebador oligonucleotídico específico
para el extremo 5' más alejado del fragmento amplificado, para
cebar la síntesis de la primera hebra.
Al híbrido de ARN/ADN resultante se le puede
añadir entonces una "cola" (por ejemplo, con guaninas)
usando una reacción de transferasa terminal estándar, el híbrido se
puede digerir con RNasaH, y entonces se puede cebar la síntesis de
la segunda hebra (por ejemplo, con un cebador
poly-C). De este modo, las secuencias de ADNc en
dirección 5' del fragmento amplificado se pueden aislar fácilmente.
Para un repaso de las estrategias útiles de clonación, véase por
ejemplo Sambrook et al., más arriba; y Ausubel et
al., más arriba.
También, los ácidos nucleicos que codifican
otros miembros de la familia de SMS 37, que de este modo tienen una
secuencia nucleotídica que difiere de una secuencia nucleotídica
según SEQ ID NO:1, están dentro del alcance de la invención.
Además, los ácidos nucleicos que codifican proteínas de SMS 37 a
partir de diferentes especies, que de este modo pueden tener una
secuencia nucleotídica que difiere de una secuencia nucleotídica
mostrada en SEQ ID NO:1, están dentro del alcance de la
invención.
La invención también se refiere a un
polinucleótido aislado hibridable en condiciones restrictivas.
Preferiblemente en condiciones muy restrictivas, a un
polinucleótido según la presente invención, tal como por ejemplo un
polinucleótido mostrado en SEQ ID NO:1. Ventajosamente, tal
polinucleótido se puede obtener a partir de un microorganismo capaz
de convertir directamente una fuente de carbono dada en vitamina C,
en particular Gluconobacter oxydans, preferiblemente
Gluconobacter oxydans DSM 17078.
Como se usa aquí, el término "hibridar"
pretende describir condiciones para la hibridación y lavado bajo
las cuales las secuencias nucleotídicas al menos alrededor de 70%,
más preferiblemente al menos alrededor de 80%, incluso más
preferiblemente al menos alrededor de 85% a 90%, lo más preferible
al menos 95% homólogas entre sí permanecen típicamente hibridadas
entre sí.
\newpage
En una realización, un ácido nucleico de la
invención es al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%,
95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o más, homólogo a una secuencia de ácido
nucleico mostrada en SEQ ID NO:1 o el complemento de la misma.
Un ejemplo preferido, no limitante de
condiciones de hibridación restrictivas es la hibridación en 6 x
cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) a alrededor de 45ºC,
seguido de uno o más lavados en 1 x SSC, 0,1% de SDS a 50ºC,
preferiblemente a 55ºC, más preferiblemente a 60ºC, e incluso más
preferiblemente a 65ºC.
Las condiciones muy restrictivas incluyen
incubaciones a 42ºC durante un período de varios días, tales como
2-4 días, usando una sonda de ADN marcada, tal como
una sonda de ADN marcada con digoxigenina (DIG), seguido de uno o
más lavados en 2 x SSC, 0,1% de SDS a temperatura ambiente, y uno o
más lavados en 0,5 x SSC, 0,1% de SDS, o 0,1 x SSC, 0,1% de SDS a
65-68ºC. En particular, las condiciones muy
restrictivas incluyen, por ejemplo, una incubación durante 2 h a 4
días a 42ºC usando una sonda de ADN marcada con DIG (preparada,
por ejemplo, usando un sistema de marcado con DIG; Roche
Diagnostics GmbH, 68298 Mannheim, Alemania) en una disolución tal
como disolución DigEasyHyb (Roche Diagnostics GmbH) con o sin 100
\mug/ml de ADN de esperma de salmón, o una disolución que
comprende formamida al 50%, 5 x SSC (150 mM de NaCl, 15 mM de
citrato de trisodio), dodecilsulfato de sodio al 0,02%,
N-lauroilsarcosina al 0,1%, y 2% de reactivo
bloqueante (Roche Diagnostics GmbH), seguido del lavado de los
filtros dos veces durante 5 a 15 minutos en 2 x SSC y 0,1% de SDS a
temperatura ambiente, y después lavando dos veces durante
15-30 minutos en 0,5 x SSC y 0,1% de SDS, o 0,1 x
SSC y 0,1% de SDS a
65-68ºC.
65-68ºC.
Preferiblemente, una molécula de ácido nucleico
aislada de la invención que se hibrida en condiciones
preferiblemente muy restrictivas a una secuencia nucleotídica de la
invención corresponde a una molécula de ácido nucleico de origen
natural. Como se usa aquí, una molécula de ácido nucleico "de
origen natural" se refiere a una molécula de ARN o de ADN que
tiene una secuencia nucleotídica que se produce en la naturaleza
(por ejemplo, codifica una proteína natural). En una
realización, el ácido nucleico codifica una proteína de SMS 37 de
G. oxydans
natural.
natural.
El experto sabrá qué condiciones aplicar para
las condiciones de hibridación restrictivas y muy restrictivas. En
la técnica hay fácilmente disponible una guía adicional que se
refiere a tales condiciones, por ejemplo en Sambrook et al.,
1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor
Press, N. Y.; y Ausubel et al. (eds. ), 1995, Current
Protocols in Molecular Biology, (John Wiley & Sons, N. Y.). Por
supuesto, un polinucleótido que se hibrida sólo a una secuencia
poly (A) (tal como el área poly (A) 3'-terminal de
los ARNm), o a un tramo complementario de restos de T (o U), no
estaría incluido en un polinucleótido de la invención usado para
hibridarse específicamente a una porción de un ácido nucleico de la
invención, puesto que tal polinucleótido se hibridaría a cualquier
molécula de ácido nucleico que contenga un tramo poly (A) o su
complemento (por ejemplo, prácticamente cualquier clon de
ADNc bicatenario).
En un enfoque típico, se pueden detectar
bibliotecas de ADN genómico o ADNc construidas a partir de otros
organismos, por ejemplo microorganismos capaces de convertir
directamente una fuente dada de carbono en vitamina C, en
particular otra especie de Gluconobacter.
Por ejemplo, se pueden seleccionar cepas de
Gluconobacter en busca de polinucleótidos homólogos mediante
análisis de transferencia Southern y/o Northern. Al detectar
transcriptos homólogos a polinucleótidos según la invención, se
pueden construir bibliotecas de ADN a partir de ARN aislado de la
cepa apropiada, utilizando técnicas estándar bien conocidas por los
expertos en la técnica. Como alternativa, se puede identificar una
biblioteca de ADN genómico total usando una sonda hibridable a un
polinucleótido según la invención.
Una molécula de ácido nucleico de la presente
invención, tal como por ejemplo una molécula de ácido nucleico
mostrada en SEQ ID NO:1 o un fragmento o derivado de la misma, se
puede aislar usando técnicas de biología molecular estándar y la
información de secuencias proporcionada aquí. Por ejemplo, usando
como sonda de hibridación toda o una porción de la secuencia de
ácido nucleico mostrada en SEQ ID NO:1, se pueden aislar moléculas
de ácido nucleico según la invención usando técnicas de hibridación
y clonación estándar (por ejemplo, como se describe en
Sambrook, J., Fritsh, E. F., y Maniatis, T. Molecular Cloning: A
Laboratory Manual. 2ª, ed. , Cold Spring Harbor Laboratory, Cold
Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989).
Además, los oligonucleótidos que corresponden a
o que son hibridables a secuencias nucleotídicas según la invención
se pueden preparar mediante técnicas sintéticas estándar, por
ejemplo, usando un sintetizador de ADN automatizado.
Las expresiones "homología" o "porcentaje
de identidad" se usan aquí de forma intercambiable. Para los
fines de esta invención, se define aquí que, a fin de determinar el
porcentaje de identidad de dos secuencias de aminoácidos o de dos
secuencias de ácido nucleico, las secuencias están alineadas con
fines de comparación óptima (por ejemplo, se pueden
introducir saltos en la secuencia de una primera secuencia de
aminoácidos o de ácido nucleico para el alineamiento óptimo con una
segunda secuencia de aminoácidos o de ácido nucleico). Entonces se
comparan los restos de aminoácidos o nucleótidos en las posiciones
de aminoácidos o posiciones nucleotídicas correspondientes. Cuando
una posición en la primera secuencia está ocupada por el mismo resto
de aminoácido o nucleótido que la posición correspondiente en la
segunda secuencia, entonces las moléculas son idénticas en esa
posición. El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es
función del número de posiciones idénticas compartidas por las
secuencias (es decir, % de identidad = número de posiciones
idénticas/número total de posiciones (es decir, posiciones
que solapan) x 100). Preferiblemente, las dos secuencias tienen la
misma longitud.
La persona experta será consciente del hecho de
que existen varios programas de ordenador diferentes para
determinar la homología entre dos secuencias. Por ejemplo, una
comparación de secuencias y la determinación del porcentaje de
identidad entre dos secuencias se puede lograr usando un algoritmo
matemático. En una realización preferida, el porcentaje de
identidad entre dos secuencias de aminoácidos se determina usando el
algoritmo de Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol. (48):
444-453 (1970)), que se ha incorporado en el
programa GAP en el paquete de programación GCG (disponible en
http://www.accelrys.com), usando una matriz Blossom 62 o una
matriz PAM250, y un peso de salto de 16, 14, 12, 10, 8, 6 o 4 y un
peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5 o 6. La persona experta apreciará
que todos estos parámetros diferentes producirán resultados
ligeramente diferentes, pero que el porcentaje global de identidad
de las dos secuencias no se ve significativamente alterado cuando se
usan algoritmos diferentes.
En aún otra realización, el porcentaje de
identidad entre dos secuencias nucleotídicas se determina usando el
programa GAP en el paquete de programación GCG (disponible en
http://www.accelrys.com), usando una matriz NWSgapdna.CMP y
un peso de salto de 40, 50, 60, 70 u 80 y un peso de longitud de 1,
2, 3, 4, 5 o 6. En otra realización, el porcentaje de identidad
entre dos secuencias de aminoácidos o nucleotídicas se determina
usando el algoritmo de E. Meyers y W. Miller (CABIOS, 4:
11-17 (1989) que se ha incorporado en el programa
ALIGN (versión 2.0) (disponible en
http://vega.igh.cnrs.fr/bin/align-guess.cgi)
usando una tabla de residuos de peso PAM120, una penalización de
longitud de salto de 12, y una penalización de salto de 4.
Las secuencias de ácido nucleico y proteínica de
la presente invención se pueden usar adicionalmente como una
"secuencia de interrogación" para llevar a cabo una búsqueda
frente a bases de datos públicas para, por ejemplo, identificar
otros miembros de la familia o secuencias relacionadas. Tales
búsquedas se pueden llevar a cabo usando los programas BLASTN y
BLASTX (versión 2.0) de Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol.
215:403-10. Las búsquedas nucleotídicas de BLAST se
pueden llevar a cabo con el programa BLASTN, puntuación = 100,
longitud de la palabra =
12 para obtener secuencias nucleotídicas homólogas a las moléculas de ácido nucleico de la presente invención. Las búsquedas de proteínas BLAST se pueden llevar a cabo con el programa BLASTX, puntuación = 50, longitud de la palabra = 3 para obtener secuencias de aminoácidos homólogas a las moléculas proteínicas de la presente invención. Para obtener alineamientos con saltos con fines comparativos, se puede utilizar Gapped BLAST como se describe en Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25 (17): 3389-3402. Cuando se utilizan los programas BLAST y Gapped BLAST, se pueden usar los parámetros por defecto de los programas respectivos (por ejemplo, BLASTX y BLASTN). Véase http://www.ncbi.nlm.nih.gov.
12 para obtener secuencias nucleotídicas homólogas a las moléculas de ácido nucleico de la presente invención. Las búsquedas de proteínas BLAST se pueden llevar a cabo con el programa BLASTX, puntuación = 50, longitud de la palabra = 3 para obtener secuencias de aminoácidos homólogas a las moléculas proteínicas de la presente invención. Para obtener alineamientos con saltos con fines comparativos, se puede utilizar Gapped BLAST como se describe en Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25 (17): 3389-3402. Cuando se utilizan los programas BLAST y Gapped BLAST, se pueden usar los parámetros por defecto de los programas respectivos (por ejemplo, BLASTX y BLASTN). Véase http://www.ncbi.nlm.nih.gov.
En otra realización preferida, una molécula de
ácido nucleico aislada de la invención comprende una molécula de
ácido nucleico que es el complemento de una secuencia nucleotídica
según la presente invención, tal como por ejemplo la secuencia
mostrada en SEQ ID NO:1. Una secuencia de ácido nucleico, que es
complementaria a la secuencia nucleotídica descrita aquí, es
aquella que es suficientemente complementaria a una secuencia
nucleotídica mostrada en SEQ ID NO:1, de forma que se puede hibridar
a dicha secuencia nucleotídica formando de ese modo un dúplex
estable.
En una realización preferida adicional, un ácido
nucleico de la invención como se muestra en SEQ ID NO:1 o su
complemento contiene al menos una mutación que conduce a un producto
génico con función/actividad modificada. La al menos una mutación
se puede introducir mediante métodos descritos aquí. En un aspecto,
la al menos una mutación conduce a una proteína de SMS 37 cuya
función y/o actividad, comparada con la contraparte de tipo
natural, está potenciada o mejorada. Los métodos para introducir
tales mutaciones son bien conocidos en la técnica.
El término "incremento" de la actividad,
como se usa aquí, engloba incrementar la actividad de uno o más
polipéptidos en el organismo productor, que a su vez son
codificados por los polinucleótidos correspondientes descritos
aquí. Hay un número de métodos disponibles en la técnica para lograr
el incremento de actividad de una proteína dada, en este caso la
proteína de SMS 37. En general, se puede incrementar la actividad
específica de una proteína, o se puede incrementar el número de
copias de la proteína. La expresión incremento de actividad o
expresiones equivalentes también engloba la situación en la que la
actividad de la proteína de SMS 37 es introducida en una célula que
no contenía esta actividad antes, por ejemplo, introduciendo
un gen que codifica SMS 37 en una célula que no contenía un
equivalente de este gen antes, o que no podía expresar una forma
activa de la proteína correspondiente antes.
Para facilitar tal incremento, se puede
incrementar el número de copias de los genes que corresponden a los
polinucleótidos descritos aquí. Como alternativa, se puede usar un
promotor potente para dirigir la expresión del polinucleótido. En
otra realización, el promotor, la región reguladora y/o el sitio de
unión al ribosoma en dirección 5' del gen se pueden alterar para
incrementar la expresión. La expresión también se puede potenciar o
incrementar incrementando la semivida relativa del ARN mensajero. En
otra realización, la actividad del propio polipéptido se puede
incrementar empleando una o más mutaciones en la secuencia de
aminoácidos del polipéptido, lo que incrementa la actividad. Por
ejemplo, la alteración de la afinidad del polipéptido por su
sustrato correspondiente puede dar como resultado una actividad
mejorada. Igualmente, se puede incrementar la semivida relativa del
polipéptido. En cualquier escenario, tanto si se potencia la
expresión génica como si se incrementa la actividad específica, la
mejora se puede lograr alterando la composición del medio de
cultivo celular y/o los métodos usados para el cultivo. "Expresión
potenciada" o "actividad mejorada", como se usan aquí,
significan un incremento de al menos 5%, 10%, 25%, 50%, 75%, 100%,
200% o incluso más de 500%, en comparación con una proteína,
polinucleótido, gen de tipo natural; o que la actividad y/o la
concentración de la proteína presente antes de los polinucleótidos
o polipéptidos están potenciadas y/o mejoradas. La actividad de la
proteína de SMS 37 también se puede potenciar poniendo en contacto
la proteína con un potenciador específico o general de su
actividad.
Otro aspecto de la invención pertenece a
vectores que contienen un ácido nucleico que codifica una proteína
según la invención o un equivalente funcional o porción de la misma.
Como se usa aquí, el término "vector" se refiere a una
molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico
al que se ha enlazado. Un tipo de vector es un "plásmido", que
se refiere a un bucle de ADN bicatenario circular en el que se han
ligado segmentos de ADN adicionales. Otro tipo de vector es un
vector vírico, en el que segmentos de ADN adicionales se pueden
ligar al genoma vírico. Ciertos vectores son capaces de una
replicación autónoma en una célula hospedante en la que se
introducen (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un
origen bacteriano de la replicación). Otros vectores se integran en
el genoma de una célula hospedante al introducirlos en la célula
hospedante, y de ese modo se replican junto con el genoma del
hospedante.
Además, ciertos vectores son capaces de dirigir
la expresión de genes a los que están enlazados operativamente.
Tales vectores se denominan aquí como "vectores de expresión".
En general, los vectores de expresión útiles en técnicas de ADN
recombinante a menudo están en forma de plásmidos. Los términos
"plásmido" y "vector" se pueden usar aquí de forma
intercambiable, ya que el plásmido es la forma más habitualmente
usada de vector. Sin embargo, la invención está destinada a incluir
otras formas de vectores de expresión, tales como vectores víricos
(por ejemplo, retrovirus de-
fectuosos para la replicación, adenovirus y virus asociados con adenovirus), que proporcionan funciones equivalentes.
fectuosos para la replicación, adenovirus y virus asociados con adenovirus), que proporcionan funciones equivalentes.
Los vectores recombinantes de la invención
comprenden un ácido nucleico de la invención en una forma adecuada
para la expresión del ácido nucleico en una célula hospedante, lo
que significa que el vector de expresión recombinante incluye una o
más secuencias reguladoras, seleccionadas en base a las células
hospedantes a usar para la expresión, que está enlazada
operativamente a la secuencia de ácido nucleico a expresar. Dentro
de un vector de expresión recombinante, "enlazada
operativamente" significa que la secuencia nucleotídica de
interés está enlazada a la secuencia o secuencias reguladoras de una
manera que permite la expresión de la secuencia nucleotídica
(por ejemplo, en un sistema in vitro de
transcripción/traducción o en una célula hospedante cuando el
vector se introduce en la célula hospedante). La expresión
"secuencia reguladora" pretende incluir promotores,
potenciadores y otros elementos de control de la expresión (por
ejemplo, atenuadores). Tales secuencias reguladoras se
describen, por ejemplo, en Goeddel; Gene Expression Technology:
Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990).
Las secuencias reguladoras incluyen aquellas que dirigen la
expresión constitutiva o inducible de una secuencia nucleotídica en
muchos tipos de células hospedantes, y aquellas que dirigen la
expresión de la secuencia nucleotídica sólo en cierta célula
hospedante (por ejemplo, secuencias reguladoras específicas
de tejidos). Los expertos en la técnica apreciarán que el diseño del
vector de expresión puede depender de factores tales como la
elección de la célula hospedante a transformar, el nivel de
expresión de proteína deseado, etc. Los vectores de expresión de la
invención se pueden introducir en células hospedantes para producir
de ese modo proteínas o péptidos, codificados por ácidos nucleicos
como se describen aquí, incluyendo, pero sin limitarse a, proteínas
mutantes, sus fragmentos, variantes o equivalentes funcionales de
los mismos, y proteínas de fusión, codificados por un ácido nucleico
como se describe aquí, por ejemplo, proteínas de SMS 37,
formas mutantes de proteínas de SMS 37, proteínas de fusión y
similares.
Los vectores de expresión recombinantes de la
invención se pueden diseñar para la expresión de proteínas de SMS
37 en un microorganismo adecuado. Por ejemplo, una proteína según la
invención se puede expresar en células bacterianas tales como cepas
que pertenecen a los géneros Gluconobacter, Gluconacetobacter
o Acetobacter. Los vectores de expresión útiles en la
presente invención incluyen vectores derivados de cromosomas,
episomas y virus, por ejemplo, vectores derivados de
plásmidos bacterianos, bacteriófagos, y vectores derivados de sus
combinaciones, tales como los derivados de elementos genéticos
plasmídicos y bacteriófagos, tales como cósmidos y fagémidos.
El inserto de ADN se puede enlazar
operativamente a un promotor apropiado, que puede ser un promotor
constitutivo o inducible. La persona experta sabrá cómo seleccionar
promotores adecuados. Los constructos de expresión pueden contener
sitios para el inicio de la transcripción, la terminación, y, en la
región transcrita, un sitio de unión a ribosoma para la traducción.
La porción codificante de los transcritos maduros expresados por
los constructos puede incluir preferiblemente un codón de iniciación
al comienzo y un codón de terminación situado apropiadamente al
final del polipéptido a traducir.
Se puede introducir ADN vectorial en células
hospedantes adecuadas vía técnicas de transformación o transfección
convencionales. Como se usa aquí, los términos
"transformación", "transconjugación" y "transfección"
se refieren a una variedad de técnicas reconocidas en la técnica
para introducir ácido nucleico extraño (por ejemplo, ADN) en
una célula hospedante, incluyendo coprecipitación con fosfato de
calcio o con cloruro de calcio, transfección mediada por
DEAE-dextrano, transducción, infección, lipofección,
transfección mediada por lípidos catiónicos, o electroporación. En
Sambrook, et al. (más arriba), Davis et al., Basic
Methods in Molecular Biology (1986) y en otros manuales de
laboratorio, se pueden encontrar métodos adecuados para transformar
o transfectar células hospedantes.
A fin de identificar y seleccionar células que
tienen integrado el ADN extraño en su genoma, generalmente se
introduce en las células hospedantes, junto con el gen de interés,
un gen que codifica un marcador seleccionable (por ejemplo,
resistencia a antibióticos). Los marcadores seleccionables
preferidos incluyen aquellos que confieren resistencia a fármacos,
tales como canamicina, tetraciclina, ampicilina y estreptomicina. Un
ácido nucleico que codifica un marcador seleccionable se introduce
preferiblemente en una célula hospedante en el mismo vector que
aquel que codifica una proteína según la invención, o se puede
introducir en un vector separado, tal como, por ejemplo, un vector
suicida, que no se puede replicar en las células hospedantes. Las
células transfectadas de forma estable con el ácido nucleico
introducido se pueden identificar mediante selección con fármacos
(por ejemplo, las células que han incorporado el gen marcador
seleccionable sobrevivirán, mientras que las otras células
morirán).
La invención proporciona también un polipéptido
aislado que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID
NO:2 o una secuencia de aminoácidos obtenible expresando un
polinucleótido de la presente invención, tal como por ejemplo una
secuencia polinucleotídica mostrada en SEQ ID NO:1, en un hospedante
apropiado.
Los polipéptidos según la invención pueden
contener sólo sustituciones conservativas de uno o más aminoácidos
en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO:2, o
sustituciones, inserciones o supresiones de aminoácidos no
esenciales. En consecuencia, un aminoácido no esencial es un resto
que se puede alterar en las secuencias de aminoácidos mostradas en
SEQ ID NO:2 sin alterar sustancialmente la función biológica. Por
ejemplo, se predice que los restos de aminoácidos que están
conservados entre las proteínas de la presente invención son
particularmente no susceptibles de alteración. Además, los
aminoácidos conservados entre las proteínas según la presente
invención y otras proteínas de SMS 37 no son susceptibles de
alteración.
La expresión "sustitución conservativa"
significa una sustitución en la que el resto de aminoácido se
sustituye por un resto de aminoácido que tiene una cadena lateral
similar. Estas familias son conocidas en la técnica, e incluyen
aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo,
lisina, arginina e histidina), cadenas laterales ácidas (por
ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales
polares no cargadas (por ejemplo, glicina, asparagina,
glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales
no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina,
isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), cadenas
laterales beta-ramificadas (por ejemplo,
treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas
(por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano,
histidina).
Como se ha mencionado anteriormente, los
polinucleótidos de la invención se pueden utilizar en la
manipulación mediante ingeniería genética de una célula hospedante
adecuada para hacerla mejor y más eficaz en la fermentación, por
ejemplo en un proceso de fermentación directa para vitamina C.
Según la invención, una célula hospedante
manipulada genéticamente mediante ingeniería/producida
recombinantemente (también denominada como célula recombinante o
célula transformada) que posee tal polinucleótido modificado, en la
que la función de la proteína enlazada está modificada
significativamente en comparación con una célula de tipo natural de
forma que se mejora el rendimiento, la producción y/o la eficacia de
producción de uno o más productos de fermentación tales como
vitamina C. La célula hospedante se puede seleccionar de un
microorganismo capaz de producir directamente uno o más productos
de fermentación tales como por ejemplo vitamina C a partir de una
fuente de carbono dada, en particular Gluconobacter oxydans,
preferiblemente G. oxydans DSM 17078.
Una "célula transformada" o "célula
recombinante" es una célula en la que (o en un ancestro de ella)
se ha introducido, por medio de técnicas de ADN recombinante, un
ácido nucleico según la invención, o en la que se ha incrementado
y/o potenciado la actividad de la proteína de SMS 37. Las células
hospedantes adecuadas incluyen células de microorganismos capaces
de producir un producto de fermentación dado, por ejemplo,
convirtiendo una fuente de carbono dada directamente en vitamina C.
En particular, estas incluyen cepas de los géneros Pseudomonas,
Pantoea, Escherichia, Corynebacterium, Ketogulonicigenium, y
bacterias del ácido acético como, por ejemplo,
Gluconobacter, Acetobacter o Gluconacetobacter,
preferiblemente Acetobacter sp., Acetobacter aceti,
Gluconobacter frateurii, Gluconobacter cerinus, Gluconobacter
thailandicus, Gluconobacter oxydans, más preferiblemente G.
oxydans, más preferiblemente G. oxydans DSM 17078.
La expresión génica mejorada también se puede
lograr modificando el gen de SMS 37, por ejemplo,
introduciendo una o más mutaciones en el gen de SMS 37, en el que
dicha modificación conduce a una proteína de SMS 37 con una función
que está significativamente mejorada en comparación con la proteína
de tipo natural.
Por lo tanto, en otra realización, el
polinucleótido que tiene la al menos una mutación deriva de un
polinucleótido como se representa mediante SEQ ID NO:1 o sus
equivalentes.
Una mutación, como se usa aquí, puede ser
cualquier mutación que conduzca a un polipéptido más funcional o
más estable, por ejemplo, productos del gen de SMS 37 más
funcionales o más estables. Esto puede incluir, por ejemplo, una
alteración en el genoma de un microorganismo, que mejora la síntesis
de SMS 37 o conduce a la expresión de una proteína de SMS 37 con
una secuencia de aminoácidos alterada cuya función, en comparación
con la contraparte de tipo natural que no tiene una secuencia de
aminoácidos alterada, está mejorada y/o potenciada. La mejora puede
ocurrir a nivel transcripcional, traduccional o
post-traduccional.
La alteración en el genoma del microorganismo se
puede obtener, por ejemplo, sustituyendo mediante una
recombinación de cruzamiento individual o doble una secuencia de ADN
de tipo natural por una secuencia de ADN que contiene la
alteración. Para la selección conveniente de transformantes del
microorganismo con la alteración en su genoma, la alteración puede
ser, por ejemplo, una secuencia de ADN que codifica un
marcador de resistencia a antibióticos, o un gen que complementa
una posible auxotrofia del microorganismo. Las mutaciones incluyen,
pero no se limitan a, mutaciones de
supresión-inserción.
Una alteración en el genoma del microorganismo
que conduce a un polipéptido más funcional se puede obtener también
mutagenizando al azar el genoma del microorganismo usando, por
ejemplo, mutágenos químicos, radiación o transposones, y
seleccionando o cribando mutantes que son mejores productores o
productores más eficaces de uno o más productos de fermentación.
Los métodos estándar para cribar y seleccionar son conocidos por la
persona experta.
En una realización específica, se desea noquear
o suprimir un represor del gen de SMS 37 de la presente invención,
es decir, en el que su expresión del gen represor es
suprimida artificialmente a fin de mejorar el rendimiento,
productividad y/o eficacia de producción del producto de
fermentación cuando se introduce en una célula hospedante adecuada.
Los métodos para proporcionar supresiones, así como los
microorganismos que poseen tales genes suprimidos, son bien
conocidos en la técnica. La supresión del gen represor se puede
inducir eliminando al menos una parte del gen represor o su región
reguladora. Como se usa aquí, "supresión de la expresión del
gen" incluye la supresión completa o parcial, así como la
supresión en condiciones específicas, y también la supresión de la
expresión de uno cualquiera de los dos alelos.
Las estrategias de mutagénesis mencionadas
anteriormente para proteínas de SMS 37 pueden dar como resultado
rendimientos aumentados de un compuesto deseado, en particular
vitamina C. Esta lista de ningún modo es limitante; las variaciones
en estas estrategias de mutagénesis serán fácilmente manifiestas
para un experto normal en la técnica. Mediante estos mecanismos,
las moléculas de ácido nucleico y de proteínas de la invención se
pueden utilizar para generar microorganismos tales como
Gluconobacter oxydans o cepas relacionadas de bacterias que
expresan moléculas de ácido nucleico y de proteínas de SMS 37
mutadas, de forma que se mejora el rendimiento, la productividad
y/o la eficacia de producción de un compuesto deseado tal como
vitamina C.
En relación con el proceso anterior que usa un
microorganismo, en un aspecto, el proceso de la presente invención
conduce a rendimientos de vitamina C que son en general al menos
alrededor de más de 5,7 g/l, tal como 10 g/l, 20 g/l, 50 g/l, 100
g/l, 200 g/l, 300 g/l, 400 g/l o más de 600 g/l. En una realización,
el rendimiento de vitamina C producida por el proceso de la
presente invención está en el intervalo de alrededor de más de 5,7
a alrededor de 600 g/l. El rendimiento de vitamina C se refiere a la
concentración de vitamina C en la corriente de cosecha que procede
directamente de la vasija de producción, es decir, el
sobrenadante libre de células que comprende la vitamina C.
En un aspecto de la invención, se proporcionan
microorganismos (en particular de los géneros Gluconobacter,
Gluconacetobacter y Acetobacter) que son capaces de
producir directamente vitamina C a partir de una fuente de carbono
adecuada como D-sorbitol y/o
L-sorbosa. Cuando se mide por ejemplo en un método
de células en reposo tras un período de incubación de 20 horas, se
encontró que estos organismos eran capaces de producir vitamina C
directamente a partir de D-sorbitol o
L-sorbosa, incluso hasta un nivel de 280 mg/l y 670
mg/l, respectivamente. En otro aspecto de la invención, se
proporciona un microorganismo capaz de producir directamente
vitamina C en cantidades de 300 mg/l cuando se parte de
D-sorbitol o más, u 800 mg/l o más cuando se parte
de L-sorbosa, respectivamente, cuando se mide por
ejemplo en un método de células en reposo tras un período de
incubación de 20 horas. Esto se puede lograr incrementando la
actividad de un polipéptido de STS, preferiblemente un polipéptido
de SMS 37. El rendimiento de vitamina C producida a partir de
D-sorbitol puede ser incluso tan alto como 400,
600, 1000 mg/l, o incluso superar 1,5, 2, 4, 10, 20, 50 g/l. El
rendimiento de vitamina C producida a partir de
L-sorbosa puede ser incluso tan alto como 1000 mg/l,
o incluso superar 1,5, 2, 4, 10, 20, 50 g/l. Preferiblemente, estas
cantidades de vitamina C se pueden lograr cuando se miden mediante
un método de células en reposo tras un período de incubación de 20
horas.
Como se usa aquí, la medición en un "método de
células en reposo" comprende (i) hacer crecer las células por
medio de cualquier método bien conocido por la persona experta en la
técnica, (ii) cosechar las células del caldo de crecimiento, y
(iii) incubar las células cosechadas en un medio que contiene el
sustrato que se va a convertir en el producto deseado, por
ejemplo, vitamina C, en condiciones en las que las células ya
no crecen más, es decir, no hay ningún incremento en la
cantidad de biomasa durante esta etapa denominada de
conversión.
El microorganismo recombinante que posee por
ejemplo un gen de SMS 37 modificado, y que es capaz de producir
el producto de fermentación en un rendimiento, productividad y/o
eficacia significativamente mayor, se puede cultivar en un medio
acuoso suplementado con nutrientes apropiados en condiciones
aerobias como se describe anteriormente.
Las moléculas de ácido nucleico, polipéptidos,
vectores, cebadores, y microorganismos recombinantes descritos aquí
se pueden usar en uno o más de los siguientes métodos:
identificación de Gluconobacter oxydans y organismos
relacionados; cartografiado de genomas de organismos relacionados
con Gluconobacter oxydans; identificación y localización de
secuencias de Gluconobacter oxydans de interés; estudios
evolutivos; determinación de regiones de las proteínas de SMS 37
requeridas para la función; modulación de una actividad o función
de proteínas de SMS 37; modulación de la actividad de una ruta de
SMS; y modulación de la producción celular de un compuesto deseado,
tal como vitamina C.
La invención proporciona métodos para
identificar moléculas que modulan la actividad de una proteína de
SMS 37, ya sea interaccionando con la propia proteína o un sustrato
o pareja de unión de la proteína de SMS 37, o modulando la
transcripción o traducción de una molécula de ácido nucleico de SMS
37 de la invención. En tales métodos, un microorganismo que expresa
una o más proteínas de SMS 37 de la invención se pone en contacto
con uno o más compuestos de ensayo, y se evalúa el efecto de cada
compuesto de ensayo sobre la actividad o nivel de expresión de la
proteína de SMS 37.
La actividad biológica, enzimática u otra de las
proteínas de SMS se puede medir por métodos bien conocidos por una
persona experta, tal como, por ejemplo, incubando una fracción
celular que contiene la proteína de SMS en presencia de su
sustrato, aceptor o aceptores o dador o dadores de electrones,
incluyendo metosulfato de fenacina (PMS),
diclorofenol-indofenol (DCIP), NAD, NADH, NADP,
NADPH, cuyo consumo se puede medir directa o indirectamente
mediante métodos fotométricos, colorimétricos o fluorométricos, y
otros componentes inorgánicos que pueden ser relevantes para el
desarrollo de la actividad. De este modo, por ejemplo, la actividad
de D-sorbitol deshidrogenasa unida a membrana se
puede medir en un ensayo en el que fracciones de membrana que
contienen esta enzima se incuban en presencia de tampón de fosfato
a pH 6, D-sorbitol y los aceptores artificiales de
electrones DCIP y PMS. La velocidad de consumo de DCIP se puede
medir a 600 nm, y es directamente proporcional a la actividad de
D-sorbitol deshidrogenasa presente en la fracción de
membrana.
En el caso de transportadores, tales como por
ejemplo importadores, simportadores o exportadores, la actividad de
tales proteínas de SMS se puede medir por métodos bien conocidos por
una persona experta, tales como, por ejemplo, incubando una
fracción de membrana que contiene la proteína de SMS con el azúcar o
alcohol de azúcar marcado radiactivamente que puede ser
transportado activamente por la proteína de SMS. La actividad del
transportador es directamente proporcional a (1) la cantidad de
radioactividad incorporada en la masa celular, si la proteína de
SMS está implicada en la importación de azúcar o alcoholes de azúcar
al citoplasma, o (2) la cantidad de radiactividad acumulada fuera
del citoplasma en el periplasma/medio extracelular, si la proteína
de SMS está implicada en la exportación de azúcar o alcoholes de
azúcar, tales como por ejemplo sorbosona, fuera del citoplasma. De
este modo, por ejemplo, la actividad de un transportador se puede
medir en un ensayo en el que células intactas que contienen el
transportador específico se incuban en presencia de tampón de
fosfato a pH 6 y la fuente de carbono marcada radiactivamente tal
como, por ejemplo, glucosa, galactosa o sorbosona. La
velocidad de asimilación de la fuente de carbono radioactiva, tal
como por ejemplo glucosa, galactosa o sorbosona, por las
células, se puede medir por métodos conocidos por la persona
experta, y es directamente proporcional a la actividad de la
proteína de SMS presente en la fracción de membrana, si se debiese
medir el transporte desde el exterior hacia el citoplasma. En el
caso de exportadores, también se pueden generar membranas
invertidas, por ejemplo vesículas
dentro-fuera, y medir la captación de radiactividad
como se describe anteriormente.
Un método adicional para medir la actividad de
exportadores tales como, por ejemplo SMS 37, puede ser vía
la determinación del nivel extracelular de compuesto producidos en
el citoplasma, tales como por ejemplo, sorbosona, pero que
requieren ser exportados al periplasma o al medio extracelular
mediante dicho exportador, y comparar este nivel con una situación
en la que no está presente el sistema de eflujo, tal como por
ejemplo mutantes noqueados en los que el gen que codifica dicho
exportador ya no es activo, y de este modo los niveles
extracelulares pueden disminuir. Por el contrario, la sobreexpresión
de tal gen que codifica dicho exportador puede dar como resultado
un aumento de los niveles extracelulares del compuesto tal como,
por ejemplo, sorbosona.
De la anterior descripción, puede ser evidente
que el producto de fermentación de los métodos según la invención
puede no estar limitado a la vitamina C sola. El "compuesto
deseado" o "producto de fermentación", como se usa aquí,
puede ser cualquier producto natural de Gluconobacter
oxydans, que incluye los productos finales e intermedios de las
rutas biosintéticas, tales como, por ejemplo,
L-sorbosa, L-sorbosona,
D-gluconato,
2-ceto-D-gluconato,
5-ceto-D-gluconato,
2,5-diceto-D-gluconato
y 2-ceto-L-gulonato
(2-KGA), en particular la generación biosintética
de vitamina C.
De este modo, la presente invención se dirige al
uso de un polinucleótido, polipéptido, vector, cebador y
microorganismo recombinante como se describe aquí en la producción
de vitamina C, es decir, la conversión directa de una fuente
de carbono en vitamina C. En una realización preferida, un
polinucleótido modificado, polipéptido, vector y microorganismo
recombinante como se describe aquí se usa para mejorar el
rendimiento, la productividad, y/o la eficacia de la producción de
vitamina C.
Los términos "producción" o
"productividad" son reconocidos en la técnica, e incluyen la
concentración del producto de fermentación (por ejemplo, vitamina
C) formado en un tiempo dado y en un volumen dado de fermentación
(por ejemplo, kg de producto por hora por litro). La
expresión "eficacia de producción" incluye el tiempo requerido
para que se logre un nivel particular de producción (por ejemplo,
cuánto tarda la célula en lograr una velocidad particular de
producción de un producto de fermentación). El término
"rendimiento" está reconocido en la técnica, e incluye la
eficacia de la conversión de la fuente de carbono en el producto
(es decir, vitamina C). Esto generalmente se escribe como,
por ejemplo, kg de producto por kg de fuente de carbono. Por
"incrementar el rendimiento y/o la producción/productividad"
del compuesto se quiere decir que la cantidad de moléculas
recuperadas, o de moléculas recuperadas útiles de ese compuesto en
una cantidad dada de cultivo a lo largo de una cantidad dada de
tiempo aumenta. Las expresiones "biosíntesis" o una "ruta
biosintética" están reconocidas en la técnica, e incluyen la
síntesis de un compuesto, preferiblemente un compuesto orgánico,
mediante una célula a partir de compuestos intermedios en lo que
puede ser un proceso de múltiples etapas y altamente regulado. La
palabra "metabolismo" está reconocida en la técnica, e incluye
la totalidad de las reacciones bioquímicas que tienen lugar en un
organismo. El metabolismo de un compuesto particular (por
ejemplo, el metabolismo de un aminoácido tal como glicina)
comprende entonces las rutas globales biosintéticas, de
modificación y de degradación en la célula relacionadas con este
compuesto. La palabra "transporte" o "importar" están
reconocidas en la técnica, e incluyen el movimiento facilitado de
una o más moléculas a través de una membrana celular a través de la
cual la molécula sería de otro modo incapaz de pasar o de ser pasada
ineficazmente.
Vitamina C, como se usa aquí, puede ser
cualquier forma química de ácido L-ascórbico
encontrada en disoluciones acuosas, tales como por ejemplo sin
disociar, en su forma de ácido libre, o disociada como un anión. La
forma de sal solubilizada de ácido L-ascórbico se
puede caracterizar como el anión en presencia de cualquier tipo de
cationes encontrados habitualmente en sobrenadantes de fermentación,
tales como por ejemplo potasio, sodio, amonio, o calcio. También
pueden estar incluidos cristales aislados de la forma de ácido libre
de ácido L-ascórbico. Por otro lado, los cristales
aislados de una forma salina de ácido L-ascórbico se
denominan por su nombre de sal correspondiente, es decir,
ascorbato sódico, ascorbato potásico, ascorbato de calcio, y
similares.
En una realización preferida, la presente
invención se refiere a un proceso para la producción de vitamina C
en el que un nucleótido según la invención, o una secuencia
polinucleotídica modificada como se describe anteriormente, se
introduce en un microorganismo adecuado, el microorganismo
recombinante se cultiva en condiciones que permiten la producción
de vitamina C con alta productividad, rendimiento y/o eficacia, el
producto de fermentación producido se aísla del medio de cultivo, y
opcionalmente se purifica posteriormente. Los microorganismos
hospedantes adecuados se pueden seleccionar de, por ejemplo,
G. oxydans DSM 17078, G. oxydans IFO 3293, G.
oxydans IFO 3292, G. oxydans ATCC 621H, G. oxydans
IFO 12528, G. oxydans T-100, G.
oxydans IFO 3291, G. oxydans IFO 3255, G. oxydans
ATCC 9937, G. oxydans ATCC 9937, G. oxydans IFO
3244, G. cerinus IFO 3266, G. frateurii IFO 3260,
G. oxydans IFO 3287, G. thailandicus NBRC 100600 o
Gluconoacetobacter liquefaciens ATCC 14835.
Esta invención se ilustra adicionalmente
mediante los siguientes ejemplos, que no se deben de interpretar
como limitantes. Los contenidos de todas las referencias,
solicitudes de patentes, patentes y solicitudes de patentes
publicadas, citadas en esta Solicitud se incorporan aquí como
referencia.
Se preparó ADN cromosómico de Gluconobacter
oxydans DSM 17078 a partir de células cultivadas a 30ºC durante
1 día en medio líquido de caldo de manitol (MB) que consiste en 25
g/l de manitol, 5 g/l de extracto de levadura (Difco), y 3 g/l de
Bactopeptone (Difco), mediante el método descrito por Sambrook et
al. (1989) "Molecular Cloning: A Laboratory Manual/Second
Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press).
Se preparó un fragmento de ADN mediante PCR con
el ADN cromosómico preparado anteriormente y un conjunto de
cebadores, Pf (SEQ ID NO:3) y Pf (SEQ ID NO:4). Para la reacción, se
usó el kit Expand High Fidelity PCR (Roche Diagnostics) y 10 ng del
ADN cromosómico en un volumen total de 100 \mul según las
instrucciones del proveedor, para obtener el producto de la PCR que
contiene la secuencia de ADN de SMS 37 (SEQ ID NO:1). El producto de
la PCR se recuperó de la reacción, y su secuencia correcta se
confirmó.
Para aumentar la expresión del gen de SMS 37, se
usó un sistema de sobreexpresión que usa un constructo plasmídico.
Aquí, el gen de SMS 37 se fusionó con un promotor constitutivo
potente, y el constructo se introdujo entonces en G. oxydans
DSM 17078. La sobreexpresión del gen de SMS 37 se determinó mediante
métodos estándar conocidos por los expertos en la técnica, tales
como análisis del transcrito usando transferencia Northern,
RT-PCR u otra tecnología, la determinación de la
expresión de la proteína usando transferencia Western,
electroforesis en gel bidimensional, determinación de la actividad
proteica usando ensayos enzimáticos específicos, o mediante la
medida directa de la formación de producto o conversión del
sustrato.
El promotor puede ser cualquier promotor que
muestra actividad constitutiva potente en Gluconobacter
oxydans, tal como el promotor tufB de Escherichia
coli, el promotor tufB de Gluconobacter oxydans,
el promotor sldh de Gluconobacter oxydans, o el
promotor sndh de Gluconobacter oxydans.
El plásmido para el sistema de sobreexpresión
basado en plásmidos puede ser cualquier plásmido que sea capaz de
replicarse tanto en Escherichia coli como en Gluconobacter
oxydans, y que se pueda transferir entre las dos especies. El
plásmido puede contener convenientemente un marcador seleccionable
de forma que se pueda monitorizar la transferencia de tal plásmido,
por ejemplo, un marcador de resistencia a antibióticos, un
marcador complementario para auxotrofia. Tal plásmido puede incluir,
pero no se limita a, pVK100, pGE1, pBBR1MCS-2,
RSF1010 y sus derivados (vectores con números de catálogo o fuente
de información, pVK100 = ATCC 37156, pGE1 = J. Ferment Bioeng. 79,
95, 1995, pBBR1MCS-2 = NCCB 3434, RSF1010 = NCCB
3110).
Todo el gen de SMS 37 se amplificó mediante PCR
usando el par de cebadores PsndhSMS 37+1 (SEQ ID NO:5) que contiene
la secuencia saliente del promotor P_{sndh} complementaria en el
extremo 5' y SMS 37HindIII-1 [SEQ ID NO:4 con
GAGAAAGCTT en el extremo 5']. El promotor P_{sndh} (SEQ ID NO:6)
se amplificó mediante PCR usando los cebadores PsndhXhoI+1 (SEQ ID
NO:7) y SMS 37Psndh-1 (SEQ ID NO:8) que contienen la
secuencia saliente de ADN de SMS 37 complementaria en el extremo
5'. Se usó ADN genómico de G. oxydans DSM 17078 como molde,
y las condiciones de reacción consistieron en 35 ciclos de
desnaturalización a 94ºC durante 30 segundos, hibridación a 50ºC
durante 30 segundos, y extensión a 72ºC durante 1 minuto. En ambos
casos, se usó el kit de PCR rico en GC (Roche Molecular
Biochemicals). Puesto que los dos fragmentos tienen salientes
complementarios, los fragmentos de PCR individuales se mezclaron y
se reamplificaron usando el par de cebadores PsndhXhoI+1/SMS
37HindIII-1 para amplificar un producto de longitud
completa, con lo que el promotor escogido se insertó en dirección
5' del gen de SMS 37. Las condiciones de la reacción de PCR para la
reacción de segunda ronda consistieron en 94ºC, 2 minutos, después
10 ciclos de [94ºC, 30 segundos, 63ºC, 30 segundos, 68ºC, 6
minutos], seguido de 20 ciclos de [94ºC, 30 segundos, 63ºC, 30
segundos, 68ºC, 6 minutos, con 20 segundos adicionales por ciclo] y
una extensión final a 68ºC durante 10 minutos. El producto de la PCR
se purificó y se digirió doblemente con XhoI y
HindIII, y se clonó en el vector pVK100 digerido con
XhoI-HindIII. La mezcla de ligación se transformó en
células TOP10 de E. coli, y se seleccionaron transformantes
en agar Luria-Bertani que contiene tetraciclina
hasta una concentración final de 10 \mug ml^{-1}. Los
transformantes putativos se identificaron mediante PCR de colonias
usando el par de cebadores PsndhXhoI+1/SMS
37HindIII-1. Se recogieron los transformantes
positivos, se obtuvieron minipreparaciones plasmídicas, y se
confirmó la secuencia de ADN del fragmento de inserción. Los
plásmidos que muestran la secuencia correcta se transformaron en
células G. oxydans DSM 17078 competentes, seleccionando
transformantes en medio de agar con caldo de manitol que contiene
tetraciclina hasta una concentración final de 10 \mug ml^{-1}.
Se observaron varios transformantes putativos, de los cuales se
analizaron cuatro mediante PCR usando el par de cebadores
PsndhXhoI+1/SMS 37HindIII-1 para verificar la
presencia del plásmido. Se encontró que todas las cepas contienen el
plásmido de sobreexpresión de SMS 37, y se denominaron G.
oxydans DSM 17078-SMS 37up1, G. oxydans
DSM 17078-SMS 37up2, G. oxydans DSM
17078-SMS 37up3 y G. oxydans DSM
17078-SMS 37up4.
Las células de G. oxydans DSM 17078,
G. oxydans DSM 17078-SMS 37up1, G.
oxydans DSM 17078-SMS 37up2, G. oxydans
DSM 17078-SMS 37up3 y G. oxydans DSM
17078-SMS 37up4 se hicieron crecer a 27ºC durante 3
días en medio de agar No. 3BD que contiene 70 g/l de
D-sorbitol, 0,5 g/l de glicerol, 7,5 g/l de extracto
de levadura (Difco), 2,5 g/l de MgSO_{4}\cdot7H_{2}O, 10 g/l
de CaCO_{3} y 18 g/l de agar (Difco).
Las células se rasparon de las placas de agar,
se suspendieron en agua destilada y se usaron para reacciones de
células en reposo llevadas a cabo a 30ºC con agitación a 220 rpm. Se
llevó a cabo una serie de reacciones (0,5 ml de mezcla de reacción
en tubos de reacción de 5 ml) con D-sorbitol al 2%
en mezclas de reacción que contienen además 0,3% de NaCl, 1% de
CaCO_{3}, y se incubaron con células a una concentración final de
OD_{600} = 10. Tras un período de incubación de 20 horas, las
muestras de las mezclas de reacción se analizaron mediante
cromatografía de líquidos de altas prestaciones (HPLC) usando un
sistema de HPLC Agilent 1100 (Agilent Technologies, Wilmington,
USA) con una columna
LiChrospher-100-RP18 (125 x 4,6 mm)
(Merck, Darmstadt, Alemania) unida a una columna
Aminex-HPX-78H (300 x 7,8 mm)
(Biorad, Reinach, Suiza). La fase móvil fue ácido sulfúrico 0,004
M, y el caudal fue 0,6 ml/min. Se registraron dos señales usando un
detector de UV (longitud de onda 254 nm) en combinación con un
detector de índice de refracción. Además, la identificación del
ácido L-ascórbico se realizó usando una
aminocolumna (YMC-Pack Polyamine-II,
YMC, Inc., Kyoto, Japón) con una detección de UV a 254 nm. La fase
móvil fue 50 mM de NH_{4}H_{2}PO_{4} y acetonitrilo
(40:60).
Se usó un sistema de HPLC Agilent Series 1100
con espectrometría de masas (MS) para identificar ácido
L-ascórbico. La MS se hizo funcionar en modo de ion
positivo usando la interfaz de electropulverización. La separación
se llevó a cabo usando una columna LUNA-C8(2)
(100 x 4,6 mm) (Phenomenex, Torrance, USA). La fase móvil fue una
mezcla de 0,1% de ácido fórmico y metanol (96:4). El ácido
L-ascórbico eluyó con un tiempo de retención de 3,1
minutos.
La identidad del ácido L-ascórbico se confirmó mediante el tiempo de retención y la masa molecular del compuesto.
La identidad del ácido L-ascórbico se confirmó mediante el tiempo de retención y la masa molecular del compuesto.
Los sobrenadantes de las mezclas de reacción
incubadas con células de cepas mutantes G. oxydans DSM
17078-SMS 37up1, G. oxydans DSM
17078-SMS 37up2, G. oxydans DSM
17078-SMS 37up3 y G. oxydans DSM
17078-SMS 37up4 contenían una media de 2,8 g/l de
vitamina C, en comparación de 1,0 g/l para G. oxydans DSM
17078.
La presencia de SEQ ID NO:1 y/o equivalentes en
otros organismos distintos de los descritos aquí anteriormente,
por ejemplo, organismos como se mencionan en la Tabla 1, se
puede determinar mediante un experimento de hibridación de ADN
simple.
Se hicieron crecer cepas de Acetobacter aceti
subsp. xylinum IFO 13693 e IFO 13773 a 27ºC durante 3 días en
medio No. 350 que contiene 5 g/l de Bactopeptone (Difco), 5 g/l de
extracto de levadura (Difco), 5 g/l de glucosa, 5 g/l de manitol, 1
g/l de MgSO_{4}\cdot7H_{2}O, 5 ml/l de etanol, y 15 g/l de
agar. Todas las otras cepas de Acetobacter,
Gluconacetobacter y todas las cepas de Gluconobacter se
hicieron crecer a 27ºC durante 3 días en medio de agar con caldo de
manitol (MB) que contiene 25 g/l de manitol, 5 g/l de extracto de
levadura (Difco), y 3 g/l de Bactopeptone (Difco), y 18 g/l de agar
(Difco). K-12 de E. coli se hizo crecer en
medio de agar con caldo Luria. Las otras cepas se hicieron crecer en
medio recomendado por los proveedores o según métodos conocidos en
la técnica. El ADN genómico se extrajo como se describe, por
ejemplo, por Sambrook et al. 1989, "Molecular Cloning:
A Laboratory Manual/Second Edition", Cold Spring Harbor
Laboratory Press), a partir de un organismo adecuado como se
menciona, por ejemplo, en la Tabla 1.
Las preparaciones de ADN genómico se digirieron
con enzimas de restricción tales como EcoRI o HindIII,
y 1 \mug de los fragmentos de ADN se separaron mediante
electroforesis en gel de agarosa (1% de agarosa). El gel se trató
con HCl 0,25 N durante 15 minutos, y después NaOH 0,5 N durante 30
minutos, y después se transfirió sobre nitrocelulosa o una membrana
de nailon con Vacuum Blotter Model 785 (BIO-RAD
Laboratories AG, Suiza) según las instrucciones del proveedor. La
transferencia resultante se puso entonces en contacto/se hibridó
con una disolución en la que la sonda, tal como por ejemplo,
un fragmento de ADN con secuencia SEQ ID NO:1, o un fragmento de
ADN que contiene parte o toda la secuencia SEQ ID NO:1 para detectar
fragmento o fragmentos positivos de ADN a partir de un organismo de
ensayo. Una sonda marcada con DIG, por ejemplo SEQ ID NO:1,
se puede preparar según el Ejemplo 1 usando el kit de marcado de
PCR-DIG (Roche Diagnostics) y un conjunto de
cebadores, SEQ ID NO:3 y SEQ ID NO:4. En la Tabla 1 se representa el
resultado de tal transferencia.
La hibridación se puede llevar a cabo en
condiciones restrictivas o muy restrictivas. Un ejemplo preferido,
no limitante, de tales condiciones son hibridación en 6x cloruro de
sodio/citrato de sodio (SSC) a alrededor de 45ºC, seguido de uno o
más lavados en 1x SSC, 0,1% de SDS a 50ºC, preferiblemente a 55ºC,
más preferiblemente a 60ºC, e incluso más preferiblemente a 65ºC.
Las condiciones muy restrictivas incluyen, por ejemplo, incubación
de 2 h a 4 días a 42ºC en una disolución tal como disolución
DigEasyHyb (Roche Diagnostics GmbH) con o sin 100 \mug/ml de ADN
de esperma de salmón, o una disolución que comprende 50% de
formamida, 5x SSC (150 mM de NaCl, 15 mM de citrato trisódico),
0,02% de dodecilsulfato de sodio, 0,1% de
N-lauroilsarcosina, y 2% de reactivo de bloqueo
(Roche Diagnostics GmbH), seguido del lavado de los filtros dos
veces durante 5 a 15 minutos en 2x SSC y 0,1% de SDS a temperatura
ambiente, y después lavando dos veces durante 15-30
min. en 0,5x SSC y 0,1% de SDS o 0,1x SSC y 0,1% de SDS a
65-68ºC. Para detectar fragmentos de ADN con menor
identidad con el ADN sonda, se pueden realizar etapas de lavado
finales a menores temperaturas, tales como 50-65ºC,
y durante un tiempo de lavado más corto, tal como
1-15 min.
Los genes que corresponden a las señales
positivas en los organismos respectivos mostrados en la Tabla 1 se
pueden clonar mediante un método de PCR bien conocido en la técnica
usando ADN genómico de tal organismo, junto con un conjunto
adecuado de cebadores, tal como por ejemplo SEQ ID NO:3 y SEQ
ID NO:4 en condiciones como se describen en el Ejemplo 1 o según lo
siguiente: se usaron 5 a 100 ng de ADN genómico por reacción
(volumen total 50 \mul). Se puede usar el sistema Expand High
Fidelity PCR (Roche Diagnostics) con condiciones de reacción que
consisten en 94ºC durante 2 min.; 30 ciclos de (i) etapa de
desnaturalización a 94ºC durante 15 segundos, (ii) etapa de
hibridación a 60ºC durante 30 segundos, (iii) etapa de síntesis a
72ºC durante 0,5 a 5 minutos, dependiendo de la longitud del ADN
diana (1 min./1 kb); extensión a 72ºC durante 7 min. Como
alternativa, se puede realizar una PCR con cebadores degenerados,
que se pueden sintetizar basándose en SEQ ID NO:2 o en secuencias
de aminoácidos como secuencias de consenso seleccionadas alineando
varias secuencias de aminoácidos obtenidas mediante un programa de
búsqueda de secuencias tales como BLASTP (o BLASTX cuando la
secuencia nucleotídica se usa como una "secuencia de
interrogación") para encontrar proteínas que tienen una
similitud con la proteína de SEQ ID NO:2. Para la PCR que usa
cebadores degenerados, la temperatura de la segunda etapa de
hibridación (véase anteriormente) se puede reducir hasta 55ºC, o
incluso hasta 50-45ºC. En la Tabla 1 se muestra el
resultado de tal experimento.
Las muestras de las reacciones de PCR se separan
mediante electroforesis en gel de agarosa, y las bandas se
visualizan con un transiluminador tras teñir con por ejemplo
bromuro de etidio, se aíslan del gel, y se confirma la secuencia
correcta.
Las secuencias de consenso mencionadas
anteriormente pueden ser secuencias de aminoácidos que pertenecen a
ciertas categorías de varias bases de datos de dominios/familias de
proteínas, tales como PROSITE (base de datos de familias y dominios
de proteínas), COGs (agrupación de grupos Ortholog), CDD (base de
datos de dominios conservados), pfam (gran colección de
alineamientos de secuencias múltiples y modelos de Markov ocultos
que cubren muchos dominios y familias de proteínas habituales). Una
vez se puede seleccionar cierta proteína con una función
idéntica/similar a la proteína de esta invención a partir de
proteínas que contienen dominio o familia de tales bases de datos,
el ADN correspondiente que codifica la proteína se puede amplificar
mediante PCR usando la secuencia proteínica o su secuencia
nucleotídica cuando está disponible en bases de datos públicas. Los
organismos siguientes pueden proporcionar adicionalmente genes, los
cuales se pueden usar como un gen alternativo de esta invención:
Shigella flexneri 2a cepa 301, Salmonella typhimurium
LT2, Bacillus subtilis 168, Agrobacterium tumefaciens
C58, Bradyrhizobium japonicum USDA 110, Sinorhizobium
meliloti 1021 o Mesorhizobium loti MAFF303099.
A fin de mejorar la producción de vitamina C en
un microorganismo adecuado que es capaz de producir directamente
vitamina C a partir de un sustrato dado, el gen de SMS 37 y
equivalentes como, por ejemplo, un producto de PCR obtenido
en el Ejemplo 4, denominado aquí como gen X, se puede usar en un
sistema de sobreexpresión según el Ejemplo 2, y se puede clonar en
pCR2.1-TOPO (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) y se
puede usar para transformar TG1 de E. coli para que tenga un
transformante Ap^{r} que tiene
pCR2.1-TOPO-gen X, es decir,
que tiene un producto de PCR obtenido en el Ejemplo 4. El inserto se
amplificó con un conjunto de cebadores, PfNdeI [SEQ ID NO:3 con
CCCAT en el extremo 5'] y PrHindIII [SEQ ID NO:4 con CCAAGCTT en el
extremo 5'], mediante PCR. El producto de la PCR resultante se
digirió con NdeI y HindIII, y el fragmento se insertó
junto con el fragmento PcrtE-SD
(Shine-Dalgarno) (documento WO 02/099095) digerido
con XhoI y NdeI en pVK100 (ATCC 37156) entre los
sitios de XhoI y HindIII. TG1 de E. coli se
transformó con el producto de ligación para que tenga un
transformante Tc^{r} que tiene el plásmido
pVK-PcrtE-SD-gen X,
que entonces se usó para transformar un hospedante adecuado, por
ejemplo G. oxydans
DSM 17078 mediante electroporación para que tenga por ejemplo Tc^{r} G. oxydans DSM 17078/pVK-PcrtE-SD-gen X.
DSM 17078 mediante electroporación para que tenga por ejemplo Tc^{r} G. oxydans DSM 17078/pVK-PcrtE-SD-gen X.
La producción de vitamina C usando las células
recombinantes de por ejemplo las cepas DSM 17078 de G.
oxydans y la cepa de tipo natural correspondiente se lleva a
cabo según el Ejemplo 3.
En la reacción con células en reposo, con 1% de
L-sorbosona como sustrato, las células recombinantes
pueden producir al menos más de 20% de vitamina C en comparación
con la cepa de tipo natural.
Señal 1: detección de ADN en una transferencia
con ADN genómico de diferentes cepas y SEQ ID NO:1 como sonda
marcada. Señal 2: detección de ADN de diferentes cepas en una
reacción de PCR usando un par de cebadores SEQ ID NO:3 y SEQ ID NO:
4. Señal 3: detección de ADN de diferentes cepas en una reacción de
PCR usando cebadores degenerados. Para más explicación, refiérase
al texto.
\global\parskip0.000000\baselineskip
<110> DSM IP Assets B.V.
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Nuevo gen SMS 37
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 25002
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.2
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1401
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Gluconobacter oxydans DSM
17078
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 466
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Gluconobacter oxydans DSM
17078
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatgagtgacg ttggcgtcgt
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttacaggccg atacgattga
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagttcgcaca ggagttccat atgagtgacg ttggcgtcgt ag
\hfill42
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 400
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Gluconobacter oxydans DSM
17078
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgagactcgag gtggcctcag cgtccctg
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctacgacgcc aacgtcactc atatggaact cctgtgcgaa ct
\hfill42
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 495
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Gluconobacter oxydans IFO
3293
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<220> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 164
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Gluconobacter oxydans IFO
3293
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (15)
1. Un polinucleótido seleccionado del grupo que
consiste en:
(a) polinucleótidos que codifican un polipéptido
que comprende la secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO:2;
(b) polinucleótidos que comprenden la secuencia
nucleotídica según SEQ ID NO:1;
(c) polinucleótidos que son al menos 70%
idénticos a un polinucleótido como se define en uno cualquiera de
(a) a (b), y que codifican un exportador de azúcar y/o un exportador
de alcohol de azúcar,
o la hebra complementaria de tal
polinucleótido.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Un vector que contiene el polinucleótido
según la reivindicación 1.
3. El vector de la reivindicación 2, en el que
el polinucleótido está enlazado operativamente a secuencias de
control de la expresión que permiten la expresión en células
hospedantes procariotas o eucariotas.
4. Un microorganismo que comprende el vector de
la reivindicación 2 ó 3.
5. Un microorganismo según la reivindicación 4,
capaz de producir directamente vitamina C a partir de
D-sorbitol en cantidades de 300 mg/l o más cuando
se mide en un método de células en reposo tras un período de
incubación de 20 horas.
6. Un microorganismo según la reivindicación 5,
capaz de producir directamente vitamina C a partir de
L-sorbosa en cantidades de 800 mg/l o más.
7. Un polipéptido codificado por un
polinucleótido según la reivindicación 1.
8. Procedimiento para producir células capaces
de expresar un polipéptido según la reivindicación 7, que comprende
la etapa de manipular mediante ingeniería genética células con el
vector de la reivindicación 2 ó 3, o con un polinucleótido según la
reivindicación 1.
9. Uso de un polinucleótido según la
reivindicación 1, o un vector según las reivindicaciones 2 ó 3, para
la producción de vitamina C.
10. Un microorganismo según la reivindicación 4,
o un microorganismo que contiene un gen endógeno que comprende un
polinucleótido según la reivindicación 1 que está sobreexpresado,
siendo capaz dicho microorganismo de aumentar la producción de
vitamina C al menos 5% en comparación con un microorganismo de tipo
natural.
11. Un microorganismo según la reivindicación
10, que produce un polipéptido según la reivindicación 7 con una
actividad aumentada y/o mejorada de exportador de azúcar y/o
exportador de alcohol de azúcar.
12. Un microorganismo según una cualquiera de
las reivindicaciones 4 a 6 ó 10 a 11, seleccionado del grupo que
consiste en Pseudomonas, Pantoea, Escherichia,
Ketogulonicigenium, y bacterias de ácido acético como, por
ejemplo, Gluconobacter, Acetobacter o
Gluconacetobacter, preferiblemente Acetobacter sp.,
Acetobacter aceti, Gluconobacter frateurii, Gluconobacter
cerinus, Gluconobacter thailandicus, Gluconobacter oxydans,
preferiblemente Gluconobacter oxydans, más preferiblemente
Gluconobacter oxydans DSM 17078.
13. Procedimiento para la producción de un gen
potenciado exportador de azúcar y/o exportador de alcohol de azúcar
en un microorganismo, comprendiendo dicho microorganismo un
polinucleótido según la reivindicación 1, comprendiendo dicho
procedimiento la etapa de sobreexpresar dicho polinucleótido que
conduce a una producción aumentada de vitamina C de al menos 5% en
comparación con el microorganismo de tipo natural.
14. Procedimiento para la producción de un
microorganismo que produce al menos 5% más de vitamina C que un
microorganismo de tipo natural, conteniendo dicho microorganismo un
gen que comprende un polinucleótido según la reivindicación 1, que
comprende la etapa de alterar dicho microorganismo de forma que el
gen esté sobreexpresado.
15. Procedimiento para la producción de vitamina
C con un microorganismo según una cualquiera de las reivindicaciones
10 a 12 o reivindicaciones 4 a 6, en el que dicho microorganismo se
incuba en un medio acuoso en condiciones que permiten la producción
directa de vitamina C a partir de D-sorbitol o
L-sorbosa, y en el que opcionalmente la vitamina C
se aísla como el producto de fermentación.
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